Summary
Transplantation af humane pluripotente stamcelleafledte GABAergiske neuroner genereret af neuronal programmering kan være en potentiel behandlingsmetode for neuroudviklingsforstyrrelser. Denne protokol beskriver generering og transplantation af humane stamcelleafledte GABAergiske neuronale forstadier i hjernen hos neonatale mus, hvilket muliggør langsigtet undersøgelse af podede neuroner og evaluering af deres terapeutiske potentiale.
Abstract
Et reduceret antal eller dysfunktion af hæmmende interneuroner er en almindelig bidragyder til neuroudviklingsforstyrrelser. Derfor er celleterapi ved hjælp af interneuroner til at erstatte eller afbøde virkningerne af ændrede neuronale kredsløb en attraktiv terapeutisk vej. Til dette formål er der behov for mere viden om, hvordan humane stamcelleafledte GABAergic interneuron-lignende celler (hdIN'er) modnes, integreres og fungerer over tid i værtskredsløbet. Af særlig betydning i neuroudviklingsforstyrrelser er en bedre forståelse af, om disse processer i transplanterede celler påvirkes af en udviklende og modnet værtshjerne. Den nuværende protokol beskriver en hurtig og yderst effektiv generering af hdIN'er fra humane embryonale stamceller baseret på transgen ekspression af transkriptionsfaktorerne Ascl1 og Dlx2. Disse neuronale forstadier transplanteres ensidigt efter 7 dage in vitro til hippocampus hos neonatale 2-dages gamle mus. De transplanterede neuroner spredes i ipsi- og kontralateral hippocampus af en musemodel af kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom og overlever i op til 9 måneder efter transplantationen. Denne tilgang gør det muligt at undersøge den cellulære identitet, integration, funktionalitet og terapeutiske potentiale af transplanterede interneuroner over længere tid i udviklingen af sunde og syge hjerner.
Introduction
Etablering, modning og forfining af neuronale netværk forekommer i den perinatale og tidlige postnatale periode og represe et afgørende tidsvindue for hjernens udvikling1. Fra en overflod af forbindelse efter fødslen udvikler hjernen sig til en finjustering af forbindelser, der strækker sig indtil ungdomsårene2. Derfor definerer ændringer i gener udtrykt i disse perioder såvel som eksterne faktorer eller fornærmelser en persons disposition for flere neuroudviklingsforstyrrelser. Svækkelser i kognition og motorisk funktion udfolder sig over tid, og farmakologiske behandlinger er begrænsede, de fleste er rettet mod symptomer med risiko for alvorlige bivirkninger.
Dysfunktion i gamma-aminosmørsyre (GABA) ergisk hæmning har vist sig at være en stor bidragyder til den underliggende årsag til forskellige neuroudviklingsforstyrrelser3, såsom skrøbeligt X syndrom, Angelman syndrom, epilepsi, skizofreni, og autisme. GABA er den vigtigste hæmmende transmitter i centralnervesystemet og er medvirkende til at opretholde excitatorisk / hæmmende (E / I) balance, synkronisering af neuronal fyring og beregning. GABAergiske interneuroner er en heterogen population af neuroner, med stigende funktionel forvikling i mere komplekse hjerneområder4 og med evolution 5,6. I betragtning af den begrænsede endogene regenerative kapacitet i den menneskelige hjerne og implikationen af interneuron dysfunktion i flere neurologiske lidelser, kan transplantationen af GABAergic interneuroner være en lovende terapeutisk vej at udforske. På denne linje synes humane stamcelleafledte GABAergiske interneuronlignende celler (hdIN'er) at være den mest translationelle og levedygtige kilde til dette formål sammenlignet med gnaverallogene neuronale prækursorer eller andre kilder, der anvendes andre steder7. Protokoller til generering af GABAergiske neuroner fra forskellige cellekilder er tilgængelige 8,9,10,11,12,13, men der kræves mere viden om, hvordan hdIN'er modnes, integreres og fungerer over tid i en udviklende patologisk hjerne. Flere undersøgelser har identificeret ændringer i gener, der er aktive under kortikal mønsterdannelse, etablering af neuronal forbindelse14 og tuning af fysiologisk E / I-balance15. Neonatal transplantation af hdIN'er til musemodeller med tilsvarende genetiske forstyrrelser giver os mulighed for at følge samspillet mellem vært og transplantat, hvilket er viden, der er nødvendig for at bestemme potentielle terapeutiske strategier.
