Summary
En arbeidsflyt er demonstrert for absolutt kvantifisering av legemiddelbærer-celleinteraksjoner ved bruk av flowcytometri for å muliggjøre bedre rasjonell evaluering av nye legemiddelleveringssystemer. Denne arbeidsflyten gjelder for legemiddelbærere av alle typer.
Abstract
En viktig komponent i utformingen av legemiddelleveringssystemer gjelder hvordan man forsterker eller demper interaksjoner med bestemte celletyper. For eksempel kan en kjemoterapeutisk bli funksjonalisert med et antistoff for å forbedre bindingen til kreftceller ("målretting") eller funksjonalisert med polyetylenglykol for å unngå immuncellegjenkjenning ("stealth"). Selv på mobilnivå er optimalisering av binding og opptak av en legemiddelbærer et komplekst biologisk designproblem. Dermed er det verdifullt å skille hvor sterkt en ny bærer interagerer med en celle fra den funksjonelle effekten av en transportørs last når den er levert til den cellen.
For å fortsette det kjemoterapeutiske eksemplet, "hvor godt det binder seg til en kreftcelle" er et eget problem fra "hvor godt det dreper en kreftcelle". Kvantitative in vitro-analyser for sistnevnte er veletablerte og er vanligvis avhengige av å måle levedyktighet. Imidlertid er mest publisert forskning på cellebærerinteraksjoner kvalitativ eller semikvantitativ. Vanligvis er disse målingene avhengige av fluorescerende merking av bæreren og rapporterer følgelig interaksjoner med celler i relative eller vilkårlige enheter. Dette arbeidet kan imidlertid standardiseres og gjøres helt kvantitativt med et lite antall karakteriseringseksperimenter. Slik absolutt kvantifisering er verdifull, da det letter rasjonelle, inter- og intra-klasse sammenligninger av ulike legemiddelleveringssystemer-nanopartikler, mikropartikler, virus, antistoff-legemiddelkonjugater, konstruerte terapeutiske celler eller ekstracellulære vesikler.
Videre er kvantifisering en forutsetning for senere metaanalyser eller i silikomodelleringsmetoder . I denne artikkelen presenteres videoguider, samt et beslutningstre for hvordan man oppnår in vitro-kvantifisering for bærermedisinleveringssystemer, som tar hensyn til forskjeller i bærerstørrelse og merkingsmodalitet. I tillegg drøftes ytterligere vurderinger for kvantitativ vurdering av avanserte legemiddelleveringssystemer. Dette er ment å tjene som en verdifull ressurs for å forbedre rasjonell evaluering og design for neste generasjon medisin.
Introduction
Utformingen av legemiddelleveringskonstruksjoner som viser spesifikk, designet oppførsel avhengig av hvilken celletype de møter, har tiltrukket seg betydelig forskningsinteresse. Potensielle legemiddelleveringskonstruksjoner eller "bærere" inkluderer lipidformuleringer, nano-dyrkede uorganiske stoffer, polymere forsamlinger, ekstracellulære vesikler, funksjonaliserte bakterieceller eller modifiserte virus. Alle disse kan utvise organ-, vevs- eller cellespesifisitet på grunn av fysiske egenskaper, overflateegenskaper eller konstruerte kjemiske funksjonaliseringer som antistofffeste 1,2.
Et nesten allestedsnærværende trinn i in vitro-bærerevaluering er å inkubere celler med en suspensjon som inneholder den legemiddelbelastede bæreren. Etter inkubasjon måles bærerens ytelse via en funksjonell avlesning av legemiddellastens ytelse, for eksempel transfeksjonseffektivitet eller toksisitet. Funksjonelle avlesninger er nyttige, da de er et nedstrøms mål på transportørens effektivitet. For mer komplekse legemiddelleveringskonstruksjoner er det imidlertid stadig viktigere å bevege seg utover funksjonelle avlesninger og separat kvantifisere graden av bærerinteraksjon med cellen av interesse. Det er noen grunner til dette.
For det første er det økende interesse for å oppdage (og iterativt forbedre) "plattform" transportørteknologier, som kan bære en rekke last. For eksempel kan lipid nanopartikler (LNPs) designet for å innkapsle RNA bytte en RNA-sekvens for en annen med få advarsler3. For å iterativt forbedre transportørteknologien er det derfor avgjørende å kvantifisere ytelsen uavhengig av lastfunksjonaliteten. For det andre kan funksjonelle avlesninger ikke være enkle for lasten av interesse, noe som kompromitterer evnen til raskt å iterere og evaluere transportørformuleringer. Mens man kan utføre in vitro-optimalisering ved hjelp av en modelllast med en enkel funksjonell avlesning (for eksempel fluorescens), kan endring av lasten endre den biologiske responsen til en bærer4 og kan dermed ikke gi representative resultater. For det tredje er mange bærere designet for å samhandle med og bli tatt opp av en bestemt celletype. En slik målrettingsevne for en transportør kan og bør differensieres fra ytelsen til den terapeutiske lastpostmålrettingen. For å fortsette LNP-eksemplet kan en RNA-last være ekstremt kraftig, men hvis LNP ikke klarer å binde seg til cellen, internaliseres og frigjøre RNA, vil ingen nedstrøms funksjonell effekt bli observert. Dette kan være et problem spesielt for bærere som er ment å målrette mot celletyper som er vanskelige å transfektere, for eksempel T-celler5. Omvendt kan en LNP målrette ekstremt effektivt, men RNA-lasten fungerer kanskje ikke. En nedstrøms analyse som bare måler lastfunksjonalitet, vil ikke kunne skille mellom disse to situasjonene, og dermed komplisere utviklingen og optimaliseringen av transportørens legemiddelleveringssystemer.
