Summary
يصف هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة لإجراء التجارب في المختبر . نقوم أيضا بتضمين إجراء مفصل لتوليد المشابك البشرية من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC والتي يمكن استخدامها كركيزة لفحوصات البلعمة في المختبر باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة من أصل نخاعي تحافظ على التوازن في البيئة الدقيقة للدماغ وأصبحت لاعبا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية. تمثل دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في مجال الصحة والمرض تحديا بسبب الإمداد المحدود للغاية بالخلايا البشرية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من الأفراد البشريين للتحايل على هذا الحاجز. هنا ، يتم توضيح كيفية التمييز بين iPSCs البشرية إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs) للتجارب في المختبر . تظهر هذه الخلايا الجذعية المستغلة الخصائص المتوقعة والفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك التشكل الشبيه بالخلايا الدبقية الصغيرة، والتعبير عن العلامات المناسبة، والبلعمة النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وثائق لعزل ووضع العلامات على ركائز متشابكة مشتقة من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC البشرية (i3LMNs). يتم استخدام اختبار التصوير الطولي للخلايا الحية لمراقبة ابتلاع المشابك البشرية الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، مما يسمح بإجراء تحقيقات في قدرة البلعمة في iMG. تنطبق البروتوكولات الموصوفة هنا على نطاق واسع على المجالات المختلفة التي تبحث في بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ومساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في المرض.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. الخلايا الدبقية الصغيرة مهمة أيضا في دماغ البالغين للحفاظ على التوازن والاستجابة بنشاط لعمليات الصدمات والأمراض. تظهر الأدلة التراكمية أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المساهمين الرئيسيين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية النمائية والتنكسية العصبية 1,2. على الرغم من أن المعرفة الحالية حول بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة قد تم اشتقاقها في الغالب من نماذج الفئران ، فقد أوضحت الدراسات الحديثة اختلافات مهمة بين الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، مما يؤكد الحاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة الوظائف الوراثية والبيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية 3,4. يمكن أن يؤدي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة الأولية المشرحة إلى تعديل خصائص الخلايا الدبقية الصغيرةبشدة 5 ، مما قد يؤدي إلى نتائج مربكة تم الحصول عليها باستخدام هذه الخلايا. الهدف العام من هذه الطريقة هو التمييز بين iPSCs البشرية إلى iMGs ، وبالتالي توفير نظام زراعة الخلايا لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في ظل الظروف القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم تضمين اختبار البلعمة باستخدام نظام نموذج بشري بالكامل هنا كوسيلة لدراسة وظائف iMGs ، كإجراء لمراقبة الجودة وتقييم الخلل الوظيفي في iMG في سياق المرض.
ظهرت مؤخرا بروتوكولات متعددة لتمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs في الأدبيات6،7،8،9،10. تشمل العيوب المحتملة لبعض البروتوكولات فترات التمايز الممتدة أو الطويلة ، وإضافة عوامل نمو متعددة ، و / أو الإجراءات التجريبية المعقدة6،9،10. هنا ، يتم توضيح طريقة تمايز "سهلة الاستخدام" تلخص جوانب تطور الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تمايز iPSCs إلى خلايا سلائف تسمى سلائف البلاعم البدائية (PMPs)7,11. يتم إنشاء PMPs كما هو موضح سابقا ، مع بعض التحسينات المقدمة هنا12. تحاكي PMPs الضامة المشتقة من كيس الصفار المستقل عن MYB ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء التطور الجنيني عن طريق غزو الدماغ قبل إغلاق حاجز الدم في الدماغ13. للتمييز النهائي بين PMPs و iMGs ، استخدمنا طريقة زراعة أحادية سريعة ومبسطة تعتمد على بروتوكولات Haenseler et al. و Brownjohn et al. ، مع بعض التعديلات لتوليد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الفعالة التي تعبر فيها iMGs بقوة عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرةالمخصبة 7,8. يمكن استنساخ طريقة التمايز هذه في المختبرات ذات الخبرة في ثقافة iPSCs ومع أهداف بحثية تهدف إلى دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نظام نموذج بشري.
تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC مصدرا ذا صلة بيولوجيا للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية لإجراء التجارب في المختبر وهي أداة مهمة للتحقيق في الوظائف الكنسية للخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك البلعمة. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا البلعمية المهنية في الدماغ والجهاز العصبي المركزي، حيث تزيل حطام الخلايا، والبروتينات المجمعة، والمايلين14 المتحلل. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في إعادة تشكيل متشابك عن طريق ابتلاع نقاط الاشتباك العصبي وفي الدفاع ضد الالتهابات الخارجية من خلال البلعمة من مسببات الأمراض15,16. في هذا البروتوكول ، يتم تقييم البلعمة بواسطة iMGs باستخدام المشابك البشرية كمواد لابتلاع iMG. تحقيقا لهذه الغاية ، تم وصف وصف لعزل التشابك العصبي المشتق من الإنسان i3LMNs. يتم تمييز المشابك البشرية المشتقة من i3LMN بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني تسمح بتحديد كمية التشابك العصبي المترجمة داخل المقصورات الحمضية أثناء معالجة البلعمة وتدهورها في المختبر. يظهر اختبار البلعمة باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لمراقبة العملية الديناميكية لابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي. يضع هذا الفحص الوظيفي أساسا للتحقيق في العيوب المحتملة في البلعمة الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض باستخدام نظام بشري كامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول معقمة، ويجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. يتم وصف جميع خطوط iPSC ، بالإضافة إلى وسائط الصيانة والتمايز ، في جدول المواد. تعتمد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الموضحة أدناه على البروتوكولاتالمنشورة مسبقا 7،8،12 مع التعديلات الجديدة الموضحة هنا.
1. تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة
ملاحظة: يتم تلخيص نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1.
- زراعة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)
ملاحظة: يمكن العثور على مزيد من التفاصيل التي تصف تقنيات زراعة iPSC في مكان آخر17.- الذوبان والصيانة
- قم بإعداد وسيط iPSC ، وقسمة الوسط ، وتخزينه في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. قم بإذابة القسمة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية واستخدمها لمدة تصل إلى 1 أسبوع. اترك الوسائط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
- قم بتغطية آبار صفيحة مكونة من 6 آبار بإضافة 1 مل من 10 ميكروغرام / مل من laminin 521 المخفف في DPBS الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم18. احتفظ بالأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة ساعتين على الأقل أو يفضل طوال الليل. بمجرد تخفيفه ، قم بتخزين اللامينين في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر.
- تحضير 10 mM Rho كيناز مثبط Y27632 (ROCK Inhibitor) محلول الأسهم عن طريق التخفيف في الماء المعقم. جعل القسمة ذات الاستخدام الواحد من محلول مثبطات ROCK وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
- قم بإعداد 0.5 mM EDTA عن طريق تخفيف محلول المخزون البالغ 0.5 M EDTA في DPBS.
