मॉडल नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस के प्राकृतिक माइक्रोबायोटा का अलगाव और लक्षण वर्णन

Summary

केनोरहाब्डिस एलिगेंस जीव विज्ञान में मुख्य मॉडल प्रजातियों में से एक है, फिर भी लगभग सभी शोध इसके स्वाभाविक रूप से जुड़े रोगाणुओं की अनुपस्थिति में किए जाते हैं। यहां वर्णित विधियां भविष्य के कार्यात्मक सी एलिगेंस अनुसंधान के आधार के रूप में संबंधित रोगाणुओं की विविधता की हमारी समझ को बेहतर बनाने में मदद करेंगी।

Abstract

निमेटोड केनोरहाबिटिस एलिगेंस प्रकृति में सूक्ष्मजीवों की एक बड़ी विविधता के साथ बातचीत करता है। सामान्य तौर पर, सी एलिगेंस आमतौर पर सड़े हुए पौधों के पदार्थ में पाया जाता है, विशेष रूप से सेब जैसे सड़े हुए फल या खाद के ढेर पर। यह कुछ अकशेरुकी मेजबानों जैसे स्लग्स और वुडलिस से भी जुड़ा हुआ है। ये आवास रोगाणुओं में समृद्ध हैं, जो सी एलिगेंस के लिए भोजन के रूप में काम करते हैं और जो लगातार नेमाटोड आंत को उपनिवेशित कर सकते हैं। आज तक, आवासों और भौगोलिक स्थानों में देशी सी एलिगेंस माइक्रोबायोटा की सटीक विविधता और स्थिरता पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। यहां, हम प्रकृति से सी एलिगेंस को अलग करने और कीड़े के माइक्रोबायोटा को चिह्नित करने के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। नेमाटोड को खाद सामग्री, सड़ने वाले सेब, स्लग्स से आसानी से अलग किया जा सकता है, या सेब को खाद के ढेर पर रखकर आकर्षित किया जा सकता है। उत्तरी गोलार्ध में सी एलिगेंस खोजने का मुख्य समय सितंबर से नवंबर तक है। कीड़े को बफर समाधान में सब्सट्रेट को डुबोकर एकत्रित सब्सट्रेट सामग्री से धोया जा सकता है, इसके बाद नेमाटोड का संग्रह और बाद के विश्लेषण के लिए नेमाटोड विकास माध्यम या पीसीआर बफर पर उनका स्थानांतरण होता है। हम आगे बताते हैं कि नमूनों का उपयोग कीड़े से जुड़े सूक्ष्मजीवों को अलग करने और शुद्ध करने और माइक्रोबायोटा समुदाय संरचना के 16 एस राइबोसोमल आरएनए विश्लेषण के लिए कीड़े को संसाधित करने के लिए कैसे किया जा सकता है। कुल मिलाकर, वर्णित विधियां आवासों और भौगोलिक स्थानों में सी एलिगेंस माइक्रोबायोटा के लक्षण वर्णन पर नए शोध को प्रोत्साहित कर सकती हैं, जिससे भविष्य के कार्यात्मक अनुसंधान के आधार के रूप में नेमाटोड के माइक्रोबायोटा की विविधता और स्थिरता की व्यापक समझ प्राप्त करने में मदद मिलती है।

Introduction

प्रकृति में, सी एलिगेंस आमतौर पर सड़े हुए पौधों के पदार्थ में पाया जाता है, विशेष रूप से सेब जैसे सड़े हुए फल या खाद के ढेर^पर। यह कुछ अकशेरुकी मेजबानों जैसे स्लग्स और वुडलिस ^2,3 के साथ भी जुड़ा हुआ ^है। ये आवास रोगाणुओं में समृद्ध हैं, जो न केवल कीड़े के लिए भोजन के रूप में काम करते हैं, बल्कि इसके साथ स्थिर संबंध भी बना सकते हैं। स्वाभाविक रूप से जुड़े सूक्ष्मजीवों की विविधता पर जानकारी केवल 2016 ^4,5,6 में प्रकाशित ^हुई थी। तब से, इन और केवल कुछ और हालिया अध्ययनों से पता चला है कि सी एलिगेंस विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया और कवक से जुड़ा हुआ है, जिसमें आमतौर पर जीनस स्यूडोमोनास, एंटरोबैक्टर, ओक्रोबैक्ट्रम, एरविनिया, कोमामोनास, ग्लूकोनोबैक्टर और कई अन्य ^6,7,8 के बैक्टीरिया शामिल हैं। कई संबंधित बैक्टीरिया कृमि आंत को स्थिर रूप से उपनिवेशित कर सकते हैं, हालांकि सभी 6,9,10,11,12 नहीं। एलिगेंस जीव विज्ञान की हमारी समझ के लिए वे महत्वपूर्ण महत्व के होने की संभावना है क्योंकि वे पोषण प्रदान कर सकते हैं, रोगजनकों और संभवतः अन्य तनावों से रक्षा कर सकते हैं, और प्रजनन दर, विकास या व्यवहार प्रतिक्रियाओं जैसे केंद्रीय जीवन-इतिहास लक्षणों को प्रभावित कर सकते हैं।

एक उदाहरण के रूप में, जेनेरा स्यूडोमोनास, ओक्रोबैक्ट्रम और एंटरोबैक्टर या ग्लूकोनोबैक्टर के स्वाभाविक रूप से जुड़े आइसोलेट्स रोगज़नक़ संक्रमण से कीड़े की रक्षा कर सकते हैं और अलग-अलग तरीकों से मार सकते हैं 5,6,11,13,14। जीनस कोमामोनास का एक विशिष्ट अलगाव निमेटोड आहार प्रतिक्रिया, विकास, जीवनकाल और प्रजनन क्षमता ^15,16,17 को प्रभावित करता ^है। प्रोवेन्सिया बैक्टीरिया न्यूरोमॉड्यूलेटर टायरामाइन का उत्पादन करते हैं और इस तरह मेजबान तंत्रिका तंत्र गतिविधि को संशोधित करते हैं और परिणामस्वरूप व्यवहार प्रतिक्रियाएं¹⁸. विभिन्न प्राकृतिक रूप से जुड़े बैक्टीरिया का एक सेट जनसंख्या वृद्धि दर, प्रजनन क्षमता और व्यवहार प्रतिक्रियाओं^को प्रभावित करने के लिए प्रदर्शित किया गया था 5,6,9,11,19।