I dette arbeidet diskuteres hvordan man absolutt kvantifiserer transportørforening . Forening er et begrep som refererer til den eksperimentelt målte graden av interaksjon mellom en bærer og en celle. Assosiasjon skiller ikke mellom membranbinding og internalisering - en bærer kan være assosiert fordi den er bundet til celleoverflaten eller fordi cellen har internalisert den. Forening måles vanligvis som en del av cellebærerinkubasjonseksperimenter. Historisk har assosiasjon blitt rapportert enten i vilkårlige fluorescerende enheter (typisk "median fluorescensintensitet" eller MFI) eller som "prosentforening", beregninger hvis begrensninger tidligere har blitt diskutert6. Kort sagt, disse målingene er ikke sammenlignbare mellom eksperimenter, laboratorier og legemiddelbærere på grunn av forskjeller i eksperimentelle protokoller, flowcytometerinnstillinger og merkingsintensitetene til forskjellige bærere. Det er gjort anstrengelser for å overvinne førstnevnte ved å kalibrere cytometeret, og dermed konvertere det relative målet for MFI til et absolutt kvantitativt mål for fluorescens7. Denne metoden tar imidlertid ikke hensyn til variabiliteten i merkingsintensiteten til forskjellige bærere, og tillater dermed ikke den rasjonelle sammenligningen av ulike bærerprestasjoner i en målcelle av valg8.
Her demonstreres hvordan man praktisk talt konverterer fra relative, vilkårlige fluorescerende enheter til den absolutte kvantitative metriske av "antall bærere per celle" ved å utføre et lite antall ytterligere karakteriseringseksperimenter. Hvis en annen beregning av bærerkonsentrasjon er ønsket (f.eks. Bærermasse per celle eller bærervolum per celle), er det enkelt å konvertere fra bærere per celle, forutsatt at bærerkarakterisering er gjort. For korthet og for å unngå sjargong, brukes ordet "bærer" i dette arbeidet for å referere til det store utvalget av legemiddelleveringskonstruksjoner. Disse kvantifiseringsteknikkene er like anvendelige, enten de brukes på en nanokonstruert gullpartikkel eller en biokonstruert bakterie.
Noen få fakta muliggjør konvertering fra vilkårlige fluorescerende enheter til bærere per celle. For det første er den målte fluorescensintensiteten proporsjonal med konsentrasjonen av en fluorofor9 (eller en fluorescerende merket bærer), forutsatt at fluorescensen er innenfor instrumentets deteksjonsgrenser og instrumenteringsinnstillingene er de samme. Således, hvis fluorescensen til en bærer og fluorescensen til en prøve er kjent, kan man bestemme hvor mange bærere som er tilstede i den prøven hvis alle målingene ble utført under de samme innstillingene og forholdene. Imidlertid, spesielt for mindre bærere, kan det ikke være mulig å måle bærerfluorescens, celle autofluorescens og celle-assosiert-med-bærere fluorescens på samme instrument med de samme innstillingene. I dette tilfellet er det et annet krav for å gjøre det mulig å konvertere mellom målt fluorescens på ett instrument og målt fluorescens på et annet. For å gjøre dette kan en standardkurve for fluoroforkonsentrasjon etableres for å måle fluorescensintensiteten på begge instrumentene, og dra nytte av molekylene av ekvivalent løselig fluorokrom (MESF) standard9. Dette tillater deretter måling av bærerfluorescensen i bulk på et ikke-cytometer, en måling som kan gjøres på bærere av enhver størrelse eller egenskap. Når slik bulkkvantifisering gjøres på en bærersuspensjon av kjent konsentrasjon, kan antall bærere per celle i en prøve igjen beregnes.
Selv om dette arbeidet demonstrerer prosessen for måling av bærerassosiasjon (som bestemt av målt fluorescensintensitet), kan en analog protokoll utføres for andre målinger av cellebærerinteraksjon (f.eks. En eksperimentell protokoll som skiller internaliserte og membranbundne bærere). I tillegg ville denne protokollen i stor grad være den samme hvis foreningen ble målt gjennom en ikke-fluorescerende analyse (for eksempel gjennom massecytometri).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Velge riktig strøm
- Følg beslutningstreet som er beskrevet i figur 1 , for å finne den beste arbeidsflyten (strøm) (figur 2) for det eksperimentelle oppsettet som brukes. Se diskusjonen for ytterligere kommentarer til dette valget av strøm.
- Hvis du følger cytometerstrømmen, fortsett med trinn 2.1.1-2.2.7. Hvis du følger Bulk Stream, fortsetter du med trinn 3.1.1.1-3.1.5.7.