- لإذابة قارورة من iPSCs المجمدة ، ضع القارورة في حمام مائي على حرارة 37 درجة مئوية حتى يتم إذابتها في الغالب. انقل محتوى القارورة على الفور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من وسط iPSC. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 1 دقيقة.
- نضح المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا بإضافة 1 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK ببطء على جدار الأنبوب لتجنب إزعاج المستعمرات.
- أضف 1.5 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط صخرة 10 ميكرومتر إلى كل من الآبار المطلية وانقل المستعمرات المعاد تعليقها قطرة قطرة إلى الآبار التي تحتوي على الوسط.
ملاحظة: استخدم 5-7 قطرات من الخطوة 1.1.1.6 لصيانة المستنبتة ولكن اضبط كثافة البذر المثلى لكل خط iPSC. - قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا جنبا إلى جنب ومن الخلف إلى الأمام. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، استبدل الوسط تماما بإضافة وسيط iPSC جديد بدون مثبط ROCK.
- للصيانة ، قم بتغيير الوسيط كل يوم حتى تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخلايا دون تغيير الوسيط لمدة 2 أيام إذا كان وسيط iPSC المستخدم يسمح بجدول تغذية مرن. ينصح بقصر هذا على مرة واحدة لكل مقطع وفقط إذا كانت الخلايا أقل من 50٪ متقاربة.
- تقسيم
- نضح الوسط وغسل الخلايا مع 1 مل من DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم).
- لإزاحة الخلايا ، أضف 1 مل من 0.5 mM EDTA واحتضانها لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة حتى ترتفع حواف مستعمرات الخلايا من سطح البئر. اغسل الخلايا مرة أخرى باستخدام DPBS وأضف 1 مل من وسط iPSC.
- افصل مستعمرات الخلايا عن طريق كشطها برفق باستخدام رافع الخلية. كشط كل منطقة من البئر مرة واحدة فقط لتجنب إزعاج المستعمرات.
ملاحظة: يمكن العثور على طرق بديلة لإزاحة المستعمرات من البئر في مكان آخر17. - باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل ، اجمع الخلايا وانقلها قطرة قطرة بنسبة 1: 6 (خلايا إلى متوسطة) إلى آبار مطلية مسبقا (كما هو مذكور في الخطوة 1.1.1.2) تحتوي على 1.5 مل من وسط iPSC.
- الذوبان والصيانة
- تمايز iPSC إلى الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs)
ملاحظة: يتم إذابة الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو في ألبومين مصل الأبقار المعقم المصفى بنسبة 0.1٪ في DPBS إلى تركيز مخزون أعلى 1000 مرة من التركيز النهائي. يوصى بتمييز iPSCs إلى iMGs أثناء الممرات المبكرة. ينصح بالتنميط النووي الروتيني لخطوط iPSC.- تحضير محلول الطلاء القياسي
- قم بإذابة محلول المخزون لكاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- أنابيب الطرد المركزي الدقيقة Prechill وأطراف ماصة المرشح عند 4 درجات مئوية.
- حصة 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة المركزة خارج الخلية في كل أنبوب ووضعها على الفور على الجليد. قم بتخزين القسمة في -20 درجة مئوية.
- لتحضير محلول الطلاء ، قم بإذابة أحد حصص كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجليد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- أضف 50 مل من وسائط DMEM-F12 الباردة والجليدية المحسنة لنمو الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والمستحثة متعددة القدرات (المشار إليها باسم DMEM-F12) إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا واحتفظ بها على الجليد.
- قم بتبريد طرف ماصة سعة 1 مل عن طريق سحب DMEM-F12 المثلج لأعلى ولأسفل عدة مرات ، ثم استخدم طرف الماصة على الفور لنقل 250 ميكرولتر من كاشف طلاء المصفوفة خارج الخلية إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط DMEM-F12.
ملاحظة: يمكن تخزين محلول الطلاء القياسي لمدة 2 أسابيع عند 4 °C.
- تكوين الجسم الجنيني (EB)
- قم بإعداد وسيط EB الذي يمكن الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أيام.
- بمجرد أن تصل iPSCs إلى 80٪ من التقاء ، افصل المستعمرات عن طريق الغسيل باستخدام 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من كاشف التفكك لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بإزاحة المستعمرات باستخدام رافع الخلايا عن طريق الكشط عدة مرات لإنشاء تعليق أحادي الخلية. اجمع الخلايا وانقل كل شيء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من DPBS.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط EB. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا وخفف 1: 1 باستخدام Trypan blue. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم ، وبناء على عدد الخلايا ، قم بتخفيف مخزون الخلايا إلى تخفيف نهائي يبلغ 10000 خلية لكل 100 ميكرولتر. بالنسبة لخلايا الطلاء ، أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المخففة لكل بئر إلى لوحة منخفضة الالتصاق ، مستديرة القاع ، 96 بئرا.
ملاحظة: بشكل عام ، يمكن الحصول على 48 بئرا من لوحة 96 بئرا من كل بئر متقارب بنسبة 80٪ من iPSCs. - جهاز طرد مركزي للصفيحة عند 125 × جم لمدة 3 دقائق واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 4 أيام. قم بإجراء تغيير نصف متوسط في اليوم 2 باستخدام ماصة متعددة القنوات وجمع 50 ميكرولتر من الوسط القديم برفق ، ثم إضافة 50 ميكرولتر من وسيط EB الجديد.
ملاحظة: في اليوم 4 ، ستشكل iPSCs هياكل خلوية كروية تسمى EBs كما هو موضح في قسم النتائج. يمكن تمديد عملية تمايز EB حتى 7 أيام ، إذا لزم الأمر.
- توليد سلائف البلاعم البدائية (PMPs)
- تحضير قاعدة PMP المتوسطة ، مرشح معقم ، وتخزينها في 4 °C لمدة تصل إلى 1 شهر.
- قم بتغطية آبار صفيحة مكونة من 6 آبار بإضافة 1 مل من محلول طلاء Matrigel المثلج البارد واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة على الأقل أو يفضل طوال الليل.
- في اليوم 4 من تمايز EB ، انقل EBs إلى الآبار المطلية ب Matrigel عن طريق جمع EBs بأطراف ماصة 1 مل (باستخدام ماصة). ماصة لأعلى ولأسفل مرة أو مرتين لإزاحة EBs من البئر. امسك اللوحة المكونة من 6 آبار بزاوية مائلة للسماح ل EBs بالاستقرار على حافة البئر.