आज तक, आवासों और भौगोलिक स्थानों में देशी सी एलिगेंस माइक्रोबायोटा की सटीक विविधता और स्थिरता को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, और इसके पर्यावरण से कीड़े और रोगाणुओं के बीच आगे के संबंधों को उजागर किया जाना बाकी है। पिछले कई अध्ययनों में कुछ मिट्टी के वातावरण, प्राकृतिक सी एलिगेंस आवासों, या मेसोकोसम प्रयोगों (यानी, प्रयोगशाला-आधारित वातावरण जो प्राकृतिक आवासों को फिर से बनाते हैं) से अलग किए गए जीवाणु उपभेदों का उपयोग किया गया था^। भले ही इन अध्ययनों ने विशिष्ट नेमाटोड लक्षणों (जैसे, नेमाटोड चयापचय²¹) पर रोगाणुओं के प्रभाव में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त की, प्रकृति में सी एलिगेंस जीव विज्ञान के लिए इन इंटरैक्शन की प्रासंगिकता स्पष्ट नहीं है। इसलिए, यह पांडुलिपि सी एलिगेंस को प्रकृति से सीधे अलग करने और बाद में एकल कीड़े और कीड़े के समूहों दोनों से स्वाभाविक रूप से जुड़े रोगाणुओं को अलग करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करती है। वर्णित विधियां प्राकृतिक सी एलिगेंस और इसके मूल माइक्रोबायोटा ^2,6,7 के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए पहले उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का एक अद्यतन और बेहतर संस्करण हैं। यह देखते हुए कि सी एलिगेंस व्यापक रूप से दुनिया भर में पौधों के पदार्थ को विघटित करने में पाया जाता है (विशेष रूप से सड़ने वाले फलों, समशीतोष्ण क्षेत्रों और शरद ऋतु में) 1,2,22,23,24,25, इस प्रोटोकॉल को किसी भी प्रयोगशाला द्वारा लागू किया जा सकता है जब भी सी एलिगेंस से संबंधित रुचि होती है। स्वाभाविक रूप से जुड़े रोगाणुओं के लक्षण और इस प्रकार एक अधिक स्वाभाविक रूप से प्रासंगिक संदर्भ। उत्तरार्द्ध नेमाटोड के जीव विज्ञान की पूर्ण समझ के लिए निर्णायक है क्योंकि यह अन्य मेजबान प्रणालियों की विविधता से जाना जाता है कि संबंधित माइक्रोबायोटा विविध जीवन इतिहास विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है²⁶, एक पहलू जो वर्तमान में लगभग सभी जीवन विज्ञान विषयों में सी एलिगेंस अध्ययनों की भीड़ में काफी हद तक उपेक्षित है।

Protocol

1. बफर और मीडिया की तैयारी

1. 5.85 ग्राम एनएसीएल, 1.123_{ग्राम के 2}एचपीओ₄, 5.926 ग्राम केएच₂पीओ₄, और 1 एल विआयनीकृत एच 2 ओ को फ्लास्क और ऑटोक्लेव में₁₂₁डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए जोड़कर एस-बफर तैयार करें।
2. 1.2% (डब्ल्यू / वी) हाइड्रॉक्सीमेथिलसेल्यूलोज (माध्यम की चिपचिपाहट पैदा करने वाला पदार्थ), 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल, 1 एमएम एमजीएसओ₄, 1 एमएम सीएसीएल₂, और 0.1% (वी / वी) एसीटोन युक्त एस-बफर जोड़कर एक चिपचिपा माध्यम तैयार करें। चिपचिपे माध्यम को तब तक ऑटोक्लेव करें और हिलाएं जब तक कि यह पूरी तरह से सजातीय न हो जाए।
   नोट: इसमें कई घंटे लग सकते हैं। इसके अलावा, एस-बफर को सीधे तैयार किया जा सकता है और पूर्व नसबंदी के बिना चिपचिपे माध्यम में जोड़ा जा सकता है।
3. 3 ग्राम केएच 2 पीओ 4, एनए_{2एचपीओ 4.2} एच₂ओ, 5 ग्राम एनएसीएल, और 1 एल विआयनीकृत एच₂ओको 1 एल फ्लास्क में जोड़कर एम 9-बफर तैयार करें। घोल को स्वचालित करें, और ठंडा होने के बाद, 1 M MgSO₄ का 1 mL जोड़ें (123.24 ग्राम MgSO_{4.7H 2}O 500 mL विआयनीकृत H 2 O में, फ़िल्टर_{निष्फल})।
4. 45 एमएल एम 9-बफर के साथ 5 एमएल ट्राइटन एक्स -100 को मिलाकर 10% (वी / वी) ट्राइटन एक्स -100 स्टॉक समाधान तैयार करें। 0.2 μm फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें।
5. 0.025% (v/v) M9-T प्राप्त करने के लिए ऑटोक्लेविंग के बाद M9-बफर के 1 L में 10% (v/v) ट्राइटन X-100 स्टॉक समाधान के 2.5 mL को जोड़कर ट्राइटन X-100 (M9-T) के साथ M9-बफर तैयार करें।
6. 50 एमएल ट्यूब में 15 एमएल बाँझ 100% ग्लिसरॉल और 35 एमएल बाँझ एस-बफर को मिलाकर एस-बफर में 30% (वी / वी) ग्लिसरॉल तैयार करें।

2. पर्यावरण के नमूने तैयार करना (चित्रा 1)

1. खाद या सड़े हुए फलों जैसे पर्यावरणीय नमूने एकत्र करें और प्रत्येक नमूने को एक व्यक्तिगत प्लास्टिक बैग, ट्यूब या अन्य साफ कंटेनर में रखें।
   नोट: नेमाटोड को आकर्षित करने के लिए, सेब को नमूना लेने से कई सप्ताह पहले खाद पर रखा जा सकता है।
2. एक खाली, बाँझ, 9 सेमी पेट्री डिश में समान रूप से पर्यावरणीय नमूने के टुकड़े फैलाएं।
   नोट: क्षय के उच्च स्तर वाले नमूनों में सी एलिगेंस होने की अधिक संभावना है। वैकल्पिक रूप से, पेप्टोन-मुक्त आगर माध्यम (पीएफएम) से भरे पेट्री डिश का उपयोग कंट्रास्ट बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
3. नमूने को लगभग 20 एमएल बाँझ चिपचिपे माध्यम के साथ सावधानीपूर्वक कवर करें।
   नोट: नेमाटोड 1-2 घंटे के भीतर सतह पर तैरते हैं। चिपचिपा माध्यम कीड़े के आंदोलन को धीमा कर देता है और उन्हें नमूना लेना आसान बनाता है। बाँझ एम 9-बफर को विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, कृमि आंदोलन तेज होगा।

