Summary
该协议描述了人诱导多能干细胞（iPSC）成小胶质细胞样细胞进行 体外 实验的分化过程。我们还包括从iPSC衍生的下运动神经元生成人突触体的详细程序，该神经元可用作使用活细胞成像系统进行 体外 吞噬测定的底物。
Abstract
小胶质细胞是骨髓来源的常驻免疫细胞，在大脑微环境中维持稳态，已成为多种神经系统疾病的关键参与者。由于人类细胞供应极其有限，研究人类小胶质细胞在健康和疾病中是一项挑战。源自人类个体的诱导多能干细胞（iPSC）可用于规避这一屏障。在这里，展示了如何将人iPSCs分化为小胶质细胞样细胞（iMGs）以进行 体外 实验。这些iMG表现出小胶质细胞的预期和生理特性，包括小胶质细胞样形态，适当标志物的表达和活性吞噬作用。此外，还提供了用于分离和标记源自人 iPSC 衍生的下运动神经元（i3LMN）的突触体底物的文档。活细胞纵向成像测定用于监测用pH敏感染料标记的人突触体的吞噬，从而可以研究iMG的吞噬能力。本文描述的方案广泛适用于研究人类小胶质细胞生物学和小胶质细胞对疾病的贡献的不同领域。
Introduction
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS的发展中起着至关重要的作用。小胶质细胞在成人大脑中对于维持体内平衡和积极应对创伤和疾病过程也很重要。累积证据表明，小胶质细胞是多种神经发育和神经退行性疾病发病机制的关键因素1，2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来自小鼠模型，但最近的研究阐明了小鼠和人类小胶质细胞之间的重要差异，强调了开发技术来研究人类小胶质细胞的遗传学和生物学功能的必要性3，4。从解剖的原代组织中分离小胶质细胞会严重改变小胶质细胞的特性5，这可能会混淆用这些细胞获得的结果。该方法的总体目标是将人iPSCs分化为iMG，从而提供细胞培养系统在基础条件下研究人小胶质细胞。此外，本文还包括使用全人模型系统的吞噬作用测定，作为研究iMGs功能的手段，既作为质量控制措施，又评估疾病背景下的iMG功能障碍。
最近在文献6，7，8，9，10中出现了从iPSC分化小胶质细胞的多种方案。某些方案的潜在缺点包括延长或长时间的分化，添加多种生长因子和/或复杂的实验程序6，9，10。在这里，展示了一种“用户友好”的分化方法，该方法通过将iPSC分化为称为原始巨噬细胞前体（PMP）的前体细胞来概括小胶质细胞个体发生的各个方面7，11。PMP如前所述生成，本文12中提供了一些优化。PMP模仿MYB非依赖性卵黄囊衍生的巨噬细胞，巨噬细胞在胚胎发育过程中通过在血脑屏障关闭之前侵入大脑而产生小胶质细胞13。为了最终将PMP分化为iMG，我们使用了基于Haenseler等人和Brownjohn等人的协议的快速简化的单一培养方法，并进行了一些修改以产生一种有效的小胶质细胞分化方法，其中iMG稳健地表达富含小胶质细胞的标记7，8。这种分化方法可以在具有iPSC培养专业知识的实验室中复制，其研究目标是使用人类模型系统研究小胶质细胞生物学。
iPSC来源的小胶质细胞是用于 体外 实验的人小胶质细胞的生物学相关来源，是研究小胶质细胞典型功能（包括吞噬作用）的重要工具。小胶质细胞是大脑和中枢神经系统的专业吞噬细胞，它们清除细胞碎片、聚集蛋白和降解的髓磷脂14。小胶质细胞还通过吞噬突触在突触重塑中发挥作用，并通过病原体的吞噬作用防御外部感染15，16。在该协议中，使用人突触体作为iMG吞噬的材料评估iMG的吞噬作用。为此，描述了分离源自人类i3LMN的突触体的描述。i3LMN衍生的人突触体用pH敏感染料标记，该染料允许在吞噬体加工和体外降解过程中定量位于酸性区室内的突触 体。显示了使用活细胞显微镜的吞噬作用测定，用于实时监测小胶质细胞吞噬的动态过程。该功能测定为使用完整的人体系统研究健康和疾病中小胶质细胞吞噬作用的可能缺陷奠定了基础。
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Protocol
注意：本协议中使用的所有试剂必须是无菌的，并且所有步骤必须在无菌条件下在生物安全柜中进行。所有iPSC细胞系以及维护和分化培养基均在材料表中进行了描述。下面图示的小胶质细胞分化方法基于先前发表的方案7，8，12，并在此描述新的修改。
1.小胶质细胞分化
注意： 图 1 总结了该协议的概述。
- 诱导多能干细胞 （iPSC） 培养
注意：描述iPSC培养技术的更多详细信息可在别处找到17。- 解冻和维护
- 制备 iPSC培养基，分装培养基，并在-20°C下储存长达6个月。将等分试样在4°C下解冻过夜，并使用长达1周。使用前将介质在环境温度下放置至少 1 小时。