Figur 1: Workstream beslutningstre. Beslutningen om hvilken Stream som skal brukes, avhenger først og fremst av transportørens interesse. Større bærere og bærere med høye spredningsegenskaper kan lettere oppdages individuelt på cytometre, noe som gjør dem egnet for kvantifisering ved hjelp av cytometerstrømmen. Bulk Stream er egnet for alle andre transportørtyper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over arbeidsflyter. Denne protokollen er delt inn i to forskjellige strømmer. Cytometerstrømmen bruker et følsomt cytometer for å telle bærerne i suspensjon, måle deres individuelle fluorescens og deretter bestemme fluorescensen av celler inkubert med bærere. Bulk Stream bruker ikke-cytometribaserte teknikker, for eksempel Nanoparticle Tracking Analysis, for å telle bærerne i suspensjon. Den enkelte bærerfluorescens kvantifiseres deretter ved hjelp av en mikroplateleser eller spektrofluorometer. Bruken av flowcytometeret er derfor begrenset til å måle den endelige fluorescensen av celler inkubert med bærere, en måling som kan gjøres på et bredere spekter av cytometre og som er uavhengig av bærertypen som brukes. Forkortelser: MESF = molekyler av ekvivalent løselig fluorokrom; MFI = median fluorescensintensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Cytometerstrømmen
- Transportør telling
MERK: Ethvert flowcytometer kan brukes til denne målingen, forutsatt at strømningshastigheten (μL/s) er kjent. Hvis strømningshastigheten er ukjent og ikke kan bestemmes, må du ikke fortsette med dette trinnet. Fortsett i stedet med trinn 3.1. Telling av bærerne i suspensjon tillater nøyaktig og reproduserbar bestemmelse av antall bærere inkubert i hvert celleeksperiment.- Sett opp cytometeret for å oppdage bærere, både ved en optisk spredningskanal (vanligvis sidespredning [SSC]) og fluorescens. Sørg for å justere terskelen for å tillate deteksjon av transportørene.
MERK: Iterasjon gjennom forskjellige optiske spredningskanaler kan være nødvendig hvis SSC ikke gir et klart signal (f.eks. fremoverspredning [FSC]). - Kjør en forbruksvareprøve for å kvantifisere antallet bakgrunnshendelser i både SSC og fluorescerende kanaler.
MERK: Ideelle antall bakgrunnshendelser er <100 hendelser/s. - Forbered bærerne for flowcytometri.
- Sørg for at bærerne er godt suspendert ved vortexing eller sonikering, avhengig av bæresystemet som er involvert.
- Hvis mulig, sørg for at bærerkonsentrasjonen er mellom 1000 bærere / μL og 10.000 bærere / μL. Et hendelsestall på en til to størrelsesordener høyere enn bakgrunnen er en god start. Hvis størrelsesordenen av bærerkonsentrasjonen er ukjent, er en god start å forberede en 1: 1000 fortynning fra lager. Bruk de første resultatene som tilbakemelding for å informere fremtidige prøvefortynninger.
MERK: En uklar suspensjon er vanligvis for konsentrert.
- Legg den første bærerprøven på cytometeret og start opptaket.
- Sammenlign hendelsestall som følge av både SSC- og fluorescenskanalene; disse skal være omtrent like (<10% forskjell). Hvis ikke, sjekk cytometerinnstillingene, for eksempel innstillinger for fotomultiplikatorrør (PMT) og laserintensitet for fluorescerende kanal. Alternativt kan du bruke andre metoder som konfokalmikroskopi for å validere at fluorescerende merking av bærerne er tilstede og jevn.
- Gjenta trinn 2.1.3-2.1.5 to eller flere ekstra ganger med forskjellige fortynninger fra bestanden. Kontroller at hendelsesantallet i hvert utvalg er minst én størrelsesorden høyere enn antallet bakgrunnshendelser.
- Kontroller at tre eller flere prøver viser en lineær trend, det vil si at en to ganger prøvefortynning skal resultere i en tilsvarende to ganger reduksjon i den målte bærerkonsentrasjonen.
- Bruk prøvene innenfor det lineære området, tilsvarende fortynningsfaktorer og den kjente cytometerstrømningshastigheten for å beregne lagerbærerkonsentrasjonen i henhold til ligning (1):
(1)
der C er lagerbærerkonsentrasjonen i transportører/ml. Det anbefales å bruke hendelsestallet avledet fra optisk spredningsdeteksjon i stedet for fluorescens.
- Sett opp cytometeret for å oppdage bærere, både ved en optisk spredningskanal (vanligvis sidespredning [SSC]) og fluorescens. Sørg for å justere terskelen for å tillate deteksjon av transportørene.
- Flowcytometriavlesning av bærercelleeksperimentet, inkludert bestemmelse av fluorescensintensitet per bærer
MERK: Ideelt sett vil fluorescerende intensitet per bærer bestemmes så nært som mulig til bærercelleeksperimentet. Dette er for å sikre at mikrofinansinstitusjoner innhentet for individuelle bærere kan direkte sammenlignes med mikrofinansinstitusjoner av celler knyttet til bærere. I praksis vil et cytometer vanligvis generere lignende resultater når det brukes på påfølgende dager med samme PMT-spenninger, men dette kan ikke garanteres.- Utform bærercelleeksperimentet. Bruk bærerkonsentrasjonen bestemt i trinn 2.1 for å administrere ønsket dose bærere.
- Sett opp flowcytometeret for det endelige bærercelleeksperimentet ved å bestemme optimale PMT-spenningsinnstillinger i de relevante kanalene. Angi tersklene for å tillate transportørdeteksjon.
- Kjør bærerne i suspensjon for å bestemme fluorescensintensiteten per bærer under gjeldende PMT-innstillinger.
- Endre om nødvendig cytometertersklene for å oppdage cellene og ikke bærerne.
- Kjør en negativ kontrollprøveceller som ikke inkuberes med bærere - for å bestemme bakgrunnsfluorescensen (autofluorescens) av cellene.
- Kjør bærercelleprøvene for å bestemme fluorescensintensiteten per celle. Denne fluorescensen er en lineær kombinasjon av cellulær autofluorescens og tilstedeværelsen av fluorescerende bærere.
