Summary
이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.
Abstract
미세아교세포는 뇌 미세 환경에서 항상성을 유지하고 여러 신경계 질환의 핵심 역할을 하는 골수성 기원의 상주 면역 세포입니다. 건강과 질병에서 인간 미세아교세포를 연구하는 것은 인간 세포의 공급이 극히 제한되어 있기 때문에 어려운 일입니다. 인간 개체에서 유래 한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는이 장벽을 우회하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 시험관 내 실험을 위해 인간 iPSC를 미세아교세포 유사 세포(iMG)로 분화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 iMG는 미세아교세포와 유사한 형태, 적절한 마커의 발현 및 활성 식균작용을 포함하여 미세아교세포의 예상 및 생리학적 특성을 나타냅니다. 추가적으로, 인간 iPSC 유래 하부 운동 뉴런(i3LMN)으로부터 유래된 시냅토좀 기질을 분리하고 표지하기 위한 문서가 제공된다. 살아있는 세포, 종단 영상 분석은 pH에 민감한 염료로 표지 된 인간 시냅 토좀의 삼킴을 모니터링하는 데 사용되어 iMG의 식세포 능력을 조사 할 수 있습니다. 본원에 기술된 프로토콜은 인간 미세아교세포 생물학 및 질병에 대한 미세아교세포의 기여를 조사하는 상이한 분야에 광범위하게 적용가능하다.
Introduction
미세아교세포는 중추신경계(CNS)에 상주하는 면역 세포이며 CNS 발달에 중요한 역할을 합니다. 미세 아교 세포는 항상성을 유지하고 외상 및 질병 과정에 적극적으로 반응하기 위해 성인 뇌에서도 중요합니다. 누적 증거에 따르면 미세아교세포는 여러 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환의 발병 기전에 주요 기여를 합니다1,2. 미세아교세포 생물학에 대한 현재의 지식은 주로 마우스 모델에서 파생되었지만 최근 연구에서는 쥐와 인간 미세아교세포 사이의 중요한 차이점을 밝혀냈으며 인간 미세아교세포의 유전학 및 생물학적 기능을 연구하기 위한 기술 개발의 필요성을 강조했습니다.3,4. 해부된 1차 조직으로부터 미세아교세포를 분리하면 미세아교세포 특성5이 심각하게 변형될 수 있으며, 잠재적으로 그러한 세포로 얻은 결과를 교란시킬 수 있다. 이 방법의 전반적인 목표는 인간 iPSC를 iMG로 분화하여 기저 조건에서 인간 미세아교세포를 연구하기 위한 세포 배양 시스템을 제공하는 것입니다. 또한, 완전 인간 모델 시스템을 사용하는 식작용 분석은 품질 관리 측정으로서 및 질병의 맥락에서 iMG 기능 장애를 평가하기 위한 수단으로서 본 명세서에 포함된다.
iPSC로부터 미세아교세포 분화를 위한 다수의 프로토콜이 최근 문헌 6,7,8,9,10에 등장하였다. 일부 프로토콜의 잠재적 단점은 연장된 또는 장기간의 분화, 다중 성장 인자의 추가, 및/또는 복잡한 실험 절차(6,9,10)를 포함한다. 여기에서 iPSC를 원시 대식세포 전구체(PMP)라고 하는 전구체 세포로 분화하여 미세아교세포 개체 발생의 측면을 요약하는 "사용자 친화적인" 분화 방법이 입증되었습니다7,11. PMP는 이전에 설명된 대로 생성되며, 일부 최적화는 여기에 제시되어 있습니다12. PMP는 MYB 비의존적 난황낭 유래 대식세포를 모방하며, 이는 혈액-뇌 장벽 폐쇄 전에 뇌를 침범하여 배아 발달 동안 미세아교세포를 생성합니다13. PMP를 iMG로 최종 차별화하기 위해 Haenseler et al. 및 Brownjohn et al.의 프로토콜을 기반으로 하는 빠르고 단순화된 단일 배양 방법을 사용했으며, iMG가 미세아교세포가 풍부한 마커 7,8을 강력하게 발현하는 효율적인 미세아교세포 분화 방법을 생성하기 위해 일부 수정했습니다. 이 분화 방법은 iPSC 배양에 대한 전문 지식과 인간 모델 시스템을 사용하여 미세아교세포 생물학을 연구하는 것을 목표로 하는 연구 목표를 가진 실험실에서 재현할 수 있습니다.
iPSC 유래 미세아교세포는 시험관 내 실험을 위한 생물학적으로 관련된 인간 미세아교세포 공급원을 나타내며 식균작용을 포함한 미세아교세포 표준 기능을 조사하는 중요한 도구입니다. 미세아교세포는 뇌와 CNS의 전문 식세포로, 세포 파편, 응집된 단백질 및 분해된 미엘린14를 제거합니다. 미세아교세포는 또한 시냅스를 삼켜 시냅스 리모델링과 병원균의 식균작용을 통한 외부 감염에 대한 방어기능을 합니다 15,16. 이 프로토콜에서 iMG에 의한 식균 작용은 iMG 삼키기위한 재료로 인간 시냅 토좀을 사용하여 평가됩니다. 이를 위해, 인간i3LMNs로부터 유래된 시냅토좀을 단리하기 위한 설명이 기술된다. i3LMN-유래된 인간 시냅토좀은 pH에 민감한 염료로 표지되어 시험관 내에서 포식체 처리 및 분해 중에 산성 구획 내에 국한된 시냅토좀의 정량화를 가능하게 한다. 생세포 현미경을 사용한 식균 작용 분석은 미세아교세포 삼킴의 동적 과정을 실시간으로 모니터링하기 위해 표시됩니다. 이 기능 분석은 완전한 인간 시스템을 사용하여 건강 및 질병에서 소교 세포 식균 작용의 가능한 결함을 조사하기위한 기초를 설정합니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약은 멸균되어야 하며 모든 단계는 멸균 상태의 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 모든 iPSC 라인과 유지 보수 및 차별화 매체는 재료 표에 설명되어 있습니다. 아래에 예시된 미세아교세포 분화 방법은 이전에 공개된 프로토콜 7,8,12에 기초하고 여기에 설명된 새로운 변형을 갖는다.
1. 미세아교세포 분화
참고: 프로토콜의 개요는 그림 1에 요약되어 있습니다.
- 유도만능줄기세포(iPSC) 배양
참고: iPSC 배양 기술을 설명하는 자세한 내용은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다17.- 해동 및 유지 보수
- iPSC 배지를 준비하고, 배지를 부분 추출하고, -20°C에서 최대 6개월 동안 보관합니다. 분취량을 4°C에서 밤새 해동하고 최대 1주일 동안 사용합니다. 사용하기 전에 미디어를 주변 온도에 1시간 이상 두십시오.
