Summary
Denne protokol beskriver differentieringsprocessen for humaninducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) i mikroglialignende celler til in vitro-eksperimenter . Vi inkluderer også en detaljeret procedure til generering af humane synaptosomer fra iPSC-afledte lavere motorneuroner, der kan bruges som substrat til in vitro-fagocytoseassays ved hjælp af levende cellebilleddannelsessystemer.
Abstract
Microglia er de hjemmehørende immunceller af myeloid oprindelse, der opretholder homeostase i hjernens mikromiljø og er blevet en nøglespiller i flere neurologiske sygdomme. At studere human microglia i sundhed og sygdom udgør en udfordring på grund af den ekstremt begrænsede forsyning af humane celler. Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) afledt af menneskelige individer kan bruges til at omgå denne barriere. Her demonstreres det, hvordan man differentierer humane iPSC'er til microglia-lignende celler (iMG'er) til in vitro-eksperimenter . Disse iMG'er udviser de forventede og fysiologiske egenskaber ved microglia, herunder microglia-lignende morfologi, ekspression af korrekte markører og aktiv fagocytose. Derudover tilvejebringes dokumentation for isolering og mærkning af synaptosomsubstrater afledt af humane iPSC-afledte nedre motorneuroner (i3LMN'er). Et levende celle, langsgående billeddannelsesassay bruges til at overvåge opslugning af humane synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof, hvilket muliggør undersøgelser af iMG's fagocytiske kapacitet. De protokoller, der er beskrevet heri, gælder bredt for forskellige områder, der undersøger human mikrogliabiologi og mikroglias bidrag til sygdom.
Introduction
Microglia er de hjemmehørende immunceller i centralnervesystemet (CNS) og spiller en afgørende rolle i udviklingen af CNS. Microglia er også vigtige i den voksne hjerne for at opretholde homeostase og aktivt reagere på traumer og sygdomsprocesser. Kumulative beviser viser, at microglia er vigtige bidragydere til patogenesen af flere neuroudviklingsmæssige og neurodegenerative sygdomme 1,2. Selvom den nuværende viden om mikroglialbiologi overvejende er afledt af musemodeller, har nylige undersøgelser belyst vigtige forskelle mellem murine og human microglia, hvilket understreger behovet for at udvikle teknologier til at studere genetik og biologiske funktioner i human microglia 3,4. Isolering af microglia fra dissekeret primært væv kan alvorligt ændre microglia-egenskaber5, hvilket potentielt kan forvirre resultater erhvervet med sådanne celler. Det overordnede mål med denne metode er at differentiere humane iPSC'er til iMG'er og derved tilvejebringe et cellekultursystem til at studere human microglia under basale forhold. Desuden er en fagocytoseanalyse ved hjælp af et fuldt menneskeligt modelsystem inkluderet heri som et middel til at studere funktionaliteten af iMG'er, både som en kvalitetskontrolforanstaltning og til at vurdere iMG-dysfunktion i forbindelse med sygdom.
Flere protokoller til microglia-differentiering fra iPSC'er er for nylig dukket op i litteraturen 6,7,8,9,10. Potentielle ulemper ved nogle protokoller inkluderer længere eller lange perioder med differentiering, tilføjelse af flere vækstfaktorer og / eller komplekse eksperimentelle procedurer 6,9,10. Her demonstreres en "brugervenlig" differentieringsmetode, der rekapitulerer aspekter af microglia ontogeni gennem differentiering af iPSC'er til forløberceller kaldet primitive makrofagprækursorer (PMP'er)7,11. PMP'er genereres som beskrevet tidligere, med nogle optimeringer præsenteret heri12. PMP'erne efterligner MYB-uafhængige æggeblomme-sac-afledte makrofager, som giver anledning til microglia under embryonal udvikling ved at invadere hjernen før blod-hjerne-barrierelukning13. For terminalt at differentiere PMP'er til iMG'er brugte vi en hurtig og forenklet monokulturmetode baseret på protokoller af Haenseler et al. og Brownjohn et al., med nogle ændringer for at generere en effektiv microglia-differentieringsmetode, hvor iMG'er robust udtrykker microglia-berigede markører 7,8. Denne differentieringsmetode kan gengives i laboratorier med ekspertise inden for iPSC-kulturen og med forskningsmål, der sigter mod at studere mikrogliabiologi ved hjælp af et menneskeligt modelsystem.
iPSC-afledt microglia repræsenterer en biologisk relevant kilde til human microglia til in vitro-eksperimenter og er et vigtigt redskab til at undersøge mikrogliale kanoniske funktioner, herunder fagocytose. Microglia er de professionelle fagocytter i hjernen og CNS, hvor de rydder celleaffald, aggregerede proteiner og nedbrudt myelin14. Microglia fungerer også i synaptisk ombygning ved at opsluge synapser og i forsvaret mod eksterne infektioner gennem fagocytose af patogener15,16. I denne protokol vurderes fagocytose ved iMG'er ved anvendelse af humane synaptosomer som materiale til iMG-opslugtning. Til dette formål beskrives en beskrivelse til isolering af synaptosomer afledt af human i3LMN'er. Dei 3LMN-afledte humane synaptosomer er mærket med et pH-følsomt farvestof, der muliggør kvantificering af synaptosomer lokaliseret i sure rum under fagosombehandling og nedbrydning in vitro. Et fagocytoseassay ved hjælp af levende cellemikroskopi er vist til overvågning af den dynamiske proces med microglia-opslugning i realtid. Dette funktionelle assay etablerer et grundlag for at undersøge mulige defekter i mikroglial fagocytose i sundhed og sygdom ved hjælp af et komplet humant system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle reagenser, der anvendes i denne protokol, skal være sterile, og alle trin skal udføres i et biosikkerhedsskab under sterile forhold. Alle iPSC-linjer samt vedligeholdelses- og differentieringsmedier er beskrevet i materialetabellen. Microglia-differentieringsmetoden illustreret nedenfor er baseret på tidligere offentliggjorte protokoller 7,8,12 med nye modifikationer beskrevet heri.
1. Microglia differentiering
BEMÆRK: En oversigt over protokollen er opsummeret i figur 1.
