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Biology

Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

Cet article décrit l’utilisation d’un nouvel imageur optique rapide pour l’imagerie macroscopique à vie par photoluminescence d’échantillons émettant de longues désintégrations. Les procédures d’intégration, d’acquisition d’images et d’analyse sont décrites, ainsi que la préparation et la caractérisation des matériaux du capteur pour l’imagerie et l’application de l’imageur dans l’étude d’échantillons biologiques.

Abstract

Cet article présente un nouvel imageur à durée de vie par photoluminescence conçu pour cartographier la concentration d’oxygène moléculaire (O2) dans différents échantillons phosphorescents allant des revêtements sensibles à l’état solide à l’O 2 aux échantillons de tissus animaux vivants colorés avec des sondes solubles sensibles à l’O2. En particulier, la sonde proche infrarouge à base de nanoparticules NanO2-IR, qui est excitable avec une diode électroluminescente (LED) de 625 nm et émet à 760 nm, a été utilisée. Le système d’imagerie est basé sur la caméra Timepix3 (Tpx3Cam) et l’adaptateur opto-mécanique, qui abrite également un intensificateur d’image. La microscopie d’imagerie à vie par phosphorescence O2 (PLIM) est couramment requise pour diverses études, mais les plates-formes actuelles ont des limites dans leur précision, leur flexibilité générale et leur facilité d’utilisation.

Le système présenté ici est un imageur rapide et très sensible, construit sur un capteur optique intégré et un module de puce de lecture, Tpx3Cam. Il est démontré qu’il produit des signaux de phosphorescence de haute intensité et des valeurs de vie stables à partir d’échantillons de tissus intestinaux colorés en surface ou de fragments du gros intestin colorés par voie intraluminale et permet la cartographie détaillée des niveaux de tissu O2 en environ 20 s ou moins. Des expériences initiales sur l’imagerie de l’hypoxie dans les tumeurs greffées chez des animaux inconscients sont également présentées. Nous décrivons également comment l’imageur peut être reconfiguré pour une utilisation avec des matériaux sensibles à l’O2 à base de colorants Pt-porphyrine à l’aide d’une LED de 390 nm pour l’excitation et d’un filtre passe-bande de 650 nm pour l’émission. Dans l’ensemble, on a constaté que l’imageur PLIM produisait des mesures quantitatives précises des valeurs de durée de vie des sondes utilisées et des cartes bidimensionnelles respectives de la concentration d’O2. Il est également utile pour l’imagerie métabolique de modèles tissulaires ex vivo et d’animaux vivants.

Introduction

O2 est l’un des paramètres environnementaux clés pour les systèmes vivants, et la connaissance de la distribution deO2 et de sa dynamique est importante pour de nombreuses études biologiques 1,2,3. L’évaluation de l’oxygénation des tissus au moyen des sondes phosphorescentes 4,5,6,7,8 et PLIM 9,10,11,12,13 gagne en popularité dans la recherche biologique et médicale 3,9,14,15,16, 17,18,19. En effet, le PLIM, contrairement aux mesures de fluorescence ou d’intensité de phosphorescence, n’est pas affecté par des facteurs externes tels que la concentration de la sonde, le photoblanchiment, l’intensité de l’excitation, l’alignement optique, la diffusion et l’autofluorescence.

Cependant, les plates-formes PLIM O2 actuelles sont limitées par leur sensibilité, leur vitesse d’acquisition d’images, leur précision et leur facilité d’utilisation générale. Le comptage monophotonique corrélé dans le temps (TCSPC), combiné à une procédure de balayage raster, est fréquemment utilisé dans les dispositifs PLIM et FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)20,21,22. Cependant, comme PLIM nécessite un long temps de séjour des pixels (de l’ordre de la milliseconde), le temps d’acquisition de l’image est beaucoup plus long que ce qui est requis pour les applications FLIM20,22,23. D’autres techniques, telles que les caméras CCD/CMOS fermées, manquent de sensibilité à un seul photon et ont de faibles fréquences d’images20,24,25,26. De plus, les systèmes PLIM existants sont principalement utilisés au format microscopique, tandis que les systèmes macroscopiques sont moins courants27.