- 칼슘과 마그네슘 18을 포함하는 DPBS에 희석한 라미닌 521 10μg/mL1mL를 추가하여 6웰 플레이트의 웰을 코팅합니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 의 인큐베이터에 적어도 2시간 동안 또는 바람직하게는 밤새 보관한다. 일단 희석되면, 라미닌을 4 °C에서 3 개월 동안 저장한다.
- 멸균 된 물에 희석하여 10mM Rho 키나제 억제제 Y27632 (ROCK 억제제) 원액을 준비하십시오. ROCK 억제제 용액의 일회용 분취량을 만들어 -20°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
- 0.5 M EDTA의 원액을 DPBS로 희석하여 0.5 mM EDTA를 제조한다.
- 냉동 iPSC의 바이알을 해동하려면 바이알을 대부분 해동될 때까지 37°C의 수조에 넣습니다. 바이알의 내용물을 4mL의 iPSC 배지가 들어있는 15mL 원추형 튜브로 즉시 옮깁니다. 500 ×g에서 1 분 동안 원 심 분리합니다.
- 상청액을 흡인하고 콜로니의 교란을 피하기 위해 튜브 벽에 10μM ROCK 억제제가 포함된 iPSC 배지 1mL를 천천히 추가하여 세포를 재현탁합니다.
- 10μM ROCK 억제제를 함유하는 1.5mL의 iPSC 배지를 코팅된 각각의 웰에 첨가하고, 재현탁된 콜로니를 배지가 들어 있는 웰에 한 방울씩 옮긴다.
알림: 배양 유지 관리를 위해 5단계에서 7-1.1.6방울을 사용하되 모든 iPSC 라인에 대해 최적의 파종 밀도를 조정하십시오. - 플레이트를 좌우로 수동으로 섞거나 뒤에서 앞으로 섞어 웰에 세포를 고르게 분배합니다. 세포를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 넣었다. 다음날, ROCK 억제제가 없는 새로운 iPSC 배지를 추가하여 배지를 완전히 교체하십시오.
- 유지 관리를 위해 세포가 80 % 컨플루언스에 도달 할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.
알림: 사용된 iPSC 배지 가 유연한 공급 일정을 허용하는 경우 배지를 변경하지 않고 셀을 2일 동안 유지할 수 있습니다. 이를 한 구절 당 한 번으로 제한하고 세포가 50 % 미만의 합류 인 경우에만 제한하는 것이 좋습니다.
- 분할
- 배지를 흡인하고 1mL의 DPBS (칼슘과 마그네슘 제외)로 세포를 씻으십시오.
- 세포를 제거하려면 0.5mM EDTA 1mL를 추가하고 세포 콜로니의 가장자리가 웰 표면에서 들어 올려질 때까지 실온에서 2-3분 동안 배양합니다. DPBS로 세포를 다시 세척하고 iPSC 배지 1mL를 추가합니다.
- 세포 리프터를 사용하여 세포 콜로니를 부드럽게 긁어 해리합니다. 식민지를 방해하지 않도록 우물의 각 영역을 한 번만 긁으십시오.
참고: 우물에서 식민지를 제거하는 대체 방법은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다17. - 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 수집하고 1.5mL의 iPSC 배지가 포함된 사전 코팅된 웰(1.1.1.2단계에서 언급한 대로)에 1:6 비율(세포 대 배지)로 한 방울씩 옮깁니다.
- 해동 및 유지 보수
- 미세아교세포(iMG)로의 iPSC 분화
참고: 소분자와 성장 인자는 DPBS의 멸균 여과된 0.1% 소 혈청 알부민에 최종 농도보다 1,000배 높은 스톡 농도로 용해됩니다. 초기 계대 과정에서 iPSC를 iMG로 구별하는 것이 좋습니다. iPSC 라인의 일상적인 핵형 분석이 권장됩니다.- 표준 코팅액 준비
- 세포외 매트릭스 코팅 시약의 스톡 용액을 얼음 위에서 밤새 해동시킨다.
- 마이크로 원심분리 튜브와 필터 피펫 팁을 4°C에서 사전 냉각합니다.
- 농축된 세포외 매트릭스 코팅 시약 250 μL를 각 튜브에 분취하고, 즉시 얼음 위에 둔다. 분취량을 -20°C에서 보관한다.
- 코팅 용액을 제조하기 위해, 세포외 매트릭스 코팅 시약 분취액 중 하나를 얼음 상에서 밤새 해동시킨다.
- 인간 배아 및 유도 만능 줄기 세포(DMEM-F12라고 함)의 성장에 최적화된 얼음처럼 차가운 DMEM-F12 50mL를 사전 냉장된 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 보관합니다.
- 얼음처럼 차가운 DMEM-F12를 위아래로 여러 번 피펫팅하여 1mL 피펫 팁을 식힌 다음 즉시 피펫 팁을 사용하여 250μL의 세포외 매트릭스 코팅 시약을 DMEM-F12 배지가 포함된 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
알림: 표준 코팅 용액은 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
- 배아 체 (EB) 형성
- 4 ° C에서 최대 4 일 동안 유지할 수있는 EB 배지 를 준비하십시오.
- iPSC가 80% 컨플루언시티에 도달하면 DPBS 1mL로 세척하고 해리 시약 1mL를 추가하여 37°C에서 2분 동안 콜로니를 해리합니다. 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 여러 번 긁어 세포 리프터를 사용하여 콜로니를 제거합니다. 세포를 수집하고 9mL의 DPBS가 들어있는 15mL 원추형 튜브로 모든 것을 옮깁니다.
- 세포를 500 ×g에서 1 분 동안 원 심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 1mL의 EB 배지에 재현탁시킨다. 10 μL의 세포를 취하여 트리판 블루로 1:1로 희석합니다. 혈구계로 세포를 계수하고, 세포 수에 기초하여, 세포 스톡을 100 μL 당 10,000 세포의 최종 희석액으로 희석한다. 도금 셀의 경우 웰당 희석된 셀 100μL를 접착력이 낮은 둥근 바닥 96웰 플레이트에 추가합니다.
참고: 일반적으로 96웰 플레이트의 48웰은 iPSC의 각 80% 합류 웰에서 얻을 수 있습니다. - 플레이트를 125 × g 에서 3분 동안 원심분리하고, 37°C 및 5%CO2 에서 4일 동안 인큐베이션한다. 멀티채널 피펫을 사용하여 2일째에 기존 배지 50μL를 부드럽게 수집한 다음 새로운 EB 배지 50μL를 다시 추가하여 절반 배지 변경을 수행합니다.