Immunmodulation anvendes almindeligvis og med succes i xenografttransplantationer for at undgå at udløse et værtsimmunrespons og afvisning16. Administrationen af immunsuppressive lægemidler, såsom cyclosporin A, forårsager imidlertid nyretoksicitet efter kronisk administration, er arbejdskrævende på grund af behovet for daglige intraperitoneale injektioner for at opnå stabile systemiske koncentrationer, hvilket forårsager dyrestress17 og har off-target effekter, der kan interagere med patologi18. Derudover har kompromittering af immunsystemet vist sig at ændre adfærdsmæssige fænotyper19 med ændringer i de tilsvarende neuroanatomiske regioner20. Transplantation i den første uge af livet har vist sig at give mulighed for tilpasning til transplanterede celler 21,22, mens andre har rapporteret indledende overlevelse efterfulgt af afvisning af transplantaterne inden for den første postnatale måned 23,24.
Denne protokol beskriver procedurer fra hdIN-generation til celletransplantation hos neonatale mus, hvilket resulterer i langsigtet graftoverlevelse og giver mulighed for undersøgelse af neuronal specificitet, synaptisk integration, funktion og terapeutisk potentiale hos transplanterede humane interneuroner under fysiologisk og patologisk udvikling.
Protocol
Alle forsøgsprocedurer blev godkendt af Malmø/Lund Dyreforsøgsetiske Råd, etisk tilladelsesnummer 12548-19, og udført i overensstemmelse med den svenske dyrevelfærdsstyrelses regler og EU-direktivet 2010/63/EU for dyreforsøg. C57BL6/J og Contactin-associeret proteinlignende 2 (Cntnap2) knock-out (KO) mus, både hanner og hunner, blev brugt på postnatal dag (P) 2 til denne undersøgelse. Der blev anvendt humane embryonale stamceller (hESC'er). Dyrene og stamcellerne blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
1. Generering af hdIN-prækursorer
BEMÆRK: Alle trin i dette afsnit udføres i en cellekulturhætte. HESC'erne blev opretholdt som fødefrie celler på coatede plader ved hjælp af et stamcellekulturmedium og passeret som kolonier.
- Udfør fremadrettet programmering af hESC'erne til hdIN-prækursorer (figur 1).
BEMÆRK: Den fremadrettede programmeringsmetode er baseret på den procedure, der er beskrevet i Gonzalez-Ramos et al.8 og Yang et al.9.- HESC'erne transduceres med lentivirale vektorer indeholdende Tet-On-systemet i et frisk stamcellekulturmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer (RI) (se Materialetabel). Opbevares ved 37 °C i inkubatoren.
- Transformatoriet ændres til et frisk stamcellekulturmedium 16 timer efter transduktion, og de transducerede celler opretholdes på samme måde som de ikke-transducerede hESC'er.
- Når de er sammenløbende, afmonteres hESC'erne som enkeltceller ved hjælp af en celleløsningsopløsning (se Materialetabel) og dem i coatede 6-brøndsplader med en densitet på 3 x 105 celler / brønd i stamcellekulturmedium indeholdende 10 μM RI on day in vitro (DIV) -1.
- Ved 1 DIV udskiftes dyrkningsmediet med N2-medium indeholdende 2 g/l doxycyclin (DOX, se Materialetabel).
BEMÆRK: DOX bruges til at inducere transgenekspression af Ascl1 og Dlx29, fra 1 DIV til 7 DIV, og fortsætter derefter in vivo ved tilsætning til drikkevandet25. - Ved 2 DIV starter en periode til udvælgelse af antibiotikaresistens, der varer indtil 5 DIV. Tilsæt puromycin (puro) og hygromycin (hygro) til det friske medium (se Materialetabel). Skift mediet på 2 DIV, 4 DIV og 5 DIV.
BEMÆRK: Optimer koncentrationerne af puro og hygro før differentieringsprotokollen ved hjælp af transducerede og ikke-transducerede hESC'er for at sikre overlevelsen af kun de celler, der bærer antibiotikaresistenskassetterne. I denne protokol blev der anvendt 0,5 μg/ml puro og 750 μg/ml hygro. - Ved 5 DIV slutter antibiotikaudvælgelsesperioden. Skift til N2-medium suppleret med 2 g / L DOX og 4 μM cytosin β-D-arabinofuranosid (Ara-C, se Materialetabel).
