Eksperimentel kvantificering af interaktioner mellem lægemiddelleveringssystemer og celler in vitro: En vejledning til præklinisk nanomedicinsk evaluering

Summary

En arbejdsgang demonstreres for den absolutte kvantificering af lægemiddelbærer-celleinteraktioner ved hjælp af flowcytometri for at muliggøre bedre rationel evaluering af nye lægemiddelafgivelsessystemer. Denne arbejdsgang gælder for lægemiddelbærere af enhver art.

Abstract

En vigtig komponent i design af lægemiddelleveringssystemer vedrører, hvordan man forstærker eller dæmper interaktioner med specifikke celletyper. For eksempel kan en kemoterapeutisk funktionaliseres med et antistof for at forbedre bindingen til kræftceller ("målretning") eller funktionaliseres med polyethylenglycol for at hjælpe med at undgå immuncellegenkendelse ("stealth"). Selv på celleniveau er optimering af bindingen og optagelsen af en lægemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Det er således værdifuldt at adskille, hvor stærkt en ny transportør interagerer med en celle fra den funktionelle effektivitet af en transportørs last, når den er leveret til den celle.

For at fortsætte det kemoterapeutiske eksempel er "hvor godt det binder til en kræftcelle" et særskilt problem fra "hvor godt det dræber en kræftcelle". Kvantitative in vitro-assays for sidstnævnte er veletablerede og er normalt afhængige af måling af levedygtighed. Imidlertid er de fleste offentliggjorte undersøgelser af cellebærerinteraktioner kvalitative eller semikvantitative. Generelt er disse målinger afhængige af fluorescerende mærkning af bæreren og rapporterer følgelig interaktioner med celler i relative eller vilkårlige enheder. Dette arbejde kan imidlertid standardiseres og gøres absolut kvantitativt med et lille antal karakteriseringseksperimenter. En sådan absolut kvantificering er værdifuld, da den letter rationelle, inter- og intra-klasse sammenligninger af forskellige lægemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, vira, antistof-lægemiddelkonjugater, konstruerede terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.

Desuden er kvantificering en forudsætning for efterfølgende metaanalyser eller in silico-modelleringsmetoder . I denne artikel præsenteres videoguider samt et beslutningstræ for, hvordan man opnår in vitro-kvantificering for transportørlægemiddelleveringssystemer, der tager højde for forskelle i bærerstørrelse og mærkningsmodalitet. Derudover diskuteres yderligere overvejelser om kvantitativ vurdering af avancerede lægemiddelleveringssystemer. Dette er beregnet til at tjene som en værdifuld ressource til forbedring af rationel evaluering og design til den næste generation af medicin.

Introduction

Designet af lægemiddelleveringskonstruktioner, der udviser specifik, designet adfærd afhængigt af hvilken celletype de støder på, har tiltrukket betydelig forskningsinteresse. Potentielle lægemiddelleveringskonstruktioner eller "bærere" inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere samlinger, ekstracellulære vesikler, funktionaliserede bakterieceller eller modificerede vira. Alle disse kan udvise organ-, vævs- eller cellespecificitet på grund af fysiske egenskaber, overfladeegenskaber eller konstruerede kemiske funktionaliseringer såsom antistoffastgørelse ^1,2.

Et næsten allestedsnærværende skridt i in vitro-bærerevaluering er at inkubere celler med en suspension, der indeholder den lægemiddelbelastede bærer. Efter inkubation måles bærerens ydeevne via en funktionel aflæsning af lægemiddellastens ydeevne, for eksempel transfektionseffektivitet eller toksicitet. Funktionelle udlæsninger er nyttige, da de er et downstream-mål for bærereffektivitet. For mere komplekse lægemiddelleveringskonstruktioner er det imidlertid stadig vigtigere at bevæge sig ud over funktionelle udlæsninger og separat kvantificere graden af bærerinteraktion med cellen af interesse. Der er et par grunde til dette.

For det første er der stigende interesse for at opdage (og iterativt forbedre) "platform" -transportteknologier, som kan transportere en række forskellige laster. For eksempel kan lipidnanopartikler (LNP'er) designet til at indkapsle RNA udveksle en RNA-sekvens til en anden med få forbehold³. For iterativt at forbedre bærerteknologien er det således afgørende at kvantificere dens ydeevne uafhængigt af lastfunktionaliteten. For det andet er funktionelle udlæsninger muligvis ikke ligetil for lasten af interesse, hvilket kompromitterer evnen til hurtigt at gentage og evaluere bærerformuleringer. Mens man kunne udføre in vitro-optimering ved hjælp af en modellast med en ligetil funktionel udlæsning (for eksempel fluorescens), kan ændring af lasten ændre det biologiske respons på en bærer⁴ og kan således ikke give repræsentative resultater. For det tredje er mange bærere designet til at interagere med og blive optaget af en bestemt celletype. En sådan målretningsevne hos et luftfartsselskab kan og bør differentieres fra udførelsen af dets terapeutiske lastpostmålretning. For at fortsætte LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt potent, men hvis LNP ikke er i stand til at binde til cellen, internaliseres og frigive RNA'et, vil der ikke blive observeret nogen nedstrøms funktionel effekt. Dette kan være et problem, især for bærere, der er beregnet til at målrette mod svært transficerede celletyper, såsom T-celler⁵. Omvendt kunne en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer muligvis ikke. Et downstream-assay, der kun måler lastfunktionalitet, vil ikke være i stand til at skelne mellem disse to situationer, hvilket komplicerer udviklingen og optimeringen af transportørens lægemiddelleveringssystemer.

