Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering og karakterisering af den naturlige mikrobiota af modellen Nematode Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans er en af de vigtigste modelarter inden for biologi, men næsten al forskning udføres i mangel af dets naturligt associerede mikrober. De metoder, der er beskrevet her, vil bidrage til at forbedre vores forståelse af mangfoldigheden af tilknyttede mikrober som grundlag for fremtidig funktionel C. elegans-forskning.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans interagerer med en stor mangfoldighed af mikroorganismer i naturen. Generelt findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg. Disse levesteder er rige på mikrober, der tjener som mad til C. elegans , og som også vedvarende kan kolonisere nematodetarmen. Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået. Her beskriver vi en passende tilgang til isolering af C. elegans fra naturen og karakterisering af ormens mikrobiota. Nematoder kan let isoleres fra kompostmateriale, rådne æbler, snegle eller tiltrækkes ved at placere æbler på kompostbunker. Den bedste tid til at finde C. elegans på den nordlige halvkugle er fra september til november. Orme kan vaskes ud af opsamlet substratmateriale ved at nedsænke substratet i bufferopløsning efterfulgt af opsamling af nematoder og deres overførsel til nematodevækstmedium eller PCR-buffer til efterfølgende analyse. Vi illustrerer yderligere, hvordan prøverne kan bruges til at isolere og rense de ormassocierede mikroorganismer og til at behandle orme til 16S ribosomal RNA-analyse af mikrobiota-samfundssammensætning. Samlet set kan de beskrevne metoder stimulere ny forskning i karakteriseringen af C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer og derved bidrage til at opnå en omfattende forståelse af mangfoldigheden og stabiliteten af nematodens mikrobiota som grundlag for fremtidig funktionel forskning.

Introduction

I naturen findes C. elegans almindeligvis i rådne plantestoffer, især rådne frugter som æbler eller på kompostbunker1. Det er også forbundet med visse hvirvelløse værter såsom snegle og træløg 2,3. Disse levesteder er rige på mikrober, som ikke kun tjener som mad til ormen, men kan også danne stabile foreninger med den. Oplysninger om mangfoldigheden af naturligt associerede mikroorganismer blev først offentliggjort i 2016 4,5,6. Siden da har disse og kun få nyere undersøgelser afsløret, at C. elegans er forbundet med en række bakterier og svampe, oftest inklusive bakterier af slægten Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter og flere andre 6,7,8. Flere tilknyttede bakterier kan stabilt kolonisere ormens tarm, men ikke alle 6,9,10,11,12. De vil sandsynligvis være af afgørende betydning for vores forståelse af C. elegans biologi, fordi de kan give ernæring, beskytte mod patogener og muligvis andre stressfaktorer og påvirke centrale livshistorietræk såsom reproduktionshastighed, udvikling eller adfærdsmæssige reaktioner.

Som et eksempel kan naturligt associerede isolater af slægterne Pseudomonas, Ochrobactrum og også Enterobacter eller Gluconobacter beskytte ormen mod patogeninfektion og dræbe på forskellige måder 5,6,11,13,14. Et specifikt isolat af slægten Comamonas påvirker nematode kostrespons, udvikling, levetid og fertilitet15,16,17. Providencia-bakterier producerer neuromodulatoren tyramin og modulerer derved værtsnervesystemets aktivitet og deraf følgende adfærdsmæssige reaktioner18. Et sæt forskellige naturligt associerede bakterier viste sig at påvirke befolkningstilvækst, fertilitet og adfærdsmæssige reaktioner 5,6,9,11,19.