ملاحظة: يمكن طلاء تسعة أو عشرة EBs لكل بئر مطلي. - بمجرد أن تستقر جميع EBs ، ماصة برفق وإزالة الوسيط القديم باستخدام طرف ماصة 1 مل مع الحفاظ على EBs على حافة البئر. أضف 3 مل من الوسط الكامل PMP الطازج إلى كل بئر. قم بتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار عن طريق خلط اللوحة يدويا جنبا إلى جنب ومن الخلف إلى الأمام. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- لا تزعج اللوحة لمدة 7 أيام للسماح ل EBs بالالتصاق بقاع البئر. بعد ذلك الوقت ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط PMP الكامل.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب إرفاق معظم EBs باللوحة. يمكن إزالة أي EBs عائمة. - بعد 5-7 أيام ، افحص EBs تحت مجهر المجال الضوئي عند تكبير 4x للتأكد من أنها متصلة بقاع الآبار. قم بتغيير الوسيط كما هو موضح في 1.2.3.5. في اليوم 21 ، قم بإجراء تغيير متوسط كامل مع 3 مل من وسيط PMP الكامل.
ملاحظة: قد تكون السلف النخاعية العائمة في الوسط واضحة في هذه المرحلة. يجب التخلص من هذه الخلايا أثناء التغيير المتوسط. - في اليوم 28 ، ابحث عن الخلايا المستديرة المشار إليها باسم PMPs في المادة الطافية واجمع الوسيط الذي يحتوي على PMPs باستخدام ماصة سعة 10 مل وماصة أوتوماتيكية. احرص على عدم إزعاج EBs. انقل PMPs والوسط إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وتابع كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
ملاحظة: عادة ما يمكن جمع PMPs من نفس خط iPSC من خمسة آبار من لوحة 6 آبار وتجميعها معا في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل. - أضف 3 مل من وسيط PMP الكامل الجديد لمزيد من الصيانة ل EBs. نظرا لأن PMPs تظهر باستمرار من EBs لأكثر من 3 أشهر ، قم بجمعها كل 4-7 أيام (لا تسمح للوسيط بتغيير اللون إلى درجة اللون الأصفر) كما هو موضح في الخطوتين 1.2.3.7 و 1.2.3.8.
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن جمع PMPs لعدة أشهر ، إلا أنها قد تغير نمطها الظاهري بمرور الوقت.
- التمايز إلى iMGs
- قم بإعداد الوسط الأساسي iMG (جدول المواد) ، وفلتر معقم وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
- بمجرد جمع PMPs في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، قم بطرد مركزي عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق PMPs باستخدام 1-2 مل من الوسط القاعدي iMG. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم عن طريق أخذ حصة صغيرة وتخفيف 1: 1 باستخدام Trypan blue.
ملاحظة: عادة ما يتم الحصول على 0.5-1.5 × 106 PMPs كل أسبوع اعتمادا على خط iPSC وعمر ثقافة EB. - جهاز طرد مركزي لبقية الخلايا مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 4 دقائق. قم بتخفيف PMPs إلى التركيز المطلوب بحيث يتم طلاء الخلايا بكثافة ~ 105 / سم2 على الألواح المعالجة بزراعة الخلايا باستخدام وسط iMG الكامل الطازج. قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسيط iMG الكامل المحضر حديثا كل 3-4 أيام طوال 10-12 يوما للسماح بالتمايز النهائي.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يجب أن تكتسب الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة. لتأكيد التزام PMPs بمصير الخلايا الدبقية الصغيرة ، يتم إجراء تحليل التألق المناعي لتأكيد التعبير عن العلامات الغنية بالخلايا الدبقية الصغيرة مثل مستقبلات purinergic P2RY12 والبروتين عبر الغشاء 119 (TMEM119) 9. - للحفاظ على صحة الخلية وقابليتها للحياة ، قم بإجراء جميع التجارب بين الأيام 10 إلى 12 من تمايز iMG.
- تحضير محلول الطلاء القياسي
2. مقايسة البلعمة باستخدام المشابك البشرية المشتقة من الخلايا العصبية الحركية
- التمايز بوساطة عامل النسخ للخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC (i3LMNs)
ملاحظة: تم استخدام خط WTC11 مع إدخال مستقر لشريط عامل النسخ المستحث hNIL الذي يحتوي على عوامل نسخ neurogenin-2 (NGN2) و islet-1 (ISL1) و LIM homeobox 3 (LHX3) في موضع الملاذ الآمن CLYBL لعملية التمايز كما هو موضح سابقا17. تم الحفاظ على خط iPSC كما هو موضح في الخطوة 1.1.1 ولكن مع ظروف الطلاء الموضحة في الخطوة 1.2.1. يمكن استخدام أي كاشف طلاء مصفوفة خارج الخلية لزراعة iPSCs التي سيتم استخدامها للتمايز العصبي لأن laminin 521 غير مطلوب. تتم موازنة جميع الوسائط مع درجة الحرارة المحيطة لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.- قم بتغطية أطباق 10 سم ب 5 مل من محلول الطلاء القياسي كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
ملاحظة: هنا ، تم استخدام 3-4 أطباق 10 سم لكل تمايز. - قم بإعداد وسط قاعدة الحث ، مرشح معقم ، وقم بتخزينه في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع.
- تحضير الوسط الخلايا العصبية ، مرشح معقم ، وتخزينها في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- تحضير محلول البورات عن طريق خلط 100 مليمول حمض البوريك، و25 مليمول من رباعي الصوديوم، و75 مليمول من كلوريد الصوديوم في ماء معقم. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.5 وقم بتصفيته بشكل معقم.
- بمجرد أن تصل iPSCs إلى 80٪ من الالتقاء ، اغسل الخلايا باستخدام DPBS وقم بإزاحة المستعمرات بإضافة 0.5 mM EDTA.
ملاحظة: عادة ما يكون بئران كافيين لكل طبق 10 سم. - احتضان الخلايا لمدة 4-5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة. قم بإزالة EDTA وأضف 3 مل من DMEM / F12 مع HEPES إلى كل بئر.
- اكشط الخلايا باستخدام رافع الخلايا واستخدم ماصة سعة 10 مل لإزالة الخلايا من قاع البئر عن طريق سحب الأنابيب برفق لأعلى ولأسفل 2-3x.
- اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأجهزة طرد مركزي بسرعة 300 × جم لمدة 3 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط iPSC الذي يحتوي على مثبط ROCK 10 ميكرومتر وقم بحسابها باستخدام مقياس الدم.
- لوحة 1.5 × 106 iPSCs في طبق 10 سم مغلفة مسبقا مع 12 مل من وسط iPSC يحتوي على مثبط 10 ميكرومتر ROCK.
- في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا باستخدام DPBS. أضف 12 مل من وسط الحث الكامل الطازج للحث على التعبير عن عوامل النسخ.
- في اليوم الثاني ، قم بتغطية أطباق 10 سم ب 5 مل من محلول طلاء الخلايا العصبية المحضر بأحجام متساوية من 0.1 مجم / مل من بولي دي ليسين و 1 مجم / مل من بولي إل أورنيثين المخفف في محلول بورات. احتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- في اليوم الثالث ، اغسل الأطباق المطلية بالماء المعقم 3x ، واستنشق الماء تماما ، واترك الأطباق تجف عن طريق إمالة الأطباق وتركها مكشوفة جزئيا داخل خزانة السلامة الحيوية لمدة 1 ساعة على الأقل في درجة الحرارة المحيطة.
- بمجرد أن تجف الأطباق تماما ، قم بتغطيتها ب 6 مل من وسط الحث الكامل المكمل ب 15 ميكروغرام / مل من اللامينين و 40 ميكرومتر BrdU لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: يوصى بعلاج BrdU للقضاء على الخلايا النشطة انقساميا وبالتالي تعزيز نقاء الثقافات العصبية. آثار BrdU على صحة الخلايا العصبية ضئيلة. - عالج الخلايا المتمايزة ب 3 مل من كاشف التفكك لكل طبق 10 سم واحتضانها لمدة 3-4 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
- أضف 6 مل من DPBS إلى اللوحة دون إزالة كاشف التفكك وماصة الخلايا في محلول لأعلى ولأسفل 4-5x مع ماصة 10 مل لفصل الخلايا.
- اجمع معلق الخلية ومرره عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 1 مل من وسط قاعدة الحث لشطف المصفاة.
- أجهزة الطرد المركزي للخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. نضح الوسط وإعادة تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الحث الكامل الذي يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتقطيع ما يقرب من 2.5 × 106 خلايا لكل طبق 10 سم في أطباق مغلفة مسبقا عن طريق تخفيف الخلايا في 6 مل من وسط الحث الكامل الذي يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU دون إزالة محلول الطلاء المضاف في الخطوة 2.1.14.
- في اليوم 4 ، قم بشفط الوسط ، واغسل الخلايا 1x باستخدام DPBS ، وأضف وسط تحريض كامل جديد يحتوي على 40 ميكرومتر BrdU.
- في اليوم 6 ، قم بنشاق الوسط ، واغسل الخلايا 1x باستخدام DPBS ، وأضف وسط الخلايا العصبية المكمل ب 1 ميكروغرام / مل من اللامينين.
- في اليوم 9 ، قم بتغيير 1/3الثالثة من الوسط عن طريق استبداله بوسط عصبي جديد مكمل ب 1 ميكروغرام / مل من اللامينين.
- حافظ على3LMNs لمدة 25 يوما إضافية عن طريق إجراء تغييرات نصف متوسطة مع وسيط Neuron مع 1 ميكروغرام / مل طازج من laminin كل 3-4 أيام.
ملاحظة: في هذه النقطة الزمنية ، يجب أن تقدمi 3LMNs مورفولوجيا عصبية مع عمليات طويلة. تميل الخلايا العصبية أيضا إلى تكوين كتل أو مجموعات من الخلايا. يمكن العثور على وصف أكثر تفصيلا لكيفية التحقق من صحة تمايز i3LMNs في مكان آخر17.
- قم بتغطية أطباق 10 سم ب 5 مل من محلول الطلاء القياسي كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.
- تنقية المشبك ووضع العلامات
ملاحظة: الحفاظ على ظروف معقمة وتنفيذ جميع الخطوات داخل خزانة السلامة البيولوجية.- اغسل3 LMNs مرتين باستخدام DPBS.
- أضف 2 مل من كاشف تحلل الخلايا الباردة لعزل التشابك العصبي ، واحتضان الجليد لمدة دقيقتين ، وكشط الخلايا العصبية بإحكام.
- انقل المحللة إلى أنابيب دقيقة متعددة سعة 2 مل (~ 1.5 مل لكل أنبوب) وأجهزة طرد مركزي عند 1200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حافظ على الأنابيب على الجليد طوال هذا الإجراء. - اجمع المادة الطافية (تخلص من الحبيبات) وأجهزة الطرد المركزي عند 15000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. حفظ وإعادة تعليق الحبيبات التي تحتوي على المشابك العصبية بحجم مماثل (مثل المحللة الأصلية) بنسبة 5٪ DMSO في DPBS.
ملاحظة: يمكن تسمية السينابتوزومات على الفور بفلوروفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. - قم بإجراء فحص بروتين حمض Bicinchoninic (BCA) لجميع الأنابيب لتقييم العائد الكلي للبروتين في إعداد المشبك.
ملاحظة: يمكن استخدام مقايسات أخرى لقياس تركيز البروتين. تم تضمين إجمالي محصول البروتين الذي تم الحصول عليه من المستحضرات المختلفة في الجدول 1 كمرجع. يوصى بإجراء تحليل اللطخة الغربية لإعداد المشبك لتأكيد وجود بروتينات ما قبل المشبكي وما بعد المشبكي. هنا ، تم اختيار علامة ما قبل المشبكي ، synaptophysin (SYP) ، وعلامة ما بعد المشبكي ، بروتين كثافة ما بعد المشبكي 95 (PSD95) لتحليل النشاف الغربي كما هو موضح سابقا19. - تحضير محلول من 100 مليمتر من بيكربونات الصوديوم في الماء ، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 ، ومرشح معقم.
- إذابة 1 ملغ من مسحوق مجفف بالتجميد من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني المستخدمة في 150 ميكرولتر من DMSO. اصنع حصصا للاستخدام مرة واحدة وقم بتخزينها في -80 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي للتشابك العصبي عند 15000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تمييع ما يصل إلى 1 ملغ من المشابك في 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 100 mM.
- لتسمية المشبك العصبي ، أضف 1 ميكرولتر من الصبغة الحساسة للأس الهيدروجيني المعاد تشكيلها لكل 1 ملغ من الجيبتوسومات وقم بتغطية التفاعل بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء. يهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة باستخدام شاكر أنبوب.
- أضف 1 مل من DPBS إلى الأنبوب وجهاز الطرد المركزي للتشابك العصبي المسمى عند 15000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية وقم بإجراء أربع عمليات غسل إضافية كما هو موضح في الخطوة 2.2.11.
- بعد الغسيل والدوران النهائي ، قم بإزالة المادة الطافية قدر الإمكان دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق المشابك العصبية الموسومة بنسبة 5٪ DMSO في DPBS بحجم التركيز المطلوب (0.7 ميكروغرام / ميكرولتر المستخدمة هنا). تحضير القسمة ذات الاستخدام الواحد وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية. تأكد من تجنب التعرض للضوء للتشابك العصبي المسمى.
- مقايسة البلعمة بالخلايا الحية
- اللوحة 20-30 × 10 4 PMPs إلى 96 لوحة بئر في 100 ميكرولتر من iMG وسط كامل واتبع عملية التمايز لمدة 10 أيام كما هو موضح في الخطوة 1.2.4.
- في يوم الفحص ، قم بإعداد محلول التلوين النووي عن طريق إضافة قطرة واحدة من البقعة النووية للخلايا الحية إلى 2 مل من الوسط القاعدي iMG.
- قم بإزالة 40 ميكرولتر من الوسط لكل بئر من لوحة 96 بئرا وأضف 10 ميكرولتر من محلول التلوين النووي باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة2 ساعة.
- ذوبان المشابك المسمى على الجليد وسونيكات بلطف باستخدام سونيكاتور الماء لمدة 1 دقيقة. نقل المشابك على الفور مرة أخرى إلى الجليد. تمييع المشابك المسمى في الوسط الكامل iMG بنسبة 1 ميكرولتر من المشابك لكل 50 ميكرولتر من المتوسط.
ملاحظة: يعتمد تركيز المشبك العصبي على الفحص وقد يتطلب التحسين. للحفاظ على نسبة منخفضة نسبيا (أي 0.1٪ أو أقل) من DMSO في الوسط ، ينصح بعدم إضافة أكثر من 2 ميكرولتر من التشابك العصبي لكل بئر. - كعنصر تحكم سلبي ، قم بمعالجة بعض الآبار بالسيتوكلاسين D لمنع بلمرة الأكتين وبالتالي البلعمة. تحضير محلول 60 ميكرومتر سيتوكلاسين D في وسط كامل iMG. أضف 10 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي قدره 10 ميكرومتر واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة.
- أخرج الطبق من الحاضنة واحتضنه عند 10 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. حافظ على الصفيحة على الجليد وأضف 50 ميكرولتر من الوسط المحتوي على المشابك العصبية المحضرة كما هو موضح في الخطوة 2.3.4.
- قم بالطرد المركزي للصفيحة عند 270 × جم لمدة 3 دقائق عند 10 درجات مئوية وحافظ على اللوحة على الجليد حتى الحصول على التصوير.
- اقتناء التصوير وتحليله
- أدخل اللوحة في قارئ تصوير الخلايا الحية وحدد الآبار المراد تحليلها.
- حدد عدسة موضوعية 20x .
- اضبط التركيز ، وشدة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، ووقت التكامل ، وكسب قنوات برايت فيلد والأزرق (4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول [DAPI]). يجب أن يكون مضان المشبك ضئيلا في النقطة الزمنية الأولية. للتركيز على القناة الحمراء (RFP) ، استخدم قناة برايتفيلد كمرجع. يمكن أن يختلف وقت التكامل والكسب بين التجارب. استخدم هذه الإعدادات الأولية للقناة الحمراء: LED: 4 ، وقت التكامل: 250 ، والكسب: 5.
- حدد عدد البلاط الفردي الذي سيتم الحصول عليه في مونتاج لكل بئر (الحصول على 16 بلاطة في مركز البئر ، وبالتالي تصوير ما يقرب من 5٪ من إجمالي مساحة البئر). اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية والفاصل الزمني المطلوب للتصوير.
ملاحظة: تم الحصول على الصور كل 1-2 ساعة لمدة تصل إلى 16 ساعة في هذه الدراسة. - افتح برنامج التحليل.
- افتح التجربة التي تحتوي على الصور. انقر على أيقونة تقليل البيانات.
- في القائمة ، اختر خياطة التصوير ضمن معالجة التصوير لإنشاء صورة كاملة من المربعات الفردية 4 × 4 في المونتاج مع المعلمات الموضحة في الجدول 2.
- بمجرد إنشاء الصور المخيطة ، حدد عتبة الكثافة باستخدام قنوات DAPI و RFP لهذه الصور. افتح صورة وانقر على تحليل; ضمن تحليل، حدد التحليل الخلوي، وضمن قناة الكشف، اختر صورة مخيطة إما في قنوات DAPI أو RFP. انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وقم بإنشاء قيمة عتبة وقيم حجم الكائن التي تحدد بشكل صحيح نوى الخلية في قناة DAPI أو إشارة المشبك في قناة RFP. كرر العملية مع صور مختلفة حتى يتم تحسين المعلمات التي يمكن تطبيقها على التجربة بأكملها.
ملاحظة: يمكن العثور على القيم المقترحة في الجدول 2. - لحساب عدد النوى، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات، وضمن تحليل الصورة، حدد التحليل الخلوي. انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة DAPI واستخدم المعلمات الموضحة في الجدول 2.
- انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة وحدد عدد الخلايا. للحصول على منطقة إشارة المشبك ، انتقل إلى قائمة تقليل البيانات وضمن التحليل ، حدد التحليل الخلوي.
- انتقل إلى علامة التبويب القناع الأساسي والعدد وضمن القناة ، حدد الصور المخيطة RFP واستخدم المعلمات المفصلة في الجدول 2.
- انتقل إلى علامة التبويب المقاييس المحسوبة وحدد منطقة مجموع الكائن. في علامة التبويب تقليل البيانات ، انقر فوق "موافق " واسمح للبرنامج بتحليل جميع الصور التي تم الحصول عليها.
- قم بتصدير قيم ناحية مجموع الكائنات وعدد الخلايا لكل نقطة زمنية. قسم منطقة مجموع الكائن على عدد الخلايا لحساب المنطقة التي تمت تسويتها لكل نقطة زمنية. في حالة مقارنة علاجات أو أنماط جينية متعددة ، احسب مؤشر البلعمة باستخدام المعادلة (1):
(1) - حفظ النتائج ودمج البيانات.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإنشاء iMGs باستخدام هذا البروتوكول ، من المهم البدء ب iPSCs غير المتمايزة التي تظهر مورفولوجيا مستعمرة مدمجة ذات حواف محددة جيدا (الشكل 2 أ). ستشكل iPSCs المنفصلة التي يتم الاحتفاظ بها كما هو موضح في قسم تكوين EB مجاميع كروية ، تسمى EBs ، والتي ستنمو في الحجم حتى اليوم 4 من التمايز (الشكل 2B). بمجرد جمع EBs وطلائها في الظروف المناسبة لتوليد PMP ، فإنها تلتصق بالألواح المطلية ب Matrigel ، وسوف تنتشر طبقة من الخلايا وتحيط بالركام الكروي (الشكل 2C). سوف تنفصل EBs غير الصحية عن اللوحة ويجب التخلص منها. من اليوم 14 إلى 21 من توليد PMP ، يمكن أن تظهر أنواع مختلفة من الخلايا وسوف تطفو في الوسط. يجب التخلص من هذه الخلايا أثناء تغييرات الوسائط12. في اليوم 28 ، ستظهر الخلايا المستديرة ذات نسبة السيتوبلازم إلى النواة الكبيرة في التعليق (الشكل 2D) ، والتي تسمى PMPs. يتم إنتاج هذه الخلايا بشكل مستمر ويمكن حصادها أسبوعيا خلال التغييرات المتوسطة لمدة تصل إلى 3 أشهر. يختلف عدد PMPs التي يتم حصادها كل أسبوع ويعتمد على خط iPSC وعمر الثقافة. ينخفض العائد بشكل عام مع مرور الوقت. يوصى بشدة بزراعة iPSCs في ألواح مطلية ب laminin 521 بدلا من Matrigel ، حيث يكون عائد PMP أعلى عندما يتم الحفاظ على iPSCs في الظروف السابقة كما تم الإبلاغ عنه سابقا وفي هذه الدراسة (الشكل 2E)18.
بعد تعرض PMPs لوسط iMG لمدة 10-12 يوما ، تكتسب الخلايا مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيتوبلازم صغير ووجود عمليات ممدودة (الشكل 3 أ). للتحقق من هوية الخلايا الدبقية الصغيرة ، أجرينا تلطيخا مناعيا بالأجسام المضادة ضد العلامة النخاعية المتأينة لجزيء محول ربط الكالسيوم 1 (IBA1) والعلامات الغنية بالخلايا الدبقية الصغيرة مستقبلات P2RY12 والبروتين عبر الغشاء 119 (TMEM119) كما هو موضح سابقا20 (انظر أيضا جدول المواد). عادة ، تعبر >95٪ من الخلايا عن IBA1 وحوالي 90٪ من الخلايا تعبر عن P2RY12 و TMEM119 (الشكل 3B).
لتقييم القدرة البلعمية ل iMGs ، تم استخدام3من المشابك البشرية المشتقة من LMN الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني. للتحقق من أن المستحضر المشبكي يحتفظ بالخصائص الهيكلية الكنسية ، تم تأكيد إثراء العلامة قبل المشبكية ، والمشبك العصبي (SYP) ، وعلامة ما بعد المشبكي ، بروتين الكثافة بعد المشبكي 95 (PSD95) 19 من خلال تحليل اللطخة الغربية (الشكل 4) الذي تم إجراؤه كما هو موضح قبل20 (انظر أيضا جدول المواد ). تصبح المشبك العصبي المسمى بصبغة حساسة لدرجة الحموضة فلورية بعد أن تبتلعها iMGs وبمجرد أن يتم توطينها داخل مقصورات حمضية داخل الخلايا (أي درجة حموضة منخفضة).
في النقطة الزمنية الأولية ، كانت إشارة الفلورسنت الحمراء ضئيلة ، لأن معظم التشابك العصبي لم يتم البلعمة بعد. بعد 30 دقيقة ، تم الكشف عن إشارة فلورسنت حمراء وزادت أكثر بمرور الوقت. بحلول الساعة 10 ، كانت إشارة الفلورسنت الحمراء قوية ، حيث تم ابتلاع معظم التشابك العصبي وتم توطينها في مقصورات حمضية داخل الخلايا عبر عملية البلعمة (الشكل 5 أ). Cytochalasin D هو مثبط بلمرة الأكتين يستخدم على نطاق واسع لمنع البلعمة. كما هو متوقع ، لاحظنا انخفاضا قويا في إشارة الفلورسنت الحمراء في iMGs المعالجة بالسيتوكلاسين D ، مما يشير إلى أن الإشارة المكتشفة ناتجة عن أحداث البلعمة. لاحظنا أيضا أن iMGs تظهر تغيرات في التشكل بعد 10 ساعات من البلعمة التي لم يتم اكتشافها في iMGs المعالجة بالسيتوكلاسين D ، ربما بسبب عدم وجود إعادة تشكيل الأكتين في iMGs المعالجة بالسيتوكلاسين D. عادة ما ترتبط التغييرات في مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة بحالة التنشيط2.
باستخدام طريقة القياس الكمي الآلي الموصوفة ، قمنا بقياس المساحة الإجمالية للإشارة الحمراء في كل نقطة زمنية وقمنا بتطبيعها إلى رقم الخلية الذي تم الحصول عليه عن طريق حساب النوى. تشير النتائج إلى أن مساحة التشابك العصبي الغارقة زادت مع مرور الوقت حتى تم الوصول إلى الهضبة في 16 ساعة. كما هو متوقع ، لم تزداد مساحة الإشارة الحمراء من الخلايا المعالجة بالسيتوكلاسين D مع مرور الوقت ، حيث تم تثبيط البلعمة (الشكل 5 ب). تشير هذه النتائج معا إلى أن iMGs قادرة على البلعمة المواد ذات الصلة بأمراض الدماغ ومناسبة للدراسات الوظيفية.
الشكل 1: رسم تخطيطي لبروتوكول تمييز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة. في اليوم 0 ، بمجرد وصول iPSCs إلى التقاء 80٪ ، يتم فصل المستعمرات إلى خلايا مفردة وتربيتها في وسط EB للحث على تكوين EB. في اليوم 4 ، يتم جمع EBs ومطلي في وسط PMP للحث على توليد PMP. بعد 28 يوما ، يتم جمع PMPs وتمييزها نهائيا إلى iMGs باستخدام وسيط iMG. يمكن جمع PMPs أسبوعيا لمدة تصل إلى 3 أشهر. الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iMGs = خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة ؛ EB = الجسم الجنيني ؛ PMP = السلائف البلاعم البدائية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مورفولوجيا الخلية التي تم تقييمها بواسطة الفحص المجهري الضوئي في مراحل التمايز من iPSCs إلى PMPs. (أ) يتم الحفاظ على iPSCs في وسط iPSC حتى التقاء 80٪. ب: جسم جنيني بعد 4 أيام من التمايز في وسط EB. (ج) EBs المرفقة بألواح مطلية و (D) PMPs الناشئة في تعليق من EBs بعد 28 يوما من الاستزراع في وسط PMP. (ه) عدد PMPs التي تم جمعها من ~ 48 EBs في الأسبوع 1 (بعد 28 يوما من تمايز PMP) والأسبوع 12. تظهر الرسوم البيانية الشريطية متوسط ستة تمايزات مستقلة (نقاط بيانات) من خطين مختلفين ل iPSC. تم الحصول على الإحصاءات عن طريق اختبار المقارنات المتعددة ل ANOVA ثنائي الاتجاه و Šídák. قضبان المقياس = 1000 ميكرومتر (أ) ، 400 ميكرومتر (B-D). الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ iMGs = خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة ؛ EB = الجسم الجنيني ؛ PMP = السلائف البلاعم البدائية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تعرض iMGs المتمايزة بواسطة هذا البروتوكول خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة الحسنة النية بعد 10 أيام من التمايز النهائي. (أ) صورة ميدانية ساطعة تمثيلية ل iMGs تقدم مورفولوجيا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة. شريط المقياس = 400 ميكرومتر. (ب) صور التألق المناعي التمثيلي ل iMGs التي تعبر عن علامات النخاع / الخلايا الدبقية الصغيرة IBA1 و P2RY12 و TMEM119. قضبان المقياس = 400 ميكرومتر (أ) ، 50 ميكرومتر (ب). الاختصارات: iMGs = الخلايا الدبقية الصغيرة ؛ IBA1 = جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 ؛ P2RY12 = مستقبلات بيورينجية P2RY12 ؛ TMEM119 = بروتين عبر الغشاء 119 ؛ DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: i3عبرت المشابك البشرية المشتقة من LMN عن علامات متشابكة بواسطة تحليل اللطخة الغربية. تحليل اللطخة الغربية التمثيلية لمستحضر متشابك بشري مشتق من i3LMN بعد 28 يوما من الثقافة التي تم فحصها باستخدام علامة ما بعد المشبكي ، PSD95 ، وعلامة ما قبل المشبكي ، و SYP ، و β-tubulin. الاختصارات: i3LMN = الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC ؛ PSD95 = بروتين كثافة ما بعد المشبكي 95 ؛ ليرة سورية = المشبك. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: مقايسة البلعمة ل iMGs باستخدام التشابك العصبي البشري المسمى بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ويتم مراقبته بواسطة التصوير الطولي للخلايا الحية . (أ) مونتاج ميداني ومضان تمثيلي ل iMGs مع تلطيخ نووي (قناة زرقاء) يتعرض لتشابك عصبي بشري مسمى (قناة حمراء) مع وبدون علاج cytoD في النقاط الزمنية المحددة. تم إنشاء المونتاج من خلال معالجة ما بعد الاستحواذ ل 16 بلاطة تم الحصول عليها بمعدل 20x. قضبان المقياس = 400 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لمنطقة إشارة الفلورسنت المشبكية الطبيعية إلى رقم الخلية. تشير نقاط البيانات إلى متوسط ± SEM لثلاث نسخ فنية. يوضح كل منحنى القياس الكمي لاثنين من التمايز المستقل (iMGs 1 و 2) من خط iPSC واحد مع وبدون علاج cytoD. الاختصارات: iMGs = الخلايا الدبقية الصغيرة ؛ cytoD = سيتوكلاسين D. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| عدد أطباق 10 سم DIF28 i3LMN | البروتين الكلي (ميكروغرام) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
الجدول 1: إجمالي إنتاج البروتين بعد عزل المشبكي من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC في 28 يوما من التمايز. إجمالي كمية البروتين التي تم الحصول عليها من أربعة تمايزات مستقلة بعد استخراج المشابك. تم حصاد أعداد مختلفة من أطباق 10 سم تحتوي على i3LMN في كل تمايز. تم قياس محصول البروتين بواسطة مقايسة بروتين BCA. الاختصارات: iPSCs = الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ؛ i3LMN = الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC ؛ DIF28 = 28 يوما من التمايز ؛ BCA = حمض البيسينتشونينيك.
| البارامترات | قيمة |
| قناة التسجيل | المجال الساطع و DAPI و RFP |
| طريقة الانصهار | مزيج خطي |
| اقتصاص صورة مخيطة لإزالة المستطيلات السوداء على الحدود | التحقق |
| تصغير حجم الصورة النهائية | التحقق |
| البارامترات | قيمة |
| عتبة | يحددها المستخدم |
| خلفية | داكن |
| تقسيم لمس الأشياء | التحقق |
| املأ الثقوب في الأقنعة | التحقق |
| الحد الأدنى لحجم الكائن | 7 ميكرومتر |
| الحد الأقصى لحجم الكائن | 30 ميكرومتر |
| تضمين كائنات الحافة الأساسية | التحقق |
| تحليل الصورة بأكملها | التحقق |
| البارامترات | قيمة |
| عتبة | يحددها المستخدم |
| خلفية | داكن |
| تقسيم لمس الأشياء | التحقق |
| املأ الثقوب في الأقنعة | التحقق |
| الحد الأدنى لحجم الكائن | 5 ميكرومتر |
| الحد الأقصى لحجم الكائن | 100 ميكرومتر |
| تضمين كائنات الحافة الأساسية | التحقق |
| تحليل الصورة بأكملها | التحقق |
الجدول 2: المعلمات المستخدمة للحصول على التصوير وتحليل البيانات. يتم سرد المعلمات المقترحة التي يجب مراعاتها للحصول على التصوير أثناء فحص البلعمة ولتحليل الصور المكتسبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة فعالة للحصول على خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC في ~ 6-8 أسابيع بنقاوة عالية وفي عائد كاف لإجراء تجارب التألق المناعي والمقايسات الأخرى التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا. وقد أسفر هذا البروتوكول عن 1 × 106 iMGs في أسبوع واحد ، مما يسمح باستخراج البروتين والحمض النووي الريبي والتحليلات النهائية المقابلة (على سبيل المثال ، RNASeq ، qRT-PCR ، اللطخة الغربية ، قياس الطيف الكتلي). ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذا البروتوكول هو أن عائد iMGs قد يقيد تطبيقات معينة. يمكن تنفيذ تعديلات إضافية لتجميع PMPs من أسابيع مختلفة والحفاظ على ثقافة متجانسة في التعليق حتى يتم جمع ما يكفي من السلف للمضي قدما في عملية التمايز في وقت واحد18. بدلا من ذلك ، يمكن توسيع نطاق تمايز EBs باستخدام لوحات زراعة الخلايا ذات المساحة الأعلى لزيادة إنتاج PMPs.
ينصح باستخدام iPSCs المستزرعة في ألواح مطلية ب laminin 521 لبدء عملية التمايز. يمكن أن تقلل كواشف الطلاء الأخرى من عدد PMPs المنتجة لاحقا في العملية18. وبالمثل ، فإن طلاء الألواح للالتصاق EB أثناء توليد PMP يحسن ارتباط EB ، وبالتالي إطالة عمر الثقافة. تم الحفاظ على ثقافة EB لمدة تصل إلى 4 أشهر ، وعند هذه النقطة ، تنفصل العديد من EBs وتموت. ومع ذلك ، أبلغ باحثون آخرون عن زراعة EBs لمدة تصل إلى 1 سنة12. في أيدينا ، تحافظ iMGs الناتجة عن ثقافات EB البالغة من العمر 3 أشهر على خصائص وظيفية مماثلة ل iMGs المتمايزة عن الثقافات الشابة. لم يتم استخدام الثقافات التي مضى عليها أكثر من 3 أشهر لإجراء التجارب الوظيفية.
لتحسين المرحلة النهائية من تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من البروتوكولات الأصلية الموضحة أعلاه 7,8 ، قمنا بتضمين 100 نانوغرام / مل من الإنترلوكين (IL) -34,7 5 نانوغرام / مل من عامل تحفيز المستعمرة 1 (M-CSF) 10 ، و 50 نانوغرام / مل من عامل النمو المحول بيتا (TGF-β) في وسط iMG. يحفز IL-34 و M-CSF المسارات المعتمدة على مستقبلات CSF1 والتي تعتبر ضرورية للحفاظ على مصير الخلايا الدبقية الصغيرة والبقاء على قيد الحياة8 بينما يدعم TGF-β توازن الخلايا الدبقية الصغيرة9 ، وبالتالي تعزيز بيئة فسيولوجية أكثر لالتزام PMP بمصير الخلايا الدبقية الصغيرة. تجدر الإشارة إلى أن عملية التمايز بأكملها الموصوفة هنا تتم في ظروف خالية من المصل ، مما يمنع الآثار المحتملة للمصل على سلوك iMG والتعديلات في التطبيقات النهائية. لإجراء تجارب وظيفية مع iMGs ، يوصى بإجراء تجارب بين 10 و 12 يوما من التمايز النهائي. تمت زراعة iMGs لمدة تصل إلى 14 يوما مع انخفاض متواضع في صلاحية الخلية ، وبعد ذلك ، تتعرض صحة الخلية للخطر بشكل كبير.
نظرا لأن إحدى الوظائف الكنسية للخلايا الدبقية الصغيرة هي البلعمة ، فقد تم تضمين اختبار للتحقيق في نشاط البلعمة في المختبر في هذا البروتوكول. لتطوير نظام قائم على الخلايا البشرية ، تم استخدام المشابك المشتقة من الإنسان i3LMNs. تم تقييم جودة تحضير المشبك العصبي من خلال تحليل اللطخة الغربية للعلامات المشبكية في هذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحقيق في الخصائص الهيكلية والوظيفية الأخرى لإعداد المشبك عن طريق المجهر الإلكتروني أو التلطيخ المناعي قبل فحص البلعمة. يعتمد البروتوكول الموصوف هنا للحصول على المشابك البشرية بشكل كبير على i3LMNs ، والتي تنتج عددا كبيرا نسبيا من الخلايا العصبية. ومع ذلك ، من المحتمل أن تكون غلة الخلايا العصبية أقل عند استخدام طرق التمايز الأخرى (أي البروتوكولات التي تتطلب كوكتيلات من الجزيئات الصغيرة). والجدير بالذكر أنه يمكن إجراء اختبار البلعمة باستخدام ركائز أخرى متعددة مثل النيكبتوسومات المشتقة من دماغ الفأر أو البروتينات المجمعة أو الخلايا الميتة ، والتي يمكن تمييزها جميعا بأصباغ حساسة للأس الهيدروجيني لمراقبة البلعمة بطريقة مماثلة. يقترح استخدام الأصباغ الحساسة للأس الهيدروجيني لأن إشارة الفلورسنت تنبعث بشكل أساسي عندما تكون المشابك موضعية داخل مقصورات الحمض أثناء معالجة البلعمة وتدهورها في الجسيمات الحالة21. تقلل هذه الخاصية من إشارة الخلفية من التشابك العصبي خارج الخلايا وتسهل استخدام الطرق الآلية للقياس الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح الأصباغ الحساسة للأس الهيدروجيني باكتشاف أحداث البلعمة الحقيقية بدلا من التصاق الركيزة أو الالتحام بغشاء الخلية.
بينما يقترح هنا استخدام ~ 35 ميكروغرام من التشابك العصبي لكل بئر ، يجب تحسين الكمية المحددة من المشابك البشرية والركائز الأخرى ، حيث تعتمد الظروف المثلى على خط iPSC والظروف التجريبية. يجب أن تؤدي مجموعة مثالية من السينابتوزومات إلى استجابة الجرعة في مقايسة البلعمة. يمكن أن يؤدي الكثير من التشابك العصبي إلى تشبع النظام ، مما يجعل من الصعب اكتشاف الاختلافات ذات المغزى كدالة للنمط الجيني أو مجموعة العلاج. سيؤدي القليل جدا من المواد إلى إشارة خرج ضعيفة في الفحص. لهذا السبب ، ينصح باختبار تركيزات متعددة من كل ركيزة لإنشاء مقايسة عمل. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم الحفاظ على النسبة المئوية DMSO ضمن نطاق آمن للحفاظ على صحة الخلايا.
في هذا البروتوكول ، تمت مراقبة البلعمة باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية (جدول المواد) لأنه يوفر معلومات حركية حول قدرة ابتلاع الخلايا. المجاهر وأنظمة التصوير التي يمكن أن تدعم تصوير الخلايا الحية والحفاظ على درجة حرارة ثابتة والرطوبة وتركيزات CO2 مناسبة أيضا لهذا الفحص. تم تصوير جميع تجارب البلعمة الموصوفة هنا عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 85٪ -95٪ و 5٪ CO2. يمكن أيضا استخدام طرق الكشف الأخرى مثل تصوير الخلايا الثابتة أو قياس التدفق الخلوي لتقييم البلعمة باستخدام نفس المواد وبروتوكولات زراعة الخلايا (بما في ذلك توليد iMGs و synptosomes المسمى) عندما يكون تصوير الخلايا الحية غير ممكن أو مرغوب فيه. وبالمثل ، يمكن استخدام برامج أخرى مفتوحة المصدر لتحليل البيانات مثل ImageJ أو CellProfiler. سيسمح هذا الأخير بإجراء تحليل آلي مماثل للبرنامج المستخدم هنا.
باختصار ، يتم توضيح تنفيذ بروتوكول قوي للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs البشرية ، وبالتالي التغلب على الموارد المحدودة للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة المتمايزة لمجموعة متنوعة من التطبيقات في دراسة أمراض النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية. علاوة على ذلك ، يتم تضمين مقايسة البلعمة "المؤنسنة" بالكامل ، والتي ستساعد بشكل أكبر في دراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلل الوظيفي في سياق التنمية البشرية والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون مايكل وارد على توفير خط WTC11 hNIL iPSC لتمايز الخلايا العصبية الحركية ومختبرات جاكسون لتزويد خط KOLF2.1J WT clone B03 iPSC المستخدم في تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة. كما نشكر دوروثي شافر على دعمها أثناء تنفيذ البروتوكولات ، وأنتوني جيامبيتروزي وجون لاندرز لمساعدتهم في نظام التصوير بالخلايا الحية وكذلك هايدن جاد لمساهماته الفنية أثناء المراجعات وجوناثان جونغ لتعاونه في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق دان وديان ريتشيو لعلم الأعصاب من كلية الطب UMASS Chan و Angel Fund، Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