- Beregn antall bærere per celle ved hjelp av følgende ligning (2):
(2)
hvor Passoc er antall bærere assosiert per celle, FI-celle er MFI av celler inkubert med bærere, FI-bakgrunn er MFI av celler som ikke inkuberes med bærere, og FI-bærer er MFI for bærere i suspensjon.
(1)
(2)3. Bulkstrømmen
- Bærertelling: nanopartikkelsporingsanalyse
MERK: I bulkstrømmen er transportørtelling et nødvendig trinn for å kvantifisere den absolutte fluorescensintensiteten per bærer (se trinn 3.1.4). I tillegg tillater telling av bærerne i suspensjon nøyaktig og reproduserbar bestemmelse av antall bærere inkubert i hvert celleeksperiment.- Forberedelse
- Monter strømningscellen på lasermodulen og lås hele lasermodulen på plass inne i instrumentet.
- Sakte (ikke raskere enn 0,1 ml / s) skyll strømningscellen med ~ 1 ml destillert vann. Hvis det dannes bobler i strømningscellen, trekker du suspensjonen delvis tilbake for å fusjonere boblen med luft-væske-grensesnittet før du fortsetter.
- Start kameraet omtrent halvveis i spylingen; Sørg for å bekrefte at bærerrester er vasket ut. Velg Capture for å åpne kategorien Capture Settings og klikk Start kamera.
- Tørk systemet med 1 ml luft. Hvis noen statiske bærere er synlige på skjermen, rengjør du flytcellen i henhold til produsentens instruksjoner.
- Forbered transportørene for Nanoparticle Tracking Analysis ved å sikre at bærerne er godt suspendert via vortexing eller sonikering, avhengig av bæresystemet som er involvert. Hvis størrelsesordenen av bestandskonsentrasjonen er ukjent, lag en 1:100 fortynning fra bestanden og bruk de første resultatene som tilbakemelding for å informere fremtidige prøvefortynninger. Fortynn bærerne i vann og ikke fosfatbufret saltvann (PBS) for å tilberede minst ~ 0,6-1 ml av hver prøve med en bærerkonsentrasjon mellom 1 × 107 bærere / ml og 1 × 109 bærere / ml.
MERK: En uklar suspensjon er vanligvis for konsentrert. Buffere og salter kan generere høy bakgrunnsstøy.
- Måling
- Ta ut lasermodulen og plasser den oppreist.
- Trekk opp den første bæreprøven i en 1 ml sprøyte. Fest sprøyten til rørinnløpet og legg prøven forsiktig inn i strømningscellen. Hvis det dannes bobler i strømningscellen, trekker du suspensjonen delvis tilbake for å fusjonere boblen med luft-væske-grensesnittet før du fortsetter. Forsikre deg om at hele strømningscellen er fylt med væske, og sett deretter på pause.
- Juster kamerafokuset om nødvendig for å visualisere individuelle operatører. Gjør grove fokusjusteringer med den roterende knappen på høyre side av instrumentet. Gjør finere justeringer ved å velge kategorien Maskinvare | Pumper/trinn. Endre fokus ved å justere skyvekontrollen for fokus .
- Juster kameranivået for å sikre at det ikke er overmetning. I kategorien Ta opp velger du det optimale kameranivået ved å justere glidebryteren.
- Hvis instrumentet er utstyrt med dette tilbehøret, legger du sprøyten som inneholder bæreprøven i sprøytepumpen for å sikre kontinuerlig prøvestrøm under målingene.
- Under SOP-fanen velger du Standardmåling for å ta fem bilder på 30 sekunder hver. Skriv inn Base filnavn og, hvis ønskelig, legge til ytterligere eksempelinformasjon ved å klikke på Avansert-knappen (som åpner en modal dialog med en rekke valg).
MERK: Hvis en fortynningsfaktor angis, justeres den endelige bærerkonsentrasjonsmålingen automatisk av programvaren. Å legge inn denne faktoren frarådes. Utfør i stedet justeringen manuelt, noe som letter analysen og gjør det mulig å vurdere om hver fortynning faller innenfor instrumentets dynamiske område (trinn 3.1.3.4). - Trykk på Opprett og kjør skript og vent til en popup vises, og be om å gå videre prøve.
- Hvis du bruker sprøytepumpen, velger du kategorien Maskinvare | Tapp for sprøytepumpe | sett infusjonshastigheten på 30-80 og trykk på Infuse. Hvis du ikke bruker sprøytepumpen, må du avansere prøven manuelt.
- I popup-vinduet velger du OK for å begynne å fange. Når popup-vinduet Please advance sample dukker opp igjen etter hvert av de fem opptakene, kontrollerer du at prøven fortsatt beveger seg gjennom strømningscellen, enten manuelt eller via sprøytepumpen. Velg deretter OK for å fortsette med neste opptak.
MERK: Etter fem opptak åpner programvaren automatisk Prosess-fanen og åpner en popup som ber om å justere prosessinnstillingene.
- Analyse
- I Prosess-fanen justerer du glidebryteren for deteksjonsterskel (mellom 4 og 8) for å identifisere forskjellige bærere som er synlige på skjermen på riktig måte. Juster skjermforsterkningen også for å hjelpe visualisering; det vil ikke påvirke nedstrømsanalysen. Bruk glidebryteren under opptaksskjermen til å bla gjennom flere rammer av videoen for å hjelpe til med å oppdage terskelinnstillingen.
MERK: Deteksjonsterskelen bør stilles inn én gang, og deretter bør den ikke endres mellom målinger eller prøver. - I popup-vinduet (notat etter trinn 3.1.2.9 ) trykker du OK for å starte sporingsanalyse. Overvåk fremdriften i analysen ved å klikke på Analyse-fanen | Kategorien Enkeltanalyse .