Figur 1: Generering af hdIN-prækursorer fra hESC'er ved at overudtrykke Ascl1 og Dlx2. (A) Skemaer over den differentieringsprotokol, der anvendes til generering af hdIN-prækursorer. (B-E) Immunocytokemi af hdIN-prækursorer ved 7 DIV for (B) neuronal markør MAP2, (C) den proliferative markør Ki67, (D) generel nuklear farvning og (E) en sammensmeltning af de tidligere markører. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Forberedelse af enkeltcellesuspensionen til transplantation
BEMÆRK: Alle trin i dette afsnit udføres i cellekulturhætten. På 7 DIV dissocieres hdIN-prækursorer og anvendes til transplantation.
- Udfør løsrivelse af cellerne ved at følge nedenstående trin.
- Fjern mediet og skyl forsigtigt cellerne med DPBS uden calcium og magnesium.
- Der tilsættes 400 μL celleaftagningsopløsning (se Materialetabel) til hver brønd på 6-brøndspladen.
BEMÆRK: Sørg for, at hele overfladen dækkes af løsningen. - Inkuberes i 2-3 minutter ved 37 °C i inkubatoren, indtil cellernes kant begynder at se skinnende ud, hvilket indikerer enzymatisk nedbrydning af celleoverfladeproteiner og løsrivelse fra brøndoverfladen.
BEMÆRK: For at øge celleoverlevelsen skal du ikke vente for længe, når alle cellerne er helt løsrevet og flyder rundt. - Derefter tilsættes 600 μL frisk N2-medium til hver brønd i 6-brøndspladen for at stoppe enzymet, og mekanisk med pipetten hjælper med at løsne cellerne for at opnå en enkeltcellesuspension.
- Cellesuspensionen overføres til et plastrør (15 ml) og centrifugeres ved 180 x g i 4 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Udfør resuspension af cellerne.
- Supernatanten kasseres ved hjælp af et vakuumsystem (omhyggeligt uden at forstyrre pelleten), og pelleten gensuspenderes i transplantationsmediet indeholdende 10 μM RI, 1 μg/ml DNase og 2 μg/μL DOX.
- Tæl de samlede celler i suspensionen ved hjælp af et tællekammer og en manuel celletæller, og juster volumenet til en endelig koncentration på 100.000 celler / μL.
- Opbevar cellesuspensionen i et lukket rør på is indtil transplantation i højst 4 timer.
BEMÆRK: Transplantationen skal udføres samme dag som fremstillingen af cellesuspensionen (7 DIV).
3. Intrahippocampal celletransplantation
BEMÆRK: Alle trin i dette afsnit udføres uden for cellekulturhætten i dyreanlægget. Tidlig postnatal transplantation af celler i hjernen blev udført på P2, i betragtning af P0 fødselsdagen.
- Forbered dig på transplantationseksperimentet ved at følge nedenstående trin.
- Autoklave alt det kirurgiske materiale eller, hvis det ikke er muligt, sterilisere med en anden godkendt metode.
- Monter injektionssprøjten i holderen uden glaskapillær. Skyl nålen med vand.
BEMÆRK: Nålen skal være 33 G. - Kurve 90° spidsen af en 30 G insulinnål.
- Opret en hjemmelavet Play-Doh-lignende scene til placering af hvalpen med hovedet fladt (figur 2A).
- Hent museburet med moderen og hvalpene, før du forbereder noget til operationen, så de kan akklimatisere sig til det nye miljø.
- Forbered en bakke med våd is og et tomt bur med noget papir til isofluranen.
- Bedøve musehvalpen.
- Blødgør et stykke papir med isofluran (se Materialetabel) og læg det inde i det tomme bur. Tag forsigtigt en hvalp og læg den i buret med papiret gennemblødt i isofluran.
BEMÆRK: Efterlad aldrig mindre end tre hvalpe hos moren. Overskrid ikke 20-30 s isofluranbedøvelse, ellers kan hvalpen dø. - Kontroller effekten af anæstesien ved bevægelsesophør.
- Umiddelbart efter anæstesi skal du placere hvalpen på et vådt væv på overfladen af våd is. Hold dyret på is i 3 minutter, indtil de øvre lemmer bliver hvide (figur 2B, blå pil). Dette tager normalt 2-3 min.