Til dato er den nøjagtige mangfoldighed og konsistens af den indfødte C. elegans mikrobiota på tværs af levesteder og geografiske placeringer ikke fuldt ud forstået, og yderligere sammenhænge mellem ormen og mikrober fra dens miljø mangler stadig at blive afdækket. Flere tidligere undersøgelser anvendte bakteriestammer isoleret fra noget jordmiljø, naturlige C. elegans levesteder eller fra mesokosmoseksperimenter (dvs. laboratoriebaserede miljøer, der genskaber naturlige levesteder) med C. elegans laboratoriestammer 4,5,20. Selvom disse undersøgelser opnåede ny indsigt i mikrobernes indflydelse på specifikke nematodeegenskaber (f.eks. Nematodemetabolisme21), er relevansen af disse interaktioner for C. elegans biologi i naturen uklar. Derfor beskriver dette manuskript metoderne til direkte at isolere C. elegans fra naturen og til at isolere og efterfølgende karakterisere de naturligt associerede mikrober fra både enkelte orme og grupper af orme. De beskrevne metoder er en opdateret og forbedret version af de procedurer, der tidligere blev anvendt til isolering og karakterisering af naturlige C. elegans og dets oprindelige mikrobiota 2,6,7. I betragtning af at C. elegans i vid udstrækning findes i nedbrydning af plantemateriale over hele kloden (især i rådne frugter, tempererede regioner og om efteråret)1,2,22,23,24,25, kan denne protokol anvendes af ethvert laboratorium, når der er interesse for at relatere C. elegans træk til naturligt associerede mikrober og dermed en mere naturligt relevant kontekst. Sidstnævnte er afgørende for en fuld forståelse af nematodens biologi, fordi det er kendt fra en mangfoldighed af andre værtssystemer, at den tilknyttede mikrobiota kan påvirke forskellige livshistoriekarakteristika26, et aspekt, der i øjeblikket stort set overses i de mange C. elegans-undersøgelser på tværs af næsten alle biovidenskabelige discipliner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af buffere og medier

  1. Forbered S-buffer ved at tilsætte 5,85 g NaCl, 1,123 g K 2 HPO 4,5,926 g KH2PO4 og 1 liter deioniseret H2O, til en kolbe og autoklave i 20 minutter ved 121 °C.
  2. Forbered et tyktflydende medium ved at tilsætte S-buffer indeholdende 1,2% (w / v) hydroxymethylcellulose (stoffet, der forårsager viskositet af mediet), 5 mg / ml kolesterol, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2 og 0,1% (v / v) acetone. Autoklave og rør det tyktflydende medium, indtil det er helt homogent.
    BEMÆRK: Dette kan tage flere timer. S-buffer kan også fremstilles direkte og tilsættes til det viskøse medium uden forudgående sterilisering.
  3. M9-buffer fremstilles ved at tilsætte 3 g KH 2 PO 4, 6 g NA2HPO4·2 H 2 O, 5 g NaCl og 1 L deioniseret H2O til en 1 L kolbe. Autoklave opløsningen, og efter afkøling tilsættes 1 ml 1 M MgSO 4 (123,24 g MgSO4·7H 2 O i 500 ml deioniseret H2O,filter steriliseret).
  4. Der fremstilles 10 % (v/v) Triton X-100 stamopløsning ved at blande 5 ml Triton X-100 med 45 ml M9-buffer. Filter-steriliser opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm filter.
  5. Forbered M9-buffer med Triton X-100 (M9-T) ved at tilsætte 2,5 ml af 10% (v/v) Triton X-100 stamopløsning til 1 liter M9-buffer efter autoklavering for at opnå 0,025% (v/v) M9-T.
  6. Forbered 30% (v / v) glycerol i S-buffer ved at blande 15 ml steril 100% glycerol og 35 ml steril S-buffer i et 50 ml rør.

2. Udarbejdelse af miljøprøver (figur 1)

  1. Indsaml miljøprøver som kompost eller rådne frugter, og læg hver prøve i en individuel plastikpose, rør eller anden ren beholder.
    BEMÆRK: For at tiltrække nematoder kan æbler placeres på kompost flere uger før prøveudtagningen.
  2. Spred stykker af miljøprøven jævnt i en tom, steril 9 cm petriskål.
    BEMÆRK: Prøver med højere henfaldsniveauer er mere tilbøjelige til at indeholde C. elegans. Eventuelt kan en petriskål fyldt med peptonefrit agarmedium (PFM) bruges til at øge kontrasten.
  3. Prøven dækkes omhyggeligt med ca. 20 ml sterilt tyktflydende medium.
    BEMÆRK: Nematoder flyder til overfladen inden for 1-2 timer. Det viskøse medium bremser ormens bevægelse og gør det lettere at prøve dem. Steril M9-buffer kan bruges som et alternativ, men ormbevægelsen vil være hurtigere.