- Når analysen er fullført, ser du etter en ledetekst for eksportinnstillinger , der Inkluder PDF og Inkluder eksperimentsammendrag skal velges som standard. Velg eventuelle andre eksportformater etter ønske.
- For å sikre at konsentrasjonen som måles er pålitelig, må du kontrollere at den målte bærerkonsentrasjonen er mellom 1 × 107 bærere/ml og 1 × 109 bærere/ml – instrumentets dynamiske område – og se etter eventuelle feilmeldinger eller forsiktighetsmeldinger under konsentrasjonsmålingsresultatet.
- Gjenta trinn 3.1.2.1-3.1.3.4 to eller flere ganger med forskjellige fortynninger fra bestanden. Sørg for at konsentrasjonen av hver prøve faller innenfor instrumentets lineære område.
- Velg tre eller flere prøver som viser en lineær trend, det vil si at en to ganger prøvefortynning skal resultere i en tilsvarende to ganger reduksjon i den målte bærerkonsentrasjonen. Bruk de valgte prøvene og tilhørende fortynningsfaktorer for å beregne lagerbærerkonsentrasjonen.
- I Prosess-fanen justerer du glidebryteren for deteksjonsterskel (mellom 4 og 8) for å identifisere forskjellige bærere som er synlige på skjermen på riktig måte. Juster skjermforsterkningen også for å hjelpe visualisering; det vil ikke påvirke nedstrømsanalysen. Bruk glidebryteren under opptaksskjermen til å bla gjennom flere rammer av videoen for å hjelpe til med å oppdage terskelinnstillingen.
- Bestemmelse av absolutt fluorescensintensitet per bærer
MERK: Siden fluorescensen til individuelle bærere i denne strømmen ikke kan karakteriseres direkte, kvantifiseres fluorescensintensiteten i bulk. Denne metoden er avhengig av det faktum at fluorescensintensiteten er lineært relatert til fluorokromkonsentrasjonen i henhold til Lambert-Beer-loven. Når slik bulkkvantifisering av bærere i suspensjon gjøres på en suspensjon av kjent bærerkonsentrasjon (se trinn 3.1), kan fluorescensen per bærer utledes. Dette trinnet kan gjøres på enten en fluorescensplateleser eller et spektrofluorometer. Fluorescensintensiteten sammenlignes med en standardkurve av prøver med kjent absolutt fluorescens, gitt i antall MESFer.- Bruk en løsning av det frie fluorokromet til å merke bæreren: resuspend fargestoffet i riktig buffer (f.eks. DMSO) og utfør ytterligere fortynninger i samme buffer som bærerfortynningsmidlet. Alternativt kan du bruke en løsning av et antistoff konjugert til fluorokrom. Beregn konsentrasjonen av stamløsningen (MESF / ml) fra konsentrasjonen i mg / ml, molekylvekten i mg / mol og Avogadros tall ved hjelp av ligning (3). Utfør en seriell fortynning i bærerfortynningsmidlet for å generere standardkurveprøver.
(3)
MERK: Bruk et fluorokromkonjugert antistoff bare hvis graden av merking, dvs. molforholdet mellom fluorokrom og antistoff i løsningen, er kjent. I utgangspunktet genererer du en standardkurve med et bredt spekter, da fluorescensintensiteten til bærerprøven fortsatt er ukjent. Herfra begrenser du det til å inkludere rekkevidden som kreves. - Forbered bærerprøvene.
MERK: Den beste fremgangsmåten er å teste to eller flere bærerfortynninger for å validere at målingene er lineære og faller innenfor rekkevidden til standardkurven. - Mål fluorescensen av like volumer av hver prøve, dvs. både bærer- og standardkurver.
- Generer en standardkurve og trekk fra den absolutte bulkfluorescensintensiteten i MESF/ml for de målte bærerprøvene.
- Beregn absolutt fluorescensintensitet per bærer (MESF/carrier) ved å dele bulkfluorescensen (MESF/ml) på bærerkonsentrasjonen (bærere/ml) som i ligning (4):
(4)
- Bruk en løsning av det frie fluorokromet til å merke bæreren: resuspend fargestoffet i riktig buffer (f.eks. DMSO) og utfør ytterligere fortynninger i samme buffer som bærerfortynningsmidlet. Alternativt kan du bruke en løsning av et antistoff konjugert til fluorokrom. Beregn konsentrasjonen av stamløsningen (MESF / ml) fra konsentrasjonen i mg / ml, molekylvekten i mg / mol og Avogadros tall ved hjelp av ligning (3). Utfør en seriell fortynning i bærerfortynningsmidlet for å generere standardkurveprøver.
- Celleeksperiment (inkludert bestemmelse av ekvivalent fluorescensintensitet per bærer)
MERK: I dette trinnet brukes flowcytometri kvantifiseringsperler for å generere en standardkurve for forholdet mellom MESF og MFI. Disse kvantifiseringsperlene består av flere perlepopulasjoner med et kjent antall MESF per perle, og disse individuelle perlene kan detekteres av et hvilket som helst cytometer. Ideelt sett bestemmes MESF-standardkurven samtidig med avlesningen av bærercelleeksperimentene. Dette er for å sikre at MFI-verdiene beregnet for individuelle bærere direkte kan sammenlignes med MFI av celler assosiert med bærere. I praksis vil et cytometer vanligvis generere lignende resultater når det brukes på påfølgende dager med samme PMT-spenninger, men dette kan ikke garanteres.- Utform bærercelleeksperimentet. Bruk bærerkonsentrasjonen bestemt i pkt. 3.1.3 for å administrere ønsket dose bærere.