- Induceret pluripotent stamcellekultur (iPSC)
BEMÆRK: Yderligere oplysninger, der beskriver iPSC-kulturteknikker, findes andetsteds17.- Optøning og vedligeholdelse
- Der fremstilles iPSC-medium, aliquot mediet, og det opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. Optø aliquoterne natten over ved 4 °C og brug dem i op til 1 uge. Lad mediet stå ved omgivelsestemperatur i mindst 1 time før brug.
- Belæg brøndene på en 6-brønds plade ved at tilsætte 1 ml 10 μg/ml laminin 521 fortyndet i DPBS indeholdende calcium og magnesium18. Pladerne opbevares i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO 2 i mindst2 timer eller helst natten over. Når lamininen er fortyndet, opbevares den ved 4 °C i 3 måneder.
- Der fremstilles 10 mM Rhokinasehæmmer Y27632 (ROCK Inhibitor) stamopløsning ved fortynding i sterilt vand. Der fremstilles engangsprøver af ROCK-hæmmeropløsning, og dem opbevares ved -20 °C i op til 1 år.
- Der fremstilles 0,5 mM EDTA ved fortynding af stamopløsningen på 0,5 M EDTA i DPBS.
- For at optø et hætteglas med frosne iPSC'er skal hætteglasset anbringes i et vandbad ved 37 °C, indtil det for det meste er optøet. Overfør straks indholdet af hætteglasset til et 15 ml konisk rør indeholdende 4 ml iPSC-medium. Centrifuge ved 500 × g i 1 min.
- Supernatanten aspireres og cellerne resuspenderes ved at tilsætte 1 ml iPSC-medium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer langsomt mod rørets væg for at undgå forstyrrelse af kolonierne.
- Der tilsættes 1,5 ml iPSC-medium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer til hver af de belagte brønde, og de resuspenderede kolonier overføres dråbe for dråbe til de brønde, der indeholder mediet.
BEMÆRK: Brug 5-7 dråber fra trin 1.1.1.6 til kulturvedligeholdelse, men juster den optimale såtæthed for hver iPSC-linje. - Fordel cellerne jævnt i brøndene ved manuelt at blande pladen fra side til side og tilbage til fronten. Cellerne anbringes i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2. Den næste dag skal du udskifte mediet fuldstændigt ved at tilføje frisk iPSC-medium uden ROCK-hæmmer.
- Til vedligeholdelse skal du ændre mediet hver dag, indtil cellerne når 80% sammenløb.
BEMÆRK: Cellerne kan opretholdes uden at ændre mediet i 2 dage, hvis det anvendte iPSC-medium tillader en fleksibel fodringsplan. Det anbefales at begrænse dette til en gang pr. passage, og kun hvis cellerne er mindre end 50% sammenflydende.
- Opdele
- Aspirer mediet og vask cellerne med 1 ml DPBS (uden calcium og magnesium).
- For at løsne cellerne tilsættes 1 ml 0,5 mM EDTA og inkuberes i 2-3 minutter ved stuetemperatur, indtil kanterne af cellekolonierne løftes fra brøndens overflade. Vask cellerne igen med DPBS og tilsæt 1 ml iPSC-medium.
- Dissocier cellekolonierne ved forsigtigt at skrabe dem ved hjælp af en celleløfter. Skrab kun hvert område af brønden én gang for at undgå at forstyrre kolonierne.
BEMÆRK: Alternative metoder til at fjerne kolonierne fra brønden findes andre steder17. - Ved hjælp af en 1 ml pipettespids opsamles cellerne og overføres dråbe for dråbe ved et forhold på 1: 6 (celler til medium) i præcoated brønde (som nævnt i trin 1.1.1.2) indeholdende 1,5 ml iPSC-medium.
- Optøning og vedligeholdelse
- iPSC-differentiering til microglia-lignende celler (iMG'er)
BEMÆRK: De små molekyler og vækstfaktorer opløses i sterilt filtreret 0,1% bovin serumalbumin i DPBS til en stamkoncentration 1.000 gange højere end den endelige koncentration. Det anbefales at differentiere iPSC'er til iMG'er i tidlige passager. Rutinemæssig karyotyping af iPSC-linjer anbefales.- Forbered standard belægningsopløsning
- Optø stamopløsningen af et ekstracellulært matrixbelægningsreagens på is ved 4 °C natten over.
- Prechill mikrocentrifugerør og filterpipettespidser ved 4 °C.
- Aliquot 250 μL af det koncentrerede ekstracellulære matrixbelægningsreagens i hvert rør og anbringes straks på is. Aliquoterne opbevares ved -20 °C.
- For at forberede belægningsopløsningen optøes en af de ekstracellulære matrixbelægningsreagensaliquoter på is ved 4 °C natten over.
- Tilsæt 50 ml iskold DMEM-F12 optimeret til vækst af humane embryonale og inducerede pluripotente stamceller (kaldet DMEM-F12) medier til et forkølet konisk rør og hold det på is.
- En 1 ml pipettespids afkøles ved at pipettere iskold DMEM-F12 op og ned flere gange, og brug derefter straks pipettespidsen til at overføre 250 μL af det ekstracellulære matrixbelægningsreagens til det koniske rør, der indeholder DMEM-F12-mediet.
BEMÆRK: Standardbelægningsopløsningen kan opbevares i 2 uger ved 4 °C.
- Embryoid krop (EB) dannelse
- Forbered EB-medium , der kan opretholdes ved 4 °C i op til 4 dage.
- Når iPSC'erne har nået 80 % sammenløb, adskilles kolonierne ved at vaske med 1 ml DPBS og tilsætte 1 ml dissociationsreagens i 2 minutter ved 37 °C. Fjern kolonierne ved hjælp af en celleløfter ved at skrabe flere gange for at skabe en enkeltcellesuspension. Saml cellerne og overfør alt til et 15 ml konisk rør indeholdende 9 ml DPBS.
- Centrifuger cellerne ved 500 × g i 1 min., fjern supernatanten, og suspender cellerne i 1 ml EB-medium. Tag 10 μL celler og fortynd 1:1 med Trypan blå. Tæl cellerne med et hæmacytometer, og baseret på celletallet fortyndes cellestammen til en endelig fortynding på 10.000 celler pr. 100 μL. Til plettering af celler tilsættes 100 μL af de fortyndede celler pr. Brønd til en lav vedhæftning, rundbundet, 96-brøndsplade.