I dette arbejde diskuteres det, hvordan man absolut kvantificerer transportørforeningen . Association er et udtryk, der refererer til den eksperimentelt målte grad af interaktion mellem en bærer og en celle. Association skelner ikke mellem membranbinding og internalisering - en bærer kan være forbundet, fordi den er bundet til celleoverfladen, eller fordi cellen har internaliseret den. Association måles almindeligvis som en del af cellebærerinkubationseksperimenter. Historisk set er association blevet rapporteret enten i vilkårlige fluorescerende enheder (typisk "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "procentforening", målinger, hvis begrænsninger tidligere er blevet diskuteret⁶. Kort sagt er disse målinger ikke sammenlignelige mellem eksperimenter, laboratorier og lægemiddelbærere på grund af forskelle i eksperimentelle protokoller, flowcytometerindstillinger og mærkningsintensiteter for forskellige bærere. Der er gjort en indsats for at overvinde førstnævnte ved at kalibrere cytometeret og derved omdanne det relative mål for MFI til et absolut kvantitativt mål for fluorescens⁷. Denne metode tager imidlertid ikke højde for variationen i mærkningsintensiteten for forskellige bærere og tillader således ikke en rationel sammenligning af forskellige bærerpræstationer i en målcelle efter eget valg⁸.

Her demonstreres det, hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheder til den absolutte kvantitative metrik for "antallet af bærere pr. Celle" ved at udføre et lille antal yderligere karakteriseringseksperimenter. Hvis der ønskes en anden metrik af bærerkoncentration (f.eks. bærermasse pr. celle eller bærervolumen pr. celle), er det ligetil at konvertere fra bærere pr. celle, forudsat at bærerkarakterisering er udført. For korthed og for at undgå jargon bruges ordet "bærer" inden for dette arbejde til at henvise til det store udvalg af lægemiddelleveringskonstruktioner. Disse kvantificeringsteknikker er lige anvendelige, uanset om de anvendes på en nano-manipuleret guldpartikel eller en bio-manipuleret bakterie.

Nogle få fakta muliggør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheder til bærere pr. Celle. For det første er den målte fluorescensintensitet proportional med koncentrationen af en fluorafore⁹ (eller en fluorescerende mærket bærer), forudsat at fluorescensen er inden for instrumentets detektionsgrænser, og instrumenteringsindstillingerne er de samme. Hvis fluorescensen af en bærer og fluorescensen af en prøve er kendt, kan man således bestemme, hvor mange bærere der er til stede i den prøve, hvis alle målinger blev udført under de samme indstillinger og betingelser. Men især for mindre bærere er det muligvis ikke muligt at måle bærerfluorescens, celleautofluorescens og celle-associeret-med-bærere fluorescens på det samme instrument med de samme indstillinger. I dette tilfælde er der et andet krav om at gøre det muligt at konvertere mellem målt fluorescens på et instrument og målt fluorescens på et andet. For at gøre dette kan der etableres en standardkurve for fluoroforkoncentration for at måle fluorescensintensiteten på begge instrumenter ved at drage fordel af molekylerne af ækvivalent opløselig fluorkrom (MESF) standard⁹. Dette tillader derefter måling af bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling, der kan udføres på bærere af enhver størrelse eller egenskab. Når en sådan bulkkvantificering udføres på en bærersuspension af kendt koncentration, kan antallet af bærere pr. celle i en prøve igen beregnes.

Mens dette arbejde demonstrerer processen til måling af bærerforening (som bestemt ved målt fluorescensintensitet), kan en analog protokol udføres for andre målinger af cellebærerinteraktion (f.eks. En eksperimentel protokol, der differentierer internaliserede og membranbundne bærere). Derudover ville denne protokol stort set være den samme, hvis foreningen blev målt gennem et ikke-fluorescerende assay (for eksempel gennem massecytometri).