참고: 4일째에 iPSC는 결과 섹션에 설명된 대로 EB라고 하는 구형 세포 구조를 형성합니다. EB 차별화 프로세스는 필요한 경우 최대 7일까지 연장할 수 있습니다.
- 원시 대식세포 전구체(PMP)의 생성
- PMP 기본 배지, 멸균 필터를 준비하고 4 ° C에서 최대 1 개월 동안 보관하십시오.
- 1mL의 얼음-차가운 Matrigel 코팅 용액을 첨가하여 6-웰 플레이트의 웰을 코팅하고, 적어도 2 h 또는 바람직하게는 밤새 37°C 및 5%CO2 에서 배양한다.
- EB 분화 4일째에 1mL 피펫 팁(피펫 사용)으로 EB를 수집하여 EB를 Matrigel이 코팅된 웰로 옮깁니다. 우물에서 EB를 제거하기 위해 한두 번 위아래로 피펫을 사용합니다. EB가 우물 가장자리에 정착할 수 있도록 6웰 플레이트를 기울어진 각도로 잡습니다.
알림: 코팅된 웰당 9개 또는 10개의 EB를 도금할 수 있습니다. - 모든 EB가 안정되면 EB를 웰 가장자리에 유지하면서 1mL 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 피펫팅하고 기존 배지를 제거합니다. 새로 준비된 PMP 완전 배지 3mL를 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 좌우로 수동으로 섞거나 뒤에서 앞으로 섞어 웰에 세포를 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에 놓는다.
- EB가 우물 바닥에 부착 될 수 있도록 7 일 동안 플레이트를 방해하지 마십시오. 그 후 PMP 완전 매체를 사용하여 반 매체 변경을 수행하십시오.
알림: 이 시점에서 대부분의 EB는 플레이트에 부착되어야 합니다. 모든 유동 EB를 제거할 수 있습니다. - 5-7 일 후, 4x 배율로 라이트 필드 현미경으로 EB를 검사하여 웰 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 1.2.3.5에 설명된 대로 매체를 변경합니다. 21일째에 3mL의 PMP 완전 배지로 완전 배지 변경을 수행합니다.
참고: 배지에 떠 있는 골수성 전구체는 이 시점에서 분명할 수 있습니다. 이러한 세포는 배지 교환 중에 폐기해야 합니다. - 28일째에, 상청액에서 PMPs로 지칭되는 둥근 세포를 찾고, 10 mL 피펫 및 자동 피펫터를 사용하여 PMPs를 포함하는 배지를 수집한다. EB를 방해하지 않도록 주의하십시오. PMP와 배지를 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 1.2.4단계에 설명된 대로 진행합니다.
알림: 일반적으로 동일한 iPSC 라인의 PMP는 6웰 플레이트의 5개 웰에서 수집하여 단일 15mL 원뿔형 튜브에 함께 모을 수 있습니다. - EB의 추가 유지 관리를 위해 3mL의 새로운 PMP 완전 배지 를 추가합니다. PMP가 3개월 이상 EB에서 지속적으로 나오면 4단계 및 7단계에 설명된 대로 1.2.3.7일 간격으로 1.2.3.8일마다 수집하십시오(매체의 색상이 노란색 톤으로 변경되지 않도록 함).
참고: PMP는 몇 개월 동안 수집할 수 있지만 시간이 지남에 따라 표현형이 변경될 수 있습니다.
- iMG로의 차별화
- iMG 기본 배지(재료 표), 멸균 필터를 준비하고 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다.
- PMP가 15mL 원뿔형 튜브에 수집되면 200× g 에서 4분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 1-2mL의 iMG 기본 배지를 사용하여 PMP를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 작은 분취량을 취하고 Trypan blue로 1 : 1로 희석하여 세포를 세십시오.
참고 : 0.5-1.5 × 106 PMP는 일반적으로 iPSC 라인과 EB 배양의 나이에 따라 매주 얻습니다. - 나머지 셀을 200 ×g에서 4 분 동안 다시 원심 분리합니다. PMP를 원하는 농도로 희석하여 세포가 신선하게 준비된 iMG 완전 배지를 사용하여 세포 배양 처리된 플레이트에 ~105/cm2의 밀도로 플레이팅되도록 합니다. 말단 차별화를 위해 10-12일 동안 3-4일마다 새로 준비된 iMG 완전 배지를 사용하여 반배지 변경을 수행합니다.
참고: 이 시점에서 세포는 미세아교세포와 유사한 형태를 획득해야 합니다. 미세아교세포 운명에 대한 PMP의 헌신을 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 퓨린성 수용체 P2RY12 및 막횡단 단백질 119(TMEM119)9와 같은 미세아교세포가 풍부한 마커의 발현을 확증합니다. - 세포 건강 및 생존력을 보존하기 위해, iMG 분화 10일에서 12일 사이에 모든 실험을 수행한다.
- 표준 코팅액 준비
2. 운동 신경 유래 인간 시냅토좀을 이용한 식균 작용 분석
- iPSC 유래 하부 운동 뉴런의 전사인자-매개 분화(i3LMNs)
참고: 뉴로게닌-2(NGN2), 섬-1(ISL1) 및 LIM 호메오박스 3(LHX3) 전사 인자를 포함하는 hNIL 유도성 전사 인자 카세트를 CLYBL 세이프 하버 유전자좌에 안정적으로 삽입한 WTC11 라인을 이전에 설명한 대로 분화 과정에 사용했습니다.17. iPSC 라인은 단계 1.1.1에서 설명한 대로 유지되었지만 단계 1.2.1에 설명된 코팅 조건으로 유지되었습니다. 라미닌 521이 필요하지 않기 때문에 뉴런 분화에 사용될 iPSC를 배양하는 데 임의의 세포외 매트릭스 코팅 시약을 사용할 수 있다. 모든 매체는 사용하기 전에 최소 1시간 동안 주변 온도와 평형을 이룹니다.- 10cm 접시에 5mL의 표준 코팅 용액으로 1.2.1cm 코팅합니다.
참고: 여기에서는 차별화당 3-4개의 10cm 접시가 사용되었습니다. - 인덕션 베이스 배지, 멸균 필터를 준비하고 4°C에서 최대 3주 동안 보관합니다.
- 뉴런 배지, 멸균 필터를 준비하고 4 ° C에서 최대 2 주 동안 보관하십시오.