- Sett opp flowcytometeret for det endelige bærercelleeksperimentet ved å bestemme optimale PMT-spenningsinnstillinger i de relevante kanalene.
- Kjør en negativ kontrollprøve, det vil si celler som ikke inkuberes med bærere, for å bestemme bakgrunnsfluorescensen.
- Forbered og resuspend flowcytometri kvantifiseringsperlene. Bruk samme buffer som brukes for celleprøvene (f.eks. Hvis perlepopulasjonene leveres separat, samler du dem sammen.
- Kjør flowcytometri kvantifiseringsperleprøven.
- Kjør bærercelleprøvene for å bestemme fluorescensintensiteten per celle.
- Bruk kvantifiseringsperleprøven til å generere en standardkurve som konverterer den absolutte fluorescensintensiteten (MESF) til MFI. Bruk denne standardkurven og resultatene fra trinn 3.1.4 for å beregne transportørens teoretiske MFI. Beregn antall bærere per celle ved hjelp av ligning (5):
(5)
Hvor Passoc er antall bærere assosiert per celle, FI-celle er MFI av celler inkubert med bærere, FI-bakgrunn er MFI av celler som ikke inkuberes med bærere, og FI-bærer er beregnet MFI for bærere i suspensjon (trinn 3.1.4).
- Forberedelse
(3)
(4)
(5)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som diskutert tidligere, krever forskjellige legemiddelbærertyper bruk av forskjellige teknikker for absolutt kvantifisering av cellebærerassosiasjon. For eksempel er 633 nm disulfidstabilisert poly (metakrylsyre) (PMASH) kjerneskallpartikler store og tette nok til deteksjon ved bruk av et følsomt flowcytometer. Som sådan ble disse partiklene merket fluorescerende, deretter inngjerdet og talt ved hjelp av sidevinklet lysspredning (SALS, analog med SSC), samt riktig fluorescerende kanal (figur 3). Forskjellen i antall hendelser i begge kanaler var 1,98 %, godt innenfor det akseptable området.
I motsetning til dette er 100 nm superparamagnetiske jernoksid nanopartikler for små til å oppdage individuelt og ble dermed analysert ved hjelp av Bulk Stream. Disse nanopartiklene ble talt og karakterisert ved hjelp av Nanoparticle Tracking Analysis (figur 4). Den gjennomsnittlige nanopartikkelstørrelsen på 136 nm reflekterer nanopartikkelens hydrodynamiske diameter i vann. Nanopartikkelkonsentrasjonen målt - fortsatt ukorrigert for fortynning utført - faller innenfor instrumentets dynamiske område, noe som tyder på vellykket og nøyaktig bestemmelse av nanopartikkelkonsentrasjonen.
Fortsetter i Bulk Stream, skal den absolutte fluorescensintensiteten til en bærersuspensjon omdannes til en MFI-verdi på flowcytometeret som brukes til den endelige cellebærerinkubasjonen. I dette eksperimentet ble kvantifiseringsperler merket med samme fluorescerende fargestoff som bæreren brukt på flere dager for å generere standardkurver på et flowcytometer (figur 5). Korrelasjonen mellom den målte MFI- og MESF-verdien av kvantifiseringsperlene er lineær og i stor grad lik mellom de målte datoene. Imidlertid kan små forskjeller mellom datoer observeres, og som sådan anbefales det å regenerere en standardkurve som en del av avlesningen av bærercelleforsøkene.
Når MFI for individuelle bærere er bestemt, kan cellebærerassosiasjonsdataene absolutt kvantifiseres og tolkes mer nøyaktig. Det anbefales å utføre tidsforløpseksperimenter, for eksempel inkubering av HeLa-celler fluorescerende merket med 235 nm PMASH-kapsler , for forskjellige tidspunkter mellom 0 timer og 24 timer (figur 6). Som forventet øker median cellefluorescens over tid, noe som indikerer at kapslene knytter seg til HeLa-celler. Selv om slike eksperimenter kan brukes til å sammenligne den relative transportørens ytelse på forskjellige tidspunkter, er disse resultatene ikke helt kvantitative.
Betydningen av absolutt kvantifisering, enten det gjøres via cytometerstrømmen eller bulkstrømmen, blir tydelig når man sammenligner sammenhengen mellom to bærertyper. Figur 7 viser de samme to eksperimentene, analysert ved enten relativ kvantifisering (figur 7A) eller absolutt kvantifisering. Forskjellen i den tilsynelatende cellulære responsen til bærere er sterk, avhengig av analysen som utføres; bærere bør ikke sammenlignes direkte ved bruk av relativ kvantifisering (figur 7A), mens absolutt kvantifisering er uavhengig av merkeintensitet og dermed mer sammenlignbar (figur 7B).