Protocol

1. Valg af den passende strøm

1. Følg beslutningstræet, der er beskrevet i figur 1 , for at bestemme den bedste arbejdsgang (strøm) (figur 2) for den anvendte eksperimentelle opsætning. Der henvises til diskussionen for yderligere kommentarer til dette valg af strøm.
2. Hvis du følger cytometerstrømmen, skal du fortsætte med trin 2.1.1-2.2.7. Hvis du følger Bulk Stream, skal du fortsætte med trin 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figur 1: Workstream beslutningstræ. Beslutningen om, hvilken Stream der skal bruges, afhænger primært af transportørens interessetype. Større bærere og bærere med høje spredningsegenskaber kan lettere detekteres individuelt på cytometre, hvilket gør dem egnede til kvantificering ved hjælp af cytometerstrømmen. Bulk Stream er velegnet til alle andre transportørtyper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Oversigt over arbejdsstrømme. Denne protokol er opdelt i to forskellige streams. Cytometerstrømmen bruger et følsomt cytometer til at tælle bærerne i suspension, måle deres individuelle fluorescens og derefter bestemme fluorescensen af celler inkuberet med bærere. Bulk Stream bruger ikke-cytometribaserede teknikker, såsom Nanoparticle Tracking Analysis, til at tælle transportørerne i suspension. Den enkelte bærerfluorescens kvantificeres derefter ved hjælp af en mikropladelæser eller et spektrofluorometer. Anvendelsen af flowcytometeret er derfor begrænset til måling af den endelige fluorescens af celler, der er inkuberet med bærere, en måling, der kan udføres på et bredere udvalg af cytometre, og som er uafhængig af den anvendte bærertype. Forkortelser: MESF = molekyler af ækvivalent opløselig fluorkrom; MFI = median fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Cytometerstrømmen

1. Tæller transportør
   BEMÆRK: Ethvert flowcytometer kan bruges til denne måling, forudsat at strømningshastigheden (μL/s) er kendt. Hvis strømningshastigheden er ukendt og ikke kan bestemmes, skal du ikke fortsætte med dette trin. Fortsæt i stedet med trin 3.1. Tælling af bærerne i suspension muliggør nøjagtig og reproducerbar bestemmelse af antallet af bærere inkuberet i hvert celleeksperiment.
   1. Opsæt cytometeret til at detektere bærere, både ved hjælp af en optisk spredningskanal (typisk sidespredning [SSC]) og fluorescens. Sørg for at justere tærsklen for at tillade detektion af transportørerne.
      BEMÆRK: Iteration gennem forskellige optiske spredningskanaler kan være påkrævet, hvis SSC ikke giver et klart signal (f.eks. forward scatter [FSC]).
   2. Kør en fortyndingsprøve for at kvantificere baggrundshændelsestællingen i både SSC- og fluorescerende kanaler.
      BEMÆRK: Ideelle baggrundshændelsestællinger er <100 begivenheder / er.
   3. Forbered bærerne til flowcytometri.
      1. Sørg for, at bærerne er godt suspenderet af hvirvel eller sonikering, afhængigt af det involverede bærersystem.
      2. Hvis det er muligt, skal du sikre dig, at bærerkoncentrationen er mellem 1.000 bærere/μL og 10.000 bærere/μL. Et begivenhedsantal på en til to størrelsesordener højere end baggrunden er en god start. Hvis størrelsesordenen af bærerkoncentrationen er ukendt, er en god start at forberede en 1:1.000 fortynding fra lageret. Brug de første resultater som feedback til at informere fremtidige prøvefortyndinger.
         BEMÆRK: En overskyet affjedring er generelt for koncentreret.
   4. Læg den første bærerprøve på cytometeret, og start optagelsen.
   5. Sammenlign hændelsestællinger som følge af både SSC- og fluorescenskanalerne; disse skal være omtrent lige (<10% forskel). Hvis ikke, skal du kontrollere cytometerindstillingerne, f.eks. fotomultiplierrør (PMT) indstillinger og laserintensitet for lysstofrøret. Alternativt kan du bruge andre metoder såsom konfokal mikroskopi til at validere, at den fluorescerende mærkning af bærerne er til stede og ensartet.
   6. Trin 2.1.3-2.1.5 gentages to eller flere gange med forskellige fortyndinger fra bestanden. Sørg for, at hændelsestællingen i hver prøve er mindst én størrelsesorden højere end baggrundshændelsestællingen.
   7. Det kontrolleres, at tre eller flere prøver viser en lineær tendens, dvs. at en fortynding af prøver to gange bør resultere i en tilsvarende dobbelt reduktion af den målte bærerkoncentration.
   8. Brug prøverne inden for det lineære område, tilsvarende fortyndingsfaktorer og den kendte cytometerstrømningshastighed til at beregne stambærerkoncentrationen i henhold til ligning (1):
      (1)
      hvor C er stambærerkoncentrationen i bærere/ml. Det anbefales at bruge hændelsestællingen afledt af optisk spredningsdetektion snarere end fluorescens.
2. Flowcytometriaflæsning af bærercelleeksperimentet, herunder bestemmelse af fluorescensintensitet pr. bærer
   BEMÆRK: Ideelt set vil fluorescerende intensitet pr. bærer blive bestemt så tæt som muligt på bærercelleeksperimentet. Dette er for at sikre, at de MFI'er, der opnås for individuelle bærere, kan sammenlignes direkte med MFI'erne for celler, der er forbundet med bærerne. I praksis vil et cytometer normalt generere lignende resultater, når det bruges på på hinanden følgende dage ved hjælp af de samme PMT-spændinger, men dette kan ikke garanteres.
   1. Design bærercelleeksperimentet. Den koncentration af bærere, der er bestemt i trin 2.1, anvendes til at administrere den ønskede dosis bærere.
   2. Indstil flowcytometeret til det endelige bærercelleeksperiment ved at bestemme optimale PMT-spændingsindstillinger i de relevante kanaler. Indstil tærsklerne for at tillade registrering af operatører.
   3. Bærerne køres i suspension for at bestemme fluorescensintensiteten pr. bærer under de aktuelle PMT-indstillinger.
   4. Hvis det er nødvendigt, skal du ændre cytometertærsklerne for at detektere cellerne og ikke bærerne.
   5. Kør en negativ kontrolprøve - celler, der ikke inkuberes med bærere - for at bestemme baggrundsfluorescensen (autofluorescens) af cellerne.
   6. Kør bærercelleprøverne for at bestemme fluorescensintensiteten pr. Celle. Denne fluorescens er en lineær kombination af cellulær autofluorescens og tilstedeværelsen af fluorescerende bærere.
   7. Beregn antallet af bærere pr. celle ved hjælp af følgende ligning (2):
      (2)
      hvor P_assoc er antallet af bærere tilknyttet pr. celle, _FI-celle er MFI'en for celler inkuberet med bærere, _FI-baggrund er MFI'en for celler, der ikke er inkuberet med bærere, og _FI-bærer er MFI'en for bærere i suspension.