L’imageur de macro PLIM28 basé sur TCSPC a été configuré pour surmonter bon nombre de ces limitations. La conception de l’imageur a été grandement facilitée par l’utilisation d’un nouvel adaptateur opto-mécanique, Cricket, qui a les éléments suivants: i) deux adaptateurs à monture C, qui permettent un couplage facile du module de caméra à l’arrière et de l’objectif de l’objectif à l’avant; ii) un boîtier interne pour un intensificateur d’image et une prise de courant pour ce dernier sur la face extérieure du grillon; iii) un espace interne derrière l’adaptateur à monture C de la face avant où un filtre d’émission standard de 25 mm peut être logé devant l’intensificateur; et iv) une optique de collimature lumineuse intégrée avec des régulateurs annulaires, qui permettent l’alignement optique / mise au point entre l’objectif et la caméra pour produire des images nettes sur la puce de l’appareil photo.

Dans l’imageur assemblé, le module de caméra est couplé à l’arrière de l’adaptateur Cricket, qui abrite également un intensificateur d’image composé d’une photocathode suivie d’une plaque à microcanaux (MCP), d’un amplificateur et d’un scintillateur rapide, le phosphore P47. Un filtre d’émission de 760 nm ± 50 nm est installé à l’intérieur du Cricket, et un objectif d’objectif, NMV-50M11'', est fixé à l’adaptateur de monture C de la face avant. Enfin, l’objectif et la caméra sont alignés optiquement avec des régulateurs annulaires.

Le rôle de l’intensificateur est de détecter les photons entrants et de les convertir en rafales de lumière rapides sur la puce de la caméra, qui sont enregistrées et utilisées pour générer des désintégrations d’émission et des images à vie. Le module de caméra comprend un réseau avancé de capteurs optiques basés sur TCSPC (256 pixels x 256 pixels) et une puce de lecture de nouvelle génération 29,30,31,32,33, qui permettent l’enregistrement simultané de l’heure d’arrivée (TOA) et du temps au-delà du seuil (TOT) des sursauts de photons à chaque pixel de la puce d’imagerie avec une résolution temporelle de 1,6 ns et un taux de lecture de 80 Mpixel / s.

Dans cette configuration, la caméra avec l’intensificateur a une sensibilité à photon unique. Il est axé sur les données et basé sur le système de lecture rapide du détecteur de pixels (SPIDR)34. La résolution spatiale de l’imageur était auparavant caractérisée par des capteurs O2 phosphorescents planaires et un masque de plaque de résolution. La fonction de réponse de l’instrument (IRF) a été mesurée par l’imagerie d’un capteur fluorescent planaire sous les mêmes réglages que ceux utilisés pour toutes les autres mesures. La durée de vie du colorant d’environ 2,6 ns était suffisamment courte pour qu’il puisse être utilisé pour la mesure IRF en mode PLIM. L’imageur peut imager des objets d’une taille maximale de 18 mm x 18 mm avec des résolutions spatiales et temporelles de 39,4 μm et 30,6 ns (pleine largeur à la moitié maximum), respectivement28.

Les protocoles suivants décrivent l’assemblage du macroimageur et son utilisation ultérieure pour cartographier la concentration d’O2 dans des échantillons biologiques colorés avec la sonde O2 proche infrarouge précédemment caractérisée,NanO2-IR 35. La sonde est une sonde de détection O2 brillante, photostable, perméable aux cellules, à base de colorant benzoporphyrine (PtBP) en platine (II). Il est excitable à 625 nm, émet à 760 nm et fournit une réponse optique robuste àO2 dans la gamme physiologique (0%-21% ou 0-210 μM de O2). Il est également démontré que l’imageur caractérise différents matériaux de capteur à base de colorants à porphyrine Pt(II). Dans l’ensemble, l’imageur est compact et flexible, similaire à un appareil photo commun. Dans la configuration actuelle, l’imageur est adapté à différentes applications PLIM grand champ. Le remplacement de la LED par une source laser rapide améliorera encore les performances de l’imageur et pourrait potentiellement permettre des applications FLIM nanosecondes.