Figure 1
Figur 1: Isolering af nematoder fra substrater. Substratprøver anbringes i tomme petriskåle og dækkes med tyktflydende medium for at skylle nematoder ud. Nematoder overføres til M9-T og vaskes gentagne gange for at fjerne bakterier udefra. Individuelle nematoder kan bruges til DNA-isolering, isolering af associerede bakterier eller placeres på agarplader for at dyrke ormepopulationer. Figur oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Isolering af Caenorhabditis nematoder (figur 1)

  1. Søg efter Caenorhabditis nematoder ved hjælp af et dissekerende mikroskop efter retningslinjerne i WormBook-kapitlet om isolering af C. elegans og relaterede nematoder af Barrière og Félix27.
    BEMÆRK: Caenorhabditis hermafroditter / hunner har en tarm af lysebrun farve (under transmitteret belysning). Desuden har tarmcellerne store cellekerner, som er synlige som hvide prikker. I modsætning hertil har andre nematodearter ofte en mørkebrun tarm og kan vise anteroposterior asymmetri i pigmentintensitet og normalt ingen synlige kerner. Vulva af voksne Caenorhabditis hermafroditter / hunner findes midt i dyret. Denne vulvalokalisering vises ikke altid af andre nematodetaxa. Caenorhabditis nematoder har to pharyngeal pærer, som begge er synlige med tilstrækkelig forstørrelse og transmitteret belysning og kontrast med mange andre nematode taxa. Caenorhabditis nematoder har en spids hale, mens nogle andre nematoder har en rund hale.
  2. Caenorhabditis nematoderne samles under et dissekeringsmikroskop i så lidt væske som muligt ved hjælp af en 20-100 μL pipette. Overfør de opsamlede nematoder direkte til 1-3 ml steril M9-T i en steril 3 cm petriskål til vask af ormene for at fjerne ikke-vedhæftede mikrober (trin 3.3) eller alternativt overføre individuelle orme til en plade med nematodevækstmedium (NGM) for at etablere en ormpopulation (trin 3.4).
  3. Vask nematoderne for at fjerne mikrober fra ydersiden af nematoden.
    BEMÆRK: Denne protokol beriger tarmbakterier, men eliminerer ikke helt bakterier, der klæber til ormens neglebånd.
    1. Inkuber nematoderne i 10-15 min i M9-T.
    2. Pipetter nematoderne i så lidt væske som muligt i 1-3 ml frisk M9-T i en ny steril 3 cm petriskål.
    3. Gentag inkubationen og overfør nematoderne til frisk M9-T to gange mere.
      BEMÆRK: Følgende trin kan udføres enten med individuelle orme eller med ormpopulationer. Ormene kan nu bruges til karakterisering af C. elegans og tilhørende mikrober samt isolering af bakterier (trin 4 og 5). Alternativt kan de overføres individuelt til NGM-plader for at etablere en ormepopulation (trin 3.4).
  4. For at opnå en ormpopulation pipetteres en individuel nematode til en NGM-plade.
    BEMÆRK: Kun hermafroditiske nematoder som C. elegans eller C . briggsae er i stand til at producere afkom fra enkelte orme. Enkelt orme af andre arter kan dog stadig producere afkom, hvis de allerede var parret.
    1. Naturligt isolerede nematoder indeholder normalt bakterier i deres tarm, som de kaster på NGM-pladerne, hvor disse bakterier vokser og er tilgængelige som mad til C. elegans. Tilsæt ikke separate fødevareorganismer som standard laboratoriefødevareorganismen, E. coli stamme OP50.
      BEMÆRK: Opdræt af orme på plader påvirker sammensætningen af det tilknyttede bakteriesamfund, men sammensætningen er stadig sammenlignelig med sammensætningen af de naturlige C. elegans isolater 6,7.
    2. Lad nematoderne sprede sig i op til 10 dage ved den passende temperatur (f.eks. 15-20 °C for tempererede steder). Disse nematoder fryses (trin 3.5), eller de anvendes til karakterisering af C. elegans og tilknyttede mikrober samt isolering af mikrober (trin 4 og 5).
  5. Frysning af nematoder til langtidsopbevaring
    1. Lad nematoderne stå på tallerkener, indtil fødevarebakterierne er forsvundet, og der er hovedsageligt små larvestadier på pladerne. Vask ormene af pladerne i 1,5 ml S-buffer.
    2. Bland 500 μL ormholdig S-buffer grundigt med 500 μL 30% (v/v) glycerol i S-buffer i et sterilt 2 ml rør. Frys rørene straks ved -80 ° C til langtidsopbevaring, ellers kan glycerol skade nematoderne.