BEMÆRK: Generelt kan 48 brønde af 96-brøndpladen fås fra hver 80% sammenflydende brønd af iPSC'er. - Pladen centrifugeres ved 125 × g i 3 minutter og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 4 dage. Udfør en halvmellemlang ændring på dag 2 ved hjælp af en flerkanalspipette og forsigtigt at samle 50 μL gammelt medium og derefter tilføje 50 μL frisk EB-medium igen.
BEMÆRK: På dag 4 vil iPSC'er danne sfæriske cellulære strukturer kaldet EB'er som beskrevet i resultatafsnittet. EB-differentieringsprocessen kan forlænges op til 7 dage, hvis det er nødvendigt.
- Generering af primitive makrofagprækursorer (PMP'er)
- Forbered PMP-basismedium, sterilt filter, og opbevar det ved 4 °C i op til 1 måned.
- Overtræk brøndene på en 6-brønds plade ved at tilsætte 1 ml iskold Matrigel-belægningsopløsning og inkuberes ved 37 °C og 5% CO 2 i mindst2 timer eller helst natten over.
- På dag 4 af EB-differentiering overføres EB'erne til de Matrigel-belagte brønde ved at samle EB'erne med 1 ml pipettespidser (ved hjælp af en pipette). Pipeten op og ned en eller to gange for at løsne EB'erne fra brønden. Hold 6-brøndspladen i en skrå vinkel, så EB'erne kan slå sig ned ved kanten af brønden.
BEMÆRK: Ni eller ti EB'er kan belægges pr. Belagt brønd. - Når alle EB'erne er faldet til ro, pipetteres forsigtigt og fjernes det gamle medium ved hjælp af en 1 ml pipettespids, mens EB'erne holdes ved kanten af brønden. Tilsæt 3 ml frisklavet PMP komplet medium til hver brønd. Fordel cellerne jævnt i brøndene ved manuelt at blande pladen fra side til side og tilbage til fronten. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Forstyr ikke pladen i 7 dage for at lade EB'erne fastgøre til bunden af brønden. Efter den tid skal du udføre en halv-medium ændring ved hjælp af PMP komplet medium.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal de fleste EB'er fastgøres til pladen. Eventuelle flydende EB'er kan fjernes. - Efter 5-7 dage inspiceres EB'erne under et lysfeltmikroskop ved 4x forstørrelse for at sikre, at de er fastgjort til bunden af brøndene. Mediet ændres som beskrevet i punkt 1.2.3.5. På dag 21 skal du udføre en komplet mellemændring med 3 ml PMP komplet medium.
BEMÆRK: Myeloide forfædre, der flyder i mediet, kan være tydelige på dette tidspunkt. Disse celler skal kasseres under medieændringen. - På dag 28 skal du kigge efter runde celler kaldet PMP'er i supernatanten og samle mediet, der indeholder PMP'erne, ved hjælp af en 10 ml pipette og automatisk pipettor. Pas på ikke at forstyrre EB'erne. PMP'erne og mediet overføres til et konisk 15 ml konisk rør, og der fortsættes som beskrevet i trin 1.2.4.
BEMÆRK: Normalt kan PMP'er fra den samme iPSC-linje opsamles fra fem brønde i en 6-brønds plade og samles i et enkelt 15 ml konisk rør. - Tilsæt 3 ml frisk PMP komplet medium til yderligere vedligeholdelse af EB'erne. Da PMP'er kontinuerligt kommer ud af EB'er i mere end 3 måneder, skal du indsamle dem hver 4-7 dage (lad ikke mediet skifte farve til en gul tone) som beskrevet i trin 1.2.3.7 og 1.2.3.8.
BEMÆRK: Selvom PMP'er kan indsamles i flere måneder, kan de ændre deres fænotype over tid.
- Differentiering til iMG'er
- Der fremstilles iMG-basismedium (materialetabel), sterilt filter, og det opbevares ved 4 °C i op til 3 uger.
- Når PMP'erne er blevet samlet i et 15 ml konisk rør, centrifugeres de ved 200 × g i 4 minutter. Supernatanten aspireres, og PMP'erne resuspenderes ved hjælp af 1-2 ml iMG basalmedium. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer ved at tage en lille aliquot og fortynde 1: 1 med Trypan blå.
BEMÆRK: 0,5-1,5 × 106 PMP'er opnås normalt hver uge afhængigt af iPSC-linjen og EB-kulturens alder. - Centrifuger resten af cellerne igen ved 200 × g i 4 min. Fortynd PMP'erne til den ønskede koncentration, således at cellerne belægges med en densitet på ~ 105 / cm2 på cellekulturbehandlede plader ved hjælp af frisklavet iMG komplet medium. Udfør en halv-medium ændring ved hjælp af frisklavet iMG komplet medium hver 3-4 dage i løbet af 10-12 dage for at muliggøre terminal differentiering.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skal cellerne erhverve mikroglia-lignende morfologi. For at bekræfte PMP'ernes engagement i microglia-skæbnen udføres immunfluorescensanalyse for at bekræfte ekspressionen af mikroglia-berigede markører såsom purinerg receptor P2RY12 og transmembranprotein 119 (TMEM119)9. - For at bevare cellens sundhed og levedygtighed skal du udføre alle eksperimenterne mellem dag 10 og 12 i iMG-differentiering.
- Forbered standard belægningsopløsning
2. Fagocytose-assay ved anvendelse af motor-neuron-afledte humane synaptosomer
- Transkriptionsfaktormedieret differentiering af iPSC-afledte nedre motorneuroner (i3LMN'er)
BEMÆRK: En WTC11-linje med stabil indsættelse af hNIL-inducerbar transkriptionsfaktorkassette indeholdende neurogenin-2 (NGN2), ø-1 (ISL1) og LIM-homeobox 3 (LHX3) transkriptionsfaktorer i CLYBL safe harbor-locus blev brugt til differentieringsprocessen som beskrevet tidligere17. iPSC-linjen blev vedligeholdt som beskrevet i trin 1.1.1, men med de belægningsbetingelser, der er beskrevet i trin 1.2.1. Ethvert ekstracellulært matrixbelægningsreagens kan bruges til dyrkning af iPSC'er, der vil blive brugt til neuronal differentiering, da laminin 521 ikke er påkrævet. Alle medier er ækvilibreret til omgivelsestemperaturen i mindst 1 time før brug.- Overtræk 10 cm skåle med 5 ml standardbelægningsopløsning som beskrevet i trin 1.2.1.