- Brug denne tid til at fylde sprøjten med cellesuspensionen. Resuspender cellerne forsigtigt med en pipette før.
- Placer hvalpen på stereotaxisk ramme. Brug ørestængerne i modsat retning (figur 2A, magentapile).
BEMÆRK: Bagsiden af ørestængerne er mindre spids, og da P2-hvalpe ikke har ører, skal du bruge den fladere side for at undgå at skade dyret. - Fra siden skal du kontrollere, om hovedet er lige. Hovedet skal være fladt; brug den Play-Doh-lignende scene til at justere for det.
BEMÆRK: Hvalpe i denne alder har endnu ikke åbnet øjnene, så der skal ikke gøres yderligere skridt i denne henseende. Hvalpe har ikke pels i denne alder, så der kræves ingen barbering af området. Der gives ingen specifik smertebehandling, da det ikke er et åbent snit i huden, og der er ingen suturering involveret. - Hold hvalpen dækket på is (oven på silkepapir) i hele operationens varighed.
BEMÆRK: Anbring ikke isen i direkte kontakt med hvalpens hud.
- Blødgør et stykke papir med isofluran (se Materialetabel) og læg det inde i det tomme bur. Tag forsigtigt en hvalp og læg den i buret med papiret gennemblødt i isofluran.
- Udfør injektionen.
- Rengør overfladen af huden ved hjælp af et blødt væv gennemblødt i ethanol.
- Identificer lambda, og indstil koordinaterne til nul på stereotaxic-instrumentets digitale skærmkonsol (figur 2C, gul stiplet linje). Sagittale og lambdoid suturer er let synlige ved øjet, da de er vaskulariserede som røde linjer.
BEMÆRK: Hvis du oplever problemer med at visualisere lambda, skal du placere et lille stykke is på huden og vente et par minutter på, at det køler ned. Fjern derefter isstykket, og den subtile blegning af huden giver dig mulighed for at visualisere. - Flyt kanylen til de ønskede koordinater. I den beskrevne protokol var den målrettede region hippocampus, og koordinaterne var som følger: anterior-posterior (AP) +0,85 og medio-lateral (ML) +1,35.
- Brug en 90° bøjet insulinnål til at trænge ind i kraniet og skabe et lille hul.
- Bring kanylen ned, indtil den har krydset kraniet, og nul dorso-ventrale (DV) koordinater. Sænk nålen, indtil de ønskede DV-koordinater. I den beskrevne protokol var koordinaterne DV -1,1.
- Injicer i henhold til de forudbestemte tidsintervaller.
BEMÆRK: I den beskrevne protokol var de nøjagtige tidspunkter følgende: (i) efter at have gået ned til DV-koordinaten, vent 3 min, (ii) injicer 1 μL volumen i 5 min, og (iii) efter at alt volumen er blevet injiceret, vent 3 min. - Træk nålen langsomt tilbage.
- Afslut proceduren.
BEMÆRK: Operationen kan ikke vare mere end 15 minutter for at sikre hvalpens overlevelse og undgå skader afledt af anæstesien ved hypotermi.- Varm hvalpen op med hænderne, indtil den begynder at bevæge sig, før du giver den tilbage til moderen.
- DOX gives i en koncentration på 1 mg/ml i 0,5% saccharoseopløsning som drikkevand i mindst 2 dage før og 3 uger efter transplantationen (PT) for at fortsætte celledifferentieringen in vivo.
Figur 2: Stereotaxisk transplantation hos nyfødte museunger på P2. (A) En Play-Doh-lignende scene til at holde hvalpens krop på plads og omvendte ørestænger (magentapile). (B) Hvid forpote (blå pil), der indikerer den nedsatte blodgennemstrømning i dette område, så hvalpen oplever anæstesi ved hypotermi. (C) Oversigt over opsætningen med hvalpen, der allerede er dækket af is over blødt silkepapir. (c#) Lukket zoom af hvalpens hoved, med injektionsnålen allerede indsat i hjernen (gul stiplet linje, der angiver lambda og lambdoid suturer). Denne figur er tilpasset fra Gonzalez Ramos et al. 27. Klik her for at se en større udgave af denne figur
Representative Results
Efter protokollen præsenteret her og illustreret i figur 1A var hdIN-prækursorer endnu ikke proliferative ved 7 DIV som defineret ved (i) negativ immunreaktivitet for cellecyklusmarkøren Ki67 og (ii) udtrykke neuronale markører såsom mikrotubuli-associeret protein 2 (MAP2) (figur 1B-E). Denne karakterisering blev udført på resterende celler, der blev omlagt i 24 timer efter at have gennemgået alle proceduretrinnene. Derudover viste den tidligere offentliggjorte genekspressionsanalyse, at en hurtig overgang fra den pluripotente tilstand til en neuronal fænotype forekommer omkring 4 DIV og 7 DIV8. Samlet set bekræftede disse resultater tilstedeværelsen af postmitotiske celler og fraværet af risiko for teratomdannelse.