4. Fremstilling af ormene til molekylær identifikation af C. elegans og mikrober

  1. For upartisk identifikation af nematodeassocierede mikrober fremstilles en 96-brøndplade med tre sterile 1 mm perler, 19,5 μL PCR-buffer og 0,5 μL proteinase K (20 mg / ml) pr. Brønd. Pipette et individ, vasket nematode til hver brønd, overfør så lidt væske som muligt.
  2. Ormpopulationer kan også bruges. Til dette vaskes ormene fra pladerne med M9-buffer og overføres ~ 300 μL ormholdig M9-buffer til 2 ml rør med 10-15 perler.
  3. Bryd nematoderne op ved hjælp af en perlehomogenisator (f.eks. perleslag i 3 minutter ved 30 Hz). Centrifuger pladen eller rørene kortvarigt for at få væsken til bunden (f.eks. i 10 s ved 8000 x g ved stuetemperatur [RT]).
  4. Identifikation af C. elegans
    1. Dna'et fra de enkelte nematoder isoleres ved at opvarme prøverne i en PCR-cykler i 1 time ved 50 °C og 15 minutter ved 95 °C. Dna fra ormepopulationer isoleres ved hjælp af en hvilken som helst isolationsmetode efter eget valg (eksempler på protokoller for forskellige isolationsmetoder ved hjælp af kommercielle sæt 7,9). Dna'et fryses ved -20 °C til langtidsopbevaring.
    2. Til identifikation af C. elegans skal du bruge DNA'et og primerparret nlp30-F (tabel 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') og nlp30-R (tabel 1, 5'-TACTTTCCCCATCCCTCT-3') i en PCR efter instruktioner fra en Taq-leverandør efter eget valg.
    3. Brug følgende PCR-betingelser: indledende denatureringstrin ved 95 °C i 2 minutter efterfulgt af 35 cyklusser på 95 °C i 45 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 1 minut og et sidste forlængelsestrin ved 72 °C i 5 min. C. elegans producerer et 154 bp PCR-produkt.
  5. Karakteriser de nematode-associerede bakterier via 16S amplicon-sekventering af V3-V4-regionen ved hjælp af det isolerede DNA.
    1. Forbered et 16S-bibliotek med de valgte 16S-primere, og følg protokollen for bibliotekets forberedelsessæt. En mulighed er at bruge primerne 341F (tabel 1, 5'-CCTACGGGGCWGCAG-3') og 806R (tabel 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'), der dækker V3-V4-regionen af 16S rRNA-genet, hvilket resulterer i sekvenser, der kan klassificeres med standarddatabaser med god opløsning7.
      BEMÆRK: Mængden af input-DNA er kritisk i dette trin. DNA erhvervet fra enkelte orme vil være meget mindre end det, der opnås fra ormpopulationer. For enkelte orme kan det være nødvendigt at øge mængden af input-DNA eller at øge mængden af PCR-cyklusser7.
    2. Biblioteker kan sekventeres på en sekventeringsplatform ved hjælp af et passende sekventeringssæt.
      BEMÆRK: Her bruges MiSeq-platformen med et passende MiSeq-reagenssæt. Reagenserne forbedres konstant og bør vælges til de nyeste standarder.

