Summary
本文描述了一种新型快速光学成像仪在长衰变发射样品的宏观光致发光寿命成像中的应用。描述了集成、图像采集和分析程序，以及用于成像的传感器材料的制备和表征以及成像仪在研究生物样品中的应用。
Abstract
本文提出了一种新的光致发光寿命成像仪，旨在绘制不同磷光样品中的分子氧（O 2）浓度，范围从固态O 2敏感涂层到用可溶性O2敏感探针染色的活体动物组织样品。特别是，使用了基于纳米粒子的近红外探针NanO2-IR，该探针可与625 nm发光二极管（LED）激发，发射波长为760 nm。成像系统基于Timepix3相机（Tpx3Cam）和光机械适配器，后者还装有图像增强器。O2磷光寿命成像显微镜（PLIM）是各种研究的常用方法，但当前平台在准确性、一般灵活性和可用性方面存在局限性。
这里介绍的系统是一个快速且高灵敏度的成像器，它建立在集成的光学传感器和读出芯片模块Tpx3Cam上。它被证明可以从表面染色的肠组织样本或大肠腔内染色的碎片中产生高强度磷光信号和稳定的寿命值，并允许在大约 20 秒或更短的时间内详细映射组织 O2 水平。还介绍了无意识动物移植肿瘤缺氧成像的初步实验。我们还描述了如何重新配置成像仪以用于基于Pt-卟啉染料的O2敏感材料，使用390 nm LED进行激发，使用带通650 nm滤光片进行发射。总体而言，发现PLIM成像仪可以对所用探头的寿命值以及O2 浓度的相应二维图进行准确的定量测量。它还可用于离体组织模型和活 体 动物的代谢成像。
Introduction
O 2是生命系统的关键环境参数之一，了解O 2的分布及其动力学对于许多生物学研究非常重要1，2，3。通过磷光探针4，5，6，7，8和PLIM 9，10，11，12，13评估组织氧合在生物和医学研究中越来越受欢迎3，9，14，15，16， 17，18，19.这是因为与荧光或磷光强度测量不同，PLIM不受探针浓度、光漂白、激发强度、光学对准、散射和自发荧光等外部因素的影响。
然而，当前的O2 PLIM平台受到其灵敏度、图像采集速度、准确性和一般可用性的限制。时间相关单光子计数（TCSPC）与光栅扫描程序相结合，经常用于PLIM和荧光寿命成像显微镜（FLIM）设备20，21，22。然而，由于PLIM需要较长的像素停留时间（在毫秒范围内），因此图像采集时间比FLIM应用所需的时间要长得多20，22，23。其他技术，如门控CCD / CMOS相机，缺乏单光子灵敏度，帧速率低20，24，25，26。此外，现有的PLIM系统大多以微观形式使用，而宏观系统不太常见27。
基于TCSPC的PLIM宏观成像仪28 的建立是为了克服其中的许多限制。使用新的光机械适配器Cricket极大地促进了成像仪的设计，该适配器具有以下特点：i）两个C接口适配器，可轻松耦合背面的相机模块和正面的物镜;ii） 用于图像增强器的内部外壳和板球外侧的后者的电源插座;iii） 正面 C 接口适配器后面的内部空间，可以在增强器前面安装标准的 25 mm 发射滤光片;iv）带有环形调节器的内置光准直光学元件，允许镜头和相机之间的光学对准/聚焦，以在相机芯片上产生清晰的图像。
在组装的成像仪中，相机模块耦合到Cricket适配器的背面，该适配器还包含一个图像增强器，该增强器由光电阴极组成，后跟微通道板（MCP），放大器和快速闪烁体P47荧光粉。板球内部装有760 nm±50 nm发射滤光片，物镜NMV-50M11'''安装在正面C接口适配器上。最后，镜头和相机与环形调节器光学对齐。
增强器的作用是检测入射光子并将其转换为相机芯片上的快速光爆发，这些光被记录并用于生成发射衰减和寿命图像。该相机模块包括基于TCSPC的先进光学传感器阵列（256像素x 256像素）和新一代读出芯片29，30，31，32，33，允许同时记录成像芯片每个像素的光子爆发的到达时间（TOA）和超过阈值的时间（TOT），时间分辨率为1.6 ns，读出速率为80 Mpixel/s。