Dernæst blev hdIN-forstadiernes overlevelse efter tidlig postnatal transplantation i hippocampus af vildtype (WT) mus testet ved immunhistokemi mod den humane cytoplasmatiske markør STEM121. HDIN-forstadierne blev transplanteret ind i højre dorsale hippocampus af naive immunkompetente mus på P2, som derefter blev ofret ved P14 og 2 måneder PT. Podede celler blev fundet over hele dorsal hippocampus samt spredt gennem corpus callosum og den kontralaterale hippocampus på begge tidspunkter. Desuden udtrykte podede hdIN'er på begge tidspunkter Ascl1, en af induktionstranskriptionsfaktorerne (supplerende figur 1), og var ikke proliferative, som det fremgår af fraværet af Ki67-ekspression (supplerende figur 2).
Det er vigtigt, at der ikke blev fundet nogen immunreaktion eller lokal inflammation mod de transplanterede celler hverken ved P14 eller 2 måneder PT, som vurderet ved fraværet af reaktiv microglia identificeret ved anvendelse af Iba1, CD68 og galectin-3 (Gal3) (figur 3), omfanget af astrogliose bestemt af glialfibrillærsyreproteinet (GFAP) og inflammatoriske cytokiner såsom interleukin-1 (IL-1), og fraværet af cytotoksiske T-lymfocytter (CD8) (figur 4).
Figur 3: hdIN'er ved P14 og 2 måneders PT ind i hippocampus hos nyfødte WT-mus uden at udløse immunafstødning fra værtsvævet. Immunofluorescens for Iba1, CD68 og Gal3 markører i hjernevæv fra (A-D) nærheden af et iskæmisk kerneområde i en elektrokoagulationsslagmusemodel (positiv kontrol, Ctrl +), (E-H) negative kontroldyr (Ctrl-) efter 2 måneder og (M-P) P14 og (I-L) dyr, der har gennemgået celletransplantation efter 2 måneder og (Q-T ) s. 14. De hvide pile angiver nogle eksempler på blodkar, der er synlige ved alle kanaler på grund af autofluorescens. Forkortelser: Ctx = cortex; Hofte = hippocampus; DG = dentat gyrus; CA1 = cornu ammonis 1. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: hdIN'er ved 2 måneders PT i hippocampus hos nyfødte WT-mus uden at udløse immunafstødning fra værtsvævet. Immunfluorescens for IL1-, GFAP- og CD8-markører i hjernevæv fra (A-D) nærheden af et iskæmisk kerneområde i en elektrokoagulationsslagsmusemodel (positiv kontrol, Ctrl +), (E-H) negative kontroldyr (Ctrl-) efter 2 måneder og (I-L) dyr, der har gennemgået celletransplantation efter 2 måneder. Forkortelser: Ctx = cortex; Hofte = hippocampus; DG = dentat gyrus. Skala bar: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
På samme måde blev hdIN-forstadier også transplanteret i hippocampus hos Cntnap2 KO-mus, en model for autismespektrumforstyrrelse og kortikal dysplasi-fokal epilepsisyndrom. I Cntnap2 KO-musene overlevede hdIN'erne faktisk op til 9 måneder PT og blev lokaliseret på injektionsstedet, selvom de også blev spredt over den ipsilaterale og endda den kontralaterale hippocampus som observeret i WT-musene (figur 5). Desuden var de fleste af de podede hdIN'er immunreaktive for interneuronmarkører, som forventet fra tidligere resultater in vitro 8,26 og hos voksne gnavere in vivo25.