5. Isolering og dyrkning af nematodeassocierede bakterier (figur 2)

  1. For at isolere bakterier skal du forberede en 96-brøndplade med tre sterile 1 mm perler, 20 μL M9-buffer pr. Brønd og pipettere en individuel, vasket nematode til hver brønd og overføre så lidt væske som muligt.
    BEMÆRK: Alternativt kan ormepopulationer vaskes fra pladerne med M9-buffer og ~ 300 μL ormholdig M9-buffer kan overføres til 2 ml rør med 10-15 perler. I alle tilfælde skal ormene komme fra en kultur, der blev identificeret som C. elegans ved hjælp af trin 4.1-4.4.
  2. Bryd nematoderne op ved hjælp af en perlehomogenisator (f.eks. perleslag i 3 minutter ved 30 Hz). Centrifuger pladen eller rørene kort for at få væsken til bunden (f.eks. i 10 s ved 8000 x g ved RT).
    BEMÆRK: Brugen af denne metode førte til isolering af bakterielle taxa svarende til dem, der blev afsløret af 16S rDNA amplicon-sekventering7, hvilket tyder på, at den beskrevne perleslag efterlader de fleste bakterieceller intakte.
  3. Opsamling supernatanten, fortynd den serielt kl. 1:10, og plade op til 100 μL på 9 cm agarplader.
    1. For at sikre, at de fleste bakterier kan dyrkes, skal du bruge en række alternative medier med forskellige næringsstofsammensætninger, herunder fortyndet trypticase sojaagar (TSA, 1:10 fortynding), MacConkey agar, Sabouraud glucose agar, kartoffel dextrose agar eller gær pepton dextrose agar.
  4. Pladerne inkuberes ved prøvetagningsstedets gennemsnitlige temperaturforhold (f.eks. temperaturer mellem 15-20 °C for tempererede steder) i 24-48 timer.
  5. Brug standard tre-streak teknikken og en steril loop for at opnå rene bakteriekulturer (figur 2).
    1. Vælg en enkelt koloni fra en plade ved hjælp af en steril løkke eller tandstikker, og stribe den ud på en ny agarplade, der indeholder det samme agarmedium som brugt til rensning. Sørg for kun at bruge ca. 1/3 af pladen.
    2. Brug enten en ny steril løkke eller steriliser en genanvendelig løkke og træk den gennem den første stribe for at skabe en anden stribe på en anden 1/3 af den samme plade.
    3. Gentag dette trin ved at trække en steril løkke gennem den anden stribe.
    4. Inkuber pladen under de samme vækstbetingelser, der anvendes til isolering. Denne teknik skal resultere i, at enkeltkolonier vokser i området med den tredje stribe.
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at gentage rensningstrin flere gange, da naturlige isolater har tendens til at danne biofilm og / eller aggregater.
  6. De rene kolonier dyrkes i et flydende medium (af samme type som agarmediet) ved hjælp af samme temperatur og væksttid som ovenfor (trin 5.4)
  7. Forbered bakterielagre ved at tilsætte 300 μL af bakteriekulturen til 200 μL 86% (v / v) glycerol (i det respektive vækstmedium, f.eks. TSB) og pipette op og ned for at blande korrekt. Alternativt fremstilles DMSO-lagre ved at blande 50 μL bakteriekultur med 50 μL 7% (v/v) DMSO. Frys ved -80 °C til langtidsopbevaring.
  8. Karakterisering af bakterier ved hjælp af sekventering af det fulde 16S ribosomale RNA-gen
    1. Ekstrahers bakterielt DNA fra rene flydende kulturer ved hjælp af en passende teknik (f.eks. Et DNA-ekstraktionssæt; erfaringsmæssigt fungerer en CTAB-baseret ekstraktionsprotokol meget godt22).
    2. Forstærk 16S rRNA-genet ved hjælp af primerne 27F (tabel 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') og 1495R (tabel 1, 5'-CTACGGCTACCTTTTTACGA -3')28 og følgende PCR-betingelser: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) og en endelig forlængelsesperiode ved 72 °C, 5 min.
    3. For at erhverve de fulde sekvenser skal du desuden bruge to interne sekventeringsprimere, såsom 701F (tabel 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') og 785R (tabel 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
Figur 2: Artsidentifikation og isolering af individuelle bakterier. Individuelle nematoder brydes op ved hjælp af en perlehomogenisator, og DNA isoleres til artsbestemmelse via PCR eller sekventering. Alternativt fortyndes det brudte nematodemateriale serielt og belægges på vækstmediumplader. Plader inkuberes, indtil bakteriekolonier vises, og enkeltkolonier stribes til nye plader for at opnå rene kulturer. Enkeltkolonier af de rene kulturer anvendes til dyrkning af flydende bakteriekulturer til fremstilling af bakteriestammer til langtidsopbevaring ved -80 °C. Figur oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Nematoden C. elegans findes ofte i nedbrydende frugter, såsom æbler, og også kompostprøver. I Nordtyskland findes C. elegans såvel som congeneriske arter (især C. remanei, men også C. briggsae) hovedsageligt fra september til2. november. Nematoderne findes oftest i nedbrydende plantemateriale, især rådne frugter som æbler eller pærer, og også kompost, især materiale, der viser en høj nedbrydningskvalitet. Frugt- og kompostprøverne kan tages ind i laboratoriet (figur 3A, B), fordeles i petriskåle (figur 3C, D) og derefter nedsænkes i et flydende eller tyktflydende medium for at tvinge ormene til at forlade substratmaterialet og svømme til mediets overflade (figur 3E, F). Derefter kan ormene opsamles, overføres til agarplader eller mikrocentrifugerør, og artens identitet bestemmes ved hjælp af diagnostiske PCR'er 2,6,7,22.

Figure 3
Figur 3: Forberedelse af æbler til isolering af nematoder. (A,B) Nematoder kan isoleres fra miljøprøver som kompost eller rådne frugter og desuden tiltrækkes ved at placere æbler på kompost. (C,D) Prøverne deles, og små stykker placeres i en petriskål. (E,F) Viskøs medium tilsættes til prøverne, hvilket normalt fører til nematoder, der forlader substratmaterialet og svømmer til overfladen af mediet. Klik her for at se en større version af denne figur.

