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Biology

Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

Questo articolo descrive l'uso di un nuovo imager ottico veloce per l'imaging macroscopico della durata della fotoluminescenza di campioni che emettono lungo decadimento. Vengono descritte le procedure di integrazione, acquisizione delle immagini e analisi, insieme alla preparazione e caratterizzazione dei materiali del sensore per l'imaging e l'applicazione dell'imager nello studio dei campioni biologici.

Abstract

Questo articolo presenta un nuovo imager di durata della fotoluminescenza progettato per mappare la concentrazione di ossigeno molecolare (O 2) in diversi campioni fosforescenti che vanno dai rivestimenti sensibili allo stato solido, O 2 a campioni di tessuto animale vivo colorati con sonde solubili sensibili all'O2. In particolare, è stata utilizzata la sonda nel vicino infrarosso basata su nanoparticelle NanO2-IR, che è eccitabile con un diodo a emissione luminosa (LED) da 625 nm ed emette a 760 nm. Il sistema di imaging si basa sulla telecamera Timepix3 (Tpx3Cam) e sull'adattatore opto-meccanico, che ospita anche un intensificatore di immagine. La microscopia a vita di imaging con fosforescenza (PLIM) O2 è comunemente richiesta per vari studi, ma le piattaforme attuali hanno limitazioni nella loro accuratezza, flessibilità generale e usabilità.

Il sistema qui presentato è un imager veloce e altamente sensibile, costruito su un sensore ottico integrato e un modulo chip di lettura, Tpx3Cam. È dimostrato che produce segnali di fosforescenza ad alta intensità e valori stabili nel corso della vita da campioni di tessuto intestinale macchiati in superficie o frammenti di intestino crasso colorati per via intraluminale e consente la mappatura dettagliata dei livelli di O2 del tessuto in circa 20 s o meno. Vengono inoltre presentati esperimenti iniziali sull'imaging dell'ipossia nei tumori innestati in animali incoscienti. Descriviamo anche come l'imager può essere riconfigurato per l'uso con materiali sensibili all'O2 basati su coloranti Pt-porfirina utilizzando un LED da 390 nm per l'eccitazione e un filtro passa banda 650 nm per l'emissione. Nel complesso, l'imager PLIM è risultato in grado di produrre misurazioni quantitative accurate dei valori di vita per le sonde utilizzate e le rispettive mappe bidimensionali della concentrazione di O2 . È anche utile per l'imaging metabolico di modelli di tessuto ex vivo e animali vivi.

Introduction

O 2 è uno dei parametri ambientali chiave per i sistemi viventi e la conoscenza della distribuzione di O 2 e della sua dinamica è importante per molti studi biologici 1,2,3. La valutazione dell'ossigenazione tissutale mediante sonde fosforescenti 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 sta guadagnando popolarità nella ricerca biologica e medica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Questo perché il PLIM, a differenza delle misurazioni dell'intensità di fluorescenza o fosforescenza, non è influenzato da fattori esterni come la concentrazione della sonda, il fotosbiancamento, l'intensità di eccitazione, l'allineamento ottico, la diffusione e l'autofluorescenza.

Tuttavia, le attuali piattaforme PLIM O2 sono limitate dalla loro sensibilità, velocità di acquisizione delle immagini, precisione e usabilità generale. Il conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC), combinato con una procedura di scansione raster, viene spesso utilizzato nei dispositivi PLIM e FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)20,21,22. Tuttavia, poiché PLIM richiede un lungo tempo di permanenza dei pixel (nell'intervallo dei millisecondi), il tempo di acquisizione dell'immagine è molto più lungo di quello richiesto per le applicazioni FLIM20,22,23. Altre tecniche, come le telecamere CCD / CMOS gated, mancano di sensibilità a singolo fotone e hanno frame rate bassi20,24,25,26. Inoltre, i sistemi PLIM esistenti sono per lo più utilizzati nel formato microscopico, mentre i sistemi macroscopici sono meno comuni27.