Figur 5: Podede hdIN'er i hippocampus af Cntnap2 KO-mus efter 9 måneders PT. (A) Immunkemi mod den cytoplasmatiske humane markør STEM121 i celletransplanterede (venstre) og falske (højre) mus. (a1 og a2) Forstørrede billeder af STEM121-positive celler. (B) Immunfluorescens for STEM121 (magenta) og interneuronmarkørerne parvalbumin (PV) og somatostatin (SST). Hvide pile angiver dobbelt positive celler for STEM121 og den respektive interneuronmarkør. (C) Ortogonal visning af en podet hdIN-immunreaktiv for STEM121 og PV. Skalalinje: 200 μm (A og B), 100 μm (a1 og a2), 20 μm (lille kvadratisk forstørrelse i a1 og a2 og C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Podede hdIN'er ved 2 måneders PT i hippocampus hos nyfødte WT-mus, der udtrykker Ascl1. Immunfluorescens mod Ascl1 og den cytoplasmatiske humane markør STEM121 ved (A) CA3 og (B) DG hos celletransplanterede WT-mus. (a) Forstørret billede af en STEM121-positiv celle. De hvide pile angiver dobbeltpositive celler for STEM121 og Ascl1. Skala bar: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Post-mitotiske podede hdIN'er efter 2 måneders PT i hippocampus hos nyfødte WT-mus. Immunfluorescens mod den proliferative markør Ki67 og den cytoplasmatiske humane markør STEM121 i (A) naive og (B) celletransplanterede WT-mus. (b) Forstørret billede af en STEM121-positiv celle. Den gule pil angiver en celle positiv for Ki67 og negativ for STEM121. Den hvide pil angiver celler, der er positive for STEM121 og negative for Ki67. Den hvide stjerne peger på en lateral ventrikel. Skala bar: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den nuværende protokol beskriver en robust, hurtig, enkel og bredt tilgængelig metode til at generere hdIN-prækursorer in vitro og dens anvendelse som tidlig interventionel celleterapi i prækliniske modeller af neuroudviklingsforstyrrelser.
Selvom nogle af de karakteristiske fænotyper af neuroudviklingsforstyrrelser opstår i ungdomsårene eller voksenalderen, er patofysiologiske ændringer allerede til stede under tidlig udvikling. Af denne grund ville tidlig intervention være stærkt berettiget til at opnå gavnlige virkninger ved at handle i kritiske hjerneudviklingsperioder før symptomatologi eller klinisk manifestation. I fremtiden vil genetisk screening og udvikling af biomarkører give profylaktisk eller præsymptomatisk behandling, hvilket repræsenterer en game changer for disse patienter. Derfor blev hdIN-forstadier transplanteret tidligt efter fødslen i Cntnap2 KO-musemodellen, når epileptogene ændringer i neuronalnetværket kan være i gang28 og på et tidspunkt, hvor cellulære ændringer er beskrevet i denne dyremodel29. Det er imidlertid vigtigt at overveje de potentielle faldgruber ved aldersekstrapolering og timingen af visse processer i musen versus den menneskelige hjerne.
Med fokus på selve proceduren er differentieringsprotokollen, der præsenteres her, baseret på brugen af transkriptionsfaktorer, som muliggør hurtig og meget effektiv programmering af stamceller sammenlignet med andre protokoller andre steder baseret på små molekyler10,30. En potentiel ulempe ved denne tilgang kan være kravet om lentivirale vektorer, som indebærer en risiko for insertional mutagenese. To kritiske trin i protokollen er tilsætningen af antibiotika og det anti-mitotiske middel til mediet for at vælge for celler, der udtrykker transkriptionsfaktorerne og eliminere proliferative celler, idet risikoen for henholdsvis teratomdannelse undgås. Selvom kun hdIN-prækursorer blev testet i denne undersøgelse, forventes proceduren at være mulig med andre cellekilder og programmerings- / differentieringsprotokoller. Ikke desto mindre bør andre neuronale undertyper og/eller modeller valideres.