- 멸균수에 100mM 붕산, 25mM 테트라보레이트나트륨 및 75mM 염화나트륨을 혼합하여 붕산염 완충액을 준비합니다. pH를 8.5로 조정하고 멸균 여과합니다.
- iPSC가 80% 컨플루언시에 도달하면 DPBS로 세포를 세척하고 0.5mM EDTA를 추가하여 콜로니를 제거합니다.
알림: 일반적으로 각 10cm 접시에 두 개의 웰로 충분합니다. - 주변 온도에서 4-5 분 동안 세포를 배양하십시오. EDTA를 제거하고 각 웰에 HEPES가 있는 DMEM/F12 3mL를 추가합니다.
- 세포 리프터를 사용하여 세포를 긁어내고 10mL 피펫을 사용하여 2-3배 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 웰 바닥에서 세포를 제거합니다.
- 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고 300× g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
- 세포를 10μM ROCK 억제제가 포함된 3mL의 iPSC 배지 에 재현탁시키고 혈구계를 사용하여 계수합니다.
- 10μM ROCK 억제제가 포함된 iPSC 배지 12mL와 함께 미리 코팅된 10cm 접시에 1.5 × 106 개의 iPSC 를 플레이팅합니다.
- 다음날 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 씻으십시오. 새로 준비된 완전 유도 배지 12mL를 추가하여 전사 인자의 발현을 유도합니다.
- 2일째에 보레이트 완충액에 희석한 동일한 부피의 폴리-D-라이신 0.1mg/mL와 폴리-L-오르니틴 1mg/mL로 준비된 뉴런 코팅액 5mL로 10cm 접시를 코팅합니다. 37°C 및 5%CO2에서 밤새 배양한다.
- 3일째에 코팅된 접시를 멸균수로 3배 씻고 물을 완전히 흡인한 다음 접시를 기울여 주변 온도에서 최소 1시간 동안 생물안전 캐비닛 내부에 부분적으로 덮지 않은 상태로 두어 접시를 건조시킵니다.
- 접시가 완전히 건조되면 15μg/mL의 라미닌과 40μM BrdU가 보충된 6mL의 완전 유도 배지 로 37°C 및 5%CO2에서 최소 1시간 동안 코팅합니다.
참고: BrdU 처리는 유사분열 활성 세포를 제거하여 신경 세포의 순도를 향상시키기 위해 권장됩니다. BrdU가 신경 건강에 미치는 영향은 미미합니다. - 분화된 세포를 10cm 접시당 3mL의 해리 시약으로 처리하고 주변 온도에서 3-4분 동안 배양합니다.
- 해리 시약을 제거하지 않고 6mL의 DPBS를 플레이트에 추가하고 10mL 피펫으로 용액의 세포를 위아래로 4-5x 피펫하여 세포를 해리시킵니다.
- 세포 현탁액을 수집하고 40μm 세포 스트레이너를 통해 50mL 원뿔형 튜브에 통과시킵니다. 인 덕션 베이스 배지 1mL를 추가하여 스트레이너를 헹굽니다.
- 세포를 300 ×g에서 5 분 동안 원 심 분리합니다. 배지를 흡인하고 40μM BrdU를 포함하는 3mL의 완전 유도 배지 에 세포를 재현탁합니다.
- 혈구계로 세포를 세십시오. 단계 2.1.14에서 첨가된 코팅 용액을 제거하지 않고 40μM BrdU를 함유하는 완전 유도 배지 6mL에 세포를 희석하여 10 cm 디쉬당 약 2.5 × 10개의 6 세포를 미리 코팅된 접시에 담는다.
- 4일째에 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 1x 세척하고 40μM BrdU를 포함하는 새로운 완전 유도 배지 를 추가합니다.
- 6일째에 배지를 흡인하고 DPBS로 세포를 1x 세척하고 1μg/mL의 라미닌이 보충된 뉴런 배지 를 추가합니다.
- 9일째에 1μg/mL의 라미닌이 보충된 새로운 뉴런 배지로 교체하여 배지의 1/3을 변경합니다.
- 3-4 일마다 새로운 1 μg / mL의 라미닌이 보충 된 Neuron 배지로 절반의 배지 변경을 수행하여 추가로 25 일 동안 i3LMN을 유지하십시오.
참고: 이 시점에서 i3LMN은 긴 과정을 가진 뉴런 형태를 나타내야 합니다. 뉴런은 또한 세포의 덩어리 또는 클러스터를 형성하는 경향이 있습니다. i3LMN의 차별화를 검증하는 방법에 대한 보다 상세한 설명은다른 곳(17)에서 찾을 수 있다.
- 10cm 접시에 5mL의 표준 코팅 용액으로 1.2.1cm 코팅합니다.
- 시냅토솜 정제 및 표지
알림: 멸균 상태를 유지하고 생물 안전 캐비닛 내부의 모든 단계를 수행하십시오.- DPBS로3LMN 을 두 번 세척하십시오.
- 시냅토좀의 분리를 위해 얼음처럼 차가운 세포 용해 시약 2mL를 넣고 얼음 위에서 2분 동안 배양한 후 뉴런을 단단히 긁어냅니다.
- 용해물을 여러 개의 2mL 마이크로튜브(튜브당 ~1.5mL 용해물)로 옮기고 1,200× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
알림: 이 절차 내내 튜브를 얼음 위에 유지하십시오. - 상청액을 수집하고(펠릿을 버리고) 15,000×g에서 4°C에서 20 분 동안 원 심분리한다. DPBS에 5% DMSO와 유사한 부피(원래 용해물과 동일)로 시냅토솜이 포함된 펠렛을 저장하고 재현탁합니다.
참고: 시냅토좀은 형광단으로 즉시 표지하거나 향후 사용을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. - 모든 튜브에 대해 비신코닌산(BCA) 단백질 분석을 수행하여 시냅토솜 제제에서 단백질의 총 수율을 평가합니다.
참고: 단백질 농도를 측정하기 위한 다른 분석을 사용할 수 있습니다. 상이한 제제로부터 수득된 총 단백질 수율은 참고로서 표 1 에 포함되었다. 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질의 존재를 확인하기 위해 시냅스 토솜 제제의 웨스턴 블롯 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 여기서, 시냅스전 마커인 시냅토피신(SYP) 및 시냅스후 마커인 시냅스후 밀도 단백질 95(PSD95)를 앞서19와 같이 웨스턴 블롯팅 분석을 위해 선택하였다. - 물에 100 mM 중탄산나트륨의 용액을 준비하고, pH를 8.5로 조정하고, 멸균 필터한다.