चित्रा 1: सब्सट्रेट से नेमाटोड का अलगाव। सब्सट्रेट नमूने खाली पेट्री व्यंजनों में रखे जाते हैं और नेमाटोड को बाहर निकालने के लिए चिपचिपे माध्यम से कवर किए जाते हैं। नेमाटोड को एम 9-टी में स्थानांतरित किया जाता है और बाहर से बैक्टीरिया को हटाने के लिए बार-बार धोया जाता है। व्यक्तिगत नेमाटोड का उपयोग डीएनए अलगाव, संबंधित बैक्टीरिया के अलगाव के लिए किया जा सकता है, या कृमि आबादी को कल्चर करने के लिए आगर प्लेटों पर रखा जा सकता है। चित्र BioRender.com के साथ बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. केनोरहाब्डिस नेमाटोड का अलगाव (चित्रा 1)

1. बैरिएरे और फेलिक्स²⁷ द्वारा सी एलिगेंस और संबंधित नेमाटोड के अलगाव पर वर्मबुक अध्याय में प्रस्तुत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके केनोरहाब्डिस नेमाटोड की खोज करें।
   नोट: केनोरहाब्डिटिस हेर्मैफ्रोडाइट्स / महिलाओं में हल्के भूरे रंग (संचारित रोशनी के तहत) की आंत होती है। इसके अलावा, आंत कोशिकाओं में बड़े सेल नाभिक होते हैं, जो सफेद बिंदुओं के रूप में दिखाई देते हैं। इसके विपरीत, अन्य नेमाटोड प्रजातियों में अक्सर गहरे भूरे रंग की आंत होती है और वर्णक तीव्रता में एंटेरोपोस्टेरियर विषमता दिखा सकती है और आमतौर पर कोई दिखाई देने वाला नाभिक नहीं होता है। वयस्क केनोरहाब्डिस हेर्मैफ्रोडाइट्स / मादाओं का वल्वा जानवर के बीच में पाया जाता है। यह वल्वा स्थानीयकरण हमेशा अन्य नेमाटोड टैक्सा द्वारा नहीं दिखाया जाता है। केनोरहाब्डिस नेमाटोड में दो ग्रसनी बल्ब होते हैं, जो दोनों पर्याप्त आवर्धन और संचारित रोशनी के साथ दिखाई देते हैं और कई अन्य नेमाटोड टैक्सा के विपरीत होते हैं। केनोरहाब्डिस नेमाटोड में एक नुकीली पूंछ होती है, जबकि कुछ अन्य नेमाटोड में एक गोल पूंछ होती है।
2. 20-100 μL पिपेट का उपयोग करके जितना संभव हो उतना कम तरल में विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत केनोरहाब्डिस नेमाटोड एकत्र करें। एकत्रित नेमाटोड को सीधे बाँझ 3 सेमी पेट्री डिश में बाँझ 3 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें ताकि कीड़े को धोया जा सके ताकि गैर-संलग्न रोगाणुओं (चरण 3.3) को हटाया जा सके या, वैकल्पिक रूप से, कृमि आबादी स्थापित करने के लिए नेमाटोड विकास माध्यम (एनजीएम) के साथ एक प्लेट पर अलग-अलग कीड़े स्थानांतरित करें (चरण 3.4)।
3. नेमाटोड के बाहर से रोगाणुओं को हटाने के लिए नेमाटोड को धो लें।
   नोट: यह प्रोटोकॉल आंत के बैक्टीरिया के लिए समृद्ध करता है लेकिन कृमि छल्ली से चिपके बैक्टीरिया को पूरी तरह से खत्म नहीं करता है।
   1. एम 9-टी में 10-15 मिनट के लिए नेमाटोड को इनक्यूबेट करें।
   2. पिपेटोड को जितना संभव हो उतना कम तरल में एक नए बाँझ 3 सेमी पेट्री डिश में 1-3 एमएल ताजा एम 9-टी में रखें।
   3. इनक्यूबेशन को दोहराएं और नेमाटोड को ताजा एम 9-टी में दो बार स्थानांतरित करें।
      नोट: निम्नलिखित चरण या तो व्यक्तिगत कीड़े के साथ या कृमि आबादी के साथ किए जा सकते हैं। कीड़े का उपयोग अब सी एलिगेंस और संबंधित रोगाणुओं के लक्षण वर्णन के साथ-साथ बैक्टीरिया के अलगाव (चरण 4 और 5) के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उन्हें कीड़े की आबादी स्थापित करने के लिए एनजीएम प्लेटों में व्यक्तिगत रूप से स्थानांतरित किया जा सकता है (चरण 3.4)।
4. कृमि आबादी प्राप्त करने के लिए, एक व्यक्तिगत नेमाटोड को एनजीएम प्लेट में बदल दें।
   नोट: केवल हर्मेथ्रोडिटिक नेमाटोड जैसे सी एलिगेंस या सी ब्रिग्से एकल कीड़े से संतान पैदा करने में सक्षम हैं। हालांकि, अन्य प्रजातियों के एकल कीड़े अभी भी संतान पैदा कर सकते हैं यदि वे पहले से ही जुड़े हुए थे।
   1. स्वाभाविक रूप से पृथक नेमाटोड में आमतौर पर उनके आंत में बैक्टीरिया होते हैं, जिन्हें वे एनजीएम प्लेटों पर बहाते हैं, जहां ये बैक्टीरिया बढ़ते हैं और सी एलिगेंस के लिए भोजन के रूप में उपलब्ध होते हैं। मानक प्रयोगशाला खाद्य जीव, ई कोलाई स्ट्रेन ओपी 50 जैसे अलग-अलग खाद्य जीवों को न जोड़ें।
      नोट: प्लेटों पर कीड़े पालन संबंधित जीवाणु समुदाय की संरचना को प्रभावित करता है, फिर भी संरचना अभी भी प्राकृतिक सी एलिगेंस आइसोलेट्स ^6,7 के बराबर है।
   2. नेमाटोड को उचित तापमान पर 10 दिनों तक प्रसार करने की अनुमति दें (उदाहरण के लिए, समशीतोष्ण स्थानों के लिए 15-20 डिग्री सेल्सियस)। इन नेमाटोड (चरण 3.5) को फ्रीज करें या सी एलिगेंस और संबंधित रोगाणुओं के लक्षण वर्णन के साथ-साथ रोगाणुओं के अलगाव (चरण 4 और 5) के लिए उनका उपयोग करें।
5. लंबे समय तक भंडारण के लिए नेमाटोड को फ्रीज करना
   1. नेमाटोड को प्लेटों पर छोड़ दें जब तक कि खाद्य बैक्टीरिया गायब न हो जाएं, और प्लेटों पर मुख्य रूप से छोटे लार्वा चरण होते हैं। 1.5 एमएल एस-बफर में प्लेटों से कीड़े धो लें।
   2. एक बाँझ 2 एमएल ट्यूब में एस-बफर में 30% (वी / वी) ग्लिसरॉल के 500 μL के साथ 500 μL की कीड़ा युक्त एस-बफर को अच्छी तरह से मिलाएं। लंबे समय तक भंडारण के लिए ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत फ्रीज करें, अन्यथा ग्लिसरॉल नेमाटोड को नुकसान पहुंचा सकता है।