3. Massestrømmen

1. Carrier counting: nanopartikel tracking analyse
   BEMÆRK: I bulkstrømmen er bærertælling et nødvendigt trin for at kvantificere den absolutte fluorescensintensitet pr. bærer (se trin 3.1.4). Derudover tillader tælling af bærerne i suspension nøjagtig og reproducerbar bestemmelse af antallet af bærere inkuberet i hvert celleeksperiment.
   1. Præparation
      1. Monter flowcellen på lasermodulet, og lås hele lasermodulet på plads inde i instrumentet.
      2. Langsomt (ikke hurtigere end 0,1 ml / s) skylles flowcellen med ~ 1 ml destilleret vand. Hvis der dannes bobler i flowcellen, trækkes suspensionen delvist tilbage for at flette boblen med luft-væske-grænsefladen, før du fortsætter.
      3. Start kameraet omtrent halvvejs gennem skylning; Sørg for at bekræfte, at bæreaffald vaskes ud. Vælg Capture for at åbne fanen Capture Settings , og klik på Start kamera.
      4. Tør systemet med 1 ml luft. Hvis der er synlige statiske bærere på skærmen, skal flowcellen rengøres i henhold til producentens anvisninger.
      5. Forbered transportørerne til nanopartikelsporingsanalyse ved at sikre, at transportørerne er godt suspenderet via hvirvel eller sonikering, afhængigt af det involverede transportsystem. Hvis størrelsesordenen af stamkoncentrationen er ukendt, fremstilles en fortynding på 1:100 fra stammen og de indledende resultater anvendes som feedback til at informere fremtidige prøvefortyndinger. Bærerne fortyndes i vand og ikke fosfatbufferet saltvand (PBS) for at forberede mindst ~0,6-1 ml af hver prøve med en bærerkoncentration på mellem 1 × 10⁷ bærestoffer/ml og 1 × 10⁹ bærestoffer/ml.
         BEMÆRK: En overskyet affjedring er generelt for koncentreret. Buffere og salte kan generere høj baggrundsstøj.
   2. Måling
      1. Tag lasermodulet ud og placer det lodret.
      2. Udarbejd den første bærerprøve i en 1 ml sprøjte. Fastgør sprøjten til rørindløbet, og læg forsigtigt prøven i flowcellen. Hvis der dannes bobler i flowcellen, trækkes suspensionen delvist tilbage for at flette boblen med luft-væske-grænsefladen, før du fortsætter. Sørg for, at hele flowcellen er fyldt med væske, og sæt derefter på pause.
      3. Juster kameraets fokus, hvis det er nødvendigt for at visualisere individuelle bærere. Foretag grove fokusjusteringer med den roterende knap på højre side af instrumentet. Foretag finere justeringer ved at vælge fanen Hardware | Pumper/trin. Skift fokus ved at justere skyderen Fokus .
      4. Juster kameraniveauet for at sikre, at der ikke er nogen overmætning. Inden for fanen Optag skal du vælge det optimale kameraniveau ved at justere skyderen.
      5. Hvis instrumentet er udstyret med dette tilbehør, lægges sprøjten med bærerprøven i sprøjtepumpen for at sikre kontinuerligt prøveflow under målingerne.
      6. Under fanen SOP skal du vælge Standardmåling for at tage fem optagelser på hver 30 sek. Indtast Base-filnavn , og tilføj om ønsket yderligere eksempeloplysninger ved at klikke på knappen Avanceret (som åbner en modal dialog med en række valgmuligheder).
         BEMÆRK: Hvis der indtastes en fortyndingsfaktor, justeres den endelige måling af bærerkoncentrationen automatisk af softwaren. Indtastning af denne faktor frarådes. Udfør i stedet justeringen manuelt, hvilket letter analysen og gør det muligt at vurdere, om hver fortynding falder inden for instrumentets dynamiske område (trin 3.1.3.4).
      7. Tryk på Opret og kør script, og vent på, at der vises et pop op-vindue, der beder om at forhåndsprøve på forhånd.
      8. Hvis du bruger sprøjtepumpen, skal du vælge fanen Hardware | Fanen Sprøjtepumpe | indstil infusionshastigheden til 30-80 , og tryk på Infuse. Hvis du ikke bruger sprøjtepumpen, skal du manuelt fremrykke prøven.
      9. I pop op-vinduet skal du vælge OK for at begynde at fange. Efter hver af de fem optagelser, når pop op-prøven dukker op igen, skal du kontrollere, at prøven stadig bevæger sig gennem flowcellen, enten manuelt eller via sprøjtepumpen. Vælg derefter OK for at fortsætte med den næste optagelse.
         BEMÆRK: Efter fem optagelser åbner softwaren automatisk fanen Proces og åbner en pop op-vindue, der beder om at justere procesindstillingerne.
   3. Analyse
      1. Under fanen Proces skal du justere skyderen Registreringstærskel (mellem 4 og 8) for korrekt at identificere forskellige bærere, der er synlige på skærmen. Juster også skærmforstærkningen for at hjælpe visualisering; Det vil ikke påvirke downstream-analysen. Brug skyderen under optagelsesskærmen til at rulle gennem flere rammer af videoen for at hjælpe med at registrere tærskelindstilling.
         BEMÆRK: Detektionstærsklen bør indstilles én gang og bør derefter ikke ændres mellem målinger eller prøver.
      2. I pop op-vinduet (note efter trin 3.1.2.9) skal du trykke på OK for at starte sporingsanalysen. Overvåg analysens fremskridt ved at klikke på fanen Analyse | Fanen Enkelt analyse .
      3. Når analysen er færdig, skal du kigge efter en prompt om eksportindstillinger , der vises, hvor Medtag PDF og Medtag eksperimentoversigt skal vælges som standard. Vælg andre eksportformater efter behov.