Il sequencer macro imager28 basato su TCSPC è stato configurato per superare molte di queste limitazioni. Il design dell'imager è stato notevolmente facilitato dall'uso di un nuovo adattatore opto-meccanico, Cricket, che ha quanto segue: i) due adattatori C-mount, che forniscono un facile accoppiamento del modulo fotocamera sul lato posteriore e dell'obiettivo sul lato anteriore; ii) un alloggiamento interno per un intensificatore di immagine e una presa di corrente per quest'ultimo sul lato esterno del Cricket; iii) uno spazio interno dietro l'adattatore frontale con montaggio a C in cui un filtro di emissione standard da 25 mm può essere alloggiato davanti all'intensificatore; e iv) un'ottica di collimazione della luce incorporata con regolatori ad anello, che consentono l'allineamento / messa a fuoco ottica tra l'obiettivo e la fotocamera per produrre immagini nitide sul chip della fotocamera.

Nell'imager assemblato, il modulo della fotocamera è accoppiato al lato posteriore dell'adattatore Cricket, che ospita anche un intensificatore di immagine costituito da un fotocatodo seguito da una piastra a microcanali (MCP), un amplificatore e uno scintillatore veloce, il fosforo P47. Un filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm è montato all'interno del Cricket e un obiettivo, NMV-50M11'', è collegato all'adattatore C-mount frontale. Infine, l'obiettivo e la fotocamera sono allineati otticamente con i regolatori ad anello.

Il ruolo dell'intensificatore è quello di rilevare i fotoni in arrivo e convertirli in rapide esplosioni di luce sul chip della fotocamera, che vengono registrati e utilizzati per generare decadimenti di emissione e immagini a vita. Il modulo telecamera comprende un avanzato array di sensori ottici basati su TCSPC (256 pixel x 256 pixel) e un chip di lettura di nuova generazione 29,30,31,32,33, che consentono la registrazione simultanea del tempo di arrivo (TOA) e del tempo oltre la soglia (TOT) dei burst di fotoni su ciascun pixel del chip di imaging con una risoluzione temporale di 1,6 ns e una velocità di lettura di 80 Mpixel/s.

In questa configurazione, la telecamera con l'intensificatore ha una sensibilità a fotone singolo. È basato sui dati e si basa sul sistema di lettura del rilevatore di pixel veloci (SPIDR)34. La risoluzione spaziale dell'imager era precedentemente caratterizzata da sensori O2 fosforescenti planari e una maschera a piastre di risoluzione. La funzione di risposta dello strumento (IRF) è stata misurata mediante l'imaging di un sensore fluorescente planare con le stesse impostazioni utilizzate per tutte le altre misurazioni. La durata del colorante di circa 2,6 ns è stata abbastanza breve da poter essere utilizzata per la misurazione IRF in modalità PLIM. L'imager può visualizzare oggetti di dimensioni fino a 18 mm x 18 mm con risoluzioni spaziali e temporali di 39,4 μm e 30,6 ns (larghezza completa a metà massima), rispettivamente28.

I seguenti protocolli descrivono l'assemblaggio del macro imager e il suo successivo utilizzo per mappare la concentrazione di O 2 in campioni biologici colorati con la sonda O2 nel vicino infrarosso precedentemente caratterizzata, NanO2-IR35. La sonda è una sonda O2 luminosa, fotostabile, permeabile alle cellule basata sul colorante benzoporfirina di platino (II) (PtBP). È eccitabile a 625 nm, emette a 760 nm e fornisce una robusta risposta ottica a O 2 nell'intervallo fisiologico (0% -21% o 0-210 μM di O2). È stato inoltre dimostrato che l'imager caratterizza diversi materiali del sensore basati su coloranti Pt(II)-porfirina. Nel complesso, l'imager è compatto e flessibile, simile a una comune fotocamera fotografica. Nella configurazione corrente, l'imager è adatto per diverse applicazioni PLIM a campo ampio. La sostituzione del LED con una sorgente laser veloce migliorerà ulteriormente le prestazioni dell'imager e potrebbe potenzialmente consentire applicazioni FLIM in nanosecondi.

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Protocol

Tutte le procedure con gli animali sono state eseguite sotto autorizzazioni rilasciate dalla Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) in conformità con la Direttiva del Consiglio delle Comunità Europee (2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico per la sperimentazione animale dell'University College Cork.