PCR ved anvendelse af C. elegans specifikke primere nlp30-F og nlp30-R resulterer i et PCR-produkt med en længde på 154 bp for C. elegans og intet produkt for andre nematoder (figur 4). For at bekræfte PCR's vellykkede ydeevne skal DNA fra en laboratoriestamme som N2 køres som positiv kontrol samtidig med DNA'et fra de isolerede nematoder. Små mængder biologisk materiale, såsom små larvestadier, kan resultere i svage PCR-bånd (figur 4A). Synligheden af PCR-båndene kan forbedres ved at bruge mere DNA i PCR (bemærk, at dette vil minimere mængden af DNA, der er tilbage til bakteriel 16S rDNA-amplicon-sekventering, f.eks. 2 μL DNA i stedet for 1 μL), ved at påføre en større mængde af PCR-produktet på gelen (f.eks. 10-15 μL), eller ved at øge antallet af PCR-cyklusser. Sammenlignet med enkelte orme giver ormpopulationer bestående af mindst 50 orme normalt en større mængde DNA, og båndene i elektroforesegelen er tydeligt synlige (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: PCR-produkt af C. elegans-specifik PCR. (A,B) De C. elegans-specifikke primere nlp30-F og nlp30-R producerer et PCR-produkt med en længde på 154 bp. Som et eksempel blev PCR'er udført på (A) enkeltorme og (B) ormepopulationer (f.eks. 300-500 individer), alle isoleret med den beskrevne protokol fra rådnende plantemateriale fra komposten i Botanisk Have i Kiel, Tyskland. (A) DNA fra enkelte orme og navnlig fra små larvestadier resulterer ofte i svage PCR-bånd. (B) DNA isoleret fra ormepopulationer (f.eks. 300-500 individer) resulterer i klarere bånd. DNA fra C. elegans N2 blev brugt som positiv kontrol (+), ingen skabelon blev brugt som negativ kontrol (-). Udstrygningerne under PCR-bånd er gelartefakter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mikroberne, der er forbundet med C. elegans, kan isoleres fra orme og også de ormholdige substratprøver. Mikrobeisolering følger generelle mikrobiologiske standarder, herunder isolering af rene kulturer fra agarplader, deres vækst i flydende medier og deres efterfølgende karakterisering (f.eks. Ved hjælp af sekvenserne af 16S ribosomalt RNA-genet for bakterier). Det er afgørende, at mikroberne isoleres som rene enkeltkolonier fra plader ved hjælp af standard mikrobiologiske procedurer (figur 5). Dette er vigtigt, fordi nogle af de C. elegans-associerede bakterier kan danne biofilm og / eller let aggregere, hvilket resulterer i kulturer med flere arter (figur 5C, D). Renheden af de isolerede bakteriekulturer kan bekræftes gennem sekvenserne af 16S rRNA-genet, som det gøres for tidligere isolerede C. elegans-associerede mikrober 6,7. De opnåede mikrober kan efterfølgende anvendes i forsøg med C. elegans.

Figure 5
Figur 5: Bakterieisolater på agarplader. Individuelle bakterieisolater er stribet ud på agarplader, i dette tilfælde tryptiske sojaagar (TSA) plader, der som eksempler viser et isolat af (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens og et eksempel med flere bakteriearter, vist som en (C) oversigt over hele pladen og (D) forstørrelse af en del af denne plade, hvor forskellige kolonityper er synlige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Liste over primere, der er brugt i denne undersøgelse Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nematoden Caenorhabditis elegans er en af de mest intensivt studerede modelorganismer inden for biologisk forskning. Det blev introduceret af Sydney Brenner i 1960'erne, oprindeligt for at forstå nervesystemets udvikling og funktion29. Siden da er C. elegans blevet en stærk model til at studere grundlæggende processer på tværs af alle biologiske discipliner, herunder adfærdsbiologi, neurobiologi, aldring, evolutionær biologi, cellebiologi, udviklingsbiologi og immunologi. Dens succes er baseret på en unik kombination af fordelagtige egenskaber, herunder en kort generationstid på ca. 3 dage, let dyrkning, gennemsigtig krop (tillader effektiv fænotypning), overlevelse af frysning, effektiv sterilisering og udviklingssynkronisering og også effektive metoder til genetisk manipulation ved mutagenese, CRISPR-Cas eller RNAi. I dag studeres C. elegans i ca. 1.500 laboratorier verden over. Da Sydney Brenner først etablerede C. elegans som et modelsystem i laboratoriet, dyrkede han bakterivornematoden på den gramnegative bakterie Escherichia coli OP50 som fødekilde. Lige siden er C. elegans blevet opretholdt i monoxenisk kultur på E. coli OP50 i laboratorier over hele verden29. Desuden synkroniseres eller de-forurenes C. elegans-populationer sædvanligvis ved en blegningsprocedure, der kun overleves af sterile æg og ingen tilknyttet mikrobe. Det er således let at generere sterile dyr, der derefter kan udsættes for individuelle bakterier under stærkt kontrollerede forhold. Som et resultat af disse standardiserede C. elegans laboratorievedligeholdelsesprotokoller blev næsten alle undersøgelser af C. elegans biologi imidlertid udført i mangel af dets naturligt associerede bakterier. Faktisk blev oplysninger om mangfoldigheden af naturligt associerede mikroorganismer først offentliggjort i 2016 4,5,6, og den nøjagtige mangfoldighed af associerede mikrober er stadig ikke fuldt ud udforsket.