      4. I afsnittet Resultater i PDF-dataeksporten skal du for at sikre, at den målte koncentration er pålidelig, kontrollere, at den målte bærerkoncentration er mellem 1 × 10⁷ bærere/ml og 1 × 10⁹ bærere/ml - instrumentets dynamiske område - og kontrollere, om der er fejlmeddelelser eller advarsler under koncentrationsmåleresultatet.
      5. Trin 3.1.2.1-3.1.3.4 gentages to eller flere gange med forskellige fortyndinger fra bestanden. Sørg for, at koncentrationen af hver prøve falder inden for instrumentets lineære område.
      6. Vælg tre eller flere prøver, der viser en lineær tendens, dvs. en dobbelt prøvefortynding bør resultere i en tilsvarende dobbelt reduktion i den målte bærerkoncentration. Brug de udvalgte prøver og tilsvarende fortyndingsfaktorer til at beregne stambærerkoncentrationen.
   4. Bestemmelse af den absolutte fluorescensintensitet pr. bærer
      BEMÆRK: Da fluorescensen af individuelle bærere i denne strøm ikke kan karakteriseres direkte, kvantificeres fluorescensintensiteten i bulk. Denne metode er afhængig af, at fluorescensintensiteten er lineært relateret til fluorokromkoncentrationen i henhold til Lambert-Beer-loven. Når en sådan bulkkvantificering af bærere i suspension udføres på en suspension af kendt bærerkoncentration (se trin 3.1), kan fluorescensen pr. bærer udledes. Dette trin kan udføres på enten en fluorescenspladelæser eller et spektrofluorometer. Fluorescensintensiteten sammenlignes med en standardkurve for prøver med kendt absolut fluorescens, angivet i antal MESF'er.
      1. Brug en opløsning af det frie fluorokromstof til at mærke bæreren: suspender farvestoffet i den relevante buffer (f.eks. DMSO) og udfør yderligere fortyndinger i samme buffer som bærerfortyndingsmidlet. Alternativt kan du bruge en opløsning af et antistof konjugeret til fluorkrom. Koncentrationen af stamopløsningen (MESF/ml) beregnes ud fra koncentrationen i mg/ml, molekylvægten i mg/mol og Avogadros tal ved hjælp af ligning (3). Udfør en seriel fortynding i bærerfortyndingsmidlet for at generere standardkurveprøver.
         (3)
         BEMÆRK: Brug kun et fluorokromkonjugeret antistof, hvis graden af mærkning, dvs. det molære forhold mellem fluorkrom og antistof i opløsningen, er kendt. Generer oprindeligt en standardkurve med et bredt interval, da fluorescensintensiteten af bærerprøven stadig er ukendt. Herfra skal du indsnævre det til at omfatte det krævede interval.
      2. Forbered bærerprøverne.
         BEMÆRK: Den bedste praksis er at teste to eller flere bærerfortyndinger for at validere, at målingerne er lineære og falder inden for standardkurvens rækkevidde.
      3. Fluorescensen af lige store mængder af hver prøve, dvs. både bærer- og standardkurver.
      4. Der genereres en standardkurve, og bulkens absolutte fluorescensintensitet i MESF/ml fratrækkes for de målte bæreprøver.
      5. Den absolutte fluorescensintensitet pr. bærerstof (MESF/bærer) beregnes ved at dividere bulkfluorescensen (MESF/ml) med bærerkoncentrationen (bærere/ml) som i ligning (4):
         (4)
   5. Celleforsøg (herunder bestemmelse af ækvivalent fluorescensintensitet pr. bærer)
      BEMÆRK: I dette trin bruges flowcytometrikvantitetsperler til at generere en standardkurve for forholdet mellem MESF og MFI. Disse kvantitetsperler består af flere perlepopulationer med et kendt antal MESF pr. perle, og disse individuelle perler kan detekteres af ethvert cytometer. Ideelt set bestemmes MESF-standardkurven samtidig med udlæsningen af bærercelleeksperimenterne. Dette er for at sikre, at MFI-værdierne beregnet for individuelle bærere kan sammenlignes direkte med MFI'en for celler, der er knyttet til bærere. I praksis vil et cytometer normalt generere lignende resultater, når det bruges på på hinanden følgende dage ved hjælp af de samme PMT-spændinger, men dette kan ikke garanteres.
      1. Design bærercelleeksperimentet. Den koncentration af bærere, der er bestemt i punkt 3.1.3, anvendes til administration af den ønskede dosis bærere.
      2. Indstil flowcytometeret til det endelige bærercelleeksperiment ved at bestemme optimale PMT-spændingsindstillinger i de relevante kanaler.
      3. Kør en negativ kontrolprøve, det vil sige celler, der ikke er inkuberet med bærere, for at bestemme baggrundsfluorescensen.
      4. Forbered og suspender flowcytometrikvantitetsperlerne. Brug den samme buffer som anvendt til celleprøverne (f.eks. PBS). Hvis perlepopulationerne leveres separat, skal du samle dem sammen.
      5. Kør flowcytometrikvantitetsperleprøven.
      6. Kør bærercelleprøverne for at bestemme fluorescensintensiteten pr. Celle.
      7. Brug kvantitetsperleprøven til at generere en standardkurve, der konverterer den absolutte fluorescensintensitet (MESF) til MFI. Brug denne standardkurve og resultaterne fra trin 3.1.4 til at beregne bærernes teoretiske MFI. Beregn antallet af bærere pr. celle ved hjælp af ligning (5):
         (5)
         Hvor P_assoc er antallet af bærere, der er tilknyttet pr. celle, er FI-celle MFI'en for celler, der er inkuberet med bærere, _{FI-baggrunden} er MFI'en for celler, der ikke er inkuberet med bærere, og _FI-bæreren er den beregnede MFI for bærere i suspension (trin 3.1.4).