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Protocol

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées en vertu d’autorisations délivrées par l’Autorité de réglementation des produits de santé (HPRA, Irlande) conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes (2010/63/UE) et ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’University College Cork.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Coloration avec la sonde d’échantillons de tissus vivants ex vivo
    1. Pour les applications ex vivo , utiliser des échantillons de tissus fraîchement isolés provenant de souris Balb/c femelles âgées de 4 semaines.
    2. Le jour de l’expérience, euthanasier une souris par décapitation et disséquer rapidement des fragments du côlon (gros intestin), d’environ 10 mm. Les laver immédiatement avec un tampon PBS, les placer dans un milieu DMEM complété par un tampon Hepes 10 mM (pH 7,2) et incuber à 37 °C36.
    3. Pour la coloration superficielle de la face sérosale de l’intestin, transférer les échantillons de tissus vivants dans une boîte en mini-boîte, appliquer 2 mL de DMEM complet contenant 1 mg/mL de sonde NanO2-IR pour couvrir les échantillons de tissus et incuber pendant 30 min à 37 °C.
      NOTE: Les cellules dans les tissus post-mortem restent vivantes pendant de nombreuses heures en culture. NaNO2-IR montre une cytotoxicité mineure, de sorte que toutes les expériences ont été complétées dans les 4 heures suivant l’isolement tissulaire.
    4. Pour la coloration intraluminale ex vivo des tissus profonds, transférer les morceaux de l’intestin dans une boîte de Petri sèche et éliminer tout excès de DMEM avec du papier filtre.
    5. Injecter 1 μL de DMEM contenant 1 mg/mL de NanO2-IR 35 dans la lumière à l’aide d’une seringue Hamilton et incuber les échantillons pendant15 minutes ou jusqu’à 4 h.
      REMARQUE : Le NaNO2-IR présente des effets cytotoxiques mineurs à long terme; Par conséquent, toutes les expériences doivent être terminées dans les 4 heures suivant l’isolement tissulaire.
  2. Préparation de tissus tumoraux colorés chez des animaux vivants
    1. Pour les applications in vivo , précolorer les cellules CT26 pendant 18 h dans un milieu sans sérum contenant une sonde NaNO2-IR à 0,05 mg/mL.
    2. Prendre une souris, raser la zone d’injection dans le flanc droit, et injecter avec une seringue 200 μL d’un mélange de 1 × 10 5 cellules non colorées et 1 × 105 cellules pré-colorées avec NanO2-IR.
    3. Permettre aux tumeurs de se développer chez les souris, en surveillant périodiquement la taille de la tumeur avec un pied à coulisse et le poids de l’animal37. Les animaux atteints de tumeurs greffées sont prêts pour l’imagerie le septième jour de la croissance tumorale.
      NOTE: Le volume tumoral a été calculé à l’aide de l’équation (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      où L est le diamètre de la tumeur, et W is le diamètre perpendiculaire au diamètre L.
    4. Sacrifiez les animaux par luxation cervicale juste avant l’imagerie.

2. Configuration de l’imagerie PLIM

  1. Prenez l’adaptateur Cricket et retirez son adaptateur arrière à monture C pour accéder au boîtier de l’intensificateur à l’intérieur. Insérez l’intensificateur d’image MCP-125 dans ce compartiment et remettez l’adaptateur à monture C en place.
  2. Retirez l’adaptateur de monture C de la face avant du Cricket, insérez le filtre d’émission 760 nm ± 50 nm et réparez-le en remettant la monture C.
  3. Connectez le module de caméra Tpx3Cam à l’arrière du module Cricket via son adaptateur de monture C
  4. Connectez l’objectif à la face avant du module Cricket via son adaptateur à monture C.
  5. Montez l’ensemble de la caméra au-dessus de la boîte noire optique, face à la scène sur laquelle les échantillons seront imagés (Figure 1).
  6. Montez la LED super lumineuse de 624 nm sur un poteau connecté à une breadboard à l’intérieur de la boîte noire.
  7. Connectez la LED à une alimentation et à un générateur d’impulsions. Allumez la LED et concentrez-la pour assurer une excitation efficace et uniforme des échantillons imagés.
  8. Connectez la caméra à un autre générateur d’impulsions et synchronisez les impulsions envoyées à la caméra et au LED38.
  9. À l’aide du câble spécial et de la prise de l’unité Cricket, connectez l’intensifificateur à une alimentation standard et réglez le gain sur 2,7 V.
  10. À l’aide des capacités de mise au point de l’objectif et de l’adaptateur Cricket, concentrez l’optique de la caméra sur la scène d’échantillonnage pour générer des images claires des échantillons avec un bon contraste et une bonne luminosité.
  11. Pour une utilisation par imageur avec des colorants Pt-porphyrine, remplacez la LED 625 nm par une LED 390 nm pour l’excitation, et remplacez le filtre 760 nm ± 50 nm par un filtre 650 nm ± 50 nm dans le module Cricket.