- 사용된 pH 민감성 염료의 동결건조된 분말 1mg을 DMSO 150μL에 가용화합니다. 일회용 분취량을 만들어 -80°C에서 보관한다.
- 시냅토좀을 15,000×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
- 100mM 중탄산나트륨 용액 100μL에 최대 1mg의 시냅토좀을 희석합니다.
- 시냅토솜에 라벨을 붙이려면 시냅토솜 1mg당 재구성된 pH 민감성 염료 1μL를 추가하고 빛 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일로 반응을 덮습니다. 튜브 셰이커를 사용하여 실온에서 2시간 동안 흔듭니다.
- 1mL의 DPBS를 튜브에 넣고 표지된 시냅토좀을 15,000× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상청액을 제거하고 단계 2.2.11에 설명된 대로 4번의 추가 세척을 수행합니다.
- 최종 세척 및 스핀 후, 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 상청액을 제거하고 표지된 시냅토좀을 원하는 농도(여기에 사용된 0.7μg/μL)의 부피로 DPBS 중 5% DMSO로 재현탁합니다. 일회용 분취량을 준비하고 -80 °C에서 보관하십시오. 표지 된 시냅 토솜에 대한 빛 노출을 피하십시오.
- 살아있는 세포 식균 작용 분석
- 20-30 × 104 PMP를 iMG 완전 배지 100 μL의 96-웰 플레이트에 넣고 단계 1.2.4에 표시된 대로 10일 동안 분화 과정을 따른다.
- 분석 당일, 살아있는 세포에 대한 핵 염색 1방울을 iMG 기본 배지 2mL에 첨가하여 핵 염색 용액을 준비합니다.
- 96-웰 플레이트의 웰당 배지 40μL를 제거하고 멀티채널 피펫을 사용하여 핵 염색 용액 10μL를 추가합니다. 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 표지 된 시냅 토좀을 얼음에서 해동하고 물 초음파 처리기를 사용하여 1 분 동안 부드럽게 초음파 처리합니다. 즉시 시냅 토솜을 얼음으로 옮깁니다. 표지된 시냅토솜을 iMG 완전 배지에서 배지 50μL당 시냅토솜 1μL의 비율로 희석합니다.
참고: 시냅토솜의 농도는 분석에 따라 다르며 최적화가 필요할 수 있습니다. 배지에서 DMSO의 상대적으로 낮은 비율(즉, 0.1% 이하)을 유지하려면 웰당 2μL 이상의 시냅토좀을 추가하지 않는 것이 좋습니다. - 음성 대조군으로서, 일부 웰을 사이토칼라신 D로 전처리하여 액틴 중합을 억제하고 따라서 식균작용을 억제한다. iMG 완전 배지에서 60 μM 시토칼라신 D의 용액을 준비한다. 10 μM의 최종 농도를 위해 10 μL의 이 용액을 각 웰에 첨가하고, 37°C 및 5%CO2 에서 30분 동안 배양한다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10 ° C에서 10 분 동안 배양합니다. 플레이트를 얼음 위에 유지하고 단계 2.3.4에 설명된 바와 같이 제조된 시냅토좀을 함유하는 배지 50μL를 첨가한다.
- 플레이트를 270 ×g에서 10°C에서 3 분 동안 원 심분리하고, 이미징이 획득될 때까지 플레이트를 얼음 위에 유지한다.
- 이미징 수집 및 분석
- 플레이트를 라이브 셀 이미징 리더에 삽입하고 분석할 웰을 선택합니다.
- 20x 대물 렌즈를 선택합니다.
- 명시야 및 청색(4',6-디아미디노-2-페닐인돌[DAPI]) 채널의 초점, 발광 다이오드(LED) 강도, 통합 시간 및 게인을 조정합니다. 시냅토솜 형광은 초기 시점에서 무시할 수 있어야 합니다. 빨간색(RFP) 채널에 초점을 맞추려면 명시야 채널을 참조로 사용합니다. 통합 시간과 이득은 실험마다 다를 수 있습니다. 빨간색 채널에 대해 LED: 4, 통합 시간: 250 및 게인: 5의 초기 설정을 사용합니다.
- 웰당 몽타주에서 획득할 개별 타일의 수를 선택합니다(웰 중앙에서 16개의 타일을 획득하여 전체 웰 면적의 약 5%를 이미징함). 온도를 37°C로 설정하고 원하는 이미징 시간 간격을 설정합니다.
참고: 이 연구에서는 최대 16시간 동안 1 - 2시간마다 이미지를 획득했습니다. - 분석 소프트웨어를 엽니다.
- 이미지가 포함된 실험을 엽니다. 데이터 축소 아이콘을 클릭합니다.
- 메뉴의 이미징 처리 아래의 이미징 스티칭을 선택하여 표 2에 설명된 매개변수를 사용하여 몽타주의 4 x 4 개별 타일에서 완전한 이미지를 만듭니다.
- 스티칭된 이미지가 생성되면 이러한 이미지에 대한 DAPI 및 RFP 채널을 사용하여 강도 임계값을 정의합니다. 이미지를 열고 분석을 클릭하십시오. 분석에서 셀룰러 분석을 선택하고 검색 채널에서 DAPI 또는 RFP 채널에서 결합된 이미지를 선택합니다. 기본 마스크 및 카운트 탭으로 이동하여 DAPI 채널의 세포핵 또는 RFP 채널의 시냅토솜 신호를 적절하게 선택하는 임계값 및 개체 크기 값을 설정합니다. 전체 실험에 적용할 수 있는 매개변수가 최적화될 때까지 다른 이미지로 프로세스를 반복합니다.
참고: 제안된 값은 표 2에서 찾을 수 있습니다. - 핵 수를 계산하려면 데이터 축소 메뉴로 이동하여 이미지 분석에서 세포 분석을 선택합니다. 기본 마스크 및 개수 탭으로 이동하고 채널에서 DAPI 스티칭된 이미지를 선택하고 표 2에 설명된 매개변수를 사용합니다.
- 계산된 메트릭 탭으로 이동하여 셀 수를 선택합니다. 시냅토솜 신호의 영역을 얻으려면 데이터 축소 메뉴로 이동하여 분석에서 세포 분석을 선택합니다.
- 기본 마스크 및 개수 탭으로 이동하고 채널에서 RFP 스티칭 이미지를 선택하고 표 2에 설명된 매개변수를 사용합니다.
- 계산된 메트릭 탭으로 이동하여 개체 합계 영역을 선택합니다. 에서 데이터 감소 탭 , 클릭 확인 소프트웨어가 획득한 모든 이미지를 분석하도록 허용합니다.