Representative Results

Som diskuteret tidligere kræver forskellige lægemiddelbærertyper anvendelse af forskellige teknikker til absolut kvantificering af cellebærerforening. For eksempel er 633 nm disulfidstabiliserede poly (methacrylsyre) (PMA_SH) kerneskalpartikler store og tætte nok til detektion ved hjælp af et følsomt flowcytometer. Som sådan blev disse partikler mærket fluorescerende, derefter gated og talt ved hjælp af sidevinkellysspredning (SALS, analog med SSC) samt den passende fluorescerende kanal (figur 3). Forskellen i hændelsesantal i begge kanaler var 1.98%, godt inden for det acceptable interval.

I modsætning hertil er 100 nm superparamagnetiske jernoxidnanopartikler for små til at detektere individuelt og blev således analyseret ved hjælp af Bulk Stream. Disse nanopartikler blev talt og karakteriseret ved hjælp af Nanoparticle Tracking Analysis (figur 4). Den gennemsnitlige nanopartikelstørrelse på 136 nm afspejler nanopartiklens hydrodynamiske diameter i vand. Den målte nanopartikelkoncentration - stadig ukorrigeret for den udførte fortynding - falder inden for instrumentets dynamiske område, hvilket tyder på en vellykket og nøjagtig bestemmelse af nanopartikelkoncentrationen.

Fortsat i bulkstrømmen skal den absolutte fluorescensintensitet af en bærersuspension omdannes til en MFI-værdi på det flowcytometer, der anvendes til den endelige cellebærerinkubation. I dette eksperiment blev kvantificeringsperler mærket med det samme fluorescerende farvestof som bæreren brugt på flere dage til at generere standardkurver på et flowcytometer (figur 5). Korrelationen mellem den målte MFI og MESF-værdien af kvantitetsperlerne er lineær og stort set ens mellem de målte datoer. Der kan dog observeres små forskelle mellem datoer, og som sådan anbefales det at regenerere en standardkurve som en del af udlæsningen af bærercelleeksperimenterne.