BEMÆRK: Her blev der brugt 3-4 10 cm skåle pr. Differentiering. - Forbered induktionsbasemedium, sterilt filter, og opbevar det ved 4 °C i op til 3 uger.
- Forbered Neuron medium, sterilt filter, og opbevar det ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Forbered boratbuffer ved at blande 100 mM borsyre, 25 mM natriumtetraborat og 75 mM natriumchlorid i sterilt vand. Juster pH til 8,5 og sterilfiltrer den.
- Når iPSC'er har nået 80% sammenløb, vaskes cellerne med DPBS og kolonierne fjernes ved at tilføje 0,5 mM EDTA.
BEMÆRK: To brønde er normalt tilstrækkelige til hver 10 cm skål. - Inkuber cellerne i 4-5 minutter ved omgivelsestemperatur. Fjern EDTA, og tilføj 3 ml DMEM/F12 med HEPES til hver brønd.
- Skrab cellerne ved hjælp af en celleløfter og brug en 10 ml pipette til at fjerne cellerne fra bunden af brønden ved forsigtigt at pipettere op og ned 2-3x.
- Saml cellerne i et 15 ml konisk rør og centrifuger ved 300 × g i 3 min.
- Resuspender cellerne i 3 ml iPSC-medium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer, og tæl dem ved hjælp af et hæmacytometer.
- Plade 1,5 × 106 iPSC'er i et overtrukket 10 cm fad med 12 ml iPSC-medium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer.
- Den næste dag skal du fjerne mediet og vaske cellerne med DPBS. Tilsæt 12 ml frisklavet komplet induktionsmedium for at inducere ekspressionen af transkriptionsfaktorerne.
- På dag 2 skal du belægge 10 cm skåle med 5 ml neuronbelægningsopløsning fremstillet med lige store mængder 0,1 mg / ml poly-D-lysin og 1 mg / ml poly-L-ornithin fortyndet i boratbuffer. Inkuberes natten over ved 37 °C og 5 % CO2.
- På dag 3 vaskes de overtrukne tallerkener med sterilt vand 3x, opsuges vandet helt, og lad opvasken tørre ved at vippe pladerne og lade dem være delvist afdækket inde i et biosikkerhedsskab i mindst 1 time ved omgivelsestemperatur.
- Når opvasken er tørret helt, skal du belægge dem med 6 ml komplet induktionsmedium suppleret med 15 μg/ml laminin og 40 μM BrdU i mindst 1 time ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: BrdU-behandling anbefales at eliminere mitotisk aktive celler og dermed forbedre renheden af neuronale kulturer. Virkningerne af BrdU på neuronal sundhed er minimale. - Behandl de differentierende celler med 3 ml dissociationsreagens pr. 10 cm skål og inkuber i 3-4 minutter ved omgivelsestemperatur.
- Tilsæt 6 ml DPBS i pladen uden at fjerne dissociationsreagenset og pipetter cellerne i opløsning op og ned 4-5x med en 10 ml pipette for at adskille cellerne.
- Opsamling cellesuspensionen og før den gennem en 40 μm cellesi ind i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 1 ml induktionsbasismedium for at skylle silen.
- Centrifuger cellerne ved 300 × g i 5 min. Mediet aspireres, og cellerne resuspenderes i 3 ml komplet induktionsmedium indeholdende 40 μM BrdU.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer. Der anbringes ca. 2,5 × 106 celler pr. 10 cm skål i forbelagte fade ved at fortynde cellerne i 6 ml komplet induktionsmedium indeholdende 40 μM BrdU uden at fjerne belægningsopløsningen tilsat i trin 2.1.14.
- På dag 4 skal du opsuge mediet, vaske cellerne 1x med DPBS og tilsæt frisk komplet induktionsmedium indeholdende 40 μM BrdU.
- På dag 6 aspireres mediet, cellerne vaskes 1x med DPBS, og neuronmedium tilsættes suppleret med 1 μg / ml laminin.
- På dag 9 ændres 1/3rd af mediet ved at erstatte det med frisk Neuron medium suppleret med 1 μg / ml laminin.
- Vedligeholdi3 LMN'er i yderligere 25 dage ved at udføre halve mellemstore ændringer med Neuron-medium suppleret med frisk 1 μg / ml laminin hver 3-4 dage.
BEMÆRK: På dette tidspunkt skali 3LMN'er præsentere en neuronal morfologi med lange processer. Neuroner har også en tendens til at danne klumper eller klynger af celler. En mere detaljeret beskrivelse af, hvordan differentieringen af i3LMN'er kan findes andre steder17.
- Overtræk 10 cm skåle med 5 ml standardbelægningsopløsning som beskrevet i trin 1.2.1.
- Synaptosom rensning og mærkning
BEMÆRK: Oprethold sterile forhold og udfør alle trin inde i et biosikkerhedsskab.- Vask i3 LMN'er to gange med DPBS.
- Tilsæt 2 ml iskoldcellelysereagenser til isolering af synaptosomer, inkuber på is i 2 minutter og skrab neuronerne fast.
- Lysatet overføres til flere 2 ml mikrorør (~ 1,5 ml lysat pr. Rør) og centrifugeres ved 1.200 × g i 10 minutter ved 4 ° C.
BEMÆRK: Vedligehold rørene på is under hele denne procedure. - Supernatanten opsamles (pelleten kasseres), og centrifugeres ved 15.000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Gem og suspender pelleten indeholdende synaptosomerne med et lignende volumen (som det originale lysat) på 5% DMSO i DPBS.
BEMÆRK: Synaptosomerne kan straks mærkes med en fluorophore eller opbevares ved -80 ° C til fremtidig brug. - Udfør et bicinchoninsyre (BCA) proteinassay for alle rør for at vurdere det samlede udbytte af protein i synaptosompræparatet.
BEMÆRK: Andre assays til måling af proteinkoncentration kan anvendes. Det samlede proteinudbytte fra forskellige præparater er medtaget i tabel 1 som reference. Det anbefales at udføre western blot-analyse af synaptosompræparatet for at bekræfte tilstedeværelsen af præsynaptiske og postsynaptiske proteiner. Her blev den presynaptiske markør, synaptophysin (SYP), og den postsynaptiske markør, postsynaptisk tæthedsprotein 95 (PSD95) valgt til western blotting-analyse som beskrevet tidligere19. - Forbered en opløsning af 100 mM natriumbicarbonat i vand, juster pH til 8,5 og sterilt filter.