HDIN-forløberens alder for transplantation, 7 DIV, blev besluttet ud fra (i) fraværet af proliferative celler, vurderet ved immunreaktivitet mod Ki67, (ii) sammen med den tidligere rapporterede observation af fald i ekspressionen af pluripotensgener såsom POU5F1 og udseendet af neuronal markør MAP2 og interneuronmarkøren GAD1 på det tidspunkt8 . Det oprindelige arbejde, der beskriver denne protokol, udførte imidlertid transplantationer ved 14 DIV efter DOX-tilbagetrækning9. Dette rejser spørgsmål om, hvorvidt DOX i moderens drikkevand kan nå celler podet i hjernen på ammende hvalpe via mælken, eller om 7 DIV DOX-induktion er nok til at fastslå GABAergic skæbne. Selvom Yang et al. identificerede 14 dages DOX som tilstrækkelig til at generere stabile neuronale celler in vitro9, opdagede Gonzalez-Ramos et al.8 GAD1-genekspression allerede ved 7 DIV, hvilket indikerer, at downstream-aktiveringen af GAD67 af Ascl1 og Dlx2 allerede har fundet sted på dette tidspunkt. Derfor er mønsteret begyndt ved 7 DIV og kan være mindre afhængig af DOX-behandlingen. Desuden indikerer beviser hos gnavere og mennesker tilstedeværelsen af DOX i modermælk 31,32, og de resultater, der præsenteres her, viser, at podede hdIN'er var immunreaktive forAscl1 efter 2 uger og 2 måneder PT og interneuronmarkører senere ved 9 måneder PT. Inden for den podede population, udover PV- og SST-positive neuroner, blev der også fundet andre markører for subpopulationer af interneuroner i lavere mængder, såsom calretinin (CR) og calbindin (CB).
Et udfordrende aspekt af denne procedure er koordineringen af timingen for både differentiering og hvalpenes alder. Normalt tager musens drægtighed 21 dage efter opsætning af parringsburet, omend dette kan variere nogle gange. Dette scenario forekommer ikke, når der udføres celletransplantationer hos voksne gnavere, når alt kan planlægges omhyggeligt og arrangeres. Ikke desto mindre kan dette let afhjælpes ved at oprette to til tre parringsbure med et 2-dages interval eller to til tre differentieringsbatcher med et 2-dages tidsforløb fra hinanden.
Selvom musene, der blev brugt i denne undersøgelse, hverken var immundefekte eller immunsupprimerede, overlevede de transplanterede celler op til 9 måneder in vivo, og markører for immunreaktion mod xenogene celler eller lokal inflammation blev ikke observeret ved hverken P14 eller 2 måneder PT. Immunafstødning af podede xenogene celler udløses mod MHC / peptider, og de vigtigste cellulære mediatorer for graftafstødning er T-lymfocytter og mikroglialceller33, 34. Derfor blev immunreaktivitet over for markører af T-celler såvel som reaktiv microglia undersøgt. Ingen tegn på immunafstødning af de podede celler i værtsvævet blev påvist hverken ved niveauer af reaktiv microglia eller ved tilstedeværelsen af T-lymfocytter i WT-mus ved P14 eller 2 måneder. Desuden blev der ikke observeret nogen lokal inflammation baseret på de vurderede niveauer af astrogliose og inflammatoriske cytokiner. Dette resultat kan delvist være afhængigt af neonatal immuntolerance 35,36,37, observeret af andre celleidentiteter, placeringer og dyremodeller35,38. Englund et al. identificerede regionale forskelle i resultatet af de podede celler med hensyn til migration og modning, herunder observation af podede celler i det tilstødende hvide stof35.
Endelig blev der observeret en større spredning af de podede celler i hippocampus sammenlignet med andre undersøgelser, der transplanterede til voksne gnavere, hvor hdIN'er forblev som en podet kerne25. Denne spredning adskiller sig også fra resultater, der tidligere er observeret af Yang et al.9, hvilket i dette tilfælde kunne forklares af cellernes alder på transplantationstidspunktet.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af det svenske forskningsråd (bevillingsnummer: 2016-02605, MA), den svenske hjernefond F02021-0369 (MA), Crafoord Foundation (MA) og Den Europæiske Unions Horizon 2020-program (H2020-MSCA-ITN-2016) under Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network-projektet Training4CRM nr. 722779 (M.K.). Vi er meget taknemmelige for hjælpen fra Andrés Miguez, fra Josep Maria Canals 'laboratorium (Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Barcelona), til undervisning i stereotaxisk celletransplantation i P2 nyfødte mus, og Mackenzie Howard, gruppeleder ved University of Texas i Austin, for råd og foreløbige koordinater til celletransplantation i hippocampus af P2 nyfødte mus. Vi takker Susanne Geres for at hjælpe med dyrepleje og Ling Cao for hjælpen med forarbejdning af væv, samt studerende, der på den ene eller anden måde har bidraget til undersøgelsen og specifikt Diana Hatamian. Endelig blev nogle af de grafikker, der blev brugt til at illustrere dette papir, oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