- 通过加入 1 mL 的 10 μg/mL 层粘连蛋白 521 在含有钙和镁18 的 DPBS 中稀释，涂覆 6 孔板的孔。将板保持在37°C和5%CO 2的培养箱中至少2 小时或优选过夜。稀释后，将层粘连蛋白在4°C下储存3个月。
- 通过在无菌水中稀释来制备10mM Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）储备溶液。制作一次性等分试样的ROCK抑制剂溶液，并将其在-20°C下储存长达1年。
- 通过在DPBS中稀释0.5M EDTA的储备溶液来制备0.5mM EDTA。
- 要解冻一瓶冷冻的iPSC，请将小瓶置于37°C的水浴中，直到大部分解冻。立即将小瓶的内容物转移到含有 4 mL iPSC 培养基的 15 mL 锥形管中。以500× g 离心1分钟。
- 吸出上清液并通过在管壁上缓慢加入 1 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养基 来重悬细胞，以避免菌落紊乱。
- 向每个包被的孔中加入 1.5 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养 基，并将重悬菌落逐滴转移到含有培养基的孔中。
注意：使用步骤1.1.1.6中的5-7滴进行培养维持，但调整每个iPSC系的最佳接种密度。 - 通过手动左右和从后到前洗牌，将细胞均匀分布在孔中。将细胞置于37°C和5%CO2的培养箱中。第二天，通过添加不含ROCK抑制剂的新鲜 iPSC 培养基来完全更换培养基。
- 为了维持，每天更换培养基，直到细胞达到80%汇合。
注意：如果使用的 iPSC 培养基允许灵活的补给时间表，则可以在不更换培养基的情况下保持细胞2天。建议将其限制为每次传代一次，并且仅在细胞汇合度低于50%的情况下。
- 分裂
- 吸出培养基并用 1 mL DPBS（不含钙和镁）洗涤细胞。
- 为了去除细胞，加入 1 mL 的 0.5 mM EDTA 并在室温下孵育 2-3 分钟，直到细胞集落的边缘从孔表面抬起。用DPBS再次洗涤细胞并加入1 mL iPSC培养基。
- 通过使用细胞提升器轻轻刮取细胞集落来解离细胞集落。只刮一次井的每个区域，以免打扰殖民地。
注意：将菌落从井中移出的替代方法可以在其他地方找到17. - 使用 1 mL 移液器吸头收集细胞并以 1：6 的比例（细胞与培养基）逐滴转移到含有 1.5 mL iPSC 培养基的预包被孔（如步骤 1.1.1.2 中所述）中。
- 解冻和维护
- iPSC 分化为小胶质细胞样细胞 （iMG）
注意：将小分子和生长因子溶解在DPBS中无菌过滤的0.1%牛血清白蛋白中，至比最终浓度高1，000倍的原液浓度。建议在早期传代期间将iPSCs分化为iMG。建议对 iPSC 细胞系进行常规核型分析。- 制备标准涂层溶液
- 将细胞外基质包衣试剂的储备溶液在4°C的冰上解冻过夜。
- 在4°C下预冷微量离心管和过滤移液器吸头。
- 将 250 μL 浓缩的细胞外基质包衣试剂分装到每个试管中，并立即置于冰上。将等分试样储存在-20°C。
- 为了制备包衣溶液，将细胞外基质包衣试剂之一在4°C的冰上解冻过夜。
- 将 50 mL 针对人类胚胎和诱导多能干细胞（称为 DMEM-F12）生长优化的冰冷 DMEM-F12 培养基中，并将其保存在冰上。
- 通过多次上下移液冰冷的 DMEM-F12 冷却 1 mL 移液器吸头，然后立即使用移液器吸头将 250 μL 细胞外基质包衣试剂转移到含有 DMEM-F12 培养基的锥形管中。
注意：标准涂层溶液可在4°C下储存2周。
- 拟胚体 （EB） 形成
- 准备可在4°C下保持长达4天的 EB培养基 。
- 一旦iPSC达到80%汇合，通过用1mL DPBS洗涤并在37°C下加入1mL解离试剂2分钟来解离菌落。 使用细胞提升器通过多次刮擦来去除菌落以产生单细胞悬液。收集细胞并将所有细胞转移到含有 9 mL DPBS 的 15 mL 锥形管中。
- 将细胞以500 × g 离心1分钟，除去上清液，并将细胞重悬于1 mL EB培养基中。取 10 μL 细胞，用台盼蓝 1：1 稀释。用血细胞计数器计数细胞，并根据细胞计数，将细胞原液稀释至每 100 μL 10，000 个细胞的最终稀释度。对于电镀细胞，每孔向低粘附性圆底 96 孔板中加入 100 μL 稀释细胞。
注意：通常，从iPSC的每个80%汇合孔中获得96孔板的48个孔。 - 将板以125 ×g 离心3分钟，并在37°C和5%CO2 下孵育4天。在第 2 天使用多通道移液器轻轻收集 50 μL 旧培养基，然后重新加入 50 μL 新鲜 EB 培养基，进行半 培养基更换。