1. Preparazione del campione

  1. Colorazione con sonda di campioni di tessuto vivo ex vivo
    1. Per le applicazioni ex vivo , utilizzare campioni di tessuto appena isolati da topi Balb/c femmina di 4 settimane.
    2. Il giorno dell'esperimento, eutanasia di un topo per decapitazione e sezionare rapidamente frammenti del colon (intestino crasso), di circa 10 mm di dimensione. Lavarli immediatamente con tampone PBS, metterli in mezzo DMEM integrato con tampone Hepes 10 mM (pH 7,2) e incubare a 37 °C36.
    3. Per la colorazione superficiale del lato sieroso dell'intestino, trasferire i campioni di tessuto vivo in un mini-piatto, applicare 2 ml di DMEM completo contenente 1 mg/mL di sonda NanO2-IR per coprire i campioni di tessuto e incubare per 30 minuti a 37 °C.
      NOTA: Le cellule nel tessuto post-mortem rimangono vive per molte ore in coltura. NaNO2-IR mostra una citotossicità minore, quindi tutti gli esperimenti sono stati completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
    4. Per la colorazione intraluminale ex vivo dei tessuti profondi, trasferire i pezzi dell'intestino in una capsula di Petri asciutta e rimuovere qualsiasi DMEM in eccesso con carta da filtro.
    5. Iniettare 1 μL di DMEM contenente 1 mg/mL di NanO2-IR 35 nel lume con una siringa di Hamilton e incubare i campioni per15 minuti o fino a 4 ore.
      NOTA: NaNO2-IR mostra effetti citotossici minori a lungo termine; Pertanto, tutti gli esperimenti dovrebbero essere completati entro 4 ore dall'isolamento tissutale.
  2. Preparazione di tessuto tumorale colorato in animali vivi
    1. Per applicazioni in vivo, pre-colorare le cellule CT26 per 18 ore in mezzo privo di siero contenente sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/ml.
    2. Prenda un topo, rada l'area di iniezione nel fianco destro e inietti con una siringa 200 μL di una miscela di 1 × 10 5 cellule non colorate e 1 × 105 cellule pre-colorate con NanO2-IR .
    3. Consentire ai tumori di crescere nei topi, monitorando periodicamente le dimensioni del tumore con una pinza e il peso dell'animale periodicamente37. Gli animali con tumori innestati diventano pronti per l'imaging il settimo giorno di crescita del tumore.
      NOTA: Il volume del tumore è stato calcolato utilizzando l'equazione (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      dove L è il diametro del tumore e W èil diametro perpendicolare al diametro L.
    4. Sacrificare gli animali per dislocazione cervicale poco prima dell'imaging.

2. Configurazione dell'imaging PLIM

  1. Prendi l'adattatore Cricket e rimuovi l'adattatore C-mount sul retro per accedere all'alloggiamento dell'intensificatore all'interno. Inserire l'intensificatore d'immagine MCP-125 in questo scomparto e riposizionare l'adattatore C-mount.
  2. Rimuovere l'adattatore C-mount frontale del Cricket, inserire il filtro di emissione da 760 nm ± 50 nm e ripararlo rimettendo il C-mount.
  3. Collegare il modulo fotocamera Tpx3Cam al lato posteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount
  4. Collegare l'obiettivo al lato anteriore del modulo Cricket tramite il suo adattatore C-mount.
  5. Montare l'intero gruppo telecamera sulla parte superiore della scatola nera ottica, rivolta verso il basso verso il basso verso il palco su cui verranno ripresi i campioni (Figura 1).
  6. Montare il LED super-luminoso da 624 nm su un palo collegato a una breadboard all'interno della scatola nera.
  7. Collegare il LED a un alimentatore e a un generatore di impulsi. Accendere il LED e metterlo a fuoco per garantire un'eccitazione efficace e uniforme dei campioni visualizzati.
  8. Collegare la telecamera a un altro generatore di impulsi e sincronizzare gli impulsi inviati alla fotocamera e al LED38.
  9. Utilizzando il cavo speciale e la presa sull'unità Cricket, collegare l'intensificatore a un alimentatore standard e impostare il guadagno su 2,7 V.
  10. Utilizzando le funzionalità di messa a fuoco dell'obiettivo e dell'adattatore Cricket, mettere a fuoco l'ottica della fotocamera sul palco campione per generare immagini nitide dei campioni con buon contrasto e luminosità.
  11. Per l'utilizzo dell'imager con coloranti Pt-porfirina, sostituire il LED da 625 nm con un LED da 390 nm per l'eccitazione e sostituire il filtro da 760 nm ± 50 nm con un filtro da 650 nm ± 50 nm nel modulo Cricket.