De beskrevne metoder vil bidrage til yderligere at karakterisere mangfoldigheden af mikrober, der er forbundet med C. elegans i naturen. Disse mikrober er sandsynligvis vigtige determinanter for nematodens livshistorie og bør derfor være en væsentlig ressource for det fremtidige arbejde med denne orm. De beskrevne metoder er en opdateret version af de eneste tidligere offentliggjorte metoder til isolering af mikrober fra naturlige C. elegans-prøver indsamlet direkte fra marken 6,7. Protokollen udnytter det faktum, at C. elegans beboer nedbrydende plantemateriale i naturen. Sådant rådnende materiale er rigt på mikrober, der tjener som mad til C. elegans og sandsynligvis vil opfylde andre funktioner, såsom immunbeskyttelse (dvs. beskyttelse mod patogener)5,6,11,13,14. Det første vigtige skridt er således at opnå egnede substrater til ormisolering. Egnethed kan afhænge af årstiden; i Nordtyskland findes C. elegans primært fra september til2. november. Dette er det tidspunkt, hvor frugter som æbler eller pærer bliver tilgængelige og begynder at rådne på jorden. Det nøjagtige tidspunkt vil sandsynligvis variere mellem geografiske regioner23,24,25,30. Ethvert plantemateriale synes egnet til C. elegans, så længe det viser en høj grad af nedbrydning og dermed bærer et rigt mikrobielt samfund - bortset fra materiale domineret af svampe, som ofte er patogene for C. elegans1. Desuden er C. elegans normalt særlig almindelig, når den generelle luftfugtighed ikke er for lav2. Til dato mangler systematisk information om, hvorvidt Caenorhabditis nematoder varierer i overflod i plantemateriale fra industrielt versus økologisk landbrug eller overflade versus dybere lag af detritus eller afhængighed af regn eller ej.

Når prøverne er indsamlet og overført til laboratoriet, skal orme "lokkes" ud af deres substrater. Dette er opnået med et par forskellige tilgange, for eksempel ved ormekstraktion gennem Baermann-tragte31 eller placering af prøver på en agarplade indeholdende E. coli-laboratoriemaden som tiltrækningsmiddel i midten27. Efter vores erfaring er protokollen beskrevet her generelt hurtigere og mere effektiv. Det er baseret på ideen om, at substratprøverne er nedsænket i en flydende eller viskøs opløsning, som effektivt tvinger ormene ud af substratet og op til væskens overflade, hvorfra de let kan opsamles. Mediets viskositet er ikke absolut nødvendig, men det bremser ormenes bevægelse og kan dermed gøre det lettere at samle dem. Den effektive opsamling af orme lettes, når væsken tilsættes omhyggeligt til substratet og derved undgår opløselighed af humøse stoffer, som kan mørkere væsken og kan gøre det vanskeligt at se nematoderne.

Den næste udfordring er at identificere C. elegans. Nogle morfologiske træk kan hjælpe med at skelne Caneorhabditis orme fra andre nematoder27, men er utilstrækkelige til præcis artsidentifikation. Rottende plantemateriale indeholder ofte andre lignende nematoder, herunder congeneriske arter, såsom C. briggsae eller C. remanei 2,6,23,25, som er umulige at skelne ved første øjekast. Derfor kan C. elegans bedst og mest pålideligt identificeres ved hjælp af diagnostisk PCR ved hjælp af artsspecifikke primere 2,6,7, som beskrevet i protokollen. I denne sammenhæng kan det være nyttigt at etablere en voksende population af de isolerede naturlige C. elegans i laboratoriet, for eksempel på standard NGM-plader. De naturlige C. eleganer medbringer normalt tilknyttede bakterier, som skæres på NGM-pladerne, hvor bakterierne normalt vokser og efterfølgende tjener som mad til ormene 6,7. Selvom den nøjagtige sammensætning af de associerede mikrober ændres under C. elegans proliferation på plader, er den stadig sammenlignelig med den af umiddelbart karakteriserede naturlige nematodeprøver 6,7 og er således et nyttigt kompromis, der tillader isolering af både C. elegans og de tilhørende mikrober.