- 각 시점에 대한 개체 합계 영역 과 셀 수 값을 내보냅니다. 개체 합계 영역을 셀 수로 나누어 시점당 정규화된 영역을 계산합니다. 여러 치료법 또는 유전자형을 비교하는 경우 식 (1)을 사용하여 식균 작용 지수를 계산하십시오.
(1) - 결과를 저장하고 데이터를 통합합니다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 iMG를 생성하려면 잘 정의된 가장자리가 있는 콤팩트한 콜로니 형태를 보여주는 미분화 iPSC로 시작하는 것이 중요합니다(그림 2A). EB 형성 섹션에 설명된 대로 유지된 해리된 iPSC는 EB라고 하는 구형 응집체를 형성하며, 이는 분화 4일째까지 크기가 커집니다(그림 2B). EB가 수집되고 PMP 생성에 적합한 조건에서 도금되면 Matrigel로 코팅 된 플레이트에 부착되고 세포 층이 퍼지고 구형 응집체를 둘러 쌉니다 (그림 2C). 건강에 해로운 EB는 플레이트에서 분리되므로 제거해야합니다. PMP 생성 14 일에서 21 일 사이에 잠재적으로 다른 세포 유형이 나타날 수 있으며 배지에 떠 있습니다. 이러한 셀은 매체 변경12 중에 폐기되어야 합니다. 28일째에 세포질 대 핵 비율이 큰 둥근 세포가 PMP라고 하는 현탁액에 나타납니다(그림 2D). 이 세포는 지속적으로 생산되며 최대 3 개월 동안 배지를 변경하는 동안 매주 수확 할 수 있습니다. 매주 수확되는 PMP의 수는 다양하며 iPSC 라인과 배양 연령에 따라 다릅니다. 수율은 일반적으로 시간이 지남에 따라 감소합니다. iPSC가 이전에 보고된 이전 조건과 본 연구(그림 2E)18에서 유지될 때 PMP 수율이 더 높기 때문에 Matrigel 대신 라미닌 521 코팅 플레이트에서 iPSC를 배양하는 것이 좋습니다.
PMP가 10-12 일 동안 iMG 배지 에 노출 된 후, 세포는 작은 세포질과 길쭉한 과정의 존재를 갖는 미세 아교 세포와 같은 형태를 얻습니다 (그림 3A). 미세아교세포 동일성을 확인하기 위해, 본 발명은 이전에 기술된 바와 같이 골수성 마커 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1 (IBA1) 및 미세아교세포-풍부 마커 퓨린성 수용체 P2RY12 및 막횡단 단백질 119 (TMEM119) (TMEM119)에 대한 항체로 면역형광 염색을 수행하였다20 (또한 물질 표 참조). 전형적으로, 세포의 >95%가 IBA1을 발현하고, 대략 90%의 세포가 P2RY12 및 TMEM119를 발현한다(도 3B).
iMGs의 식능력을 평가하기 위해,i3LMN-민감성 염료로 표지된 인간 시냅토좀을 사용하였다. 시냅토솜 제제가 정준 구조적 특성, 시냅스 전 마커, 시냅토피신(SYP) 및 시냅스 후 마커의 농축을 확인하기 위해 시냅스 후 밀도 단백질 95(PSD95)19를 앞서 설명한 대로 수행한 웨스턴 블롯 분석(그림 4)으로 확인하였다(또한 재료 표 참조). ). pH에 민감한 염료로 표지 된 시냅토솜은 iMG에 의해 흡수 된 후 세포 내 산성 (즉, 낮은 pH) 구획 내에 국한되면 형광이됩니다.
초기 시점에서 대부분의 시냅토솜이 아직 식균되지 않았기 때문에 적색 형광 신호는 미미했습니다. 30분 후, 적색 형광 신호가 검출되었고 시간이 지남에 따라 더 증가하였다. 10 시간까지, 대부분의 시냅 토솜이 삼켜졌고 식균 작용 과정을 통해 산성 세포 내 구획에 국한되었기 때문에 적색 형광 신호가 강력했습니다 (그림 5A). 사이토칼라신 D는 식작용을 차단하는 데 널리 사용되는 액틴 중합 억제제입니다. 예상대로, 우리는 사이토 칼라 신 D- 처리 된 iMG에서 적색 형광 신호의 강한 감소를 관찰했으며, 이는 검출 된 신호가 식세포 사건의 결과임을 나타냅니다. 우리는 또한 iMG가 사이토칼라신 D-처리된 iMG에서 액틴 리모델링이 부족하기 때문에 사이토칼라신 D-처리된 iMG에서 검출되지 않은 식균작용 10시간 후 형태의 변화를 보인다는 것을 발견했습니다. 미세아교세포 형태의 변화는 일반적으로 활성화 상태2와 관련이 있습니다.
설명 된 자동 정량화 방법을 사용하여 각 시점에서 적색 신호의 총 면적을 측정하고 핵을 세어 얻은 세포 수로 정규화했습니다. 결과는 삼켜진 시냅토좀의 면적이 16시간에 고원에 도달할 때까지 시간이 지남에 따라 증가했음을 나타냅니다. 예상대로, 사이토 칼라 신 D- 처리 된 세포로부터의 적색 신호의 영역은 식균 작용이 억제 되었기 때문에 시간이 지남에 따라 증가하지 않았다 (그림 5B). 함께, 이러한 결과는 iMG가 뇌 질환 관련 물질을 식균 할 수 있고 기능 연구에 적합하다는 것을 나타냅니다.