3. Acquisizione di immagini

  1. Posizionare il campione davanti all'obiettivo della fotocamera.
    NOTA: utilizzare uno stadio regolabile x-y-z come supporto del campione per regolare la posizione del campione per una buona messa a fuoco.
  2. Spegni tutte le luci nella stanza.
  3. Accendere il software Sophy per la messa a punto dei parametri operativi, come la messa a fuoco e l'allineamento del campione.
    NOTA: il software Sophy viene fornito insieme alla fotocamera per impostare i parametri di imaging e registrare i dati. Assicurarsi che il software sia collegato alla fotocamera controllando il codice della fotocamera. Tuttavia, abbiamo utilizzato un programma diverso per l'acquisizione dei dati.
  4. In Moduli, selezionate fotogrammi infiniti e impostate la modalità operativa pixel su soglia di tempo.
  5. In Moduli, vai a Anteprima e seleziona Modulo attivo. Verrà visualizzata la finestra Medpix/Timpix Frames .
  6. In questa finestra, modificare la scala dei colori e ruotare l'immagine con l'orientamento desiderato.
  7. Accendere l'intensificatore e avviare la registrazione.
    NOTA: Utilizzare la schermata di registrazione del software Sophy per confermare visivamente l'allineamento e la messa a fuoco del campione e per ottimizzare i parametri di eccitazione LED per la registrazione.
  8. Interrompere la registrazione e chiudere il software Sophy.
  9. Vai al terminale e utilizza il software progettato su misura per acquisire i dati grezzi in formato binario e post-elaborarli (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Nel terminale, eseguire i seguenti comandi per registrare i dati:
      Cd Document/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nome del file} - t {tempo di acquisizione}
      NOTA: dopo aver digitato "ls", controllare l'elenco dei file nella directory corrente; confermare che Tpx3daq è visto.
    2. Attendere che tutti i fotogrammi vengano registrati.
    3. Per elaborare i dati, eseguire i seguenti comandi nel terminale:
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      radice
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Attendere l'apertura di una finestra RRGui . Selezionare tutte le variabili a sinistra e Tutti i dati, File singolo e Centroid a destra.
    5. Selezionare il file da elaborare ed eseguire il riduttore di dati.
      NOTA: tutti i file elaborati verranno visualizzati nella stessa cartella del file raw.

4. Analisi dei dati

  1. Analizza i dati post-elaborati con un programma dedicato scritto in linguaggio C che scriverà i dati in un file immagine .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Aprire i file di immagine .ics utilizzando il software Time Resolved Imaging disponibile gratuitamente (vedere Tabella dei materiali). Utilizzare due funzioni esponenziali per adattarsi ai decadimenti della fosforescenza.
  3. Aprire i file di immagine .ics dotati con il software di analisi delle immagini disponibile (vedere Tabella dei materiali).
  4. Utilizzando le tabelle di ricerca, generare immagini di durata della fosforescenza e codificarle in scala pseudocolore (ad esempio, colore blu per brevi vite e rosso per lunghe vite). Utilizzare la funzione Misura per calcolare i valori medi di durata per l'intera immagine o specifiche regioni di interesse (ROI).
  5. Convertire i valori di vita nella concentrazione di ossigeno utilizzando l'equazione ottenuta dal montaggio della calibrazione O2 della sonda36.
    NOTA: L'equazione (2) è stata utilizzata per questo lavoro:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Representative Results

Per le applicazioni di imaging ex vivo , frammenti di tessuti intestinali sono stati colorati dall'applicazione topica della sonda NanO2-IR sul lato sieroso del tessuto. Per una colorazione più profonda, 1 μL della sonda è stato iniettato nel lume. In quest'ultimo caso, la parete intestinale spessa 0,2-0,25 mm ha schermato la sonda dalla fotocamera. I due processi di colorazione sono illustrati nella Figura 2A.