Figur 3: Telling av partikler ved hjelp av et flowcytometer (Cytometer Stream). Et Apogee flowcytometer ble brukt. (A) Partikkeltelling ved hjelp av en optisk kanal (SALS), noe som resulterer i et hendelsestall på 200 659. (B) Transportørtelling ved bruk av transportørens fluorescerende kanal, noe som resulterer i et hendelsestall på 204 636. I begge tilfeller ble en arcsinh-transformasjon etterfulgt av gating påført (henholdsvis 6 og 4). Tall laget av rådata av 633 nm kjerneskallpartikler først publisert i Faria et al.10. Forkortelse: SALS = småvinklet lysspredning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Telling av transportører ved hjelp av Nanoparticle Tracking Analysis (Bulk Stream). Superparamagnetiske jernoksid nanopartikler på 100 nm i størrelse ble karakterisert og talt ved hjelp av Nanoparticle Tracking Analysis. Venstre, konsentrasjon / størrelse histogram av individuelle resultater av fem replikere målinger. Høyre, gjennomsnittlig konsentrasjon / størrelsesfordeling ± SEM på fem replikasjoner. I denne spesielle prøven ble det utført en fortynning på 1:2 000 fra lager for å oppnå en konsentrasjon innenfor instrumentets dynamiske område. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Konvertering av MESF til MFI ved hjelp av kvantifiseringsperler på et flowcytometer (Bulk Stream). Fluorescerende perler med fire forskjellige MESF-verdier ble analysert på et flowcytometer på forskjellige dager, og standardkurver ble tegnet. Forkortelser: MESF = molekyler av ekvivalent løselig fluorokrom; MFI = median fluorescensintensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Endelig celleeksperiment på flow cytometer-tidsforløpsserier (Cytometer Stream og Bulk Stream). Representative bilder av flowcytometridata fra et tidsforløpseksperiment. THP-1-celler ble inkubert med en 235 nm polymerkapsel i 0 timer, 1 t, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 16 timer og 24 timer (venstre til høyre). Bærerfluorescens vises på x-aksen, mens en optisk kanal vises på y-aksen. I alle tilfeller ble det utført en arcsinh-transformasjon. Ingen gating ble utført (annet enn å velge grensene for grafen). Opprettet fra rådata i Faria et al.10. Forkortelse: SALS = småvinklet lysspredning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Relativ versus absolutt kvantifisering av bærer-celle-assosiasjon (Cytometer Stream og Bulk Stream). Begge figurene visualiserer data fra de samme to eksperimentene, en 24 timers inkubasjon mellom RAW264.7 makrofager og 150 nm (blå) eller 633 nm kjerneskallbærere (oransje), opprettet fra rådata i Faria et al.10. Medianene til begge tekniske replikaene er plottet. (A) Relativ kvantifisering, rapportert som MFI i a.u. (B) Absolutt kvantifisering, rapportert som antall bærere per celle. Forkortelser: MFI = median fluorescensintensitet; a.u. = vilkårlige enheter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karakterisering av samspillet mellom legemiddelbærere og celler blir stadig viktigere i utviklingen av nye legemiddelleveringssystemer. Spesielt for å tillate rasjonell evaluering og sammenligning av ulike bærerkonstruksjoner, er absolutt kvantifisering av ytelsen til transportøren til å samhandle med mål- og off-target-celler kritisk. Denne protokollen beskriver en tostrømsmetode som gjør det mulig for enhver forsker som arbeider med en legemiddelbærer å konvertere relative, semikvantitative flowcytometridata om cellebærerforening til absolutte kvantitative resultater. Den skisserte prosessen gjelder for alle typer bærere - små, store, organiske, uorganiske - forutsatt at de er fluorescerende merket. Imidlertid krever forskjellige bærere forskjellige tilnærminger for å beregne bærerne per celle. Dette skyldes grensene for ulike instrumenteringer som brukes til de nødvendige karakteriseringsmålingene.
Som sådan er denne protokollen delt inn i to strømmer: Cytometer Stream og Bulk Stream. Den første, Cytometer Stream, er den enklere tilnærmingen og krever bare et flowcytometer, men dette cytometeret må være følsomt nok til å oppdage de enkelte bærerne som brukes, eller med andre ord, stoffbæreren av interesse må være stor og tett nok til å bli oppdaget. Bulk Stream er kompatibel med alle bærertyper, da behovet for å oppdage individuelle bærere omgås ved bruk av alternativ instrumentering. Bulk Stream krever imidlertid flere karakteriseringseksperimenter som skal gjøres.
For å hjelpe til med å velge riktig strøm (og som sådan de riktige teknologiene), er de ovennevnte hensynene oppsummert i et beslutningstre (figur 1). For å gjenta, er Bulk Stream egnet for alle forskere uavhengig av hvilken transportørtype som brukes, og kan dermed alltid tilbakestilles som en sikkerhetskopi. Arbeidsflytene til de to strømmene er skissert i figur 2. Spesielt, med de pågående fremskrittene i følsomheten til flowcytometre, er det mulig at Cytometer Stream kan brukes til mer <300 nm-bærere.
Noen få notater bør gjøres på denne prosedyren. For det første er den beskrevne strategien for å konvertere cellefluorescensen til et absolutt antall bærere per celle avhengig av måling av den enkelte bærerfluorescens i suspensjon. Imidlertid påvirkes fluorescens av det umiddelbare kjemiske miljøet til fluorokrom (f.eks. bærerfortynningsmidlet, celleoverflaten eller forskjellige intracellulære rom). Spesielt er det sure miljøet i det endosomale rommet kjent for å påvirke fluorescensintensiteten til visse primært proteinbaserte fargestoffer11. Uavhengig av hvilken bærertype som er studert, anbefales det derfor å bruke pH-ufølsomme og svært fotostabile fargestoffer for merking av legemiddelbærere (se materialtabellen for en anbefaling). Den ekstra fordelen med dette fargestoffområdet er dets generelle lysstyrke, noe som forbedrer følsomheten til deteksjon av legemiddelbærere.