在这种配置中，带有增强器的相机具有单光子灵敏度。它是数据驱动的，并且基于快速像素检测器读出（SPIDR）系统34。成像仪的空间分辨率先前用平面磷光O2 传感器和分辨率板模板表征。仪器响应函数（IRF）是通过平面荧光传感器在与所有其他测量相同的设置下成像来测量的。染料的寿命约为2.6 ns，足以用于PLIM模式下的IRF测量。成像仪可以对尺寸最大为 18 mm x 18 mm 的物体进行成像，空间和时间分辨率分别为 39.4 μm 和 30.6 ns（半最大值时全宽），分别为28。
以下协议描述了宏观成像仪的组装及其后续用途，用于绘制用先前表征的近红外O 2探针NanO2-IR35染色的生物样品中的O2浓度。该探针是一种基于铂（II）苯卟啉（PtBP）染料的明亮，可光，细胞渗透的O2传感探针。它在 625 nm 处可激发，在 760 nm 处发射，并在生理范围（0%-21% 或 0-210 μM 的 O 2）内对 O2 提供强大的光学响应。该成像仪还被证明可以表征基于Pt（II）-卟啉染料的不同传感器材料。总体而言，成像器紧凑而灵活，类似于普通的摄影相机。在当前设置中，成像仪适用于不同的宽场PLIM应用。用快速激光源代替LED将进一步提高成像仪的性能，并可能实现纳秒级FLIM应用。
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Protocol
所有动物程序均根据欧洲共同体理事会指令（2010/63 / EU）在健康产品监管局（HPRA，爱尔兰）颁发的授权下进行，并得到科克大学动物实验伦理委员会的批准。
1. 样品制备
- 用活组织样品离 体染色
- 对于 离体 应用，使用来自4周龄雌性Balb / c小鼠的新鲜分离的组织样品。
- 在实验当天，通过斩首对小鼠实施安乐死，并快速解剖结肠（大肠）的碎片，大小约为10毫米。立即用PBS缓冲液洗涤它们，置于补充有10mM Hepes缓冲液（pH 7.2）的DMEM培养基中，并在37°C下孵育36。
- 对于肠浆膜侧的表面染色，将活组织样品转移到迷你培养皿中，应用含有 2 mL 含有 1 mg/mL NanO2-IR 探针的完整 DMEM 以覆盖组织样品，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
注意：死后组织中的细胞在培养物中保持数小时的活性。NaNO2-IR显示出轻微的细胞毒性，因此所有实验在组织分离后4小时内完成。 - 对于深部组织腔内 离体 染色，将肠碎片转移到干燥的培养皿中，并用滤纸去除任何多余的DMEM。
- 用汉密尔顿注射器将 1 μL 含有 1 mg/mL NanO2-IR 35 的 DMEM 注入腔中，并将样品孵育15 分钟或长达 4 小时。
注意：NaNO2-IR显示出轻微的长期细胞毒性作用;因此，所有实验应在组织分离后4小时内完成。
- 活体动物染色肿瘤组织的制备
- 对于 体内 应用，在含有 NaNO2-IR 探针的无血清培养基中以 0.05 mg/mL 的速度对 CT26 细胞进行预染色 18 小时。
- 取一只小鼠，剃除右胁的注射区域，并用注射器注射200μL的1×10 5未染色细胞和1×105细胞的混合物预染NanO 2-IR。
- 允许肿瘤在小鼠中生长，用卡尺定期监测肿瘤大小和动物体重37。移植肿瘤的动物在肿瘤生长的第七天准备好进行成像。
注意：使用公式（1）计算肿瘤体积：
V = （L × W 2）/2 （1）
其中 L 是肿瘤的直径， W is是垂直于直径 L的直径。 - 在成像前通过颈椎脱位处死动物。
2. PLIM成像设置
- 拿起 Cricket 适配器，卸下其背面 C 接口适配器以进入内部的增强器外壳。将 MCP-125 图像增强器插入此隔间，然后将 C 接口适配器放回原处。
- 拆下 Cricket 的正面 C 接口适配器，插入 760 nm ± 50 nm 发射滤光片，然后放回 C 接口进行固定。
- 通过其 C 接口适配器 将 Tpx3Cam 摄像头模块连接到板球模块的背面
- 通过其 C 接口适配器 将 镜头连接到板球模块的正面。
- 将整个相机组件安装在光学黑匣子的顶部，朝下到样品成像的载物台（图1）。
- 将 624 nm 超亮 LED 安装在连接到黑匣子内面包板的立柱上。
- 将 LED 连接到电源和脉冲发生器。打开 LED 并聚焦，以确保成像样品的有效和均匀激发。