Når MFI'en for de enkelte luftfartsselskaber er blevet bestemt, kan cellebærerforeningsdataene absolut kvantificeres og fortolkes mere præcist. Det anbefales at udføre tidsforløbseksperimenter, f.eks. inkubering af HeLa-celler fluorescerende mærket med 235 nm PMA SH-kapsler, til forskellige tidspunkter mellem 0 timer og 24 timer (figur 6). Som forventet øges mediancellefluorescens over tid, hvilket indikerer, at kapslerne er forbundet med HeLa-celler. Mens sådanne eksperimenter kan bruges til at sammenligne den relative bærerpræstation på forskellige tidspunkter, er disse resultater ikke absolut kvantitative.

Betydningen af absolut kvantificering, uanset om den udføres via Cytometer Stream eller Bulk Stream, bliver tydelig, når man sammenligner sammenhængen mellem to bærertyper. Figur 7 viser de samme to eksperimenter, analyseret ved enten relativ kvantificering (figur 7A) eller absolut kvantificering. Forskellen i det tilsyneladende cellulære respons på bærere er skarp afhængigt af den udførte analyse; Bærere bør ikke sammenlignes direkte, når der anvendes relativ kvantificering (figur 7A), mens absolut kvantificering er uafhængig af mærkningsintensitet og dermed mere sammenlignelig (figur 7B).

Figur 3: Tælling af partikler ved hjælp af et flowcytometer (Cytometer Stream). Et Apogee flowcytometer blev brugt. (A) Partikeltælling ved hjælp af en optisk kanal (SALS), hvilket resulterer i et hændelsestal på 200.659. (B) Bærertælling ved hjælp af bærerens fluorescerende kanal, hvilket resulterer i et hændelsestal på 204.636. I begge tilfælde blev der anvendt en arcsinh-transformation efterfulgt af gating (henholdsvis 6 og 4). Tal skabt ud fra rådata om 633 nm kerneskalpartikler, der først blev offentliggjort i Faria et ^al.10. Forkortelse: SALS = lysspredning med lille vinkel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Optælling af luftfartsselskaber ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (bulkstrøm). Superparamagnetiske jernoxidnanopartikler på 100 nm i størrelse blev karakteriseret og talt ved hjælp af Nanoparticle Tracking Analysis. Til venstre, koncentrations-/størrelseshistogram af individuelle resultater af fem replikatmålinger. Højre, gennemsnitlig koncentration / størrelsesfordeling ± SEM på fem replikater. I denne særlige prøve blev der udført en fortynding på 1:2.000 fra lager for at opnå en koncentration inden for instrumentets dynamiske område. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Konvertering af MESF til MFI ved hjælp af kvantitetsperler på et flowcytometer (Bulk Stream). Fluorescerende perler med fire forskellige MESF-værdier blev analyseret på et flowcytometer på forskellige dage, og standardkurver blev tegnet. Forkortelser: MESF = molekyler af ækvivalent opløselig fluorkrom; MFI = median fluorescensintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Afsluttende celleeksperiment på flowcytometer-tidskursusserier (Cytometer Stream og Bulk Stream). Repræsentative billeder af flowcytometridata fra et tidsforløbseksperiment. THP-1-celler blev inkuberet med en 235 nm polymerkapsel i 0 timer, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer og 24 timer (fra venstre mod højre). Bærerfluorescens vises på x-aksen, mens en optisk kanal vises på y-aksen. I alle tilfælde blev der udført en arcsinh-transformation. Der blev ikke udført gating (bortset fra at vælge grafens grænser). Oprettet ud fra rådata i Faria et ^al.10. Forkortelse: SALS = lysspredning med lille vinkel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: Relativ versus absolut kvantificering af bærer-celle-association (Cytometer Stream og Bulk Stream). Begge figurer visualiserer data fra de samme to eksperimenter, en 24 timers inkubation mellem RAW264.7 makrofager og 150 nm (blå) eller 633 nm kerneskalbærere (orange), skabt af rådata i Faria et ^al.10. Medianerne af begge tekniske replikater er plottet. (A) Relativ kvantificering, rapporteret som MFI i AU (B) Absolut kvantificering, rapporteret som antallet af bærere pr. celle. Forkortelser: MFI = median fluorescensintensitet; AU = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Karakterisering af interaktionerne mellem lægemiddelbærere og celler bliver stadig vigtigere i udviklingen af nye lægemiddelleveringssystemer. Specifikt for at muliggøre rationel evaluering og sammenligning af forskellige bærerkonstruktioner er absolut kvantificering af bærerens ydeevne til at interagere med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokol beskriver en to-strøms metode, der gør det muligt for enhver forsker, der arbejder med en lægemiddelbærer, at konvertere relative, semikvantitative flowcytometridata om cellebærerforening til absolutte kvantitative resultater. Den skitserede proces gælder for enhver type bærer - lille, stor, økologisk, uorganisk - forudsat at de er fluorescerende mærket. Imidlertid kræver forskellige bærere forskellige tilgange til at beregne bærerne pr. Celle. Dette skyldes grænserne for forskellige instrumenter, der anvendes til de krævede karakteriseringsmålinger.