4. सी एलिगेंस और रोगाणुओं की आणविक पहचान के लिए कीड़े की तैयारी

1. नेमाटोड से जुड़े रोगाणुओं की निष्पक्ष पहचान के लिए, तीन बाँझ 1 मिमी मोती, पीसीआर-बफर के 19.5 μL, और प्रोटीनेज K (20 मिलीग्राम / एमएल) प्रति कुएं के 0.5 μL के साथ एक 96-वेल प्लेट तैयार करें। पिपेट एक व्यक्ति, धोया हुआ निमेटोड प्रत्येक कुएं में, जितना संभव हो उतना कम तरल स्थानांतरित करता है।
2. कृमि आबादी का भी उपयोग किया जा सकता है। इसके लिए, प्लेटों से कीड़े को एम 9-बफर के साथ धोएं और 10-15 मोतियों के साथ 2 एमएल ट्यूबों में कीड़े युक्त एम 9-बफर के ~ 300 μL स्थानांतरित करें।
3. एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके नेमाटोड को तोड़ें (उदाहरण के लिए, 30 हर्ट्ज पर 3 मिनट के लिए मोती-पिटाई)। तरल को नीचे लाने के लिए प्लेट या ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें (उदाहरण के लिए, कमरे के तापमान [आरटी] पर 8000 x g पर 10 सेकंड के लिए)।
4. सी एलिगेंस की पहचान
   1. 50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए और 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीसीआर साइक्लर में नमूने को गर्म करके अलग-अलग नेमाटोड के डीएनए को अलग करें। पसंद की किसी भी अलगाव विधि का उपयोग करके कृमि आबादी के डीएनए को अलग करें (उदाहरण वाणिज्यिक किट ^7,9 का उपयोग करके विभिन्न अलगाव विधियों के प्रोटोकॉल)। लंबे समय तक भंडारण के लिए डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
   2. सी एलिगेंस की पहचान के लिए, पसंद के टैक आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन करते हुए, पीसीआर में डीएनए और प्राइमर जोड़ी एनएलपी 30-एफ (तालिका 1, 5'-ACACATACAACTCA-3') और nlp30-R (तालिका 1, 5'-TACTTTCCCCCCATCCGTATC-3') का उपयोग करें।
   3. निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक विकृतीकरण चरण, इसके बाद 45 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम बढ़ाव चरण।
5. पृथक डीएनए का उपयोग करके, वी 3-वी 4 क्षेत्र के 16 एस एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के माध्यम से निमेटोड से जुड़े बैक्टीरिया को चिह्नित करें।
   1. पसंद के 16 एस प्राइमरों के साथ एक 16 एस लाइब्रेरी तैयार करें और लाइब्रेरी तैयारी किट प्रोटोकॉल का पालन करें। एक विकल्प 16 एस आरआरएनए जीन के वी 3-वी 4 क्षेत्र को कवर करने वाले प्राइमर 341 एफ (तालिका 1, 5'-सीसीटीएसीजीडब्ल्यूजीडब्ल्यूसीएजीसीजी -3') और 806 आर (तालिका 1, 5'-जीएसीटीएसीएचवीजीटीएटीसीटीसीटीसीसी -3') का उपयोग करना है, जिसके परिणामस्वरूप अनुक्रम^होते हैं जिन्हें अच्छे रिज़ॉल्यूशन 7 के साथ मानक डेटाबेस के साथ वर्गीकृत किया जा सकता है।
      नोट: इस चरण में इनपुट डीएनए की मात्रा महत्वपूर्ण है। एकल कीड़े से प्राप्त डीएनए कृमि आबादी से प्राप्त डीएनए की तुलना में बहुत कम होने जा रहा है। एकल कीड़े के लिए, इनपुट डीएनए की मात्रा बढ़ाना या पीसीआर चक्र 7 की मात्रा बढ़ाना आवश्यक हो सकता^है।
   2. पुस्तकालयों को एक उपयुक्त अनुक्रमण किट का उपयोग करके अनुक्रमण मंच पर अनुक्रमित किया जा सकता है।
      नोट: यहां, मिसेक प्लेटफॉर्म का उपयोग एक उपयुक्त मिसेक अभिकर्मक किट के साथ किया जाता है। अभिकर्मकों में लगातार सुधार किया जाता है और उन्हें नवीनतम मानकों के लिए चुना जाना चाहिए।

5. निमेटोड से जुड़े बैक्टीरिया का अलगाव और खेती (चित्रा 2)