- 将摄像机连接到另一个脉冲发生器，并同步发送到摄像机的脉冲和LED38。
- 使用Cricket单元上的特殊电缆和插座，将增强器连接到标准电源，并将 增益 设置为 2.7 V。
- 使用镜头和Cricket适配器的对焦功能，将相机光学元件聚焦在样品台上，以生成具有良好对比度和亮度的样品的清晰图像。
- 对于与 Pt-卟啉染料一起使用的成像仪，请将 625 nm LED 替换为 390 nm LED 进行激发，并将 760 nm ± 50 nm 滤光片替换为 Cricket 模块中的 650 nm ± 50 nm 滤光片。
3. 图像采集
- 将样品放在相机镜头前面。
注意：使用x-y-z可调载物台作为样品架，以调整样品位置以获得良好的聚焦。 - 关掉房间里的所有灯。
- 打开 Sophy 软件以调整操作参数，例如聚焦和样品对齐。
注意：Sophy软件与相机一起提供，用于设置成像参数并记录数据。通过检查相机代码确保软件已连接到相机。但是，我们使用不同的程序进行数据采集。 - 在 模块中，选择 无限帧，并将 像素操作模式 设置为 时间超过阈值。
- 在“模块”中，转到“预览”，然后选择“活动模块”。这将打开 Medpix/Timpix 帧窗口。
- 在此窗口中，更改 色阶，并将图像 旋转 到所需的方向。
- 打开增强器，然后开始录制。
注意：使用Sophy软件的记录屏幕直观地确认样品的对齐和焦点，并优化用于记录的LED激发参数。 - 停止录制，然后关闭 Sophy 软件。
- 转到 终端，并使用定制设计的软件获取二进制格式的原始数据并对其进行后处理（https://github.com/svihra/TimePix3）。
- 在 终端中，运行以下命令记录数据：
CD 文档/SPIDR/trunk/release/
ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {文件名} - t {采集时间}
注意：键入“ls”后，检查当前目录中的文件列表;确认可以看到 Tpx3daq。 - 等到所有帧都记录下来。
- 要处理数据，请在终端中运行以下命令 ：
cd 文档/数据处理/Timepix3/Timepix3/
根
.l 数据处理.cpp++
.x 德吉。C - 等待 RRGui 窗口打开。选择左侧的所有变量，右侧选择“ 所有数据”、“ 单个文件”和 “质心 ”。
- 选择要处理的文件并运行数据缩减器。
注意：所有已处理的文件将显示在与原始文件相同的文件夹中。
- 在 终端中，运行以下命令记录数据：
4. 数据分析
- 使用用C语言编写的专用程序分析后处理的数据，该程序将数据写入.ics图像文件（https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam）。
- 使用免费提供的时间分辨成像软件打开.ics图像文件（参见 材料表）。使用 双指数 函数来拟合磷光衰减。
- 使用可用的图像分析软件打开拟合的图像.ics文件（参见 材料表）。
- 使用 查找表生成磷光寿命图像，并以伪色标对其进行编码（例如，蓝色表示短寿命，红色表示长寿命）。使用 测量 函数计算整个图像或特定感兴趣区域 （ROI） 的平均生命周期值。
- 通过使用从探头36的O2校准拟合获得的方程将寿命值转换为氧气浓度。
注：本工作使用了等式（2）：
O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT （2）
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Representative Results
对于 离体 成像应用，通过在组织的浆膜侧局部应用NanO2-IR探针对肠组织碎片进行染色。为了进行更深的染色，将 1 μL 探针注入管腔中。在后一种情况下，0.2-0.25毫米厚的肠壁将探头与相机隔绝开来。两种染色过程如图 2A所示。