- Oplevér 1 mg frysetørret pulver af det anvendte pH-følsomme farvestof i 150 μL DMSO. Lav engangsalikvoter, og opbevar dem ved -80 °C.
- Synaptosomerne centrifugeres ved 15.000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fortynd op til 1 mg synaptosomer i 100 μL 100 mM natriumbicarbonatopløsning.
- For at mærke synaptosomerne tilsættes 1 μL af det rekonstituerede pH-følsomme farvestof pr. 1 mg synaptosomer og dækker reaktionen med aluminiumsfolie for at undgå lyseksponering. Ryst ved stuetemperatur i 2 timer ved hjælp af en rørryster.
- Der tilsættes 1 ml DPBS til røret, og de mærkede synaptosomer centrifugeres ved 15.000 × g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes, og der udføres yderligere fire vaske som beskrevet i trin 2.2.11.
- Efter den sidste vask og centrifugering fjernes supernatanten så meget som muligt uden at forstyrre pelleten, og de mærkede synaptosomer med 5% DMSO i DPBS gensuspenderes ved et volumen for den ønskede koncentration (0,7 μg / μL anvendes her). Der fremstilles alikvoter til engangsbrug, og opbevares ved -80 °C. Sørg for at undgå lyseksponering for de mærkede synaptosomer.
- Levende celle fagocytose assay
- Plade 20-30 × 10 4 PMP'er i 96-brøndsplader i 100 μL iMG komplet medium og følg differentieringsprocessen i 10 dage som angivet i trin 1.2.4.
- På dagen for analysen skal du forberede den nukleare farvningsopløsning ved at tilføje 1 dråbe af en nuklear plet til levende celler i 2 ml iMG basalmedium.
- Fjern 40 μL medium pr. brønd af 96-brøndspladen, og tilsæt 10 μL af kernefarvningsopløsningen ved hjælp af en flerkanalspipette. Pladen inkuberes ved 37 °C og 5 % CO 2 i2 timer.
- Tø de mærkede synaptosomer op på is og soniker forsigtigt ved hjælp af en vandsonikator i 1 min. Overfør straks synaptosomerne tilbage til is. Fortynd de mærkede synaptosomer i iMG komplet medium i et forhold på 1 μL synaptosomer pr. 50 μL medium.
BEMÆRK: Koncentrationen af synaptosomet er analyseafhængig og kan kræve optimering. For at opretholde en relativt lav procentdel (dvs. 0,1% eller mindre) DMSO i mediet anbefales det ikke at tilføje mere end 2 μL synaptosomer pr. Brønd. - Som negativ kontrol forbehandles nogle af brøndene med cytochalasin D for at hæmme actinpolymerisation og dermed fagocytose. Forbered en opløsning af 60 μM cytochalasin D i iMG komplet medium. Der tilsættes 10 μL af denne opløsning til hver brønd for en endelig koncentration på 10 μM og inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min.
- Fjern pladen fra inkubatoren, og inkuber ved 10 °C i 10 min. Pladen holdes på is, og der tilsættes 50 μL medium indeholdende synaptosomer fremstillet som beskrevet i trin 2.3.4.
- Centrifuger pladen ved 270 × g i 3 minutter ved 10 °C, og hold pladen på is, indtil billeddannelsen er optaget.
- Anskaffelse og analyse af billedbehandling
- Indsæt pladen i en levende cellebilledlæser, og vælg de brønde, der skal analyseres.
- Vælg et objektiv på 20x .
- Juster fokus, lysdiode (LED) intensitet, integrationstid og forstærkning af brightfield og blå (4',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]) kanaler. Synaptosomfluorescensen skal være ubetydelig på det oprindelige tidspunkt. Hvis du vil fokusere på den røde (RFP) kanal, skal du bruge brightfieldkanalen som reference. Integrationstiden og gevinsten kan variere mellem eksperimenter; brug disse indledende indstillinger for den røde kanal: LED: 4, integrationstid: 250 og forstærkning: 5.
- Vælg antallet af individuelle fliser, der skal erhverves i en montage pr. brønd (anskaf 16 fliser i midten af brønden, hvorved ca. 5% af det samlede brøndareal billeddannes). Indstil temperaturen til 37 °C og det ønskede tidsinterval for billeddannelse.
BEMÆRK: Billeder blev erhvervet hver 1 - 2 timer i op til 16 timer i denne undersøgelse. - Åbn analysesoftwaren.
- Åbn det eksperiment, der indeholder billederne. Klik på ikonet Datareduktion.
- I menuen skal du vælge Billedsyning under Billedbehandlingsbehandling for at oprette et komplet billede fra de 4 x 4 individuelle felter i montagen med de parametre, der er beskrevet i tabel 2.
- Når de syede billeder er oprettet, skal du definere en intensitetstærskel ved hjælp af DAPI- og RFP-kanalerne for disse billeder. Åbn et billede, og klik på Analyser; Vælg Mobilanalyse under Analyse, og vælg et syet billede enten i DAPI- eller RFP-kanalerne under Analyse, og vælg et syet billede enten i DAPI- eller RFP-kanalerne. Gå til fanen Primær maske og antal, og opret en tærskelværdi og objektstørrelsesværdier, der korrekt markerer cellekernerne i DAPI-kanalen eller synaptosomsignalet i RFP-kanalen. Gentag processen med forskellige billeder, indtil parametre, der kan anvendes på hele eksperimentet, er optimeret.
BEMÆRK: Foreslåede værdier findes i tabel 2. - Hvis du vil tælle antallet af kerner, skal du gå til menuen Datareduktion og vælge Mobilanalyse under Billedanalyse. Gå til fanen Primærmaske og antal, og vælg de DAPI-syede billeder under Kanal, og brug de parametre, der er beskrevet i tabel 2.
- Gå til fanen Beregnede målepunkter, og vælg Celleantal. For at få området for synaptosomsignalet skal du gå til menuen Datareduktion og vælge Cellulær analyse under Analyse.
- Gå til fanen Primær maske og tæl, og vælg RFP-syede billeder under Kanal, og brug de parametre, der er beskrevet i tabel 2.
- Gå til fanen Beregnede målepunkter, og vælg Objektsumområde. I fanen Datareduktion skal du klikke på OK og lade softwaren analysere alle de erhvervede billeder.
- Eksportér værdierne Objektsumområde og Celleantal for hvert tidspunkt. Opdel objektsumområdet med celletællingen for at beregne det normaliserede område pr. tidspunkt. Hvis du sammenligner flere behandlinger eller genotyper, beregnes fagocytoseindekset ved hjælp af ligning (1):
(1) - Gem resultaterne, og integrer dataene.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at generere iMG'er ved hjælp af denne protokol er det vigtigt at starte med udifferentierede iPSC'er, der viser kompakt kolonimorfologi med veldefinerede kanter (figur 2A). Dissocierede iPSC'er, der opretholdes som beskrevet i EB-dannelsesafsnittet, vil danne sfæriske aggregater, kaldet EB'er, som vil vokse i størrelse indtil dag 4 af differentiering (figur 2B). Når EB'erne er indsamlet og belagt under de rette betingelser for PMP-generering, fastgøres de til de Matrigel-belagte plader, og et lag af celler spredes og omgiver de sfæriske aggregater (figur 2C). Usunde EB'er løsner sig fra pladen og bør elimineres. Fra dag 14 til 21 af PMP-generationen kan potentielt forskellige celletyper dukke op og flyde i mediet; Disse celler skal kasseres under medieskift12. På dag 28 vises runde celler med et stort cytoplasma-til-kerne-forhold i suspension (figur 2D), kaldet PMP'er. Disse celler produceres kontinuerligt og kan høstes ugentligt under mellemstore ændringer i op til 3 måneder. Antallet af PMP'er, der høstes hver uge, varierer og afhænger af iPSC-linjen og kulturens alder; Udbyttet falder generelt med tiden. Det anbefales kraftigt at dyrke iPSC'er i laminin 521-overtrukne plader i stedet for Matrigel, da PMP-udbyttet er højere, når iPSC'er opretholdes under de tidligere forhold som rapporteret tidligere og i denne undersøgelse (figur 2E)18.
Efter at PMP'er har været udsat for iMG-medium i 10-12 dage, erhverver cellerne en microglia-lignende morfologi med en lille cytoplasma og tilstedeværelsen af aflange processer (figur 3A). For at verificere microglia-identitet udførte vi immunfluorescensfarvning med antistoffer mod den myeloide markørioniserede calciumbindende adaptermolekyle 1 (IBA1) og de mikroglia-berigede markører purinerg receptor P2RY12 og transmembranprotein 119 (TMEM119) som beskrevet tidligere20 (se også materialetabellen). Typisk udtrykker >95% af cellerne IBA1, og ca. 90% af cellerne udtrykker P2RY12 og TMEM119 (figur 3B).
For at vurdere iMG'ernes fagocytiske kapacitet blev der anvendt3LMN-afledte humane synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof. For at verificere, at synaptosompræparatet bevarer kanoniske strukturelle egenskaber, blev berigelsen af den præsynaptiske markør, synaptophysin (SYP) og den postsynaptiske markør, postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD95)19 bekræftet ved Western blot-analyse (figur 4) udført som beskrevet før20 (se også materialetabellen ). Synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof bliver fluorescerende efter at være blevet opslugt af iMG'er, og når de er lokaliseret i intracellulære sure (dvs. lav pH) rum.
På det oprindelige tidspunkt var det røde fluorescerende signal minimalt, da de fleste synaptosomer endnu ikke var fagocytoseret. Efter 30 minutter blev et rødt fluorescerende signal detekteret og øget yderligere over tid. Ved 10 timer var det røde fluorescerende signal robust, da de fleste synaptosomer var blevet opslugt og var lokaliseret til sure intracellulære rum via fagocytoseprocessen (figur 5A). Cytochalasin D er en actinpolymerisationsinhibitor, der i vid udstrækning anvendes til at blokere fagocytose. Som forventet observerede vi en stærk reduktion af det røde fluorescerende signal i cytochalasin D-behandlede iMG'er, hvilket indikerer, at det detekterede signal skyldes fagocytiske hændelser. Vi bemærkede også, at iMG'er viser ændringer i morfologi efter 10 timers fagocytose, der ikke blev påvist i cytochalasin D-behandlede iMG'er, muligvis på grund af manglen på actin-ombygning i cytochalasin D-behandlede iMG'er. Ændringer i microglia-morfologi er normalt forbundet med aktiveringsstatus2.
Ved at bruge den beskrevne automatiserede kvantificeringsmetode målte vi det samlede areal af rødt signal på hvert tidspunkt og normaliserede det til cellenummeret opnået ved at tælle kernerne. Resultaterne indikerer, at området med opslugte synaptosomer steg med tiden, indtil et plateau blev nået ved 16 timer. Som forventet steg området med rødt signal fra cytochalasin D-behandlede celler ikke med tiden, da fagocytose blev hæmmet (figur 5B). Tilsammen indikerer disse resultater, at iMG'er er i stand til fagocytoserende hjernesygdomsrelevant materiale og er egnede til funktionelle undersøgelser.
Figur 1: Skematisk for protokollen til differentiering af iPSC'er til microglia-lignende celler. På dag 0, når iPSC'er har nået 80% sammenløb, adskilles kolonierne i enkeltceller og dyrkes i EB-medium for at inducere EB-dannelse. På dag 4 indsamles og belægges EB'er i PMP-medium for at inducere PMP-generering. Efter 28 dage indsamles PMP'er og differentieres terminalt til iMG'er ved hjælp af iMG-medium. PMP'er kan indsamles ugentligt i op til 3 måneder. Forkortelser: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller; iMG'er = microglia-lignende celler; EB = embryoid krop; PMP = primitiv makrofag forløber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Cellemorfologi vurderet ved lysmikroskopi i differentieringsstadierne fra iPSC'er til PMP'er. (B) En embryoid krop efter 4 dages differentiering i EB-medium. C) EB'er fastgjort til coatede plader og D) PMP'er, der opstår i suspension fra EB'er efter 28 dages dyrkning i PMP-medium. (E) Antal PMP'er indsamlet fra ~48 EB'er i uge 1 (efter 28 dages PMP-differentiering) og uge 12. Søjlediagrammer viser gennemsnittet af seks uafhængige differentieringer (datapunkter) fra to forskellige iPSC-linjer. Statistikker blev opnået ved tovejs ANOVA og Šídáks multiple sammenligningstest. Skalabjælker = 1.000 μm (A), 400 μm (B-D). Forkortelser: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller; iMG'er = microglia-lignende celler; EB = embryoid krop; PMP = primitiv makrofag forløber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: IMG'er, der er differentieret ved denne protokol, viser ægte microglia-egenskaber efter 10 dages terminaldifferentiering. (A) Repræsentativt brightfield-billede af iMG'er, der præsenterer mikroglia-lignende morfologi. Skala bar = 400 μm. (B) Repræsentative immunfluorescensbilleder af iMG'er, der udtrykker myeloid/microglia-markørerne IBA1, P2RY12 og TMEM119. Skalastænger = 400 μm (A), 50 μm (B). Forkortelser: iMG'er = microglia-lignende celler; IBA1 = ioniseret calciumbindende adaptermolekyle 1; P2RY12 = purinerg receptor P2RY12; TMEM119 = transmembranprotein 119; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: i3LMN-afledte humane synaptosomer udtrykte synaptiske markører ved western blot-analyse. Repræsentativ western blot-analyse af et humant synaptosompræparat afledt afi 3LMN efter 28 dages dyrkning undersøgt med den postsynaptiske markør, PSD95, den præsynaptiske markør, SYP og β-tubulin. Forkortelser: i3LMN = iPSC-afledte nedre motorneuroner; PSD95 = postsynaptisk densitet protein 95; SYP = synaptophysin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Fagocytoseassay af iMG'er ved hjælp af humane synaptosomer mærket med et pH-følsomt farvestof og overvåget af levende celle-, langsgående billeddannelse. (A) Repræsentative lysfelt- og fluorescensmontager af iMG'er med nuklear farvning (blå kanal) udsat for mærkede humane synaptosomer (rød kanal) med og uden cytoD-behandling på de angivne tidspunkter. Montagerne blev skabt ved efterbehandling af 16 fliser erhvervet ved 20x. Skalastænger = 400 μm. (B) Kvantificering af arealet af synaptosomfluorescerende signal normaliseret til cellenummeret. Datapunkter angiver den gennemsnitlige ± SEM for tre tekniske replikater. Hver kurve viser kvantificeringen for to uafhængige differentieringer (iMG'er 1 og 2) fra en iPSC-linje med og uden cytoD-behandling. Forkortelser: iMG'er = microglia-lignende celler; cytoD = cytochalasin D. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antal 10 cm retter DIF28 i3LMN | Total protein (μg) |
| 2 | 143.2 |
| 2 | 34.9 |
| 5 | 613.8 |
| 7 | 1,159 |
Tabel 1: Samlet proteinudbytte efter synaptosomisolering fra iPSC-afledte lavere motorneuroner ved 28 dages differentiering. Samlet proteinmængde opnået fra fire uafhængige differentieringer efter synaptosomer blev ekstraheret. Forskellige antal 10 cm retter indeholdende i3LMN blev høstet i hver differentiering. Proteinudbyttet blev målt ved BCA-proteinassay. Forkortelser: iPSC'er = inducerede pluripotente stamceller; i3LMN = iPSC-afledte nedre motorneuroner; DIF28 = 28 dages differentiering; BCA = bicinchonininsyre.
| Parametre | Værdi |
| Tilmeldingskanal | Lyst felt, DAPI og RFP |
| Fusion metode | Lineær blanding |
| Beskær syet billede for at fjerne sorte rektangler på kanterne | Kontrolleret |
| Downsize endelige billede | Kontrolleret |
| Parametre | Værdi |
| Tærskel | Bestemt af bruger |
| Baggrund | Mørk |
| Opdele berøringsobjekter | Kontrolleret |
| Fyld huller i masker | Kontrolleret |
| Min. objektets størrelse | 7 μm |
| Maks. objektstørrelse | 30 μm |
| Medtag primære kantobjekter | Kontrolleret |
| Analyser hele billedet | Kontrolleret |
| Parametre | Værdi |
| Tærskel | Bestemt af bruger |
| Baggrund | Mørk |
| Opdele berøringsobjekter | Kontrolleret |
| Fyld huller i masker | Kontrolleret |
| Min. objektets størrelse | 5 μm |
| Maks. objektstørrelse | 100 μm |
| Medtag primære kantobjekter | Kontrolleret |
| Analyser hele billedet | Kontrolleret |
Tabel 2: Parametre, der anvendes til billedindsamling og dataanalyse. Foreslåede parametre, der skal overvejes til billeddannelsesoptagelse under fagocytoseanalysen og til analyse af de erhvervede billeder, er angivet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Differentieringsprotokollen beskrevet her giver en effektiv metode til at opnå iPSC-afledte microglia-lignende celler i ~ 6-8 uger med høj renhed og i et tilstrækkeligt udbytte til at udføre immunfluorescensforsøg og andre assays, der kræver et højere antal celler. Denne protokol har givet op til 1 × 106 iMG'er på 1 uge, hvilket giver mulighed for protein- og RNA-ekstraktion og tilsvarende nedstrømsanalyser (f.eks. RNASeq, qRT-PCR, western blot, massespektrometri). Når det er sagt, er en begrænsning af denne protokol, at udbyttet af iMG'er kan begrænse visse applikationer. Yderligere ændringer kan implementeres for at akkumulere PMP'er fra forskellige uger og opretholde en homogen kultur i suspension, indtil der er indsamlet nok forfædre til at fortsætte med differentieringsprocessen på én gang18. Alternativt kan differentieringen af EB'er opskaleres ved at bruge cellekulturplader med højere areal for at øge produktionen af PMP'er.