1. बैक्टीरिया को अलग करने के लिए, तीन बाँझ 1 मिमी मोतियों, प्रति कुएं के 20 μL M9-बफर के साथ एक 96-वेल प्लेट तैयार करें, और प्रत्येक कुएं में एक व्यक्ति, धोए गए नेमाटोड को पिपेट करें, जितना संभव हो उतना कम तरल स्थानांतरित करें।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, कृमि आबादी को एम 9-बफर के साथ प्लेटों से धोया जा सकता है और ~ 300 μL की कीड़ा युक्त M9-बफर को 10-15 मोतियों के साथ 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित किया जा सकता है। सभी मामलों में, कीड़े को एक संस्कृति से आना चाहिए जिसे चरण 4.1-4.4 का उपयोग करके सी एलिगेंस के रूप में पहचाना गया था।
2. एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके नेमाटोड को तोड़ें (उदाहरण के लिए, 30 हर्ट्ज पर 3 मिनट के लिए मोती-पिटाई)। तरल को नीचे लाने के लिए प्लेट या ट्यूबों को संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज करें (उदाहरण के लिए, आरटी पर 8000 x g पर 10 सेकंड के लिए)।
   नोट: इस विधि के उपयोग से 16 एस आरडीएनए एम्प्लिकॉन अनुक्रमण⁷ द्वारा प्रकट किए गए जीवाणु टैक्सा के अलगाव का कारण बना, यह सुझाव देते हुए कि वर्णित मोती-धड़कन अधिकांश जीवाणु कोशिकाओं को बरकरार रखता है।
3. सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें, इसे 1:10 पर क्रमिक रूप से पतला करें, और 9 सेमी आगर प्लेटों पर 100 μL तक प्लेट करें।
   1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश बैक्टीरिया की खेती की जा सकती है, विभिन्न पोषक तत्वों की रचनाओं के साथ विभिन्न प्रकार के वैकल्पिक मीडिया का उपयोग करें, जिसमें पतला ट्रिप्टिकेस सोया एगर (टीएसए, 1: 10 तनुकरण), मैककॉन्की आगर, सबौरॉड ग्लूकोज एगर, आलू डेक्सट्रोज एगर, या खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोज एगर शामिल हैं।
4. 24-48 घंटे के लिए नमूना स्थान की औसत तापमान स्थितियों (उदाहरण के लिए, समशीतोष्ण स्थानों के लिए 15-20 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान) पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
5. शुद्ध जीवाणु संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए मानक तीन-लकीर तकनीक और एक बाँझ लूप का उपयोग करें (चित्रा 2)।
   1. बाँझ लूप या टूथपिक का उपयोग करके एक प्लेट से एक एकल कॉलोनी चुनें और इसे एक नई आगर प्लेट पर रखें जिसमें शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले समान आगर माध्यम हो। प्लेट के केवल 1/3 का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
   2. या तो एक नए बाँझ लूप का उपयोग करें या पुन: प्रयोज्य लूप को निष्फल करें और उसी प्लेट के एक और 1/3 पर दूसरी लकीर बनाने के लिए इसे पहली लकीर के माध्यम से खींचें।
   3. दूसरी लकीर के माध्यम से बाँझ लूप खींचकर इस चरण को दोहराएं।
   4. अलगाव के लिए उपयोग की जाने वाली समान विकास स्थितियों में प्लेट को इनक्यूबेट करें। इस तकनीक के परिणामस्वरूप तीसरी लकीर के क्षेत्र में एकल उपनिवेश बढ़ने चाहिए।
      नोट: शुद्धिकरण चरण को कई बार दोहराना आवश्यक हो सकता है क्योंकि प्राकृतिक आइसोलेट्स बायोफिल्म और / या समुच्चय बनाते हैं।
6. शुद्ध कालोनियों को ऊपर दिए गए समान तापमान और विकास समय का उपयोग करके तरल माध्यम (आगर माध्यम के समान प्रकार) में उगाएं (चरण 5.4)
7. बैक्टीरिया कल्चर के 300 μL को 86% (v / v) ग्लिसरॉल (संबंधित विकास माध्यम में, उदाहरण के लिए, TSB) के 200 μL में जोड़कर बैक्टीरिया स्टॉक तैयार करें और ठीक से मिश्रण करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे करें। वैकल्पिक रूप से, 7% (v/v) DMSO के 50 μL के साथ 50 μL बैक्टीरियल कल्चर को मिलाकर DMSO स्टॉक तैयार करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
8. पूर्ण 16 एस राइबोसोमल आरएनए जीन के अनुक्रमण का उपयोग करके बैक्टीरिया की विशेषता
   1. एक उपयुक्त तकनीक का उपयोग करके शुद्ध तरल संस्कृतियों से जीवाणु डीएनए निकालें (उदाहरण के लिए, एक डीएनए निष्कर्षण किट; अनुभव से, एक सीटीएबी-आधारित निष्कर्षण प्रोटोकॉल बहुत अच्छी तरह से काम करता है²²)।
   2. प्राइमरों 27एफ (तालिका 1, 5'-GAGAGTTTTTGATCCTGGCTCAG-3') और 1495R (तालिका 1, 5'-CTACGGCTTTTTGTACGA -3') ²⁸ और निम्नलिखित पीसीआर स्थितियों का उपयोग करके 16S RRNA जीन को बढ़ाएं: 95 °C, 2 मिनट, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) और 72 °C, 100 पर अंतिम विस्तार अवधि।
   3. पूर्ण अनुक्रम प्राप्त करने के लिए, दो आंतरिक अनुक्रमण प्राइमरों का भी उपयोग करें, जैसे कि 701एफ (तालिका 1, 5'-जीटीजीटीएजी-3') और 785 आर (तालिका 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3') ⁶।

चित्रा 2: प्रजातियों की पहचान और व्यक्तिगत बैक्टीरिया का अलगाव। अलग-अलग नेमाटोड को एक मोती होमोजेनाइज़र का उपयोग करके तोड़ दिया जाता है, और डीएनए को पीसीआर या अनुक्रमण के माध्यम से प्रजातियों के निर्धारण के लिए अलग किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, टूटे हुए नेमाटोड सामग्री को क्रमिक रूप से पतला किया जाता है और विकास माध्यम प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। प्लेटों को तब तक इनक्यूबेट किया जाता है जब तक कि बैक्टीरिया कॉलोनियां दिखाई न दें, और एकल कॉलोनियों को शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए नई प्लेटों में खींचा जाता है। शुद्ध संस्कृतियों की एकल कॉलोनियों का उपयोग -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए बैक्टीरिया के स्टॉक की तैयारी के लिए तरल जीवाणु संस्कृतियों को विकसित करने के लिए किया जाता है। चित्र BioRender.com के साथ बनाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

एलिगेंस अक्सर फलों, जैसे सेब, और खाद के नमूनों को विघटित करने में पाया जाता है। उत्तरी जर्मनी में, सी एलिगेंस के साथ-साथ कंजेनेरिक प्रजातियां (विशेष रूप से सी रेमानेई लेकिन सी ब्रिग्से) मुख्य रूप से सितंबर से² नवंबर तक पाई जाती हैं। नेमाटोड आमतौर पर पौधों के पदार्थ को विघटित करने में पाए जाते हैं, विशेष रूप से सड़ने वाले फल जैसे सेब या नाशपाती, और खाद भी, विशेष रूप से सामग्री जो अपघटन का एक उच्च ग्रेड दिखाती है। फल और खाद के नमूनों को प्रयोगशाला (चित्रा 3 ए, बी) में ले जाया जा सकता है, पेट्री व्यंजनों (चित्रा 3 सी, डी) में वितरित किया जा सकता है, और बाद में एक तरल या चिपचिपा माध्यम में डुबोया जा सकता है ताकि कीड़े सब्सट्रेट सामग्री छोड़ सकें और माध्यम की सतह पर तैर सकें (चित्रा 3 ई, एफ)। इसके बाद, कीड़े को एकत्र किया जा सकता है, आगर प्लेटों या माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों पर स्थानांतरित किया जा सकता है, और नैदानिक पीसीआर ^2,6,7,22 का उपयोग करके प्रजातियों की पहचान निर्धारित की जा सकती ^है।