得到的强度和PLIM图像如图2B-G所示。颜色清楚地反映了寿命值的差异，因此，组织浆膜和粘膜侧的氧合差异。图2C和图2D是指局部染色（图2C）和腔内染色（图2D）的类似组织组。正如预期的那样，组织显示出相似的PLIM模式。然而，与浆膜侧的局部染色（图2C）相比，组织粘膜侧的腔内染色（图2D）显示出更高的寿命值，反映了肠内表面的氧合较低（图2C），其显示较低的寿命。这反映了肠道外表面的较高氧合。
为了检查肠道寿命信号和呼吸活动的稳定性，对2小时内腔内染色的样品进行了延时PLIM分析（图2D-G）。在孵育的15分钟（54.4μs±0.9μs）和2小时（61.1μs±0.8μs）之间观察到寿命值的增加，这反映了肠管腔部分O2水平的降低。此外，孵育2小时后的低O2水平证明组织呼吸在整个解剖，制备，染色，孵育和成像步骤期间持续。此外，图2D-G中观察到的管腔形状的变化可归因于注入腔的探头的分布，这意味着LT信号反映了探头所在的区域。
为了评估成像仪在 体内的未来性能，在处死后立即对小鼠生长的移植皮下肿瘤中的缺氧成像进行了初步研究（图3）。在这种情况下，将Balb / c小鼠皮下注射到右胁，用200μLCT26细胞混合物，未染色或用0.05mg / mL NanO2-IR探针染色。PLIM在肿瘤生长的第七天进行，并在成像前（即死后）处死小鼠。小鼠生长第七天肿瘤区域的图像如图 3A，B所示。
肿瘤生长第七天小鼠肿瘤区域的强度（左）和PLIM（右）图像（图3B）证明了成像仪和探针在此类实验中的性能和灵敏度（未显示更详细的统计数据）。每只动物成像20秒。小鼠的左翼被剃光并成像为空白。它们没有产生PLIM信号。相反，肿瘤和探针的区域产生~50μs的稳定寿命信号。该实验的目的是评估成像仪在活体动物和人类疾病模型的 体内 研究中的可用性。虽然这部分显示了初步的定性结果，但正在编写相应的文件，其中提供了更彻底的定量评估。
接下来，该成像仪还演示了基于Pt（II）-卟啉染料的传感器材料的PLIM成像。Pt-八乙基卟啉染料（PtOEP）的化学结构和相应传感器材料的制备技术细节详见别处6，39。通过将薄膜浸没在PBS缓冲液（空气饱和氧化态）或含有葡萄糖和葡萄糖氧化酶的PBS中，将薄膜浸没在PBS缓冲液（空气饱和氧化态）中，将基于聚苯乙烯的磷光固态传感器涂层作为小斑点沉积在透明聚酯薄膜（聚酯薄膜）上，从而提供完全脱氧的条件。在含氧（25.6 μs±0.5 μs）和脱氧条件（65.7 μs±1.5 μs）下获得的寿命信号与之前报告的结果相匹配6。含氧和脱氧传感器的强度和PLIM图像如图 4A，B所示。
图1：成像仪38的实验设置。 经Sen等人许可转载38。版权：光学学会。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：局部和腔内染色小鼠肠道样品的 O2 PLIM。 （A） 使用 （B） 磷光强度和 （C） 用 NanO2-IR 探针局部染色的肠道的 PLIM 图像的两种染色方法的说明。（D-G）染色后15分钟，30分钟，1小时和2小时的腔内染色肠的延时PLIM。PLIM图像以伪色标显示：蓝色对应于较低的寿命，红色对应于较高的寿命值。比例尺 = 5 毫米。缩写：PLIM = 磷光寿命成像显微镜。请点击此处查看此图的大图。
图3：小鼠右胁移植肿瘤的O2 PLIM 。 （A）活体动物肿瘤发展的图形说明。肿瘤生长第七天（B）的磷光强度（左）和PLIM（右）肿瘤区域图像。PLIM图像以伪色标表示：蓝色对应于较低的寿命，红色对应于较高的寿命值。比例尺 = 5 毫米。缩写：PLIM = 磷光寿命成像显微镜。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：基于 PtOEP 的传感器光斑的磷光强度。 （A）含氧和（B）脱氧状态下PtOEP传感器斑点的磷光强度（左）和PLIM（右）图像。PLIM图像以伪色标表示：蓝色对应于较低的寿命，红色对应于较高的寿命值。缩写：PLIM =磷光寿命成像显微镜;PtOEP = 铂八乙基卟啉。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