3. Acquisition d’images

  1. Placez l’échantillon devant l’objectif de la caméra.
    REMARQUE: Utilisez une platine réglable x-y-z comme porte-échantillon afin d’ajuster la position de l’échantillon pour une bonne mise au point.
  2. Éteignez toutes les lumières de la pièce.
  3. Activez le logiciel Sophy pour régler les paramètres opérationnels, tels que la mise au point et l’alignement des échantillons.
    REMARQUE: Le logiciel Sophy est fourni avec la caméra pour configurer les paramètres d’imagerie et enregistrer les données. Assurez-vous que le logiciel est connecté à l’appareil photo en vérifiant le code de l’appareil photo. Cependant, nous avons utilisé un programme différent pour l’acquisition de données.
  4. Dans Modules, sélectionnez des images infinies et définissez le mode de fonctionnement des pixels sur le dépassement du seuil.
  5. Dans Modules, accédez à Aperçu, puis sélectionnez Module actif. La fenêtre Medpix/Timpix Frames s’ouvre .
  6. Dans cette fenêtre, modifiez l’échelle de couleurs et faites pivoter l’image dans l’orientation souhaitée.
  7. Allumez l’intensificateur et démarrez l’enregistrement.
    REMARQUE: Utilisez l’écran d’enregistrement du logiciel Sophy pour confirmer visuellement l’alignement et la mise au point de l’échantillon et pour optimiser les paramètres d’excitation LED pour l’enregistrement.
  8. Arrêtez l’enregistrement et fermez le logiciel Sophy.
  9. Accédez au terminal et utilisez le logiciel conçu sur mesure pour acquérir les données brutes au format binaire et les post-traiter (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Dans le terminal, exécutez les commandes suivantes pour enregistrer les données :
      Document CD/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nom du fichier} - t {temps d’acquisition}
      Remarque : En tapant « ls », vérifiez la liste des fichiers dans le répertoire actif ; confirmez que Tpx3daq est visible.
    2. Attendez que toutes les images soient enregistrées.
    3. Pour traiter les données, exécutez les commandes suivantes dans le terminal :
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      racine
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Attendez qu’une fenêtre RRGui s’ouvre. Sélectionnez toutes les variables à gauche et Toutes les données, Fichier unique et Centroïde à droite.
    5. Sélectionnez le fichier à traiter et exécutez le réducteur de données.
      Remarque : Tous les fichiers traités apparaîtront dans le même dossier que le fichier brut.

4. Analyse des données

  1. Analysez les données post-traitées avec un programme dédié écrit en langage C qui écrira les données dans un fichier image .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Ouvrez les fichiers image .ics à l’aide du logiciel d’imagerie à résolution temporelle disponible gratuitement (voir le tableau des matériaux). Utilisez deux fonctions exponentielles pour s’adapter aux désintégrations de phosphorescence.
  3. Ouvrez les fichiers d’images .ics ajustés avec le logiciel d’analyse d’image disponible (voir Table des matériaux).
  4. À l’aide des tables de correspondance, générez des images de durée de vie de phosphorescence et codez-les dans une échelle de pseudo-couleur (par exemple, couleur bleue pour les courtes durées de vie et rouge pour les longues durées de vie). Utilisez la fonction Mesure pour calculer les valeurs moyennes de durée de vie de l’image entière ou des régions d’intérêt (ROI) spécifiques.
  5. Convertir les valeurs de durée de vie en concentration d’oxygène en utilisant l’équation obtenue à partir du réglage de l’étalonnage O2 de la sonde36.
    NOTE: L’équation (2) a été utilisée pour ce travail:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Representative Results

Pour les applications d’imagerie ex vivo , des fragments de tissus intestinaux ont été colorés par l’application topique de la sonde NanO2-IR sur la face sérossale du tissu. Pour une coloration plus profonde, 1 μL de la sonde a été injecté dans la lumière. Dans ce dernier cas, la paroi intestinale de 0,2 à 0,25 mm d’épaisseur protégeait la sonde de la caméra. Les deux procédés de coloration sont illustrés à la figure 2A.