L'intensità risultante e le immagini PLIM sono presentate nella Figura 2B-G. I colori riflettono chiaramente la differenza nei valori di vita e, quindi, la differenza di ossigenazione dei lati sierosi e mucosi del tessuto. La Figura 2C e la Figura 2D si riferiscono a insiemi simili di tessuti che sono stati colorati localmente (Figura 2C) e intraluminalmente (Figura 2D). Come previsto, i tessuti hanno mostrato modelli PLIM simili. Tuttavia, la colorazione intraluminale del lato mucoso del tessuto (Figura 2D) ha mostrato valori di vita più elevati, riflettendo una minore ossigenazione nella superficie interna dell'intestino, rispetto alla colorazione topica del lato sieroso (Figura 2C), che ha mostrato tempi di vita inferiori. Ciò riflette una maggiore ossigenazione nella superficie esterna dell'intestino.

Per esaminare la stabilità dei segnali di vita e l'attività respiratoria dell'intestino, è stata condotta un'analisi PLIM time-lapse sui campioni colorati intraluminalmente nell'arco di 2 ore (Figura 2D-G). Un aumento dei valori di vita è stato osservato tra 15 minuti (54,4 μs ± 0,9 μs) e 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs ) dell'incubazione, che riflette una riduzione dei livelli di O2 nella parte luminale dell'intestino. Inoltre, i bassi livelli di O 2 dopo2 ore di incubazione dimostrano che la respirazione dei tessuti è continuata per l'intero periodo di dissezione, preparazione, colorazione, incubazione e fasi di imaging. Inoltre, il cambiamento nella forma del lume osservato nella Figura 2D-G può essere attribuito alla distribuzione della sonda iniettata nel lume, il che significa che il segnale LT riflette l'area in cui si trova la sonda.

Per valutare le prestazioni future dell'imager in vivo, uno studio iniziale sull'imaging dell'ipossia nei tumori sottocutanei innestati cresciuti nei topi è stato effettuato immediatamente dopo il sacrificio (Figura 3). In questo caso, i topi Balb/c sono stati iniettati per via sottocutanea nel fianco destro con 200 μL di una miscela di cellule CT26, che erano non colorate o colorate con una sonda NanO2-IR da 0,05 mg/ml. PLIM è stato eseguito il settimo giorno della crescita del tumore e i topi sono stati sacrificati poco prima dell'imaging (cioè post-mortem). Le immagini delle aree tumorali nei topi al settimo giorno di crescita sono mostrate in Figura 3A,B.

Le immagini di intensità (a sinistra) e PLIM (a destra) per le aree tumorali nei topi al settimo giorno di crescita tumorale (Figura 3B) dimostrano le prestazioni e la sensibilità sia dell'imager che della sonda in tali esperimenti (dati statistici più dettagliati non mostrati). Gli animali sono stati fotografati per 20 secondi ciascuno. I fianchi sinistri dei topi sono stati rasati e fotografati come uno spazio vuoto. Non hanno prodotto segnali PLIM. Al contrario, le regioni con il tumore e la sonda hanno prodotto segnali di vita stabili di ~ 50 μs. Lo scopo di questo esperimento era valutare l'usabilità dell'imager per studi in vivo con animali vivi e modelli di malattie umane. Mentre questa parte ha mostrato risultati qualitativi preliminari, è in preparazione un documento corrispondente, che fornisce una valutazione quantitativa più approfondita.

Successivamente, l'imager è stato dimostrato anche nell'imaging PLIM di materiali sensoriali basati su coloranti porfirinici Pt(II). La struttura chimica del colorante Pt-ottaetilporfina (PtOEP) e i dettagli tecnici della preparazione dei corrispondenti materiali del sensore sono descritti altrove 6,39. I rivestimenti dei sensori a stato solido fosforescente a base di polistirene PtOEP depositati su un film di poliestere trasparente (Mylar) come piccole macchie sono stati ripresi immergendo il film in tampone PBS (stato ossigenato saturo d'aria) o in PBS contenente glucosio e glucosio ossidasi, che fornisce una condizione completamente deossigenata. I segnali di vita ottenuti nelle condizioni ossigenate (25,6 μs ± 0,5 μs) e deossigenate (65,7 μs ± 1,5 μs) corrispondevano ai risultati riportati in precedenza6. Le immagini di intensità e PLIM dei sensori ossigenati e deossigenati sono riportate nella Figura 4A, B.

Figure 1
Figura 1: Configurazione sperimentale dell'imager38. Ristampato con il permesso di Sen et al.38. Diritto d'autore: The Optical Society. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: O2 PLIM dei campioni di intestino di topo colorati localmente e intraluminalmente. (A) Illustrazione dei due metodi di colorazione utilizzando (B) intensità di fosforescenza e (C) immagini PLIM dell'intestino colorato localmente con la sonda NanO2-IR. (D-G) PLIM timelapse dell'intestino colorato per via intraluminale a 15 min, 30 min, 1 h e 2 h dopo la colorazione. Le immagini PLIM sono presentate in una scala pseudocromatica: il colore blu corrisponde a una durata inferiore e il colore rosso corrisponde a valori di durata più elevati. Barre della scala = 5 mm. Abbreviazione: PLIM = microscopia di imaging a vita della fosforescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: O2 PLIM di tumori innestati nei fianchi destri dei topi . (A) Illustrazione grafica dello sviluppo tumorale negli animali vivi. Intensità della fosforescenza (a sinistra) e immagini PLIM (a destra) delle aree tumorali nel settimo giorno di crescita del tumore (B). L'immagine PLIM è presentata in una scala pseudocromatica: il colore blu corrisponde a una durata inferiore e il colore rosso corrisponde a valori di durata più elevati. Barra scala = 5 mm. Abbreviazione: PLIM = microscopia di imaging a vita della fosforescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Intensità di fosforescenza dello spot del sensore basato su PtOEP. Immagini di intensità di fosforescenza (a sinistra) e PLIM (a destra) dello spot del sensore PtOEP negli stati (A) ossigenato e (B) deossigenato. Le immagini PLIM sono presentate in una scala pseudocromatica: il blu corrisponde a una durata inferiore e il colore rosso corrisponde a valori di durata più elevati. Abbreviazioni: PLIM = microscopia di imaging a vita della fosforescenza; PtOEP = platino ottaetilporfirina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

I protocolli di cui sopra forniscono una descrizione dettagliata dell'assemblaggio del nuovo imager e del suo funzionamento in modalità FLIM/PLIM al microsecondo. La telecamera Tpx3Cam di nuova generazione basata su TCSPC, accoppiata mediante l'adattatore optomeccanico Cricket con l'intensificatore di immagine, il filtro di emissione e il macroobiettivo, produce un modulo ottico stabile, compatto e flessibile facile da usare. L'imager ha dimostrato di funzionare bene con una serie di diversi campioni e compiti analitici, che includevano la caratterizzazione di materiali fosforescenti e l'imaging di tessuti vivi O2 . Negli esperimenti di imaging sono stati utilizzati la sonda solubile permeabile alle cellule permeabile NanO2-IR nel vicino infrarosso Pt(II)-benzoporfirina e i sensori a stato solido a base di porfirina a emissione rossa Pt(II). Questi sensori sono stati utilizzati con successo per il rilevamento della fosforescenza spenta di O2 grazie al loro grande spostamento di Stokes, alla lunga durata delle emissioni, all'elevata sensibilità, alla risposta rapida e alla buona stabilità fotochimica.

Queste diverse sonde sensibili all'O2 e i rivestimenti a stato solido, quando testati sul macro imager, hanno prodotto risultati che concordano con i dati pubblicati in precedenza40. I materiali hanno dimostrato una buona uniformità, contrasto e risposte nel corso della vita alle mutevoli condizioni ambientali, in particolare in termini di temperatura e stato di ossigenazione. Il confronto di questi risultati con quelli prodotti sul microscopio confocale TCSPC-PLIM mostra che il nuovo imager è accurato, ha letture di durata di migliore qualità e acquisisce immagini PLIM ad alta velocità e sensibilità28,38,40.

L'imager ha anche dimostrato prestazioni promettenti con campioni biologici colorati fosforescenti di diversi tipi. Pertanto, sono state prodotte mappe dettagliate della concentrazione di O2 per i campioni contenenti sospensioni di cellule respiranti colorate, tessuto animale vivo postmortem, organi interi e tumori innestati. L'imager ha fornito misurazioni dei valori di durata dalla superficie e anche a profondità fino a 0,5 mm all'interno del tessuto28,36,38.

Poiché i valori di durata della fosforescenza sono fortemente influenzati dalla temperatura41, è necessario implementare uno stretto controllo della temperatura dei campioni ripresi, ad esempio utilizzando uno stadio di campionamento riscaldato e/o una camera dell'incubatore. Durante l'utilizzo dell'eccitazione UV, è importante scegliere attentamente i supporti del campione, poiché molti materiali possiedono autofluorescenza in questa regione spettrale, che influisce sul vero valore di vita del campione. Tutte le immagini PLIM in questo studio sono state eseguite con una potenza LED di 4 V e una larghezza di impulso di 50 ns per un tempo di integrazione di 20 s; Tuttavia, questi parametri possono essere regolati come richiesto. Circa 104.500 fotogrammi vengono registrati durante i 20 secondi di tempo di acquisizione delle immagini. Infine, è importante eseguire le misurazioni in una camera buia per evitare interferenze con la luce ambientale.

Pertanto, l'imager PLIM può eseguire misurazioni rapide e quantitative con oggetti macroscopici di dimensioni significative. Sebbene la scansione laser PLIM-TCSPS sia possibile, sarebbe troppo lenta a causa dei lunghi tempi di permanenza richiesti per i coloranti sensibili all'ossigeno. Questo imager, tuttavia, è veloce e può registrare tutti i pixel contemporaneamente. Inoltre, le misurazioni basate sull'intensità possono essere influenzate dalla concentrazione di colorante fluorescente/fosforescente, da un LED instabile o da intensità laser, dal fotosbiancamento, dall'allineamento dei componenti ottici e dalla dispersione dai campioni. Al contrario, il macro imager basato su TCSPC è essenzialmente indipendente da questi fattori. Pertanto, può eseguire misurazioni accurate e senza calibrazione di O2. Gli svantaggi della fotocamera includono la sua elaborazione dei dati relativamente complessa e le grandi dimensioni dei dati (~ 2 Gb).

In futuro, l'imager potrà anche essere utilizzato non solo per mappare le concentrazioni di O2 , ma anche altri parametri chimici e biochimici dei campioni testati, come la dinamica del pH e del glucosio, utilizzando le sonde o i sensori corrispondenti. Questo lo rende uno strumento utile per studi fisiologici con vari modelli di tessuto e malattia. L'imager può anche essere aggiornato per funzionare in modalità FLIM al nanosecondo. Tuttavia, ciò richiede la sostituzione degli attuali LED con una sorgente di eccitazione più veloce (ad esempio, un laser ps). Anche il funzionamento del sistema in modalità dual PLIM/FLIM è principalmente possibile.

Nel complesso, l'imager dimostra semplicità e versatilità, insieme a buone funzionalità e prestazioni operative nelle applicazioni TCSPC-PLIM a campo ampio. Gli imager a largo campo disponibili in commercio eseguono principalmente immagini basate sull'intensità, in cui le intensità fosforescenti possono essere influenzate da fattori come il fotosbiancamento, la geometria di misurazione, la dispersione dai campioni, ecc. L'attuale imager si basa sull'imaging a vita, il che rende le misurazioni più quantitative che qualitative. Inoltre, l'integrazione della telecamera ottica Tpx3Cam con l'adattatore Cricket e l'intensificatore di immagine fornisce sensibilità a singolo fotone, semplicità, flessibilità e robustezza delle misurazioni. A differenza di altri sistemi, può essere trasportato sul sito degli esperimenti e ruotato di 360° in base ai requisiti del campione e dell'attività di misurazione. Con il suo obiettivo attuale, che è facile cambiare per un altro obiettivo, l'imager può misurare campioni di dimensioni fino a 18 mm x 18 mm in pochi secondi e con un'elevata risoluzione spaziale di 256 pixel x 256 pixel. Questo documento descrive le procedure dettagliate su come preparare i campioni per il test e utilizzare l'imager nelle diverse applicazioni PLIM.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Il sostegno finanziario per questo lavoro da parte della Science Foundation Ireland, sovvenzioni SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 e 18 / SP / 3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) è riconosciuto con gratitudine.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3

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References

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Biologia Numero 194
Imager macro a fluorescenza per applicazioni biomediche
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Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

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