चित्र 3: नेमाटोड के अलगाव के लिए सेब की तैयारी। (A, B) नेमाटोड को पर्यावरणीय नमूनों जैसे खाद या सड़े हुए फलों से अलग किया जा सकता है और सेब को खाद पर रखकर भी आकर्षित किया जा सकता है। (C, D) नमूने विभाजित हैं, और छोटे टुकड़ों को पेट्री डिश में रखा जाता है। (E, F) नमूनों में चिपचिपा माध्यम जोड़ा जाता है, जो आमतौर पर नेमाटोड को सब्सट्रेट सामग्री छोड़ने और माध्यम की सतह पर तैरने की ओर जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सी एलिगेंस विशिष्ट प्राइमर एनएलपी 30-एफ और एनएलपी 30-आर का उपयोग करके पीसीआर के परिणामस्वरूप सी एलिगेंस के लिए 154 बीपी लंबाई का पीसीआर उत्पाद होता है और अन्य नेमाटोड के लिए कोई उत्पाद नहीं होता है (चित्रा 4)। पीसीआर के सफल प्रदर्शन की पुष्टि करने के लिए, एन 2 जैसे प्रयोगशाला तनाव के डीएनए को पृथक नेमाटोड के डीएनए के साथ समवर्ती रूप से सकारात्मक नियंत्रण के रूप में चलाया जाना चाहिए। जैविक सामग्री की छोटी मात्रा, जैसे कि छोटे लार्वा चरण, कमजोर पीसीआर बैंड (चित्रा 4 ए) का परिणाम हो सकता है। पीसीआर बैंड की दृश्यता को पीसीआर में अधिक डीएनए का उपयोग करके बेहतर बनाया जा सकता है (ध्यान दें कि यह बैक्टीरिया 16 एस आरडीएनए एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के लिए छोड़े गए डीएनए की मात्रा को कम करेगा, उदाहरण के लिए, 1 μL के बजाय डीएनए के 2 μL), जेल में पीसीआर उत्पाद की एक बड़ी मात्रा लागू करके (उदाहरण के लिए, 10-15 μL), या पीसीआर चक्रों की संख्या में वृद्धि करके। एकल कीड़े की तुलना में, कम से कम 50 कीड़े से युक्त कृमि आबादी आमतौर पर बड़ी मात्रा में डीएनए उत्पन्न करती है, और वैद्युतकणसंचलन जेल में बैंड स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं (चित्रा 4 बी)।

चित्रा 4: सी एलिगेंस-विशिष्ट पीसीआर का पीसीआर उत्पाद। (ए, बी) एलिगेंस-विशिष्ट प्राइमर एनएलपी 30-एफ और एनएलपी 30-आर 154 बीपी लंबाई के पीसीआर उत्पाद का उत्पादन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, पीसीआर (ए) एकल कीड़े और (बी) कृमि आबादी (जैसे, 300-500 व्यक्तियों) पर किए गए थे, सभी को जर्मनी के कील में बॉटनिकल गार्डन की खाद से सड़ने वाले पौधे के पदार्थ से वर्णित प्रोटोकॉल के साथ अलग किया गया था। (ए) एकल कीड़े के डीएनए और विशेष रूप से, छोटे लार्वा चरणों के परिणामस्वरूप अक्सर कमजोर पीसीआर बैंड होते हैं। (बी) कृमि आबादी (जैसे, 300-500 व्यक्तियों) से अलग डीएनए के परिणामस्वरूप स्पष्ट बैंड होते हैं। एलिगेंस एन 2 के डीएनए का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण (+) के रूप में किया गया था, किसी भी टेम्पलेट का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण (-) के रूप में नहीं किया गया था। पीसीआर बैंड के नीचे स्मीयर जेल कलाकृतियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रोगाणु, जो सी एलिगेंस से जुड़े होते हैं, को कीड़े और कृमि युक्त सब्सट्रेट नमूनों से अलग किया जा सकता है। माइक्रोब अलगाव सामान्य सूक्ष्म जीव विज्ञान मानकों का पालन करता है, जिसमें एगर प्लेटों से शुद्ध संस्कृतियों का अलगाव, तरल मीडिया में उनकी वृद्धि और उनके बाद के लक्षण वर्णन (उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया के लिए 16 एस राइबोसोमल आरएनए जीन के अनुक्रमों का उपयोग करना) शामिल हैं। यह महत्वपूर्ण है कि मानक सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रक्रियाओं (चित्रा 5) का उपयोग करके रोगाणुओं को प्लेटों से शुद्ध एकल उपनिवेशों के रूप में अलग किया जाए। एलिगेंस से जुड़े कुछ बैक्टीरिया बायोफिल्म बना सकते हैं और / या आसानी से एकत्र हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बहु-प्रजाति संस्कृतियां (चित्रा 5 सी, डी) हो सकती हैं। पृथक जीवाणु संस्कृतियों की शुद्धता की पुष्टि 16 एस आरआरएनए जीन के अनुक्रमों के माध्यम से की जा सकती है, जैसा कि पहले से पृथक सी एलिगेंस से जुड़े रोगाणुओं ^6,7 के लिए किया ^गया था। प्राप्त रोगाणुओं को बाद में सी एलिगेंस के साथ प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है।

चित्रा 5: एगर प्लेटों पर बैक्टीरियल आइसोलेट्स। इस मामले में, ट्राइप्टिक सोया एगर (टीएसए) प्लेटों पर अलग-अलग बैक्टीरियल आइसोलेट्स को लकीरकिया जाता है, उदाहरण के रूप में (ए) स्यूडोमोनास लुरिडा, (बी) स्यूडोमोनास फ्लोरेसेंस का एक अलग-थलग, और कई जीवाणु प्रजातियों के साथ एक उदाहरण दिखाया जाता है, जिसे (सी) पूरी प्लेट के अवलोकन और (डी) इस प्लेट के एक खंड के आवर्धन के रूप में दिखाया गया है, जिसमें अलग-अलग कॉलोनी प्रकार दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की सूची कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

निमेटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस जैविक अनुसंधान में सबसे गहन अध्ययन किए गए मॉडल जीवों में से एक है। यह 1960 के दशक में सिडनी ब्रेनर द्वारा पेश किया गया था, मूल रूप से तंत्रिका तंत्र^के विकास और कार्य को समझने के लिए। एलिगेंस व्यवहार जीव विज्ञान, न्यूरोबायोलॉजी, एजिंग, विकासवादी जीव विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान, विकासात्मक जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी सहित सभी जैविक विषयों में मौलिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बन गया है। इसकी सफलता लाभप्रद गुणों के एक अद्वितीय संयोजन पर आधारित है, जिसमें लगभग 3 दिनों का एक छोटी पीढ़ी का समय, खेती में आसानी, पारदर्शी शरीर (कुशल फेनोटाइपिंग की अनुमति), ठंड का अस्तित्व, कुशल नसबंदी और विकासात्मक सिंक्रनाइज़ेशन, और म्यूटेनेसिस, सीआरआईएसपीआर-सीएएस, या आरएनएआई द्वारा आनुवंशिक हेरफेर के लिए कुशल तरीके भी शामिल हैं। आज, सी एलिगेंस का अध्ययन दुनिया भर में लगभग 1,500 प्रयोगशालाओं में किया जाता है। जब सिडनी ब्रेनर ने पहली बार प्रयोगशाला में एक मॉडल प्रणाली के रूप में सी एलिगेंस की स्थापना की, तो उन्होंने खाद्य स्रोत के रूप में ग्राम-नकारात्मक जीवाणु एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 पर बैक्टीरिवोर नेमाटोड विकसित किया। तब से, सी एलिगेंस को दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में ई कोलाई ओपी 50 पर मोनोक्सेनिक संस्कृति में बनाए रखा गया^है। एलिगेंस की आबादी आदतन एक ब्लीचिंग प्रक्रिया द्वारा सिंक्रनाइज़ या डी-दूषित होती है जो केवल बाँझ अंडे और कोई संबद्ध माइक्रोब द्वारा जीवित रहती है। इस प्रकार बाँझ जानवरों को उत्पन्न करना आसान है जो तब अत्यधिक नियंत्रित परिस्थितियों में व्यक्तिगत बैक्टीरिया के संपर्क में आ सकते हैं। हालांकि, इन मानकीकृत सी एलिगेंस प्रयोगशाला रखरखाव प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप, सी एलिगेंस जीव विज्ञान पर लगभग सभी अध्ययन इसके स्वाभाविक रूप से जुड़े बैक्टीरिया की अनुपस्थिति में किए गए थे। वास्तव में, स्वाभाविक रूप से जुड़े सूक्ष्मजीवों की विविधता पर जानकारी केवल 2016 ^4,5,6 में प्रकाशित हुई थी, और संबंधित रोगाणुओं की सटीक विविधता अभी भी पूरी तरह से पता नहीं लगाई गई है।

वर्णित विधियां रोगाणुओं की विविधता को और अधिक चिह्नित करने में मदद करेंगी जो प्रकृति में सी एलिगेंस से जुड़े हैं। ये सूक्ष्मजीव नेमाटोड के जीवन इतिहास के महत्वपूर्ण निर्धारक हैं और इस प्रकार इस कीड़े के साथ भविष्य के काम के लिए एक आवश्यक संसाधन होना चाहिए। वर्णित विधियाँ क्षेत्र ^6,7 से सीधे एकत्र किए गए प्राकृतिक सी एलिगेंस नमूनों से रोगाणुओं को अलग करने के लिए पहले प्रकाशित एकमात्र तरीकों का एक अद्यतन संस्करण हैं। प्रोटोकॉल इस तथ्य का लाभ उठाता है कि सी एलिगेंस प्रकृति में विघटित पौधे के पदार्थ में निवास करता है। इस तरह की सड़ने वाली सामग्री रोगाणुओं में समृद्ध है, जो सी एलिगेंस के लिए भोजन के रूप में काम करते हैं और अन्य कार्यों को पूरा करने की संभावना रखते हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा सुरक्षा (यानी, रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षा) 5,6,11,13,14। इस प्रकार पहला महत्वपूर्ण कदम कृमि अलगाव के लिए उपयुक्त सब्सट्रेट प्राप्त करना है। उपयुक्तता वर्ष के समय पर निर्भर हो सकती है; उत्तरी जर्मनी में, सी एलिगेंस मुख्य रूप से सितंबर से² नवंबर तक पाया जाता है। यह वह समय होता है जब सेब या नाशपाती जैसे फल उपलब्ध हो जाते हैं और जमीन पर सड़ने लगते हैं। सटीक समय भौगोलिक क्षेत्रों 23,24,25,30 के बीच भिन्न होने की संभावना है। एलिगेंस के लिए कोई भी पौधे की सामग्री उपयुक्त दिखाई देती है, जब तक कि यह अपघटन की एक उच्च डिग्री दिखाती है और इस प्रकार कवक के प्रभुत्व वाली सामग्री को छोड़कर एक समृद्ध माइक्रोबियल समुदाय रखती है, जो अक्सर सी एलिगेंस¹ के लिए रोगजनक होते हैं। एलिगेंस आमतौर पर विशेष रूप से आम है जब सामान्य आर्द्रता^{बहुत कम नहीं} होती है। आज तक, व्यवस्थित जानकारी की कमी है कि क्या केनोरहाब्डिस नेमाटोड औद्योगिक बनाम जैविक खेती या सतह बनाम डेट्राइटस की गहरी परत या बारिश पर निर्भरता से पौधों की सामग्री में बहुतायत में भिन्न होते हैं या नहीं।

एक बार नमूने एकत्र करने और प्रयोगशाला में स्थानांतरित करने के बाद, कीड़े को अपने सब्सट्रेट्स से "लालच" करने की आवश्यकता होती है। यह कुछ अलग-अलग दृष्टिकोणों के साथ हासिल किया गया है, उदाहरण के लिए, बेयरमैन फ़नल³¹ के माध्यम से कीड़े निष्कर्षण या मध्य²⁷ में एक आकर्षण के रूप में ई कोलाई प्रयोगशाला भोजन युक्त एगर प्लेट पर नमूनों का प्लेसमेंट। हमारे अनुभव में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर तेज और अधिक कुशल है। यह इस विचार पर आधारित है कि सब्सट्रेट के नमूने एक तरल या चिपचिपे समाधान में डूबे हुए हैं, जो कुशलतापूर्वक कीड़े को सब्सट्रेट से बाहर और तरल की सतह तक मजबूर करता है, जहां से उन्हें आसानी से एकत्र किया जा सकता है। माध्यम की चिपचिपाहट बिल्कुल आवश्यक नहीं है, लेकिन यह कीड़े की गति को धीमा कर देता है और इस प्रकार उन्हें इकट्ठा करना आसान बना सकता है। कीड़े के कुशल संग्रह को सुविधाजनक बनाया जाता है जब तरल को सब्सट्रेट में सावधानीपूर्वक जोड़ा जाता है, जिससे किसी भी ह्यूमस पदार्थों के घुलनशीलता से बचा जा सकता है, जो तरल को काला कर सकता है और नेमाटोड को देखना मुश्किल बना सकता है।