L’intensité résultante et les images PLIM sont présentées à la figure 2B-G. Les couleurs reflètent clairement la différence dans les valeurs de durée de vie et, par conséquent, la différence d’oxygénation des côtés sérosal et muqueux du tissu. La figure 2C et la figure 2D font référence à des ensembles similaires de tissus colorés par voie topique (figure 2C) et intraluminale (figure 2D). Comme prévu, les tissus présentaient des profils PLIM similaires. Cependant, la coloration intraluminale de la face muqueuse du tissu (Figure 2D) a montré des valeurs de durée de vie plus élevées, reflétant une oxygénation plus faible dans la surface interne de l’intestin, par rapport à la coloration topique de la face sérosale (Figure 2C), qui a montré des durées de vie plus faibles. Cela reflète une oxygénation plus élevée dans la surface externe de l’intestin.

Pour examiner la stabilité des signaux à vie et l’activité respiratoire de l’intestin, une analyse PLIM en accéléré a été effectuée sur les échantillons colorés par voie intraluminale pendant 2 heures (Figure 2D-G). Une augmentation des valeurs de durée de vie a été observée entre 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) et 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs) de l’incubation, ce qui reflète une réduction des niveaux d’O2 dans la partie luminale de l’intestin. De plus, les faibles niveauxd’O2 après 2 h d’incubation prouvent que la respiration tissulaire s’est poursuivie pendant toute la période de dissection, de préparation, de coloration, d’incubation et d’imagerie des étapes. De plus, le changement de forme de la lumière observé à la figure 2D-G peut être attribué à la distribution de la sonde injectée dans la lumière, ce qui signifie que le signal LT reflète la zone où se trouve la sonde.

Pour évaluer les performances futures de l’imageur in vivo, une première étude sur l’imagerie de l’hypoxie dans des tumeurs sous-cutanées greffées cultivées chez la souris a été réalisée immédiatement après le sacrifice (Figure 3). Dans ce cas, des souris Balb/c ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit avec 200 μL d’un mélange de cellules CT26, qui n’étaient pas colorées ou colorées avec une sonde NanO2-IR de 0,05 mg/mL. PLIM a été réalisée le septième jour de la croissance tumorale, et les souris ont été sacrifiées juste avant l’imagerie (c’est-à-dire post-mortem). Les images des zones tumorales chez les souris au septième jour de croissance sont montrées à la figure 3A, B.

Les images d’intensité (à gauche) et de PLIM (à droite) pour les zones tumorales chez les souris au septième jour de la croissance tumorale (Figure 3B) démontrent les performances et la sensibilité de l’imageur et de la sonde dans de telles expériences (données statistiques plus détaillées non présentées). Les animaux ont été imagés pendant 20 s chacun. Les flancs gauches des souris ont été rasés et imagés comme un blanc. Ils n’ont produit aucun signal PLIM. En revanche, les régions avec la tumeur et la sonde ont produit des signaux de vie stables de ~ 50 μs. Le but de cette expérience était d’évaluer l’utilisabilité de l’imageur pour des études in vivo avec des animaux vivants et des modèles de maladies humaines. Bien que cette partie ait montré des résultats qualitatifs préliminaires, un document correspondant est en cours de préparation, qui fournit une évaluation quantitative plus approfondie.

Ensuite, l’imageur a également été démontré dans l’imagerie PLIM de matériaux de capteurs à base de colorants Pt(II)-porphyrine. La structure chimique du colorant Pt-octaéthylporphine (PtOEP) et les détails techniques de la préparation des matériaux de capteur correspondants sont décrits ailleurs 6,39. Les revêtements de capteurs à semi-conducteurs phosphorescents à base de polystyrène PtOEP déposés sur un film de polyester transparent (Mylar) sous forme de petites taches ont été imagés en immergeant le film dans un tampon PBS (état oxygéné saturé d’air) ou dans du PBS contenant du glucose et de la glucose oxydase, ce qui fournit un état entièrement désoxygéné. Les signaux de durée de vie obtenus dans les conditions oxygénées (25,6 μs ± 0,5 μs) et désoxygénées (65,7 μs ± 1,5 μs) correspondaient aux résultats rapportés précédemment6. L’intensité et les images PLIM des capteurs oxygénés et désoxygénés sont données à la figure 4A, B.