For det andre er metodene diskutert ovenfor ment å gi veiledning, men på ingen måte danne en eksklusiv liste over teknikker som kan brukes til å utføre de ulike trinnene i kvantifiseringsarbeidsflyten. Spesielt finnes det en rekke teknikker for å telle mindre eller lavspredningsbærere (som de i Bulk Stream). Disse inkluderer andre instrumenter som er i stand til å utføre den samme Nanoparticle Tracking Analysis12, samt andre metoder helt, for eksempel multi-vinkel dynamisk lysspredning, massespektroskopi, elektronmikroskopi 13, gravimetri eller optisk tetthetsmålinger (videre gjennomgått av Shang og Gao14). Videre er denne eksperimentelle kvantifiseringen - flytting fra vilkårlige fluorescensenheter til et absolutt antall bærere per celle - bare en del av det som kan kalles en "kvantitativ biologisk arbeidsflyt". Absolutt eksperimentell kvantifisering er nødvendig, men ikke tilstrekkelig. Bare kvantifisering og rapportering av transportørforeningen tar ikke hensyn til forskjeller i partikkelassosiasjon på grunn av det eksperimentelle oppsettet, for eksempel inkubasjonstid, dose og konsentrasjon av legemiddelbærer tilsatt, eller antall celler som brukes per eksperimentell beholder.
I tillegg kan bærere med forskjellige fysisk-kjemiske egenskaper ha svært forskjellige doser levert til celler, selv når det eksperimentelle oppsettet er identisk15. Transportørens ytelse - selv in vitro - kan ikke bestemmes uten å ta hensyn til alle disse faktorene. Med andre ord, bare kvantifisering av bærer-celle-foreningen tillater generelt ikke en objektiv sammenligning av bærere mellom forskere og laboratorier. I lys av dette har det vært tidligere diskutert viktigheten av å utføre tidsforløpseksperimenter av bærer-celle-assosiasjon og påfølgende i silico matematisk modellering for å utlede kinetiske parametere (dvs. hastighetskonstanter) som et objektivt og kvantitativt mål på affiniteten mellom et bestemt bærercellepar10. Eksperimentell kvantifisering er også en forutsetning for at andre silikoteknikker skal kunne anvendes, for eksempel å identifisere potensielle kilder til biologisk heterogenitet16 eller bestemme penetrasjonskinetikk i en kompleks biologisk modell17. Kombinert med retningslinjene for minimumsinformasjonsrapportering i Bio-Nano eksperimentell litteratur for standardisert rapportering18, kan den kvantitative evalueringen av bærerytelse akselerere utviklingen av ny nanomedisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC; GNT1149990), Australian Centre for HIV and Hepatitis Virology Research (ACH2), samt en gave fra boet til Réjane Louise Langlois. F.C. anerkjenner tildelingen av et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Senior Principal Research Fellowship (GNT1135806). Figur 1 og figur 2 ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
- Conde, J., et al. Revisiting 30 years of biofunctionalization and surface chemistry of inorganic nanoparticles for nanomedicine. Frontiers in Chemistry. 2, 48 (2014).
- Cheng, Q., et al. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Jackson, N. A. C., Kester, K. E., Casimiro, D., Gurunathan, S., DeRosa, F. The promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines. 5 (1), 1-6 (2020).
- Press, A. T., et al. Cargo-carrier interactions significantly contribute to micellar conformation and biodistribution. NPG Asia Materials. 9 (10), 444 (2017).
- Cevaal, P. M., et al. In vivo T cell-targeting nanoparticle drug delivery systems: Considerations for rational design. ACS Nano. 15 (3), 3736-3753 (2021).
- Faria, M., Johnston, S. T., Mitchell, A. J., Crampin, E., Caruso, F. Bio-nano science: Better metrics would accelerate progress. Chemistry of Materials. 33 (19), 7613-7619 (2021).
- Shin, H., Kwak, M., Geol Lee, T., Youn Lee, J. Quantifying the level of nanoparticle uptake in mammalian cells using flow cytometry. Nanoscale. 12 (29), 15743-15751 (2020).
- Lozano-Andrés, E., et al. Considerations for MESF-bead based assignment of absolute fluorescence values to nanoparticles and extracellular vesicles by flow cytometry. bioRxiv. , (2021).
- Schwartz, A., et al. Formalization of the MESF unit of fluorescence intensity. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 57 (1), 1-6 (2004).
- Faria, M., et al. Revisiting cell-particle association in vitro: A quantitative method to compare particle performance. Journal of Controlled Release. 307, 355-367 (2019).
- Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Analytical Chemistry. 80 (19), 7437-7444 (2008).
- Comfort, N., et al. Nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (169), e62447 (2021).
- Cui, J., et al. Immobilized particle imaging for quantification of nano- and microparticles. Langmuir. 32 (14), 3532-3540 (2016).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: Towards accurate determination of the molar concentration. Chemical Society Reviews. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Thomas, D. G., et al. ISD3: A particokinetic model for predicting the combined effects of particle sedimentation, diffusion and dissolution on cellular dosimetry for in vitro systems. Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 6 (2018).
- Johnston, S. T., Faria, M., Crampin, E. J. Isolating the sources of heterogeneity in nano-engineered particle-cell interactions. The Journal of the Royal Society Interface. 17 (166), 20200221 (2020).
- Ahmed-Cox, A., et al. Spatio-temporal analysis of nanoparticles in live tumor spheroids impacted by cell origin and density. Journal of Controlled Release. 341, 661-675 (2022).
- Faria, M., et al. Minimum information reporting in bio-nano experimental literature. Nature Nanotechnology. 13 (9), 777-785 (2018).