그림 1: iPSC를 미세아교세포 유사 세포로 분화하기 위한 프로토콜의 개략도. 0일째에 iPSC가 80% 컨플루언스에 도달하면 콜로니를 단일 세포로 해리하고 EB 배지에서 배양하여 EB 형성을 유도합니다. 4일째에 EB를 수집하고 PMP 배지에 도말하여 PMP 생성을 유도합니다. 28일 후, PMP를 수집하고 iMG 배지를 사용하여 iMG로 말단 분화시킨다. PMP는 최대 3 개월 동안 매주 수집 할 수 있습니다. 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; iMGs = 미세아교세포; EB = 배아체; PMP = 원시 대 식세포 전구체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: iPSC에서 PMP로의 분화 단계에서 광학 현미경으로 평가한 세포 형태. (A) iPSC는 80% 컨플루언시까지 iPSC 배지에서 유지되었습니다. (B) EB 배지에서 분화 4일 후의 배아체. (C) 코팅된 플레이트에 부착된 EB 및 (D) PMP 배지에서 28일 배양 후 EB로부터 현탁액으로 나오는 PMP. (E) 1주차(PMP 분화 28일 후) 및 12주차에 ~48개의 EB에서 수집된 PMP 수. 막대 그래프는 두 개의 서로 다른 iPSC 라인에서 6개의 독립적인 차별화(데이터 포인트)의 평균을 보여줍니다. 통계는 양방향 분산 분석과 Šídák의 다중 비교 검정으로 얻었습니다. 스케일 바 = 1,000 μm (A), 400 μm (B-D). 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; iMGs = 미세아교세포; EB = 배아체; PMP = 원시 대 식세포 전구체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 이 프로토콜로 분화된 iMG는 말단 분화 10일 후 진정한 미세아교세포 특성을 나타냅니다. (A) 미세아교세포와 유사한 형태를 나타내는 iMG의 대표적인 명시야 이미지. 스케일 바 = 400 μm. (B) 골수/미세아교세포 마커 IBA1, P2RY12 및 TMEM119를 발현하는 iMG의 대표적인 면역형광 이미지. 스케일 바 = 400 μm (A), 50 μm (B). 약어 : iMGs = 미세 아교 세포 유사 세포; IBA1 = 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 1; P2RY12 = 퓨린성 수용체 P2RY12; TMEM119 = 막횡단 단백질 119; DAPI = 4',6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4:i3LMN 유래 인간 시냅토좀은 웨스턴 블롯 분석에 의해 시냅스 마커를 발현시켰다. 배양 28일 후에i3LMN으로부터 유래된 인간 시냅토좀 제제의 대표적인 웨스턴 블롯 분석은 시냅스후 마커, PSD95, 시냅스전 마커, SYP, 및 β-튜불린으로 프로핑하였다. 약어 : i3LMN = iPSC 유래 하부 운동 뉴런; PSD95 = 시냅스 후 밀도 단백질 95; SYP = 시냅토피신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: pH 민감성 염료로 표지되고 살아있는 세포, 종단 영상으로 모니터링 되는 인간 시냅토좀을 사용한 iMG의 식작용 분석. (A) 표시된 시점에서 cytoD 처리 유무에 관계없이 표지된 인간 시냅토좀(적색 채널)에 노출된 핵 염색(청색 채널)이 있는 iMG의 대표적인 명시야 및 형광 몽타주. 몽타주는 20x에서 획득한 16개의 타일을 획득 후 처리하여 생성되었습니다. 스케일 바 = 400 μm. (B) 세포 수로 정규화 된 시냅 토좀 형광 신호의 면적 정량화. 데이터 포인트는 세 번의 기술 반복실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 각 곡선은 cytoD 처리가 있거나 없는 하나의 iPSC 라인에서 두 개의 독립적인 분화(iMG 1 및 2)에 대한 정량화를 보여줍니다. 약어 : iMGs = 미세 아교 세포 유사 세포; cytoD = cytochalasin D. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| DIF28 i3LMN의 10cm 접시 수 | 총 단백질 (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
표 1: 분화 28일에 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 시냅토솜 분리 후 총 단백질 수율. 시냅토좀을 추출한 후 4개의 독립적인 분화로부터 얻은 총 단백질량. i3LMN을 함유하는 상이한 수의 10cm 접시를 각각의 분화에서 수확하였다. 단백질 수율은 BCA 단백질 분석법으로 측정하였다. 약어 : iPSC = 유도 만능 줄기 세포; i3LMN= iPSC-유래된 하부 운동 뉴런; DIF28 = 분화 28일; BCA = 비신코닌산.
| 매개 변수 | 값 |
| 등록 채널 | 명시야, DAPI 및 RFP |
| 융합 방법 | 선형 블렌드 |
| 테두리에서 검은색 사각형을 제거하기 위해 결합된 이미지 자르기 | 확인 |
| 최종 이미지 축소 | 확인 |
| 매개 변수 | 값 |
| 문지방 | 사용자에 의해 결정됨 |
| 배경 | 어둠 |
| 만지는 물체 분할 | 확인 |
| 마스크의 구멍 채우기 | 확인 |
| 최소 개체 크기 | 7 마이크로미터 |
| 최대 개체 크기 | 30 마이크로미터 |
| 기본 모서리 객체 포함 | 확인 |
| 전체 이미지 분석 | 확인 |
| 매개 변수 | 값 |
| 문지방 | 사용자에 의해 결정됨 |
| 배경 | 어둠 |
| 만지는 물체 분할 | 확인 |
| 마스크의 구멍 채우기 | 확인 |
| 최소 개체 크기 | 5 마이크로미터 |
| 최대 개체 크기 | 100 마이크로미터 |
| 기본 모서리 객체 포함 | 확인 |
| 전체 이미지 분석 | 확인 |
표 2: 이미징 수집 및 데이터 분석에 사용되는 파라미터. 식균 작용 분석 중 이미징 획득 및 획득 된 이미지의 분석을 위해 고려해야 할 제안 된 매개 변수가 나열되어 있습니다.
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Discussion
여기에 설명된 분화 프로토콜은 ~6-8주 내에 iPSC 유래 미세아교세포 유사 세포를 고순도로 충분한 수율로 얻을 수 있는 효율적인 방법을 제공하여 면역형광 실험 및 더 많은 수의 세포가 필요한 기타 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 1주일 동안 최대 1× 10,6개의 iMG를 산출하여 단백질 및 RNA 추출 및 해당 다운스트림 분석(예: RNASeq, qRT-PCR, 웨스턴 블롯, 질량 분석법)을 가능하게 합니다. 즉, 이 프로토콜의 한계는 iMG의 수율이 특정 애플리케이션을 제한할 수 있다는 것입니다. 상이한 주로부터의 PMP를 축적하고, 분화 과정을 한 번에 진행하기에 충분한 전구체가 수집될 때까지 현탁액에서 균질한 배양물을 유지하기 위해 추가의 변형이 구현될 수 있다(18). 대안적으로, EB의 분화는 PMP의 생산을 증가시키기 위해 더 높은 면적의 세포 배양 플레이트를 사용하여 확장될 수 있다.
분화 과정을 시작하기 위해 라미닌 521 코팅 플레이트에서 배양된 iPSC를 사용하는 것이 좋습니다. 다른 코팅 시약은 공정(18)에서 나중에 생성되는 PMP의 수를 감소시킬 수 있다. 유사하게, PMP 생성 동안 EB 접착을 위해 플레이트를 코팅하면 EB 부착이 개선되어 배양 수명이 연장됩니다. EB 문화는 최대 4개월 동안 유지되었으며, 이 시점에서 여러 EB가 분리되어 죽습니다. 그러나 다른 연구자들은 최대 1 년 동안 EB를 배양했다고보고합니다12. 3 개월 된 EB 배양에서 생성 된 iMG는 젊은 배양 물과 차별화 된 iMG와 유사한 기능적 특성을 유지합니다. 3 개월 이상 된 배양 물은 기능 실험에 사용되지 않았습니다.