Figure 1
Figure 1 : Configuration expérimentale de l’imageur38. Reproduit avec la permission de Sen et al.38. Droit d’auteur : The Optical Society. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : O2 PLIM des échantillons d’intestin de souris colorés par voie topique et intraluminale. (A) Illustration des deux méthodes de coloration utilisant (B) l’intensité de la phosphorescence et (C) les images PLIM de l’intestin coloré par voie topique avec la sonde NanO2-IR. (D-G) Timelapse PLIM de l’intestin coloré intraluminalement à 15 min, 30 min, 1 h et 2 h après la coloration. Les images PLIM sont présentées dans une échelle de pseudo-couleurs : la couleur bleue correspond à une durée de vie inférieure, et la couleur rouge correspond à des valeurs de durée de vie plus élevées. Barres d’échelle = 5 mm. Abréviation : PLIM = microscopie d’imagerie à durée de vie de phosphorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : O2 PLIM de tumeurs greffées dans les flancs droits des souris. (A) Illustration graphique du développement tumoral chez les animaux vivants. Intensité de phosphorescence (à gauche) et images PLIM (à droite) des zones tumorales au septième jour (B) de la croissance tumorale. L’image PLIM est présentée dans une échelle de pseudo-couleurs : la couleur bleue correspond à une durée de vie inférieure, et la couleur rouge correspond à des valeurs de durée de vie plus élevées. Barre d’échelle = 5 mm. Abréviation : PLIM = microscopie d’imagerie à durée de vie de phosphorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Intensité de phosphorescence du spot du capteur basé sur PtOEP. Intensité de phosphorescence (à gauche) et images PLIM (droite) du point du capteur PtOEP dans les états (A) oxygéné et (B) désoxygéné. Les images PLIM sont présentées dans une échelle de pseudo-couleurs : le bleu correspond à une durée de vie inférieure, et la couleur rouge correspond à des valeurs de durée de vie plus élevées. Abréviations : PLIM = microscopie d’imagerie à vie de phosphorescence; PtOEP = octaéthylporphyrine de platine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les protocoles ci-dessus donnent une description détaillée de l’assemblage du nouvel imageur et de son fonctionnement en mode FLIM/PLIM à la microseconde. La caméra Tpx3Cam de nouvelle génération basée sur TCSPC, couplée au moyen de l’adaptateur opto-mécanique Cricket avec l’intensificateur d’image, le filtre d’émission et la macro-lentille, produit un module optique stable, compact et flexible facile à utiliser. L’imageur s’est avéré performant avec une gamme d’échantillons et de tâches analytiques différents, qui comprenaient la caractérisation des matériaux phosphorescents et l’imagerie des tissus vivants O2 . La sonde soluble NanO2-IR perméable aux cellules à base de Pt(II)-benzoporphyrine dans le proche infrarouge et les capteurs à semi-conducteurs à base de Pt(II)-porphyrine émettant des rouges ont été utilisés dans les expériences d’imagerie. Ces capteurs ont été utilisés avec succès pour la détection de phosphorescence éteinte del’O2 en raison de leur grand décalage de Stokes, de leur longue durée de vie en émission, de leur sensibilité élevée, de leur réponse rapide et de leur bonne stabilité photochimique.

Ces différentes sondes sensibles à l’O2 et ces revêtements à semi-conducteurs, lorsqu’ils ont été testés sur le macroimageur, ont produit des résultats en accord avec les données précédemment publiées40. Les matériaux ont démontré une bonne uniformité, un contraste et une bonne durée de vie des réponses aux conditions environnementales changeantes, en particulier en termes de température et d’état d’oxygénation. La comparaison de ces résultats avec ceux produits sur le microscope confocale TCSPC-PLIM montre que le nouvel imageur est précis, a des lectures de durée de vie de meilleure qualité et acquiert des images PLIM avec une vitesse et une sensibilité élevées28,38,40.

L’imageur a également démontré des performances prometteuses avec des échantillons biologiques colorés phosphorescents de différents types. Ainsi, des cartes détaillées de concentration d’O2 ont été produites pour les échantillons contenant des suspensions de cellules respiratoires colorées, des tissus animaux vivants post-mortem, des organes entiers et des tumeurs greffées. L’imageur a fourni des mesures des valeurs de durée de vie à partir de la surface et même à des profondeurs allant jusqu’à 0,5 mm à l’intérieur du tissu28,36,38.