अगली चुनौती सी एलिगेंस की पहचान करना है। कुछ रूपात्मक विशेषताएं अन्य नेमाटोड²⁷ से कैनोरहाब्डिस कीड़े को अलग करने में मदद कर सकती हैं, फिर भी सटीक प्रजातियों की पहचान के लिए अपर्याप्त हैं। सड़ने वाले पौधे के पदार्थ में अक्सर अन्य समान दिखने वाले नेमाटोड होते हैं, जिनमें कोंजेनेरिक प्रजातियां शामिल हैं, जैसे कि सी ब्रिग्से या सी रेमानी ^2,6,23,25, जिन्हें पहली नजर में भेद करना असंभव है। एलिगेंस को प्रोटोकॉल में वर्णित प्रजाति-विशिष्ट प्राइमर ^2,6,7 का उपयोग करके नैदानिक पीसीआर की मदद से सबसे अच्छा और सबसे मज़बूती से पहचाना जा सकता है। इस संदर्भ में, प्रयोगशाला में पृथक प्राकृतिक सी एलिगेंस की एक प्रसार आबादी स्थापित करना उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, मानक एनजीएम प्लेटों पर। एलिगेंस आमतौर पर संबंधित बैक्टीरिया को साथ लाते हैं, जो एनजीएम प्लेटों पर जड़े होते हैं, जहां बैक्टीरिया आमतौर पर बढ़ते हैं, बाद में कीड़े ^6,7 के लिए भोजन के रूप में कार्य करते हैं। यद्यपि प्लेटों पर सी एलिगेंस प्रसार के दौरान संबंधित रोगाणुओं की सटीक संरचना बदल जाती है, फिर भी यह तुरंत विशेषता वाले प्राकृतिक नेमाटोड नमूने ^6,7 के बराबर है, और इस प्रकार एक उपयोगी समझौता है जो सी एलिगेंस और संबंधित रोगाणुओं दोनों के अलगाव की अनुमति देता है।

एक बार सी एलिगेंस की सफलतापूर्वक पहचान हो जाने के बाद, नेमाटोड या संबंधित सब्सट्रेट नमूनों का उपयोग संबंधित रोगाणुओं के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि रोगाणु वास्तव में प्रकृति में सी एलिगेंस से जुड़े हैं, प्रोटोकॉल के सभी चरणों में संदूषण से बचने के लिए यह प्रमुख महत्व का है। क्षेत्र में खाद और फलों के नमूनों का संग्रह शोधकर्ता द्वारा विशेष देखभाल के साथ किया जाना चाहिए, निष्फल सामग्री का उपयोग करके। प्रयोगशाला में सामग्री के सभी प्रसंस्करण को उच्च स्तर की स्वच्छता सुनिश्चित करनी चाहिए और फिर से प्लास्टिक के बर्तन और बफर को निष्फल करना चाहिए। संदूषण जोखिम को कम करने के लिए, सभी प्रयोगशाला कार्य आदर्श रूप से एक अलग प्रयोगशाला कक्ष में किए जाने चाहिए, जो विशेष रूप से रोगाणुओं के अलगाव के लिए समर्पित है। एक विकल्प के रूप में, खुली प्लेटों, ट्यूबों या अन्य कंटेनरों के साथ सभी काम एक लामिनार प्रवाह कैबिनेट में किया जाना चाहिए। संदूषण जोखिम का आकलन करने के लिए, उचित नियंत्रण नमूने (जैसे, नमूने के बिना या कीड़े के बिना) समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, विभिन्न मीडिया की एक किस्म का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि उनकी विभिन्न विकास आवश्यकताओं के साथ सभी विभिन्न प्रकार के बैक्टीरिया की खेती और अलगाव किया जा सकता है। फिर भी, पिछले काम ने संकेत दिया कि अब तक सभी पृथक बैक्टीरिया, जो प्राकृतिक सी एलिगेंस आइसोलेट्स से जुड़े हैं, एनजीएम और टीएसए प्लेटों पर आसानी से बढ़ते हैं। इस प्रकार, इन मीडिया पर ध्यान केंद्रित करना पर्याप्त हो सकता है।

पृथक और विशेषता वाले रोगाणु सी एलिगेंस के प्राकृतिक इतिहास की बेहतर समझ में योगदान देंगे। इससे भी महत्वपूर्ण बात, आज तक, यह अच्छी तरह से समझा नहीं गया है कि सी एलिगेंस अपने स्वाभाविक रूप से जुड़े रोगाणुओं का जवाब कैसे देता है, कौन सी आणविक प्रक्रियाएं शामिल हैं, और कौन से कार्य अपने माइक्रोबियल सहयोगियों के साथ कीड़े की बातचीत को मध्यस्थ करते हैं। मुख्य अपवादों में से एक सी एलिगेंस और कोमामोनास डीए 1877 के बीच बातचीत पर वाल्होट समूह द्वारा व्यापक काम है। इसने जीवाणु द्वारा प्रदान किए गए एक केंद्रीय मेटाबोलाइट के रूप में विटामिन बी 12 का खुलासा किया, जो कृमि जीन अभिव्यक्ति, प्रजनन क्षमता, जीवनकाल और विकास ^15,16,17 को प्रभावित करता ^है। वाल्होट समूह ने आगे दिखाया कि प्रजनन क्षमता और विकास पर विटामिन बी 12 प्रभाव मेथिओनिन / एस-एडेनोसिलमेथियोनीन चक्र पर निर्भर करता है और कई प्रतिलेखन कारकों से प्रभावित होता है, जैसे कि परमाणु हार्मोन रिसेप्टर एनएचआर -23 15,16,17। इसके अलावा, बैक्टीरियल विटामिन बी 12 संभावित विषाक्त शॉर्ट-चेन फैटी एसिड प्रोपियोनेट एसिड के टूटने में योगदान देता है, जिसे विटामिन बी 12 की अनुपस्थिति में चयापचय नेटवर्क रीवायरिंग के माध्यम से क्षतिपूर्ति की जा सकती है, जाहिरा तौर पर 3-हाइड्रॉक्सीप्रोपियोनेट^16,32 के उत्पादन के माध्यम से। एक अलग उदाहरण सेनगुप्ता लैब द्वारा खोजा गया प्रोवेंसिया का न्यूरो-मॉड्यूलेटरी प्रभाव है, जहां बैक्टीरियल टायरामाइन को सी एलिगेंस टायरामाइन β-हाइड्रॉक्सिलेज द्वारा ऑक्टोपामाइन में परिवर्तित किया जाता है, जो बाद में विशिष्ट संवेदी न्यूरॉन्स¹⁸ में OCTR-1 ऑक्टोपामाइन रिसेप्टर के साथ अपनी बातचीत के माध्यम से कृमि व्यवहार को प्रभावित करता है। फिर भी एक और उदाहरण प्रतिरक्षा सुरक्षा है, जो विभिन्न बैक्टीरिया द्वारा प्रदान किया जाता है, विशेष रूप से जीनस स्यूडोमोनास के। यह या तो रोगाणुरोधी यौगिकों के उत्पादन के माध्यम से या अप्रत्यक्ष प्रभाव के माध्यम से होता है, संभवतः विशिष्ट मेजबान प्रतिक्रियाओं के सक्रियण के माध्यम से ^6,11,14। अतिरिक्त रोगाणुओं और विशेष रूप से प्राकृतिक रूप से जुड़े माइक्रोबियल समुदायों का उपयोग इस मॉडल नेमाटोड के जीव विज्ञान की अधिक यथार्थवादी समझ प्राप्त करने में मदद करेगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COMSOL	COMSOL		multiphysics simulation software