上述协议详细描述了新成像仪的组装及其在微秒级FLIM/PLIM模式下的操作。基于TCSPC的新一代Tpx3Cam相机，通过光机械适配器Cricket与图像增强器，发射滤光片和微距镜头相结合，产生了稳定，紧凑和灵活的光学模块，易于操作。该成像仪在一系列不同的样品和分析任务中表现良好，其中包括磷光材料和活组织O2 成像的表征。成像实验采用近红外Pt（II）-苯并卟啉基细胞渗透可溶性探针NanO2-IR和红光Pt（II）-卟啉固态传感器。这些传感器具有斯托克斯位移大、发射寿命长、灵敏度高、响应快、光化学稳定性好等优点，已成功用于O2 的淬灭磷光检测。
这些不同的O2敏感探头和固态涂层在宏观成像仪上进行测试时，产生的结果与先前发表的数据一致40。这些材料表现出良好的均匀性、对比度和对不断变化的环境条件的寿命响应，特别是在温度和氧化状态方面。将这些结果与共聚焦TCSPC-PLIM显微镜上产生的结果进行比较表明，新的成像仪是准确的，具有更高质量的寿命读数，并且以高速和灵敏度获取PLIM图像28，38，40。
该成像仪还对不同类型的磷光染色生物样品表现出有希望的性能。因此，为含有染色呼吸细胞悬浮液、活死后动物组织、整个器官和移植肿瘤的样品制作了详细的 O2 浓度图。成像仪提供了来自表面的寿命值的测量值，甚至在组织内部深度可达0.5毫米的地方28，36，38。
由于磷光寿命值受温度41的强烈影响，因此有必要对成像样品进行严格的温度控制，例如使用加热的样品台和/或培养箱。使用紫外激发时，仔细选择样品架非常重要，因为许多材料在该光谱区域具有自发荧光，这会影响样品的真实寿命值。本研究中的所有PLIM成像均在4 V的LED功率和50 ns的脉冲宽度下进行，积分时间为20 s;但是，可以根据需要调整这些参数。在20秒的图像采集时间内记录了大约104，500帧。最后，重要的是在暗室中进行测量，以避免环境光干扰。
因此，PLIM成像仪可以对大尺寸的宏观物体进行快速、定量的寿命测量。虽然激光扫描PLIM-TCSPS是可能的，但由于氧感应染料需要很长的停留时间，它太慢了。但是，该成像器速度很快，可以同时记录所有像素。此外，基于强度的测量可能会受到荧光/磷光染料浓度、不稳定的 LED 或激光强度、光漂白、光学元件的排列以及样品散射的影响。相比之下，基于TCSPC的宏观成像仪基本上与这些因素无关。因此，它可以对O2进行准确且无需校准的测量。相机的缺点包括相对复杂的数据处理和较大的数据大小（~2 Gb）。
将来，成像仪不仅可以使用相应的探针或传感器来绘制O2 浓度，还可以用于绘制测试样品的其他化学和生化参数，例如pH和葡萄糖动力学。这使其成为各种组织和疾病模型进行生理研究的有用工具。成像仪也可以升级为在纳秒级FLIM模式下运行。然而，这需要用更快的激发源（例如，ps激光器）替换当前的LED。系统在双PLIM/FLIM模式下的操作也是主要的。
总之，该成像仪在宽场TCSPC-PLIM应用中展示了简单性和多功能性，以及良好的功能和操作性能。市售的宽场成像仪大多执行基于强度的成像，其中磷光强度可能受到光漂白、测量几何形状、样品散射等因素的影响。目前的成像仪基于寿命成像，这使得测量更定量而不是定性。此外，Tpx3Cam光学相机与Cricket适配器和图像增强器的集成提供了单光子灵敏度，简单性，灵活性和测量的鲁棒性。与其他系统不同，它可以携带到实验现场并根据样品和测量任务的要求旋转360°。凭借其当前的物镜，该物镜很容易更换为另一个镜头，可以在几秒钟内测量尺寸达18 mm x 18 mm的样品，并具有256像素x 256像素的高空间分辨率。本文介绍了如何准备样品进行测试并在不同的PLIM应用中使用成像仪的分步程序。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
爱尔兰科学基金会对这项工作的财政支持，SFI/12 / RC / 2276_P2，SFI / 17 / RC-PhD / 3484和18 / SP / 3522，突破性癌症研究（爱尔兰精准肿瘤学）表示感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
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