Étant donné que les valeurs de durée de vie de phosphorescence sont fortement influencées par la température41, il est nécessaire de mettre en œuvre un contrôle serré de la température des échantillons imagés, par exemple en utilisant un étage d’échantillonnage chauffé et/ou une chambre d’incubateur. Lors de l’utilisation de l’excitation UV, il est important de choisir soigneusement les porte-échantillons, car de nombreux matériaux possèdent une autofluorescence dans cette région spectrale, ce qui affecte la valeur réelle de la durée de vie de l’échantillon. Toute l’imagerie PLIM de cette étude a été réalisée à une puissance LED de 4 V et une largeur d’impulsion de 50 ns pour un temps d’intégration de 20 s ; toutefois, ces paramètres peuvent être ajustés au besoin. Environ 104 500 images sont enregistrées pendant les 20 s de temps d’acquisition de l’image. Enfin, il est important d’effectuer les mesures dans une chambre sombre pour éviter les interférences de la lumière ambiante.

Ainsi, l’imageur PLIM peut effectuer des mesures de durée de vie rapides et quantitatives avec des objets macroscopiques de taille significative. Bien que le PLIM-TCSPS à balayage laser soit possible, il serait trop lent en raison des longs temps de séjour requis pour les colorants à détection d’oxygène. Cet imageur, cependant, est rapide et peut enregistrer tous les pixels simultanément. De plus, les mesures basées sur l’intensité peuvent être influencées par la concentration de colorant fluorescent/phosphorescent, une LED instable ou des intensités laser, le photoblanchiment, l’alignement des composants optiques et la diffusion des échantillons. En revanche, l’imageur de macro basé sur TCSPC est essentiellement indépendant de ces facteurs. Par conséquent, il peut effectuer des mesures précises et sans étalonnage de O2. Les inconvénients de l’appareil photo incluent son traitement de données relativement complexe et ses grandes tailles de données (~ 2 Go).

À l’avenir, l’imageur pourra également être utilisé non seulement pour cartographier les concentrationsd’O2 , mais également d’autres paramètres chimiques et biochimiques des échantillons testés, tels que la dynamique du pH et du glucose, à l’aide des sondes ou capteurs correspondants. Cela en fait un outil utile pour les études physiologiques avec divers modèles de tissus et de maladies. L’imageur peut également être mis à niveau pour fonctionner en mode FLIM nanoseconde. Cependant, cela nécessite le remplacement des LED actuelles par une source d’excitation plus rapide (par exemple, un laser ps). Le fonctionnement du système en mode double PLIM/FLIM est également principalement possible.

Dans l’ensemble, l’imageur fait preuve de simplicité et de polyvalence, ainsi que de bonnes fonctionnalités et performances opérationnelles dans les applications TCSPC-PLIM à grand champ. Les imageurs grand champ disponibles dans le commerce effectuent principalement une imagerie basée sur l’intensité, dans laquelle les intensités phosphorescentes peuvent être influencées par des facteurs tels que le photoblanchiment, la géométrie de mesure, la diffusion à partir d’échantillons, etc. L’imageur actuel est basé sur l’imagerie de la durée de vie, ce qui rend les mesures plus quantitatives que qualitatives. De plus, l’intégration de la caméra optique Tpx3Cam avec l’adaptateur Cricket et l’intensificateur d’image offre une sensibilité, une simplicité, une flexibilité et une robustesse des mesures à photon unique. Contrairement à d’autres systèmes, il peut être transporté sur le site des expériences et tourné à 360° en fonction des exigences de l’échantillon et de la tâche de mesure. Avec son objectif actuel, facile à changer pour un autre objectif, l’imageur peut mesurer des échantillons jusqu’à 18 mm x 18 mm en quelques secondes et avec une résolution spatiale élevée de 256 pixels x 256 pixels. Ce document décrit étape par étape les procédures de préparation des échantillons pour les tests et l’utilisation de l’imageur dans les différentes applications PLIM.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Le soutien financier pour ce travail de la Science Foundation Ireland, des subventions SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 et 18/SP/3522, et de Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) est vivement apprécié.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3

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Biologie numéro 194
Macro-imageur à vie de fluorescence pour applications biomédicales
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Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C.,… More

Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

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