注意：在第4天，iPSCs将形成称为EB的球形细胞结构，如结果部分所述。如有必要，EB差异化过程可延长至7天。
- 原始巨噬细胞前体（PMP）的产生
- 制备 PMP基础培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达1个月。
- 通过加入 1 mL 冰冷的 Matrigel 涂层溶液涂覆 6 孔板的孔，并在 37 °C 和 5% CO 2 下孵育至少2 小时或优选过夜。
- 在EB分化的第4天，通过用1 mL移液器吸头（使用移液器）收集EB，将EB转移到Matrigel包被的孔中。上下移液一次或两次，将EB从井中取出。以倾斜的角度握住 6 孔板，以使 EB 在孔的边缘沉降。
注意：每个涂层孔可以镀九个或十个EB。 - 一旦所有EB稳定下来，轻轻移液并使用1 mL移液器吸头取出旧培养基，同时将EB保持在孔的边缘。向每个孔中加入 3 mL 新鲜制备的 PMP 完全培养基 。通过手动左右和从后到前洗牌，将细胞均匀分布在孔中。将板置于37°C和5%CO2的培养箱中。
- 7天内不要打扰板，以使EB附着在井底。之后，使用 PMP完全培养基进行半培养基更换。
注意：此时，大多数EB应连接到板上。可以删除任何浮动的EB。 - 5-7天后，在4倍放大倍率的光场显微镜下检查EB，以确保它们附着在孔底。按照 1.2.3.5 中所述更改介质。在第 21 天，用 3 mL PMP 完全培养基进行 完全培养基更换。
注意：此时漂浮在培养基中的髓系祖细胞可能很明显。这些细胞应在更换培养基期间丢弃。 - 在第 28 天，在上清液中寻找称为 PMP 的圆形细胞，并使用 10 mL 移液器和自动移液器收集含有 PMP 的培养基。注意不要打扰EB。将PMP和培养基转移到15 mL锥形管中，并按照步骤1.2.4中所述进行操作。
注意：通常，来自同一iPSC系的PMP可以从6孔板的五个孔中收集，并汇集在单个15 mL锥形管中。 - 加入 3 mL 新鲜 PMP 完全培养基 以进一步维护 EB。由于PMP连续从EB中出现超过3个月，请按照步骤1.2.3.7和1.2.3.8中所述每4-7天收集一次（不要让培养基变色为黄色调）。
注意：虽然PMP可以收集几个月，但它们可能会随着时间的推移而改变其表型。
- 与iMG的差异化
- 制备 iMG基础培养基 （材料表），无菌过滤器并将其在4°C下储存长达3周。
- 将PMP收集到15 mL锥形管中后，以200 × g 离心4分钟。吸出上清液并使用 1-2 mL iMG 基础培养基重悬 PMP。使用血细胞计数器计数细胞，取少量等分试样并用台盼蓝 1：1 稀释。
注意：通常每周获得 0.5-1.5 × 106 PMP，具体取决于 iPSC 系和 EB 培养的年龄。 - 再次以200×g离心其余细胞4分钟。将PMP稀释至所需浓度，使得使用新鲜制备的iMG完全培养基以~105 / cm2的密度将细胞接种在细胞培养处理的平板上。在10-12天内，每3-4天使用新鲜制备的iMG完全培养基进行半培养基更换，以实现终末分化。
注意：此时，细胞应获得小胶质细胞样形态。为了确认PMP对小胶质细胞命运的承诺，进行了免疫荧光分析以证实富含小胶质细胞的标志物的表达，例如嘌呤能受体P2RY12和跨膜蛋白119（TMEM119）9。 - 为了保持细胞健康和活力，在iMG分化的第10至12天之间进行所有实验。
- 制备标准涂层溶液
2. 使用运动神经元衍生的人突触体进行吞噬试验
- 转录因子介导的iPSC衍生的下运动神经元的分化（i3LMN）
注意：WTC11系将含有神经原蛋白-2（NGN2），胰岛-1（ISL1）和LIM同源盒3（LHX3）转录因子的hNIL诱导转录因子盒稳定插入CLYBL安全港位点，用于先前描述的分化过程17.iPSC线保持如步骤1.1.1中所述，但包被条件如步骤1.2.1中所述。由于不需要层粘连蛋白521，因此任何细胞外基质包被试剂都可用于培养将用于神经元分化的iPSC。使用前，将所有培养基平衡至环境温度至少1小时。- 按照步骤 1.2.1 所述，用 5 mL 标准涂层溶液涂覆 10 cm 培养皿。
注意：在这里，每个区分使用了 3-4 个 10 厘米的培养皿。 - 制备 诱导基培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达3周。
- 准备 神经元培养基，无菌过滤器，并将其在4°C下储存长达2周。
- 通过在无菌水中混合 100 mM 硼酸、25 mM 四硼酸钠和 75 mM 氯化钠来制备硼酸盐缓冲液。将pH调节至8.5并无菌过滤。
- 一旦iPSC达到80%汇合，用DPBS洗涤细胞并通过添加0.5mM EDTA去除菌落。
注意：每个 10 厘米的培养皿通常有两个孔就足够了。 - 将细胞在环境温度下孵育4-5分钟。取出 EDTA 并向每个孔中加入 3 mL 带有 HEPES 的 DMEM/F12。
- 使用细胞提升器刮取细胞，并使用 10 mL 移液器轻轻上下移液 2-3 次，从孔底部取出细胞。
- 将细胞收集在 15 mL 锥形管中，并以 300 × g 离心 3 分钟。
- 将细胞重悬于含有 10 μM ROCK 抑制剂的 3 mL iPSC 培养基 中，并使用血细胞计数器对其进行计数。
- 在预包被的 10 cm 培养皿中板 1.5 × 10 6个 iPSC ，其中含有 12 mL 含有 10 μM ROCK 抑制剂的 iPSC 培养基 。
- 第二天，取出培养基并用DPBS洗涤细胞。加入 12 mL 新鲜制备的 完全诱导培养基以诱导 转录因子的表达。
- 在第 2 天，用 5 mL 神经元包被溶液涂覆 10 cm 培养皿，该溶液用等体积的 0.1 mg/mL 聚-D-赖氨酸和 1 mg/mL 在硼酸盐缓冲液中稀释的聚-L-鸟氨酸制备。在37°C和5%CO2下孵育过夜。
- 在第3天，用无菌水清洗涂有涂层的餐具3次，完全吸出水，并通过倾斜盘子并将它们部分暴露在生物安全柜内在环境温度下至少1小时，让培养皿干燥。
- 培养皿完全干燥后，在37°C和5%CO2下用补充有15μg/ mL层粘连蛋白和40μM BrdU的6mL完全诱导培养基涂覆至少1小时。
注意：建议进行BrdU处理以消除有丝分裂活性细胞，从而提高神经元培养物的纯度。BrdU对神经元健康的影响很小。 - 每 10 cm 培养皿用 3 mL 解离试剂处理分化细胞，并在环境温度下孵育 3-4 分钟。
- 在不去除解离试剂的情况下将 6 mL DPBS 添加到板中，并用 10 mL 移液管将溶液中的细胞上下移液 4-5 倍以解离细胞。
- 收集细胞悬液并将其通过 40 μm 细胞过滤器进入 50 mL 锥形管中。加入 1 mL 感应基培养 基 冲洗过滤器。
- 将细胞以300 × g 离心5分钟。吸出培养基并将细胞重悬于含有 40 μM BrdU 的 3 mL 完全诱导培养基 中。
- 用血细胞计数器计数细胞。通过将细胞稀释在含有40μM BrdU的6mL完全诱导培养基中而不除去步骤2.1.14中添加的包衣溶液，将每10cm培养皿中约2.5×10个6个细胞板到预包被的培养皿中。
- 在第4天，吸出培养基，用DPBS洗涤细胞1倍，并加入含有40μM BrdU的新鲜 完全诱导培养基 。
- 在第6天，吸出培养基，用DPBS洗涤细胞1倍，并加入补充有1μg/ mL层粘连蛋白的 神经元培养基 。
- 在第 9 天，用补充有 1 μg/mL 层粘连蛋白的新鲜神经元培养基代替培养基，更换培养基的 1/3rd。
- 每 3-4 天用补充有新鲜 1 μg/mL 层粘连蛋白的神经元培养基进行半培养基更换，将i 3个 LMN 再维持 25 天。
注意：在这个时间点，i3LMN应该呈现具有长过程的神经元形态。神经元也倾向于形成细胞团块或细胞簇。有关如何验证i3LMN的分化的更详细描述可以在别处找到17。
- 按照步骤 1.2.1 所述，用 5 mL 标准涂层溶液涂覆 10 cm 培养皿。
- 突触体纯化和标记
注意：保持无菌条件并在生物安全柜内执行所有步骤。- 用DPBS 清洗 i 3 个 LMN 两次。
- 加入 2 mL 冰冷细胞裂解试剂用于分离突触体，在冰上孵育 2 分钟，并牢固地刮擦神经元。
- 将裂解物转移到多个2 mL微管（每管~1.5 mL裂解物）中，并在4°C下以1，200× g 离心10分钟。
注意：在整个过程中将试管保持在冰上。 - 收集上清液（弃去沉淀）并在4°C下以15，000× g 离心20分钟。 在DPBS中保存并重悬含有具有相似体积（与原始裂解物）的5%DMSO的突触体的沉淀。
注意：突触体可以立即用荧光团标记或储存在-80°C以备将来使用。 - 对所有试管进行二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定，以评估突触体制剂中蛋白质的总产量。
注意：可以使用其他测定来测量蛋白质浓度。从不同制剂获得的总蛋白得率已列入 表1 作为参考。建议对突触体制剂进行蛋白质印迹分析，以确认突触前和突触后蛋白的存在。在这里，如前所述，选择突触前标记物突触素（SYP）和突触后标记物突触后密度蛋白95（PSD95）进行蛋白质印迹分析，如前所述19。 - 制备100mM碳酸氢钠在水中的溶液，将pH调节至8.5，并无菌过滤。
- 将所用pH敏感染料的1mg冻干粉末溶解到150μLDMSO中。制作一次性等分试样并将其储存在-80°C。
- 在4°C下以15，000× g 离心突触体5分钟。
- 在 100 μL 100 mM 碳酸氢钠溶液中稀释多达 1 mg 突触体。
- 要标记突触体，每 1 mg 突触体加入 1 μL 重构 pH 敏感染料，并用铝箔覆盖反应以避免光照。使用摇管在室温下摇动2小时。
- 向管中加入1mL DPBS，并在4°C下以15，000× g 离心标记的突触体5分钟。
- 除去上清液并按照步骤2.2.11所述进行四次额外的洗涤。
- 在最后一次洗涤和旋转后，在不干扰沉淀的情况下尽可能多地去除上清液，并在DPBS中用5%DMSO重悬标记的突触体，体积为所需浓度（此处使用的0.7μg/ μL）。准备一次性等分试样并储存在-80°C。 确保避免光暴露在标记的突触体中。
- 活细胞吞噬试验
- 将板 20-30 × 104 PMP 放入 100 μL iMG 完全培养基中的 96 孔板中，并按照步骤 1.2.4 所示进行 10 天的分化过程。
- 在测定当天，通过将1滴活细胞核染色剂加入2mL iMG基础培养基中来制备核染色溶液。
- 96孔板每孔取出40 μL培养基，并使用多通道移液器加入10 μL核染色溶液。将板在37°C和5%CO2 下孵育2小时。
- 在冰上解冻标记的突触体，并使用水超声仪轻轻超声处理1分钟。立即将突触体转移回冰块。在 iMG完全 培养基中以每50μL培养基1μL突触体的比例稀释标记的突触体。
注意：突触体的浓度取决于测定，可能需要优化。为了在培养基中保持相对较低的DMSO百分比（即0.1%或更低），建议每孔添加的突触体不要超过2μL。 - 作为阴性对照，用细胞松弛素D预处理一些孔以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。在 iMG完全培养基中制备60μM细胞松弛素D的溶液。向每个孔中加入10μL该溶液，终浓度为10μM，并在37°C和5%CO2 下孵育30分钟。
- 从培养箱中取出板并在10°C下孵育10分钟。将板保持在冰上，并加入50μL含有按步骤2.3.4制备的突触体的培养基。
- 将板在10°C下以270 ×g 离心3分钟，并将板保持在冰上直到成像采集。
- 成像采集和分析
- 将板插入活细胞成像读数器并选择要分析的孔。
- 选择 20倍 物镜。
- 调整明场和蓝色（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）通道的焦点、发光二极管 （LED） 强度、积分时间和增益。突触体荧光在初始时间点应可忽略不计。要聚焦于红色 （RFP） 通道，请使用明场通道作为参考。积分时间和增益可能因实验而异;对红色通道使用以下初始设置：LED：4、积分时间：250和增益：5。
- 选择每孔蒙太奇中要采集的单个图块的数量（在孔中心采集 16个图块 ，从而成像大约占总 孔面积的5%）。将 温度 设置为 37°C 和 所需的成像时间间隔 。
注意：在本研究中，每1-2小时采集一次图像长达16小时。 - 打开分析软件。
- 打开包含图像的实验。单击 数据缩减 图标。
- 在菜单中，选择“成像处理”下的“成像拼接”，以使用表 2 中所述的参数从蒙太奇中的 4 x 4 个单独拼接创建完整图像。
- 创建拼接图像后，使用这些图像的 DAPI 和 RFP 通道定义强度阈值。打开图像并单击分析;在“分析”下，选择“蜂窝分析”，然后在“检测通道”下，在 DAPI 或 RFP 通道中选取拼接图像。转到“主掩码和计数”选项卡，并建立阈值和对象大小值，以正确选择DAPI通道中的细胞核或RFP通道中的突触体信号。用不同的图像重复该过程，直到可以应用于整个实验的参数得到优化。
注意：建议值可在 表 2 中找到。 - 要计算细胞核的数量，请转到“数据缩减”菜单，然后在“图像分析”下选择“细胞分析”。转到主掩码和计数选项卡，在通道下，选择 DAPI 拼接图像并使用表 2 中所述的参数。
- 转到 “计算指标 ”选项卡，然后选择 “单元格计数”。 要获取突触体信号的区域，请转到 “数据缩减 ”菜单，然后在“分析 ”下选择 “细胞分析”。
- 转到 主掩码和计数 选项卡，在 通道下，选择 RFP 拼接 图像并使用 表 2 中详述的参数。
- 转到 计算指标 选项卡，然后选择 对象总和区域。在 数据缩减 标签 ，单击 确定 并允许软件分析所有采集的图像。
- 导出每个时间点的对象 总和面积 和 像元计数 值。将 对象总和 面积除以 单元格计数以计算每个时间点的归一化面积。如果比较多种治疗或基因型，请使用公式（1）计算吞噬指数：
（1） - 保存结果并集成数据。
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Representative Results
为了使用该协议生成iMG，重要的是从未分化的iPSC开始，这些iPSCs显示出紧凑的集落形态和明确的边缘（图2A）。如EB形成部分所述维持的解离iPSC将形成球形聚集体，称为EB，其大小将增长到分化的第4天（图2B）。一旦EB被收集并在适当的条件下接种以产生PMP，它们就会附着在Matrigel涂层的板上，并且一层细胞将扩散并围绕球形聚集体（图2C）。不健康的EB会从板上脱落，应予以消除。从PMP生成的第14天到第21天，可能会出现不同的细胞类型并漂浮在培养基中;这些细胞应在更换培养基时丢弃12.在第28天，具有大细胞质与细胞核比的圆形细胞将以悬浮形式出现（图2D），称为PMP。这些细胞是连续产生的，可以在培养基更换期间每周收获长达 3 个月。每周收获的PMP数量各不相同，取决于iPSC系和培养物的年龄;产量通常会随着时间的推移而下降。强烈建议在层粘连蛋白521包被的平板而不是基质胶中培养iPSC，因为当iPSCs维持在先前和本研究中报道的先前条件下时，PMP产量更高（图2E）18。
PMP暴露于 iMG培养基 10-12天后，细胞获得小胶质细胞样形态，具有小细胞质和细长过程（图3A）。为了验证小胶质细胞的身份，我们用针对髓系标志物电离钙结合接头分子1（IBA1）和富含小胶质细胞的标记嘌呤能受体P2RY12和跨膜蛋白119（TMEM119）的抗体进行了免疫荧光染色，如前所述20 （另见 材料表）。通常，>95%的细胞表达IBA1，约90%的细胞表达P2RY12和TMEM119（图3B）。
为了评估iMGs的吞噬能力，使用了i 3个用pH敏感染料标记的LMN衍生的人突触体。为了验证突触体制剂是否保留了规范的结构特性，通过蛋白质印迹分析（图4）证实了突触前标记物突触素（SYP）和突触后标志物突触后密度蛋白95（PSD95）19的富集，如前所述20（另见材料表).用pH敏感染料标记的突触体在被iMG吞噬并且一旦它们位于细胞内酸性（即低pH）区室内后就会变成荧光。
在最初的时间点，红色荧光信号很小，因为大多数突触体尚未被吞噬。30分钟后，检测到红色荧光信号并随着时间的推移进一步增加。到10小时，红色荧光信号很强烈，因为大多数突触体已被吞噬并通过吞噬过程 定位 到酸性细胞内区室（图5A）。细胞松弛素D是一种肌动蛋白聚合抑制剂，广泛用于阻断吞噬作用。正如预期的那样，我们观察到细胞松弛素D处理的iMGs中的红色荧光信号强烈减少，表明检测到的信号是由吞噬细胞事件引起的。我们还注意到，iMGs在吞噬10小时后显示出形态变化，这在细胞松弛素D处理的iMGs中未检测到，可能是由于细胞松弛素D处理的iMGs缺乏肌动蛋白重塑。小胶质细胞形态的变化通常与活化状态有关2。
通过使用所描述的自动定量方法，我们测量了每个时间点红色信号的总面积，并将其归一化为通过计数细胞核获得的细胞数。结果表明，吞噬突触体的面积随时间增加，直到16 h达到平台期。正如预期的那样，来自细胞松弛素D处理的细胞的红色信号面积不随时间增加，因为吞噬作用受到抑制（图5B）。总之，这些结果表明iMGs能够吞噬脑部疾病相关物质，适用于功能研究。
图 1：将 iPSC 分化为小胶质细胞样细胞的方案示意图。 在第0天，一旦iPSCs达到80%汇合，菌落被解离成单细胞并在EB培养基中培养以诱导EB形成。在第4天，收集EB并接种在PMP培养基中以诱导PMP生成。28天后，收集PMP并使用iMG培养基最终分化为iMG。PMP 可以每周收集一次，最长可达 3 个月。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;iMGs = 小胶质细胞样细胞;EB = 拟胚体;PMP = 原始巨噬细胞前体。 请点击此处查看此图的大图。
图2：在从iPSCs到PMP的分化阶段通过光学显微镜评估细胞形态。 （A）iPSCs在iPSC培养基中维持至80%汇合。（B）在EB培养基中分化4天后的胚状体。（C）附着在包被板上的EB和（D）在PMP培养基中培养28天后从EB悬浮液中出现的PMP。（E） 在第 1 周（PMP 分化 28 天后）和第 12 周从 ~48 个 EB 收集的 PMP 数量。条形图显示了来自两条不同 iPSC 线的六个独立分化（数据点）的平均值。通过双向方差分析和Šídák多重比较检验获得统计数据。比例尺 = 1，000 μm （A）， 400 μm （B-D）。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;iMGs = 小胶质细胞样细胞;EB = 拟胚体;PMP = 原始巨噬细胞前体。请点击此处查看此图的大图。
图 3：通过该协议分化的 iMG 在终末分化 10 天后显示出 真正的 小胶质细胞特征。 （A）呈现小胶质细胞样形态的iMG的代表性明场图像。比例尺= 400μm。 （B）表达骨髓/小胶质细胞标志物IBA1，P2RY12和TMEM119的iMG的代表性免疫荧光图像。比例尺= 400 微米 （A）， 50 微米 （B）。缩写：iMGs = 小胶质细胞样细胞;IBA1 = 离子钙结合接头分子 1;P2RY12 = 嘌呤能受体 P2RY12;TMEM119 = 跨膜蛋白 119;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：i3个 LMN 衍生的人突触体通过蛋白质印迹分析表达突触标志物。 使用突触后标记物 PSD95、突触前标记物、SYP 和 β-微管蛋白进行培养 28 天后，对源自 i3LMN 的人突触体制剂进行代表性蛋白质印迹分析。缩写：i3LMN = iPSC 衍生的下运动神经元;PSD95 = 突触后密度蛋白 95;SYP = 突触素。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用用 pH 敏感染料标记的人突触体并通过活细胞纵向成像监测的 iMG 的吞噬作用测定 。 （A）具有核染色（蓝色通道）的iMG的代表性明场和荧光蒙太奇暴露于标记的人突触体（红色通道），在指定的时间点进行和不进行细胞D处理。蒙太奇是通过对以 20 倍采集的 16 块瓷砖进行后期采集处理来创建的。比例尺= 400 μm。 （B）量化标准化为细胞数的突触体荧光信号的面积。数据点表示三个技术重复的平均±SEM。每条曲线显示来自一个iPSC系的两个独立分化（iMGs 1和2）的定量，有和没有细胞D处理。缩写：iMGs = 小胶质细胞样细胞;细胞D = 细胞松弛素 D. 请点击此处查看此图的大图。
| DIF28 i3LMN 的 10 厘米培养皿数量 | 总蛋白（微克） |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
表1：分化28天时从iPSC衍生的下运动神经元中分离突触体后的总蛋白产量。 提取突触体后从四个独立分化中获得的总蛋白质量。在每次分化中收获不同数量的含有i3LMN的10 cm培养皿。通过BCA蛋白质测定法测量蛋白质产量。缩写：iPSC = 诱导多能干细胞;i3LMN = iPSC 衍生的下运动神经元;DIF28 = 28天分化;支链氨基酸=二辛可宁酸。
| 参数 | 价值 |
| 注册通道 | 明场、DAPI 和 RFP |
| 融合方式 | 线性混合 |
| 裁剪拼接图像以删除边框上的黑色矩形 | 检查 |
| 缩小最终图像 | 检查 |
| 参数 | 价值 |
| 门槛 | 由用户决定 |
| 背景 | 黑暗 |
| 拆分触摸对象 | 检查 |
| 填充面具上的孔 | 检查 |
| 最小对象大小 | 7 微米 |
| 最大对象大小 | 30 微米 |
| 包括主边缘对象 | 检查 |
| 分析整个图像 | 检查 |
| 参数 | 价值 |
| 门槛 | 由用户决定 |
| 背景 | 黑暗 |
| 拆分触摸对象 | 检查 |
| 填充面具上的孔 | 检查 |
| 最小对象大小 | 5 微米 |
| 最大对象大小 | 100 微米 |
| 包括主边缘对象 | 检查 |
| 分析整个图像 | 检查 |
表2：用于成像采集和数据分析的参数。 列出了在吞噬作用测定期间进行成像采集和用于分析采集图像时要考虑的建议参数。
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Discussion
此处描述的分化方案提供了一种有效的方法，可在~6-8周内获得iPSC衍生的小胶质细胞样细胞，具有高纯度和足够的产量，以进行免疫荧光实验和其他需要更多细胞数的测定。该协议在 1 周内产生了多达 1 × 106 iMG，这允许蛋白质和 RNA 提取以及相应的下游分析（例如，RNASeq、qRT-PCR、蛋白质印迹、质谱）。也就是说，该协议的局限性是iMG的产量可能会限制某些应用。可以实施额外的修饰以积累来自不同周的PMP，并保持悬浮的均质培养物，直到收集足够的祖细胞以立即进行分化过程18。或者，EB的分化可以通过使用更高面积的细胞培养板来扩大，以增加PMP的产量。
建议使用在层粘连蛋白521包被的平板中培养的iPSCs来启动分化过程。其它包衣试剂可以减少工艺后期产生的PMP数量18。同样，在PMP生成过程中涂覆板以粘附EB可改善EB附着，从而延长培养物的寿命。EB培养物已维持长达4个月，此时，多个EB分离并死亡。然而，其他研究人员报告说，EB培养长达1年12。在我们手中，从3个月大的EB培养物中产生的iMG保持与年轻培养物区分的iMG相似的功能特性;超过 3 个月的培养物尚未用于功能实验。
为了优化小胶质细胞分化的最后阶段与上述原始方案7，8，我们在iMG培养基中纳入了100 ng / mL的白细胞介素（IL）-34，7 5 ng / mL的集落刺激因子1（M-CSF）10和50 ng / mL转化生长因子-β（TGF-β）。IL-34和M-CSF刺激CSF1受体依赖性途径，这对于维持小胶质细胞的命运和存活至关重要8，而TGF-β支持小胶质细胞稳态9，从而促进PMP对小胶质细胞命运的承诺的更多生理环境。值得注意的是，这里描述的整个分化过程是在无血清条件下进行的，这可以防止血清对iMG行为的可能影响和下游应用的改变。对于iMGs的功能实验，建议在10至12天的末端分化之间进行实验。iMGs已经培养了长达14天，细胞活力略有降低，之后，细胞健康会显着受损。
由于小胶质细胞的典型功能之一是吞噬作用，因此该协议中包括研究 体外 吞噬活性的测定。为了开发基于人类细胞的系统，使用了源自人类i3LMN的突触体。在本研究中，通过突触标志物的蛋白质印迹分析评估突触体制备的质量。此外，突触体制剂的其他结构和功能特性可以在吞噬测定之前通过电子显微镜或免疫染色进行研究。这里描述的获得人类突触体的协议严重依赖于i3LMN，其产生相对大量的神经元。然而，当使用其他分化方法（即需要小分子混合物的方案）时，神经元产量可能会更低。值得注意的是，吞噬作用测定可以使用多种其他底物进行，例如小鼠脑衍生的突触体，聚集蛋白或死细胞，所有这些都可以用pH敏感染料标记以类似的方式监测吞噬作用。建议使用pH敏感染料，因为荧光信号主要是在吞噬体处理和溶酶体降解过程中突触体位于酸区间内时发出的21。这一特性减少了来自细胞外突触体的背景信号，并有助于使用自动定量方法。此外，pH敏感染料允许检测真正的吞噬事件，而不是底物粘附或停靠在细胞膜上。
虽然本文建议每孔使用~35μg突触体，但应优化人突触体和其他底物的特定量，因为最佳条件取决于iPSC系和实验条件。理想的突触体范围应在吞噬作用测定中产生剂量反应。过多的突触体会使系统饱和，因此很难检测出基因型或治疗组的有意义的差异。材料太少会导致测定中的输出信号较弱。因此，建议测试每种底物的多种浓度以建立有效的测定。此外，重要的是将%DMSO保持在安全范围内，以保持细胞健康。
在该协议中，使用活细胞成像系统（材料表）监测吞噬作用，因为它提供有关细胞吞噬能力的动力学信息。能够支持活细胞成像并保持稳定的温度、湿度和 CO2 浓度的显微镜和成像系统也适用于该测定。这里描述的所有吞噬实验都在37°C，湿度为85%-95%和CO2%下成像。当活细胞成像不可行或不需要时，其他检测方法（例如固定细胞成像或流式细胞术）也可用于使用相同的材料和细胞培养方案（最多并包括iMG和标记的合成体的产生）来评估吞噬作用。同样，其他开源软件可用于数据分析，例如ImageJ或CellProfiler;后者将允许与此处使用的软件相媲美的自动分析。
总之，说明了将小胶质细胞样细胞与人iPSCs区分开来的稳健方案的实施，从而克服了人类小胶质细胞的有限资源。分化小胶质细胞可用于神经发育和神经退行性疾病研究的各种应用。此外，还包括完全“人源化”的吞噬测定，这将进一步帮助研究人类发育和疾病背景下的小胶质细胞功能和功能障碍。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者感谢Michael Ward提供用于运动神经元分化的WTC11 hNIL iPSC系，感谢Jackson实验室提供用于小胶质细胞分化的KOLF2.1J WT克隆B03 iPSC系。我们还要感谢Dorothy Schafer在协议实施过程中的支持，Anthony Giampetruzzi和John Landers在活细胞成像系统方面的帮助，以及Hayden Gadd在修订期间的技术贡献和Jonathan Jung在这项研究中的合作。这项工作得到了UMASS Chan医学院的Dan和Diane Riccio神经科学基金和天使基金公司的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
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