Når C. elegans er identificeret med succes, kan nematoderne eller de tilhørende substratprøver anvendes til isolering og karakterisering af de associerede mikrober. For at sikre, at mikroberne virkelig er forbundet med C. elegans i naturen, er det af største betydning at undgå forureninger på tværs af alle trin i protokollerne. Indsamling af kompost- og frugtprøver i marken skal udføres med særlig omhu af forskeren ved hjælp af steriliseret materiale. Al behandling af materiale i laboratoriet skal sikre et højt hygiejneniveau og igen steriliseret plastvarer og buffere. For at reducere kontamineringsrisikoen bør alt laboratoriearbejde ideelt set udføres i et separat laboratorierum, der udelukkende er dedikeret til isolering af mikroberne. Som et alternativ skal alt arbejde med åbne plader, rør eller andre beholdere udføres i et laminært flowskab. For at vurdere kontamineringsrisikoen bør passende kontrolprøver (f.eks. uden prøver eller uden orme) behandles parallelt. Desuden kan en række forskellige medier bruges til at sikre, at alle forskellige typer bakterier med deres forskellige vækstkrav kan dyrkes og isoleres. Ikke desto mindre viste tidligere arbejde, at alle hidtil isolerede bakterier, der er forbundet med naturlige C. elegansisolater , let vokser på NGM- og TSA-plader. Det kan således være tilstrækkeligt at fokusere på disse medier.

De isolerede og karakteriserede mikrober vil bidrage til en forbedret forståelse af C. elegans naturhistorie. Endnu vigtigere er det til dato ikke godt forstået, hvordan C. elegans reagerer på dets naturligt associerede mikrober, hvilke molekylære processer der er involveret, og hvilke funktioner der formidler ormens interaktion med dets mikrobielle associerede. En af de vigtigste undtagelser er Walhout-gruppens omfattende arbejde om samspillet mellem C. elegans og Comamonas DA 1877. Det afslørede vitamin B12 som en central metabolit leveret af bakterien, som påvirker ormens genekspression, fertilitet, levetid og udvikling15,16,17. Walhout-gruppen viste yderligere, at vitamin B12-effekten på fertilitet og udvikling afhænger af methionin / S-Adenosylmethionin-cyklussen og påvirkes af flere transkriptionsfaktorer, såsom den nukleare hormonreceptor NHR-2315,16,17. Desuden bidrager bakterielt vitamin B12 til nedbrydningen af den potentielt giftige kortkædede fedtsyrepropionatsyre, som i mangel af vitamin B12 kan kompenseres gennem metabolisk netværksomlægning, tilsyneladende gennem produktion af 3-hydroxypropionat16,32. Et andet eksempel er den neuromodulerende virkning af Providencia, opdaget af Sengupta-laboratoriet, hvor bakteriel tyramin omdannes af C. elegans tyramin β-hydroxylase til blæksprutte, som efterfølgende påvirker ormens adfærd gennem dets interaktion med OCTR-1 octopaminreceptoren i specifikke sensoriske neuroner18. Endnu et eksempel er immunbeskyttelse, som leveres af forskellige bakterier, især dem af slægten Pseudomonas. Dette sker enten gennem produktion af antimikrobielle forbindelser eller gennem en indirekte effekt, muligvis via aktivering af specifikke værtsresponser 6,11,14. Yderligere mikrober og især brugen af naturligt associerede mikrobielle samfund vil bidrage til at opnå en mere realistisk forståelse af biologien i denne model nematode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi erklærer, at vi ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkender økonomisk støtte fra den tyske videnskabsfond (projekt A1.1 og A1.2 fra Collaborative Research Center 1182 om metaorganismers oprindelse og funktion). Vi takker medlemmerne af Schulenburg-laboratoriet for deres råd og støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

Biologi udgave 186 Caenorhabditis elegans værtsmikrobiota-interaktioner æble kompost Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Isolering og karakterisering af den naturlige mikrobiota af modellen Nematode <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter