Human Microglia-lignende celler: Differensiering fra induserte pluripotente stamceller og in vitro levende cellefagocytoseanalyse ved bruk av humane synaptosomer
Summary
Denne protokollen beskriver differensieringsprosessen av humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs) til mikroglia-lignende celler for in vitro eksperimentering. Vi inkluderer også en detaljert prosedyre for å generere humane synaptosomer fra iPSC-avledede lavere motorneuroner som kan brukes som substrat for in vitro fagocytoseanalyser ved bruk av levende celleavbildningssystemer.
Abstract
Microglia er de bosatte immuncellene av myelogen opprinnelse som opprettholder homeostase i hjernens mikromiljø og har blitt en nøkkelspiller i flere nevrologiske sykdommer. Å studere humane mikroglia i helse og sykdom representerer en utfordring på grunn av den ekstremt begrensede tilførselen av humane celler. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) avledet fra menneskelige individer kan brukes til å omgå denne barrieren. Her er det demonstrert hvordan man skiller humane iPSCer til mikroglia-lignende celler (iMGs) for in vitro eksperimentering. Disse iMGene viser de forventede og fysiologiske egenskapene til microglia, inkludert mikroglia-lignende morfologi, uttrykk for riktige markører og aktiv fagocytose. I tillegg er dokumentasjon for isolering og merking av synaptosomsubstrater avledet fra humane iPSC-avledede lavere motorneuroner (i3LMN) gitt. En live-celle, langsgående bildeanalyse brukes til å overvåke oppslukning av humane synaptosomer merket med et pH-følsomt fargestoff, noe som muliggjør undersøkelser av iMGs fagocytiske kapasitet. Protokollene beskrevet her er bredt anvendelige for ulike felt som undersøker human microglia biologi og bidraget av microglia til sykdom.
Introduction
Microglia er de bosatte immuncellene i sentralnervesystemet (CNS) og spiller en avgjørende rolle i utviklingen av CNS. Microglia er også viktig i den voksne hjernen for å opprettholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sykdomsprosesser. Kumulative bevis viser at mikroglia er viktige bidragsytere til patogenesen av flere nevrodevelopmental og neurodegenerative sykdommer 1,2. Selv om dagens kunnskap om mikrogliabiologi hovedsakelig er avledet fra musemodeller, har nyere studier belyst viktige forskjeller mellom murine og human microglia, og understreker behovet for å utvikle teknologier for å studere genetikk og biologiske funksjoner hos humane microglia 3,4. Isolering av mikroglia fra dissekert primærvev kan alvorlig modifisere mikrogliaegenskaper5, potensielt forvirrende resultater oppnådd med slike celler. Det overordnede målet med denne metoden er å differensiere humane iPSCer i iMGs, og dermed gi et cellekultursystem for å studere human mikroglia under basale forhold. Videre er en fagocytoseanalyse ved hjelp av et fullt menneskelig modellsystem inkludert her som et middel til å studere funksjonaliteten til iMGs, både som et kvalitetskontrollmål og for å vurdere iMG-dysfunksjon i sammenheng med sykdom.
Flere protokoller for mikrogliadifferensiering fra iPSCs har nylig dukket opp i litteraturen 6,7,8,9,10. Potensielle ulemper ved noen protokoller inkluderer lengre eller lange perioder med differensiering, tillegg av flere vekstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle prosedyrer 6,9,10. Her demonstreres en “brukervennlig” differensieringsmetode som rekapitulerer aspekter av mikroglia-ontogeni gjennom differensiering av iPSC-er til forløperceller kalt primitive makrofagforløpere (PMP)7,11. PMP-er genereres som beskrevet tidligere, med noen optimaliseringer presentert her i12. PMP-ene etterligner MYB-uavhengige eggeplomme-sac-avledede makrofager, som gir opphav til mikroglia under embryonal utvikling ved å invadere hjernen før blod-hjernebarrierelukking13. For å terminalt differensiere PMP-er i iMG-er brukte vi en rask og forenklet monokulturmetode basert på protokoller av Haenseler og medarbeidere og Brownjohn et al., med noen modifikasjoner for å generere en effektiv mikrogliadifferensieringsmetode der iMG-er robust uttrykker mikrogliaberikede markører 7,8. Denne differensieringsmetoden kan reproduseres i laboratorier med kompetanse i kulturen til iPSCs og med forskningsmål som tar sikte på å studere mikrogliabiologi ved hjelp av et menneskelig modellsystem.
iPSC-avledet mikroglia representerer en biologisk relevant kilde til humane mikroglia for in vitro eksperimentering og er et viktig verktøy for å undersøke mikroglial kanoniske funksjoner, inkludert fagocytose. Microglia er de profesjonelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleavfall, aggregerte proteiner og nedbrutt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygging ved å oppsluke synapser og i forsvaret mot eksterne infeksjoner gjennom fagocytose av patogener15,16. I denne protokollen vurderes fagocytose ved iMGs ved bruk av humane synaptosomer som materiale for iMG-oppslukning. Til dette formål beskrives en beskrivelse for å isolere synaptosomer avledet fra humane i3LMNer. De i3LMN-avledede humane synaptosomene er merket med et pH-følsomt fargestoff som muliggjør kvantifisering av synaptosomer lokalisert i sure rom under fagosombehandling og nedbrytning in vitro. En fagocytoseanalyse ved bruk av levende cellemikroskopi er vist for å overvåke den dynamiske prosessen med mikroglia-oppslukning i sanntid. Denne funksjonelle analysen etablerer et grunnlag for å undersøke mulige defekter i mikroglial fagocytose i helse og sykdom ved hjelp av et komplett humant system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Differensieringsprotokollen beskrevet her gir en effektiv metode for å oppnå iPSC-avledede mikroglia-lignende celler i ~ 6-8 uker med høy renhet og i tilstrekkelig utbytte for å utføre immunfluorescenseksperimenter og andre analyser som krever et høyere antall celler. Denne protokollen har gitt opptil 1 × 106 iMGs på 1 uke, noe som muliggjør protein- og RNA-ekstraksjon og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrensning av de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Michael Ward for å gi WTC11 hNIL iPSC-linjen for motorneurondifferensiering og Jackson Laboratories for å levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen som brukes til mikrogliadifferensiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hennes støtte under implementeringen av protokollene, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjelp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisjoner og Jonathan Jung for hans samarbeid i denne studien. Dette arbeidet ble støttet av Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.
Materials
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