위에서 설명한 원래 프로토콜에서 미세아교세포 분화의 최종 단계를 최적화하기 위해 7,8, iMG 배지에 100ng/mL의 인터루킨(IL)-34,7 5ng/mL의 콜로니 자극 인자 1(M-CSF)10 및 50ng/mL의 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β)를 포함했습니다. IL-34 및 M-CSF는 미세아교세포의 운명과 생존을 유지하는 데 중요한 CSF1 수용체 의존성 경로를 자극합니다.8 TGF-β는 미세아교세포 항상성9을 지원하여 미세아교세포 운명에 대한 PMP 헌신을 위한 보다 생리학적 환경을 촉진합니다. 참고로, 여기에 설명된 전체 분화 과정은 혈청이 없는 조건에서 수행되므로 iMG 거동에 대한 혈청의 영향 및 다운스트림 응용 분야의 변경을 방지할 수 있습니다. iMG를 사용한 기능 실험의 경우 말단 분화 10 일에서 12 일 사이에 실험을 수행하는 것이 좋습니다. iMG는 세포 생존율이 약간 감소하면서 최대 14일 동안 배양되었으며, 그 이후에는 세포 건강이 크게 손상됩니다.
미세 아교 세포의 표준 기능 중 하나가 식균 작용이기 때문에 시험관 내에서 식세포 활성을 조사하기위한 분석법이이 프로토콜에 포함되었습니다. 인간-세포-기반 시스템을 개발하기 위해, 인간i3LMN으로부터 유래된 시냅토좀이 사용되었다. 시냅토좀 제제의 품질은 본 연구에서 시냅스 마커의 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가되었다. 추가적으로, 시냅토솜 제제의 다른 구조적 및 기능적 특성은 식균작용 분석 전에 전자 현미경 또는 면역염색에 의해 조사될 수 있다. 인간 시냅토좀을 얻기 위해 여기에 설명된 프로토콜은 상대적으로 많은 수의 뉴런을 생성하는i3LMN에 크게 의존합니다. 그러나 뉴런 수율은 다른 분화 방법(즉, 소분자의 칵테일을 요구하는 프로토콜)을 사용할 때 더 낮을 수 있습니다. 특히, 식균 작용 분석은 마우스-뇌 유래 시냅토솜, 응집된 단백질 또는 죽은 세포와 같은 여러 다른 기질로 수행할 수 있으며, 이들 모두는 유사한 방식으로 식작용을 모니터링하기 위해 pH 민감성 염료로 표지될 수 있습니다. pH 민감성 염료를 사용하는 것이 제안되는데, 그 이유는 리소좀(21)에서 포식체 처리 및 분해 동안 시냅토좀이 산 구획 내에 국한될 때 형광 신호가 주로 방출되기 때문이다. 이 특성은 세포 외부의 시냅 토좀으로부터의 배경 신호를 감소시키고 자동화 된 정량화 방법의 사용을 용이하게합니다. 또한 pH에 민감한 염료는 기질 부착 또는 세포막에 도킹하는 것과는 대조적으로 진정한 식균 작용을 감지할 수 있습니다.
본 명세서에서는 웰당 ~35μg의 시냅토좀을 사용하는 것이 좋지만, 최적 조건은 iPSC 라인 및 실험 조건에 따라 달라지기 때문에 인간 시냅토솜 및 기타 기질의 특정 양을 최적화해야 합니다. 이상적인 범위의 시냅토솜은 식균작용 분석에서 용량-반응을 초래해야 합니다. 너무 많은 시냅토솜은 시스템을 포화시켜 유전자형 또는 치료 그룹의 함수로서 의미 있는 차이를 감지하기 어렵게 만듭니다. 물질이 너무 적 으면 분석에서 출력 신호가 약해집니다. 이러한 이유로 작업 분석을 설정하기 위해 각 기질의 여러 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 또한 세포 건강을 보존하기 위해 % DMSO를 안전한 범위 내로 유지하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜에서, 식균 작용은 세포의 삼킴 용량에 대한 운동 정보를 제공하기 때문에 살아있는 세포 이미징 시스템 (재료 표)을 사용하여 모니터링되었습니다. 생세포 이미징을 지원하고 안정적인 온도, 습도 및CO2 농도를 유지할 수 있는 현미경 및 이미징 시스템도 이 분석에 적합합니다. 여기에 기술된 모든 식작용 실험은 85%-95% 습도 및 5%CO2를 갖는 37°C에서 이미지화되었다. 고정 세포의 이미징 또는 유세포 분석과 같은 다른 검출 방법은 라이브 셀 이미징이 불가능하거나 바람직하지 않은 경우 동일한 물질 및 세포 배양 프로토콜 (iMG 및 표지 된 synptosome의 생성까지 포함)을 사용하여 식균 작용을 평가하는 데 사용할 수도 있습니다. 마찬가지로 ImageJ 또는 CellProfiler와 같은 다른 오픈 소스 소프트웨어를 데이터 분석에 활용할 수 있습니다. 후자는 여기에 사용 된 소프트웨어에 필적하는 자동화 된 분석을 허용합니다.
요약하면, 미세아교세포-유사 세포를 인간 iPSC로부터 구별하기 위한 강력한 프로토콜의 구현이 예시되어, 인간 미세아교세포의 제한된 자원을 극복한다. 분화 된 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환 연구의 다양한 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 또한, 완전히 "인간화된" 식균작용 분석이 포함되어 있어 인간 발달 및 질병의 맥락에서 미세아교세포 기능 및 기능 장애에 대한 연구를 더욱 도울 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 운동 뉴런 분화를 위한 WTC11 hNIL iPSC 라인을 제공한 마이클 워드와 미세아교세포 분화에 사용되는 KOLF2.1J WT 클론 B03 iPSC 라인을 공급한 잭슨 연구소에 감사를 표합니다. 또한 프로토콜 구현 과정에서 도움을 준 도로시 샤퍼, 생세포 이미징 시스템에 도움을 준 앤서니 지암페트루치와 존 랜더스, 개정 기간 동안 기술적 기여를 해준 헤이든 갓, 이 연구에서 협력한 조나단 정에게 감사드립니다. 이 연구는 UMASS Chan Medical School과 Angel Fund, Inc.의 Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience Fund의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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