Som sådan er denne protokol opdelt i to strømme: Cytometer Stream og Bulk Stream. Den første, Cytometer Stream, er den mere ligetil tilgang og kræver kun et flowcytometer, men dette cytometer skal være følsomt nok til at detektere de enkelte bærere, der anvendes, eller med andre ord skal lægemiddelbæreren af interesse være stor og tæt nok til at blive detekteret. Bulk Stream er kompatibel med enhver transportørtype, da behovet for at opdage individuelle luftfartsselskaber omgås ved hjælp af alternativ instrumentering. Bulk Stream kræver dog, at der udføres flere karakteriseringseksperimenter.

For at hjælpe med at vælge den relevante strøm (og som sådan de relevante teknologier) er ovenstående overvejelser opsummeret i et beslutningstræ (figur 1). For at gentage, er Bulk Stream velegnet til alle forskere uanset den anvendte transportørtype og kan derfor altid vendes tilbage til som backup. Arbejdsgangene for de to strømme er beskrevet i figur 2. Især med de igangværende fremskridt inden for følsomheden af flowcytometre er det muligt, at Cytometer Stream kan bruges til mere <300 nm bærere.

Der skal gøres et par bemærkninger om denne procedure. For det første er den beskrevne strategi for omdannelse af cellefluorescensen til et absolut antal bærere pr. celle afhængig af målingen af den enkelte bærerfluorescens i suspension. Imidlertid påvirkes fluorescens af fluorokromens umiddelbare kemiske miljø (f.eks. bærerfortyndingsmidlet, celleoverfladen eller forskellige intracellulære rum). Især det sure miljø i det endosomale rum vides at påvirke fluorescensintensiteten af visse primært proteinbaserede farvestoffer¹¹. Som sådan anbefales det, uanset hvilken bærertype der er undersøgt, at anvende pH-ufølsomme og meget fotosbare farvestofområder til mærkning af lægemiddelbærere (se materialetabellen for en anbefaling). Den ekstra fordel ved dette farvestofområde er dets generelle lysstyrke, hvilket forbedrer følsomheden af detektion af lægemiddelbærere.

For det andet er de metoder, der er diskuteret ovenfor, beregnet til at give vejledning, men udgør på ingen måde en eksklusiv liste over teknikker, der kan bruges til at udføre de forskellige trin i kvantificeringsarbejdsgangen. Der findes især en række forskellige teknikker til at tælle mindre eller lavspredningsbærere (som dem i bulkstrømmen). Disse omfatter andre instrumenter, der er i stand til at udføre den samme nanopartikelsporingsanalyse¹², såvel som andre metoder i det hele taget, såsom flervinklet dynamisk lysspredning, massespektroskopi, elektronmikroskopi 13, gravimetri eller optiske densitetsmålinger (yderligere gennemgået af Shang og Gao¹⁴). Desuden er denne eksperimentelle kvantificering - flytning fra vilkårlige fluorescensenheder til et absolut antal bærere pr. Celle - kun en del af, hvad der kan betegnes som en "kvantitativ biologisk arbejdsgang". Absolut eksperimentel kvantificering er nødvendig, men ikke tilstrækkelig. Blot kvantificering og rapportering af bærerforeningen tager ikke højde for forskelle i partikelforening på grund af den eksperimentelle opsætning, såsom inkubationstid, dosis og koncentration af tilsat lægemiddelbærer eller antallet af celler, der anvendes pr. Eksperimentel beholder.

Derudover kan bærere med forskellige fysisk-kemiske egenskaber have meget forskellige doser leveret til celler, selv når den eksperimentelle opsætning er identisk¹⁵. Carrier ydeevne - selv in vitro - kan ikke bestemmes uden at tage højde for alle disse faktorer. Med andre ord giver en simpel kvantificering af bærercelleforeningen generelt ikke mulighed for en upartisk sammenligning af bærere mellem forskere og laboratorier. I dette lys har der været forudgående diskussion om vigtigheden af at udføre tidsforløbseksperimenter af bærer-celle-association og efterfølgende in silico matematisk modellering for at udlede kinetiske parametre (dvs. hastighedskonstanter) som et upartisk og kvantitativt mål for affiniteten mellem et bestemt bærer-cellepar¹⁰. Eksperimentel kvantificering er også en forudsætning for, at der kan anvendes andre in silico-teknikker , såsom identifikation af potentielle kilder til biologisk heterogenitet¹⁶ eller bestemmelse af penetrationskinetik i en kompleks biologisk model¹⁷. Kombineret med retningslinjerne for minimumsinformationsrapportering i bio-nano-eksperimentel litteratur for standardiseret rapportering¹⁸ kan den kvantitative evaluering af bærerens ydeevne fremskynde udviklingen af ny nanomedicin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard