Summary
Denne protokollen beskriver differensieringsprosessen av humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs) til mikroglia-lignende celler for in vitro eksperimentering. Vi inkluderer også en detaljert prosedyre for å generere humane synaptosomer fra iPSC-avledede lavere motorneuroner som kan brukes som substrat for in vitro fagocytoseanalyser ved bruk av levende celleavbildningssystemer.
Abstract
Microglia er de bosatte immuncellene av myelogen opprinnelse som opprettholder homeostase i hjernens mikromiljø og har blitt en nøkkelspiller i flere nevrologiske sykdommer. Å studere humane mikroglia i helse og sykdom representerer en utfordring på grunn av den ekstremt begrensede tilførselen av humane celler. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) avledet fra menneskelige individer kan brukes til å omgå denne barrieren. Her er det demonstrert hvordan man skiller humane iPSCer til mikroglia-lignende celler (iMGs) for in vitro eksperimentering. Disse iMGene viser de forventede og fysiologiske egenskapene til microglia, inkludert mikroglia-lignende morfologi, uttrykk for riktige markører og aktiv fagocytose. I tillegg er dokumentasjon for isolering og merking av synaptosomsubstrater avledet fra humane iPSC-avledede lavere motorneuroner (i3LMN) gitt. En live-celle, langsgående bildeanalyse brukes til å overvåke oppslukning av humane synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff, noe som muliggjør undersøkelser av iMGs fagocytiske kapasitet. Protokollene beskrevet her er bredt anvendelige for ulike felt som undersøker human microglia biologi og bidraget av microglia til sykdom.
Introduction
Microglia er de bosatte immuncellene i sentralnervesystemet (CNS) og spiller en avgjørende rolle i utviklingen av CNS. Microglia er også viktig i den voksne hjernen for å opprettholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sykdomsprosesser. Kumulative bevis viser at mikroglia er viktige bidragsytere til patogenesen av flere nevrodevelopmental og neurodegenerative sykdommer 1,2. Selv om dagens kunnskap om mikrogliabiologi hovedsakelig er avledet fra musemodeller, har nyere studier belyst viktige forskjeller mellom murine og human microglia, og understreker behovet for å utvikle teknologier for å studere genetikk og biologiske funksjoner hos humane microglia 3,4. Isolering av mikroglia fra dissekert primærvev kan alvorlig modifisere mikrogliaegenskaper5, potensielt forvirrende resultater oppnådd med slike celler. Det overordnede målet med denne metoden er å differensiere humane iPSCer i iMGs, og dermed gi et cellekultursystem for å studere human mikroglia under basale forhold. Videre er en fagocytoseanalyse ved hjelp av et fullt menneskelig modellsystem inkludert her som et middel til å studere funksjonaliteten til iMGs, både som et kvalitetskontrollmål og for å vurdere iMG-dysfunksjon i sammenheng med sykdom.
Flere protokoller for mikrogliadifferensiering fra iPSCs har nylig dukket opp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potensielle ulemper ved noen protokoller inkluderer lengre eller lange perioder med differensiering, tillegg av flere vekstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle prosedyrer 6,9,10. Her demonstreres en "brukervennlig" differensieringsmetode som rekapitulerer aspekter av mikroglia-ontogeni gjennom differensiering av iPSC-er til forløperceller kalt primitive makrofagforløpere (PMP)7,11. PMP-er genereres som beskrevet tidligere, med noen optimaliseringer presentert her i12. PMP-ene etterligner MYB-uavhengige eggeplomme-sac-avledede makrofager, som gir opphav til mikroglia under embryonal utvikling ved å invadere hjernen før blod-hjernebarrierelukking13. For å terminalt differensiere PMP-er i iMG-er brukte vi en rask og forenklet monokulturmetode basert på protokoller av Haenseler og medarbeidere og Brownjohn et al., med noen modifikasjoner for å generere en effektiv mikrogliadifferensieringsmetode der iMG-er robust uttrykker mikrogliaberikede markører 7,8. Denne differensieringsmetoden kan reproduseres i laboratorier med kompetanse i kulturen til iPSCs og med forskningsmål som tar sikte på å studere mikrogliabiologi ved hjelp av et menneskelig modellsystem.
iPSC-avledet mikroglia representerer en biologisk relevant kilde til humane mikroglia for in vitro eksperimentering og er et viktig verktøy for å undersøke mikroglial kanoniske funksjoner, inkludert fagocytose. Microglia er de profesjonelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleavfall, aggregerte proteiner og nedbrutt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygging ved å oppsluke synapser og i forsvaret mot eksterne infeksjoner gjennom fagocytose av patogener15,16. I denne protokollen vurderes fagocytose ved iMGs ved bruk av humane synaptosomer som materiale for iMG-oppslukning. Til dette formål beskrives en beskrivelse for å isolere synaptosomer avledet fra humane i3LMNer. De i3LMN-avledede humane synaptosomene er merket med et pH-følsomt fargestoff som muliggjør kvantifisering av synaptosomer lokalisert i sure rom under fagosombehandling og nedbrytning in vitro. En fagocytoseanalyse ved bruk av levende cellemikroskopi er vist for å overvåke den dynamiske prosessen med mikroglia-oppslukning i sanntid. Denne funksjonelle analysen etablerer et grunnlag for å undersøke mulige defekter i mikroglial fagocytose i helse og sykdom ved hjelp av et komplett humant system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle reagensene som brukes i denne protokollen må være sterile, og alle trinnene må utføres i et biosikkerhetsskap under sterile forhold. Alle iPSC-linjene, samt vedlikeholds- og differensieringsmedier, er beskrevet i materialtabellen. Microglia-differensieringsmetoden illustrert nedenfor er basert på tidligere publiserte protokoller 7,8,12 med nye modifikasjoner beskrevet her.
1. Microglia differensiering
MERK: En oversikt over protokollen er oppsummert i figur 1.
- Indusert pluripotent stamcellekultur (iPSC)
MERK: Ytterligere detaljer som beskriver iPSC-kulturteknikker finner du andre steder17.- Tining og vedlikehold
- Forbered iPSC medium, aliquot mediet, og oppbevar ved -20 °C i opptil 6 måneder. Tine aliquotene over natten ved 4 °C og bruk dem i opptil 1 uke. La mediet stå ved omgivelsestemperatur i minst 1 time før bruk.
- Belegg brønnene på en 6-brønns plate ved å tilsette 1 ml 10 μg / ml laminin 521 fortynnet i DPBS som inneholder kalsium og magnesium18. Oppbevar platene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO 2 i minst2 timer eller helst over natten. Etter fortynning oppbevares lamininet ved 4 °C i 3 måneder.
- Tilbered 10 mM Rho kinaseinhibitor Y27632 (ROCK Inhibitor) stamløsning ved fortynning i sterilt vann. Lag engangsaliquots av ROCK-hemmerløsning og oppbevar dem ved -20 °C i opptil 1 år.
- Forbered 0,5 mM EDTA ved å fortynne stamløsningen av 0,5 M EDTA i DPBS.
- For å tine et hetteglass med frosne iPSC-er, plasser hetteglasset i et vannbad ved 37 °C til det meste er tint. Overfør umiddelbart innholdet i hetteglasset til et 15 ml konisk rør inneholdende 4 ml iPSC-medium. Sentrifuge ved 500 × g i 1 min.
- Aspirer supernatanten og resuspendere cellene ved å tilsette 1 ml iPSC-medium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer sakte mot rørveggen for å unngå forstyrrelse av koloniene.
- Tilsett 1,5 ml iPSC-medium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer til hver av de belagte brønnene og overfør de resuspenderte koloniene dråpe for dråpe til brønnene som inneholder mediet.
MERK: Bruk 5-7 dråper fra trinn 1.1.1.6 for kulturvedlikehold, men juster den optimale såtettheten for hver iPSC-linje. - Fordel cellene jevnt i brønnene ved å stokke platen manuelt fra side til side og bakover til front. Plasser cellene i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Neste dag erstatter du mediet fullstendig ved å tilsette ferskt iPSC-medium uten ROCK-hemmer.
- For vedlikehold, bytt medium hver dag til cellene når 80% sammenløp.
MERK: Cellene kan vedlikeholdes uten å bytte medium i 2 dager hvis iPSC-mediet som brukes tillater en fleksibel fôringsplan. Det anbefales å begrense dette til en gang per passasje og bare hvis cellene er mindre enn 50% sammenflytende.
- Splitting
- Aspirer mediet og vask cellene med 1 ml DPBS (uten kalsium og magnesium).
- For å løsne cellene, tilsett 1 ml 0,5 mM EDTA og inkuber i 2-3 minutter ved romtemperatur til kantene på cellekoloniene løfter seg fra overflaten av brønnen. Vask cellene igjen med DPBS og tilsett 1 ml iPSC-medium.
- Dissosiere cellekoloniene ved å skrape dem forsiktig ved hjelp av en celleløfter. Skrap hvert område av brønnen bare én gang for å unngå å forstyrre koloniene.
MERK: Alternative metoder for å fjerne koloniene fra brønnen finnes andre steder17. - Ved hjelp av en 1 ml pipettespiss samler du cellene og overfører dem dråpe for dråpe i forholdet 1:6 (celler til medium) til forhåndsbelagte brønner (som nevnt i trinn 1.1.1.2) som inneholder 1,5 ml iPSC-medium.
- Tining og vedlikehold
- iPSC-differensiering til mikroglia-lignende celler (iMGs)
MERK: De små molekylene og vekstfaktorene oppløses i sterilt filtrert 0,1 % bovint serumalbumin i DPBS til en stamkonsentrasjon som er 1000 ganger høyere enn den endelige konsentrasjonen. Det anbefales å skille iPSCs i iMGs under tidlige passasjer. Rutinemessig karyotyping av iPSC-linjer anbefales.- Klargjør standard beleggløsning
- Tine stamløsningen av et ekstracellulært matriksbeleggreagens på is ved 4 °C over natten.
- Forkjølte mikrosentrifugerør og filterpipettespisser ved 4 °C.
- Aliquot 250 μL av det konsentrerte ekstracellulære matriksbelegget reagens i hvert rør og umiddelbart plassert på is. Oppbevar aliquotene ved -20 °C.
- For å klargjøre overflatebehandlingsløsningen tiner du et av de ekstracellulære matriksbeleggets aliquots på is ved 4 °C over natten.
- Tilsett 50 ml iskald DMEM-F12 optimalisert for vekst av humane embryonale og induserte pluripotente stamceller (referert til DMEM-F12) media til et forkjølt konisk rør og hold det på is.
- Avkjøl en pipettespiss på 1 ml ved å pipettere iskald DMEM-F12 opp og ned flere ganger, og bruk deretter pipettspissen umiddelbart til å overføre 250 μL av det ekstracellulære matriksbeleggreagenset til det koniske røret som inneholder DMEM-F12-mediet.
MERK: Standard overflatebehandlingsløsning kan oppbevares i 2 uker ved 4 °C.
- Embryoid kroppsdannelse (EB)
- Forbered EB medium som kan opprettholdes ved 4 °C i opptil 4 dager.
- Når iPSCs har nådd 80% sammenløp, dissosiere koloniene ved å vaske med 1 ml DPBS og tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens i 2 minutter ved 37 ° C. Fjern koloniene ved hjelp av en celleløfter ved å skrape flere ganger for å lage en encellet suspensjon. Samle cellene og overfør alt til et 15 ml konisk rør som inneholder 9 ml DPBS.
- Sentrifuger cellene ved 500 × g i 1 min, fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml EB-medium. Ta 10 μL celler og fortynn 1:1 med Trypan blått. Tell cellene med et hemacytometer, og basert på celletallet, fortynn cellestammen til en endelig fortynning av 10.000 celler per 100 μL. For pletteringsceller, tilsett 100 μL av de fortynnede cellene per brønn i en lav tilslutning, rundbunnet, 96-brønnsplate.
MERK: Generelt kan 48 brønner på 96-brønnsplaten fås fra hver 80% sammenflytende brønn av iPSCs. - Sentrifuger platen ved 125 × g i 3 minutter og inkuberer ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 dager. Utfør en halv middels endring på dag 2 ved å bruke en flerkanals pipette og forsiktig samle 50 μL gammelt medium, og deretter legge tilbake 50 μL friskt EB-medium.
MERK: På dag 4 vil iPSCs danne sfæriske cellulære strukturer kalt EBs som beskrevet i resultatdelen. EB-differensieringsprosessen kan forlenges opptil 7 dager, om nødvendig.
- Generering av primitive makrofagforløpere (PMP)
- Forbered PMP base medium, sterilt filter, og oppbevar det ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Belegg brønnene på en 6-brønns plate ved å tilsette 1 ml iskald Matrigel beleggløsning og inkuber ved 37 °C og 5 % CO 2 i minst2 timer eller helst over natten.
- På dag 4 av EB-differensieringen, overfør EB-ene til de matrikelbelagte brønnene ved å samle EB-ene med 1 ml pipettespisser (ved hjelp av en pipette). Pipette opp og ned en eller to ganger for å løsne EBene fra brønnen. Hold 6-brønnsplaten i en vippet vinkel for å tillate EB-ene å slå seg ned i kanten av brønnen.
MERK: Ni eller ti EBer kan belegges per belagt brønn. - Når alle EB-ene har lagt seg, pipetter forsiktig og fjern det gamle mediet med en 1 ml pipettespiss mens du holder EB-ene i kanten av brønnen. Tilsett 3 ml nylaget PMP komplett medium til hver brønn. Fordel cellene jevnt i brønnene ved å stokke platen manuelt fra side til side og bakover til front. Plasser platen i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Ikke forstyrr platen i 7 dager for å la EB-ene feste seg til bunnen av brønnen. Etter den tiden, utfør en halv middels endring ved hjelp av PMP komplett medium.
MERK: På dette tidspunktet skal de fleste EB-ene festes til platen. Eventuelle flytende EB-er kan fjernes. - Etter 5-7 dager, inspiser EBene under et lysfeltmikroskop ved 4x forstørrelse for å sikre at de er festet til bunnen av brønnene. Endre mediet som beskrevet i 1.2.3.5. På dag 21, utfør en fullstendig medium endring med 3 ml PMP komplett medium.
MERK: Myeloide forfedre som flyter i mediet kan være tydelige på dette tidspunktet. Disse cellene skal kastes under mediumendringen. - På dag 28, se etter runde celler referert til som PMPs i supernatanten og samle mediet som inneholder PMP-ene ved hjelp av en 10 ml pipette og automatisk pipettor. Pass på at du ikke forstyrrer EB-ene. Overfør PMP-ene og mediet til et 15 ml konisk rør og fortsett som beskrevet i trinn 1.2.4.
MERK: Vanligvis kan PMP-er fra samme iPSC-linje samles fra fem brønner på en 6-brønns plate og samles sammen i et enkelt 15 ml konisk rør. - Tilsett 3 ml fersk PMP komplett medium for videre vedlikehold av EBs. Siden PMP-er kontinuerlig dukker opp fra EB-er i mer enn 3 måneder, må du samle dem hver 4-7 dag (ikke la mediet endre farge til en gul tone) som beskrevet i trinn 1.2.3.7 og 1.2.3.8.
MERK: Selv om PMP-er kan samles inn i flere måneder, kan de endre fenotypen over tid.
- Differensiering til iMGs
- Forbered iMG basemedium (Table of Materials), sterilt filter og oppbevar det ved 4 °C i opptil 3 uker.
- Når PMP-ene er samlet inn i et 15 ml konisk rør, sentrifuger dem ved 200 × g i 4 minutter. Aspirer supernatanten og resuspendere PMP-ene ved å bruke 1-2 ml iMG basalmedium. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer ved å ta en liten aliquot og fortynne 1: 1 med Trypan blå.
MERK: 0,5-1,5 × 106 PMP oppnås normalt hver uke, avhengig av iPSC-linjen og alderen på EB-kulturen. - Sentrifuger resten av cellene igjen ved 200 × g i 4 minutter. Fortynn PMP-ene til ønsket konsentrasjon slik at cellene belegges med en tetthet på ~105/cm2 på cellekulturbehandlede plater ved bruk av nytilberedt iMG komplett medium. Utfør en halv middels endring ved hjelp av nylaget iMG komplett medium hver 3-4 dag gjennom 10-12 dager for å tillate terminal differensiering.
MERK: På dette tidspunktet bør cellene skaffe seg mikroglia-lignende morfologi. For å bekrefte PMPs forpliktelse til mikroglia skjebne, utføres immunfluorescensanalyse for å bekrefte uttrykket av mikrogliaberikede markører som purinergisk reseptor P2RY12 og transmembranprotein 119 (TMEM119)9. - For å bevare cellehelse og levedyktighet, utfør alle forsøkene mellom dag 10 og 12 av iMG-differensiering.
- Klargjør standard beleggløsning
2. Fagocytoseanalyse ved bruk av motorneuron-avledede humane synaptosomer
- Transkripsjonsfaktormediert differensiering av iPSC-avledede lavere motorneuroner (i3LMN-er)
MERK: En WTC11-linje med stabil innsetting av hNIL-induserbar transkripsjonsfaktorkassett som inneholder neurogenin-2 (NGN2), holme-1 (ISL1) og LIM homeobox 3 (LHX3) transkripsjonsfaktorer i CLYBL safe harbor-lokuset ble brukt til differensieringsprosessen som beskrevet tidligere17. iPSC-linjen ble opprettholdt som beskrevet i trinn 1.1.1, men med beleggforholdene beskrevet i trinn 1.2.1. Ethvert ekstracellulært matriksbeleggreagens kan brukes til dyrking av iPSC-er som vil bli brukt til nevrondifferensiering siden laminin 521 ikke er nødvendig. Alle mediene er likevektet til omgivelsestemperatur i minst 1 time før bruk.- Strøk 10 cm tallerkener med 5 ml standard beleggløsning som beskrevet i trinn 1.2.1.
MERK: Her ble det brukt 3-4 10 cm retter per differensiering. - Forbered Induction Base medium, sterilt filter, og oppbevar det ved 4 °C i opptil 3 uker.
- Forbered Neuron medium, sterilt filter, og oppbevar det ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Forbered boratbuffer ved å blande 100 mM borsyre, 25 mM natriumtetraborat og 75 mM natriumklorid i sterilt vann. Juster pH til 8,5 og steril filtrer den.
- Når iPSCs har nådd 80% sammenløp, vask cellene med DPBS og løsne koloniene ved å legge til 0,5 mM EDTA.
MERK: To brønner er vanligvis tilstrekkelig for hver 10 cm tallerken. - Inkuber cellene i 4-5 minutter ved omgivelsestemperatur. Fjern EDTA og tilsett 3 ml DMEM / F12 med HEPES til hver brønn.
- Skrap cellene ved hjelp av en celleløfter og bruk en 10 ml pipette for å fjerne cellene fra bunnen av brønnen ved å forsiktig pipettere opp og ned 2-3x.
- Samle cellene i et 15 ml konisk rør og sentrifuge ved 300 × g i 3 minutter.
- Resuspend cellene i 3 ml iPSC-medium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer og telle dem ved hjelp av et hemacytometer.
- Tallerken 1,5 × 106 iPSC i en forhåndsbelagt 10 cm skål med 12 ml iPSC-medium inneholdende 10 μM ROCK-hemmer.
- Neste dag, fjern mediet og vask cellene med DPBS. Tilsett 12 ml nylaget komplett induksjonsmedium for å indusere uttrykket av transkripsjonsfaktorene.
- På dag 2, belegg 10 cm retter med 5 ml nevronbeleggløsning tilberedt med like store mengder 0,1 mg / ml poly-D-lysin og 1 mg / ml poly-L-ornitin fortynnet i boratbuffer. Inkuber over natten ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 3, vask de belagte oppvasken med sterilt vann 3x, aspirer vannet helt, og la oppvasken tørke ved å vippe platene og la dem være delvis avdekket inne i et biosikkerhetsskap i minst 1 time ved omgivelsestemperatur.
- Når oppvasken er helt tørket, belegger du dem med 6 ml komplett induksjonsmedium supplert med 15 μg/ml laminin og 40 μM BrdU i minst 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
MERK: BrdU-behandling anbefales for å eliminere mitotisk aktive celler og dermed øke renheten til nevronkulturene. Effektene av BrdU på neuronal helse er minimal. - Behandle differensierende celler med 3 ml dissosiasjonsreagens per 10 cm tallerken og inkuber i 3-4 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Tilsett 6 ml DPBS i platen uten å fjerne dissosiasjonsreagenset og pipetten cellene i oppløsning opp og ned 4-5x med en 10 ml pipette for å dissosiere cellene.
- Samle cellesuspensjonen og send den gjennom en 40 μm cellesil inn i et 50 ml konisk rør. Tilsett 1 ml induksjonsbasemedium for å skylle silen.
- Sentrifuger cellene ved 300 × g i 5 minutter. Aspirer mediet og resuspender cellene i 3 ml komplett induksjonsmedium inneholdende 40 μM BrdU.
- Tell cellene med et hemocytometer. Plate ca. 2,5 × 106 celler per 10 cm tallerken i forhåndsbelagte retter ved å fortynne cellene i 6 ml komplett induksjonsmedium inneholdende 40 μM BrdU uten å fjerne beleggoppløsningen tilsatt i trinn 2.1.14.
- På dag 4, aspirer mediet, vask cellene 1x med DPBS, og tilsett nytt komplett induksjonsmedium inneholdende 40 μM BrdU.
- På dag 6, aspirere mediet, vask cellene 1x med DPBS, og legg til Neuron medium supplert med 1 μg / ml laminin.
- På dag 9, endre 1/3rd av mediet ved å erstatte det med friskt Neuron-medium supplert med 1 μg / ml laminin.
- Oppretthold i 3 LMNs i ytterligere 25 dager ved å utføre halv medium endringer med Neuron medium supplert med friske 1 μg / ml laminin hver3-4dager.
MERK: På dette tidspunktet bør i3LMN-er presentere en nevronmorfologi med lange prosesser. Nevroner har også en tendens til å danne klumper eller klynger av celler. En mer detaljert beskrivelse av hvordan man validerer differensieringen av i3LMNer finnes andre steder17.
- Strøk 10 cm tallerkener med 5 ml standard beleggløsning som beskrevet i trinn 1.2.1.
- Synaptosom rensing og merking
MERK: Oppretthold sterile forhold og utfør alle trinnene inne i et biosikkerhetsskap.- Vask i3 LMNs to ganger med DPBS.
- Tilsett 2 ml iskald cellelysemiddel for isolering av synaptosomer, inkuber på is i 2 minutter, og skrap nevronene godt.
- Overfør lysatet til flere 2 ml mikrorør (~1,5 ml lysat per rør) og sentrifuge ved 1 200 × g i 10 minutter ved 4 °C.
MERK: Vedlikehold rørene på is gjennom hele denne prosedyren. - Samle supernatanten (kast pelleten) og sentrifugen ved 15 000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Lagre og resuspend pelleten som inneholder synaptosomene med et tilsvarende volum (som det opprinnelige lysatet) på 5% DMSO i DPBS.
MERK: Synaptosomene kan umiddelbart merkes med en fluorophore eller lagres ved -80 ° C for fremtidig bruk. - Utfør en Bicinchoninic acid (BCA) proteinanalyse for alle rør for å vurdere det totale utbyttet av protein i synaptosompreparatet.
MERK: Andre analyser for å måle proteinkonsentrasjon kan brukes. Det totale proteinutbyttet oppnådd fra forskjellige preparater er inkludert i tabell 1 som referanse. Det anbefales å utføre western blot-analyse av synaptosompreparatet for å bekrefte tilstedeværelsen av presynaptiske og postsynaptiske proteiner. Her ble presynaptisk markør, synaptofysin (SYP), og postsynaptisk markør, postsynaptisk tetthetsprotein 95 (PSD95) valgt for vestlig blottinganalyse som beskrevet tidligere19. - Forbered en løsning av 100 mM natriumbikarbonat i vann, juster pH til 8,5 og sterilt filter.
- Solubiliser 1 mg lyofilisert pulver av det brukte pH-følsomme fargestoffet i 150 μL DMSO. Lag aliquots til engangsbruk og oppbevar dem ved -80 °C.
- Sentrifuger synaptosomene ved 15 000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fortynn opptil 1 mg synaptosomer i 100 μL 100 mM natriumbikarbonatoppløsning.
- For å merke synaptosomene, tilsett 1 μL av det rekonstituerte pH-følsomme fargestoffet per 1 mg synaptosomer og dekk reaksjonen med aluminiumsfolie for å unngå lyseksponering. Rist ved romtemperatur i 2 timer med en rørrister.
- Tilsett 1 ml DPBS i røret og sentrifuger de merkede synaptosomene ved 15 000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og utfør ytterligere fire vasker som beskrevet i trinn 2.2.11.
- Etter den siste vasken og spinningen, fjern supernatanten så mye som mulig uten å forstyrre pelleten og resuspendere de merkede synaptosomene med 5% DMSO i DPBS ved et volum for ønsket konsentrasjon (0,7 μg / μL brukt her). Tilbered engangs aliquots og oppbevar ved -80 ° C. Pass på å unngå lyseksponering for de merkede synaptosomene.
- Levende cellefagocytose analyse
- Plate 20-30 × 10 4 PMP i 96-brønnsplater i 100 μL iMG komplett medium og følg differensieringsprosessen i 10 dager som angitt i trinn 1.2.4.
- På analysedagen forbereder du den kjernefysiske fargeløsningen ved å tilsette 1 dråpe kjernefysisk flekk for levende celler i 2 ml iMG basalmedium.
- Fjern 40 μL medium per brønn på 96-brønnsplaten og tilsett 10 μL av kjernefargingsløsningen ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO 2 i2 timer.
- Tine de merkede synaptosomene på is og forsiktig sonikere ved hjelp av en vannsoniker i 1 min. Overfør synaptosomene umiddelbart tilbake til is. Fortynn de merkede synaptosomene i iMG komplett medium i et forhold på 1 μL synaptosomer per 50 μL medium.
MERK: Konsentrasjonen av synaptosom er analyseavhengig og kan kreve optimalisering. For å opprettholde en relativt lav prosentandel (dvs. 0,1% eller mindre) DMSO i mediet, anbefales det ikke å legge til mer enn 2 μL synaptosomer per brønn. - Som negativ kontroll, forbehandle noen av brønnene med cytochalasin D for å hemme aktinpolymerisasjon og dermed fagocytose. Forbered en løsning av 60 μM cytochalasin D i iMG komplett medium. Tilsett 10 μL av denne løsningen til hver brønn for en endelig konsentrasjon på 10 μM og inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter.
- Fjern platen fra inkubatoren og inkuber ved 10 °C i 10 minutter. Oppretthold platen på is og tilsett 50 μL medium som inneholder synaptosomer fremstilt som beskrevet i trinn 2.3.4.
- Sentrifuger platen ved 270 × g i 3 minutter ved 10 °C og hold platen på is til avbildning.
- Bildeopptak og analyse
- Sett platen inn i en levende celleavbildningsleser og velg brønnene som skal analyseres.
- Velg en 20x objektivlinse.
- Juster fokus, lysdiode (LED) intensitet, integrasjonstid og forsterkning av de lyse og blå (4',6-diamidino-2-fenylindol [DAPI]) kanalene. Synaptosomfluorescensen skal være ubetydelig ved det opprinnelige tidspunktet. Hvis du vil fokusere på den røde kanalen (RFP), bruker du brightfield-kanalen som referanse. Integrasjonstiden og gevinsten kan variere mellom eksperimenter; bruk disse innledende innstillingene for den røde kanalen: LED: 4, integrasjonstid: 250 og forsterkning: 5.
- Velg antall individuelle fliser som skal anskaffes i en montasje per brønn (skaff 16 fliser i midten av brønnen, og avbilde dermed ca. 5% av det totale brønnområdet). Still temperaturen til 37 ° C og ønsket tidsintervall for avbildning.
MERK: Bilder ble anskaffet hver 1 - 2 time i opptil 16 timer i denne studien. - Åpne analyseprogramvaren.
- Åpne eksperimentet som inneholder bildene. Klikk på Datareduksjon-ikonet.
- I menyen velger du Imaging Stitching under Imaging Processing for å lage et komplett bilde fra de 4 x 4 individuelle flisene i montasjen med parametrene beskrevet i tabell 2.
- Når de sydde bildene er opprettet, definerer du en intensitetsterskel ved hjelp av DAPI- og RFP-kanalene for disse bildene. Åpne et bilde og klikk på Analyser; under Analyse velger du Mobilanalyse, og under Gjenkjenningskanal velger du et sydd bilde i DAPI- eller RFP-kanalene. Gå til kategorien Primærmaske og antall og opprett en terskelverdi og objektstørrelsesverdier som riktig velger cellekjernene i DAPI-kanalen eller synaptosomsignalet i RFP-kanalen. Gjenta prosessen med forskjellige bilder til parametere som kan brukes på hele eksperimentet, er optimalisert.
MERK: Foreslåtte verdier finner du i tabell 2. - Hvis du vil telle antall kjerner, går du til Datareduksjon-menyen og velger Mobilanalyse under Bildeanalyse. Gå til kategorien Primærmaske og antall, og velg DAPI-sydde bilder under Kanal, og bruk parameterne som er beskrevet i tabell 2.
- Gå til fanen Beregnede beregninger, og velg Celleantall. For å få området til synaptosomsignalet, gå til Datareduksjon-menyen og velg Mobilanalyse under Analyse.
- Gå til kategorien Primærmaske og antall, og velg bilder som er sydd av RFP, og bruk parameterne som er beskrevet i tabell 2.
- Gå til fanen Beregnede beregninger , og velg Objektsumområde. I kategorien Datareduksjon klikker du på OK og lar programvaren analysere alle de anskaffede bildene.
- Eksporter verdiene for Objektsumområde og Celleantall for hvert tidspunkt. Del objektsumområdet med celleantallet for å beregne det normaliserte området per tidspunkt. Hvis du sammenligner flere behandlinger eller genotyper, beregne fagocytoseindeksen ved hjelp av ligning (1):
(1) - Lagre resultatene og integrer dataene.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å generere iMG-er ved hjelp av denne protokollen, er det viktig å starte med udifferensierte iPSC-er som viser kompaktkolonimorfologi med veldefinerte kanter (figur 2A). Dissosierte iPSCer opprettholdt som beskrevet i EB-formasjonsdelen vil danne sfæriske aggregater, kalt EBs, som vil vokse i størrelse til dag 4 av differensiering (figur 2B). Når EB-ene er samlet og belagt under passende forhold for PMP-generering, festes de til de matrikelbelagte platene, og et lag med celler vil spre seg og omslutte de sfæriske aggregatene (figur 2C). Usunn EB vil løsne fra platen og bør elimineres. Fra dag 14 til 21 av PMP-generasjonen kan potensielt forskjellige celletyper dukke opp og vil flyte i mediet; Disse cellene skal kastes under medieendringer12. På dag 28 vil runde celler med et stort cytoplasma-til-kjerne-forhold vises i suspensjon (figur 2D), kalt PMP. Disse cellene produseres kontinuerlig og kan høstes ukentlig under middels endringer i opptil 3 måneder. Antall PMP-er som høstes hver uke varierer og avhenger av iPSC-linjen og kulturens alder; avkastningen avtar generelt med tiden. Det anbefales sterkt å dyrke iPSC i laminin 521-belagte plater i stedet for Matrigel, da PMP-utbyttet er høyere når iPSC opprettholdes under de tidligere forholdene som rapportert tidligere og i denne studien (figur 2E)18.
Etter at PMP har blitt eksponert for iMG-medium i 10-12 dager, får cellene en mikroglia-lignende morfologi med en liten cytoplasma og tilstedeværelsen av langstrakte prosesser (figur 3A). For å verifisere mikrogliaidentitet utførte vi immunfluorescensfarging med antistoffer mot det myeloide markørioniserte kalsiumbindende adaptermolekylet 1 (IBA1) og de mikrogliaberikede markørene purinergisk reseptor P2RY12 og transmembranprotein 119 (TMEM119) som beskrevet tidligere20 (se også materialtabellen). Vanligvis uttrykker >95% av cellene IBA1 og omtrent 90% av cellene uttrykker P2RY12 og TMEM119 (figur 3B).
For å vurdere fagocytisk kapasitet av iMGs, ble det brukt3LMN-avledede humane synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff. For å verifisere at synaptosompreparatet beholder kanoniske strukturelle egenskaper, ble anrikningen av den presynaptiske markøren, synaptofysin (SYP) og den postsynaptiske markøren, postsynaptisk tetthetsprotein 95 (PSD95)19 bekreftet ved vestlig blotanalyse (figur 4) utført som beskrevet før20 (se også materialtabellen ). Synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff blir fluorescerende etter å ha blitt oppslukt av iMGs og når de er lokalisert i intracellulære sure (dvs. lave pH) rom.
På det første tidspunktet var det røde fluorescerende signalet minimalt, da de fleste synaptosomene ennå ikke var fagocytosert. Etter 30 minutter ble det oppdaget et rødt fluorescerende signal og økte ytterligere over tid. Ved 10 timer var det røde fluorescerende signalet robust, da de fleste synaptosomene hadde blitt oppslukt og ble lokalisert til sure intracellulære rom via fagocytoseprosessen (figur 5A). Cytochalasin D er en aktinpolymerisasjonshemmer som er mye brukt til å blokkere fagocytose. Som forventet observerte vi en sterk reduksjon av det røde fluorescerende signalet i cytokalasin D-behandlede iMGer, noe som indikerer at det oppdagede signalet skyldes fagocytiske hendelser. Vi la også merke til at iMGs viser endringer i morfologi etter 10 timer fagocytose som ikke ble påvist i cytochalasin D-behandlede iMGs, muligens på grunn av mangel på aktinremodellering i cytochalasin D-behandlede iMGs. Endringer i mikrogliamorfologi er vanligvis forbundet med aktiveringsstatus2.
Ved å bruke den beskrevne automatiserte kvantifiseringsmetoden målte vi det totale arealet av rødt signal ved hvert tidspunkt og normaliserte det til celletallet oppnådd ved å telle kjernene. Resultatene indikerer at arealet av oppslukte synaptosomer økte med tiden til et platå ble nådd ved 16 timer. Som forventet økte ikke området med rødt signal fra cytokalasin D-behandlede celler med tiden, siden fagocytose ble hemmet (figur 5B). Sammen indikerer disse resultatene at iMG er i stand til fagocytosering av hjernesykdomsrelevant materiale og er egnet for funksjonelle studier.
Figur 1: Skjematisk av protokollen for å differensiere iPSCs i mikroglia-lignende celler. På dag 0, når iPSCs har nådd 80% sammenløp, blir koloniene dissosiert i enkeltceller og dyrket i EB-medium for å indusere EB-dannelse. På dag 4 samles EBs og belagt i PMP-medium for å indusere PMP-generering. Etter 28 dager samles PMP-er og differensieres terminalt til iMG-er ved bruk av iMG-medium. PMP kan samles ukentlig i opptil 3 måneder. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iMGs = microglia-lignende celler; EB = embryoid kropp; PMP = primitiv makrofag forløper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cellemorfologi vurdert ved lysmikroskopi i differensieringsstadiene fra iPSC til PMPs. (A) iPSCs opprettholdt i iPSC-medium til 80% sammenløp. (B) En embryoid kropp etter 4 dagers differensiering i EB-medium. (C) EBs festet til belagte plater og (D) PMPs som kommer i suspensjon fra EBs etter 28 dagers kultur i PMP-medium. (E) Antall PMPer samlet inn fra ~48 EBs ved uke 1 (etter 28 dager med PMP-differensiering) og uke 12. Stolpediagrammer viser gjennomsnittet av seks uavhengige differensieringer (datapunkter) fra to forskjellige iPSC-linjer. Statistikk ble oppnådd ved toveis ANOVA og Šídáks multiple sammenligningstest. Skalastenger = 1 000 μm (A), 400 μm (B-D). Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; iMGs = microglia-lignende celler; EB = embryoid kropp; PMP = primitiv makrofag forløper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: iMGs differensiert av denne protokollen viser bona fide microglia-egenskaper etter 10 dager med terminal differensiering. (A) Representativt brightfield-bilde av iMG-er som presenterer mikroglia-lignende morfologi. Skala bar = 400 μm. (B) Representative immunfluorescensbilder av iMGs som uttrykker myeloide / mikroglia markører IBA1, P2RY12 og TMEM119. Skalastenger = 400 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: iMGs = microglia-lignende celler; IBA1 = ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1; P2RY12 = purinerg reseptor P2RY12; TMEM119 = transmembranprotein 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: i3LMN-avledede humane synaptosomer uttrykt synaptiske markører ved vestlig blotanalyse. Representativ western blot-analyse av et humant synaptosompreparat avledet fra i3LMN etter 28 dagers kultur undersøkt med den postsynaptiske markøren, PSD95, den presynaptiske markøren, SYP og β-tubulin. Forkortelser: i3LMN = iPSC-avledede lavere motorneuroner; PSD95 = postsynaptisk tetthetsprotein 95; SYP = synaptofysin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fagocytoseanalyse av iMGs ved bruk av humane synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff og overvåket av levende celle, langsgående avbildning . (A) Representative lysfelt- og fluorescensmontasjer av iMG-er med kjernefarging (blå kanal) utsatt for merkede humane synaptosomer (rød kanal) med og uten cytoD-behandling ved de angitte tidspunktene. Montasjene ble opprettet ved etterbehandling av 16 fliser anskaffet ved 20x. Skalastenger = 400 μm. (B) Kvantifisering av arealet av synaptosomfluorescerende signal normalisert til cellenummeret. Datapunkter indikerer gjennomsnittlig ± SEM på tre tekniske replikasjoner. Hver kurve viser kvantifiseringen for to uavhengige differensieringer (iMGs 1 og 2) fra en iPSC-linje med og uten cytoD-behandling. Forkortelser: iMGs = microglia-lignende celler; cytoD = cytochalasin D. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Antall 10 cm retter av DIF28 i3LMN | Totalt protein (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabell 1: Totalt proteinutbytte etter synaptosomisolering fra iPSC-avledede lavere motorneuroner ved 28 dagers differensiering. Total proteinmengde oppnådd fra fire uavhengige differensieringer etter at synaptosomer ble ekstrahert. Ulike antall 10 cm retter som inneholdt i3LMN ble høstet i hver differensiering. Proteinutbyttet ble målt ved BCA-proteinanalyse. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; i3LMN = iPSC-avledede lavere motorneuroner; DIF28 = 28 dager med differensiering; BCA = bicinkoninsyre.
| Parametere | Verdi |
| Registrering kanal | Lyst felt, DAPI og RFP |
| Fusjonsmetode | Lineær blanding |
| Beskjær sydd bilde for å fjerne svarte rektangler på kantlinjene | Rutet |
| Redusere størrelsen på det endelige bildet | Rutet |
| Parametere | Verdi |
| Terskel | Bestemmes av brukeren |
| Bakgrunn | Mørk |
| Dele berørende objekter | Rutet |
| Fyll hull i masker | Rutet |
| Min. objektstørrelse | 7 mikrometer |
| Objektstørrelse | 30 mikrometer |
| Inkludere objekter med primærkant | Rutet |
| Analyser hele bildet | Rutet |
| Parametere | Verdi |
| Terskel | Bestemmes av brukeren |
| Bakgrunn | Mørk |
| Dele berørende objekter | Rutet |
| Fyll hull i masker | Rutet |
| Min. objektstørrelse | 5 mikrometer |
| Objektstørrelse | 100 μm |
| Inkludere objekter med primærkant | Rutet |
| Analyser hele bildet | Rutet |
Tabell 2: Parametere brukt for bildeopptak og dataanalyse. Foreslåtte parametere å vurdere for bildebehandling under fagocytoseanalysen og for analyse av de oppkjøpte bildene er oppført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differensieringsprotokollen beskrevet her gir en effektiv metode for å oppnå iPSC-avledede mikroglia-lignende celler i ~ 6-8 uker med høy renhet og i tilstrekkelig utbytte for å utføre immunfluorescenseksperimenter og andre analyser som krever et høyere antall celler. Denne protokollen har gitt opptil 1 × 106 iMGs på 1 uke, noe som muliggjør protein- og RNA-ekstraksjon og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrensning av denne protokollen at utbyttet av iMG-er kan begrense visse applikasjoner. Ytterligere modifikasjoner kan implementeres for å akkumulere PMPer fra forskjellige uker og opprettholde en homogen kultur i suspensjon til nok forfedre er samlet for å fortsette med differensieringsprosessen på en gang18. Alternativt kan differensieringen av EBs skaleres opp ved å bruke cellekulturplater med høyere område for å øke produksjonen av PMP-er.
Det anbefales å bruke iPSCs dyrket i laminin 521-belagte plater for å starte differensieringsprosessen. Andre beleggreagenser kan redusere antall PMP-er produsert senere i prosessen18. På samme måte forbedrer belegging av platene for EB-adhesjon under PMP-generering EB-vedlegget, og forlenger dermed kulturens levetid. EB-kulturen har blitt opprettholdt i opptil 4 måneder, og da løsner og dør flere EBer. Andre forskere rapporterer imidlertid at de dyrker EBs i opptil 1 år12. I våre hender opprettholder iMGs generert fra 3 måneder gamle EB-kulturer lignende funksjonelle egenskaper som iMGs differensiert fra unge kulturer; kulturer eldre enn 3 måneder har ikke blitt brukt til funksjonell eksperimentering.
For å optimalisere sluttfasen av mikrogliadifferensiering fra de opprinnelige protokollene beskrevet ovenfor 7,8, inkluderte vi 100 ng/ml interleukin (IL)-34,7 5 ng/ml kolonistimuleringsfaktor 1 (M-CSF)10 og 50 ng/ml transformerende vekstfaktor-beta (TGF-β) i iMG-mediet. IL-34 og M-CSF stimulerer CSF1-reseptoravhengige veier som er avgjørende for å opprettholde microglia skjebne og overlevelse8 mens TGF-β støtter microglia homeostase9, og dermed fremmer et mer fysiologisk miljø for PMP-forpliktelse til microglia skjebne. Merk at hele differensieringsprosessen beskrevet her utføres i serumfrie forhold, noe som forhindrer mulige effekter av serum på iMG-oppførsel og endringer i nedstrøms applikasjoner. For funksjonell eksperimentering med iMG anbefales det å gjennomføre eksperimenter mellom 10 og 12 dager med terminal differensiering. iMGs har blitt dyrket i opptil 14 dager med en beskjeden reduksjon av cellens levedyktighet, hvoretter cellehelsen er betydelig kompromittert.
Siden en av de kanoniske funksjonene til mikroglia er fagocytose, ble en analyse for å undersøke fagocytisk aktivitet in vitro inkludert i denne protokollen. For å utvikle et menneske-celle-basert system ble synaptosomer avledet fra humane i3LMN brukt. Kvaliteten på synaptosompreparatet ble vurdert ved western blot-analyse av synaptiske markører i denne studien. I tillegg kan andre strukturelle og funksjonelle egenskaper av synaptosompreparatet undersøkes ved elektronmikroskopi eller immunostaining før fagocytoseanalysen. Protokollen beskrevet her for å oppnå humane synaptosomer er sterkt avhengig av i3LMN, noe som gir et relativt høyt antall nevroner. Imidlertid vil nevronutbyttet sannsynligvis være lavere ved bruk av andre differensieringsmetoder (dvs. protokoller som krever cocktailer av små molekyler). Spesielt kan fagocytoseanalysen utføres med flere andre substrater som musehjerneavledede synaptosomer, aggregerte proteiner eller døde celler, som alle kan merkes med pH-følsomme fargestoffer for å overvåke fagocytose på lignende måte. Det foreslås å bruke pH-følsomme fargestoffer fordi det fluorescerende signalet hovedsakelig sendes ut når synaptosomene er lokalisert i syrerom under fagosombehandling og nedbrytning i lysosomene21. Denne egenskapen reduserer bakgrunnssignalet fra synaptosomer utenfor cellene og letter bruken av automatiserte kvantifiseringsmetoder. I tillegg tillater pH-følsomme fargestoffer deteksjon av sanne fagocytosehendelser i motsetning til substrattilslutning eller docking på cellemembranen.
Mens det her foreslås å bruke ~ 35 μg synaptosomer per brønn, bør den spesifikke mengden humane synaptosomer og andre substrater optimaliseres, da optimale forhold avhenger av iPSC-linjen og eksperimentelle forhold. Et ideelt utvalg av synaptosomer bør resultere i en dose-respons i fagocytoseanalysen. For mye synaptosomer kan mette systemet, noe som gjør det vanskelig å oppdage meningsfulle forskjeller som en funksjon av genotype eller behandlingsgruppe. For lite materiale vil resultere i et svakt utgangssignal i analysen. Av denne grunn anbefales det å teste flere konsentrasjoner av hvert substrat for å etablere en arbeidsanalyse. I tillegg er det viktig å opprettholde% DMSO innenfor et trygt område for å bevare cellehelsen.
I denne protokollen ble fagocytose overvåket ved hjelp av et levende celleavbildningssystem (Table of Materials) fordi det gir kinetisk informasjon om cellens oppslukningskapasitet. Mikroskoper og bildesystemer som kan støtte levende cellebilder og opprettholde stabil temperatur, fuktighet og CO 2-konsentrasjoner er også egnet for denne analysen. Alle fagocytoseeksperimentene beskrevet her ble avbildet ved 37 °C med 85%-95% fuktighet og 5% CO2. Andre deteksjonsmetoder som avbildning av faste celler eller flowcytometri kan også brukes til å vurdere fagocytose ved bruk av de samme materialene og cellekulturprotokollene (til og med generering av iMG og merkede synptosomer) når levende celleavbildning ikke er mulig eller ønsket. På samme måte kan annen åpen kildekode-programvare brukes til dataanalyse som ImageJ eller CellProfiler; sistnevnte vil tillate en automatisert analyse som kan sammenlignes med programvaren som brukes her.
Oppsummert illustreres implementering av en robust protokoll for å skille mikroglia-lignende celler fra humane iPSCer, og dermed overvinne den begrensede ressursen til humane mikroglia. Differensiert mikroglia kan brukes til en rekke applikasjoner i studiet av nevrodevelopmental og neurodegenerative sykdommer. Videre er en fullstendig "humanisert" fagocytoseanalyse inkludert, noe som ytterligere vil hjelpe studiet av mikrogliafunksjon og dysfunksjon i sammenheng med menneskelig utvikling og sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne takker Michael Ward for å gi WTC11 hNIL iPSC-linjen for motorneurondifferensiering og Jackson Laboratories for å levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen som brukes til mikrogliadifferensiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hennes støtte under implementeringen av protokollene, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjelp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisjoner og Jonathan Jung for hans samarbeid i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F.
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