Det anbefales at bruge iPSC'er dyrket i laminin 521-belagte plader for at starte differentieringsprocessen. Andre belægningsreagenser kan reducere antallet af PMP'er, der produceres senere i processen18. På samme måde forbedrer belægning af pladerne til EB-vedhæftning under PMP-generering EB-vedhæftning og forlænger dermed kulturens levetid. EB-kulturen er blevet opretholdt i op til 4 måneder, hvorefter flere EB'er løsnes og dør. Andre forskere rapporterer dog, at de dyrker EB'er i op til 1 år12. I vores hænder opretholder iMG'er genereret fra 3 måneder gamle EB-kulturer lignende funktionelle egenskaber som iMG'er, der adskiller sig fra unge kulturer; Kulturer ældre end 3 måneder er ikke blevet brugt til funktionelle eksperimenter.
For at optimere den sidste fase af microglia-differentiering fra de oprindelige protokoller beskrevet ovenfor 7,8 inkluderede vi 100 ng / ml interleukin (IL) -34,7 5 ng / ml kolonistimuleringsfaktor 1 (M-CSF) 10 og 50 ng / ml transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) i iMG-mediet. IL-34 og M-CSF stimulerer CSF1-receptorafhængige veje, der er afgørende for at opretholde microglia-skæbne og overlevelse8, mens TGF-β understøtter microglia homeostase9 og dermed fremmer et mere fysiologisk miljø for PMP-engagement i microglia-skæbne. Bemærk, at hele differentieringsprocessen beskrevet her udføres under serumfrie forhold, hvilket forhindrer mulige virkninger af serum på iMG-adfærd og ændringer i downstream-applikationer. Til funktionelle eksperimenter med iMG'er anbefales det at udføre eksperimenter mellem 10 og 12 dages terminal differentiering. iMG'er er blevet dyrket i op til 14 dage med en beskeden reduktion af cellelevedygtighed, hvorefter cellesundheden er signifikant kompromitteret.
Da en af de kanoniske funktioner i microglia er fagocytose, blev et assay til undersøgelse af fagocytisk aktivitet in vitro inkluderet i denne protokol. For at udvikle et human-cellebaseret system blev synaptosomer afledt af human i3LMN'er anvendt. Kvaliteten af synaptosompræparatet blev vurderet ved western blot-analyse af synaptiske markører i denne undersøgelse. Derudover kan andre strukturelle og funktionelle egenskaber ved synaptosompræparatet undersøges ved elektronmikroskopi eller immunostaining før fagocytoseassayet. Protokollen beskrevet her for at opnå humane synaptosomer er stærkt afhængig afi 3LMN'er, som giver et relativt højt antal neuroner. Imidlertid vil neuronale udbytter sandsynligvis være lavere, når der anvendes andre differentieringsmetoder (dvs. protokoller, der kræver cocktails af små molekyler). Især kan fagocytoseassayet udføres med flere andre substrater såsom musehjerneafledte synaptosomer, aggregerede proteiner eller døde celler, som alle kan mærkes med pH-følsomme farvestoffer for at overvåge fagocytose på en lignende måde. Det foreslås at anvende pH-følsomme farvestoffer, fordi fluorescerende signal hovedsageligt udsendes, når synaptosomerne lokaliseres i syrerum under fagosombehandling og nedbrydning i lysosomerne21. Denne egenskab reducerer baggrundssignalet fra synaptosomer uden for cellerne og letter brugen af automatiserede kvantificeringsmetoder. Derudover giver pH-følsomme farvestoffer mulighed for påvisning af ægte fagocytosehændelser i modsætning til substratadhærens eller docking på cellemembranen.
Mens det heri foreslås at bruge ~ 35 μg synaptosomer pr. Brønd, bør den specifikke mængde humane synaptosomer og andre substrater optimeres, da optimale forhold afhænger af iPSC-linjen og de eksperimentelle betingelser. Et ideelt udvalg af synaptosomer bør resultere i et dosis-respons i fagocytose-assayet. For mange synaptosomer kan mætte systemet, hvilket gør det vanskeligt at opdage meningsfulde forskelle som en funktion af genotype eller behandlingsgruppe. For lidt materiale vil resultere i et svagt udgangssignal i analysen. Af denne grund anbefales det at teste flere koncentrationer af hvert substrat for at etablere et arbejdsassay. Derudover er det vigtigt at opretholde % DMSO inden for et sikkert interval for at bevare cellens sundhed.
I denne protokol blev fagocytose overvåget ved hjælp af et levende cellebilleddannelsessystem (Materialetabel), fordi det giver kinetisk information om cellernes opslugningskapacitet. Mikroskoper og billeddannelsessystemer, der kan understøtte levende cellebilleddannelse og opretholde stabil temperatur, fugtighed og CO2 -koncentrationer, er også velegnede til dette assay. Alle de fagocytoseforsøg, der er beskrevet her, blev afbildet ved 37 °C med 85%-95% fugtighed og 5% CO2. Andre detektionsmetoder såsom billeddannelse af faste celler eller flowcytometri kan også bruges til at vurdere fagocytose ved hjælp af de samme materialer og cellekulturprotokoller (op til og med generering af iMG'er og mærkede synptosomer), når levende cellebilleddannelse ikke er mulig eller ønsket. På samme måde kan anden open source-software bruges til dataanalyse såsom ImageJ eller CellProfiler; Sidstnævnte vil give mulighed for en automatiseret analyse, der kan sammenlignes med den software, der anvendes her.
Sammenfattende illustreres implementeringen af en robust protokol til differentiering af microglia-lignende celler fra humane iPSC'er, hvorved den begrænsede ressource af human microglia overvindes. Differentieret microglia kan bruges til en række applikationer i undersøgelsen af neurodevelopmental og neurodegenerative sygdomme. Desuden er et fuldt "humaniseret" fagocytose-assay inkluderet, hvilket yderligere vil hjælpe undersøgelsen af microglia-funktion og dysfunktion i forbindelse med menneskelig udvikling og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker Michael Ward for at levere WTC11 hNIL iPSC-linjen til motorneurondifferentiering og Jackson Laboratories for at levere KOLF2.1J WT-klonen B03 iPSC-linjen, der bruges til mikroglia-differentiering. Vi takker også Dorothy Schafer for hendes støtte under implementeringen af protokollerne, Anthony Giampetruzzi og John Landers for deres hjælp med live-cell imaging system samt Hayden Gadd for hans tekniske bidrag under revisioner og Jonathan Jung for hans samarbejde i denne undersøgelse. Dette arbejde blev støttet af Dan og Diane Riccio Fund for Neuroscience fra UMASS Chan Medical School og Angel Fund, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for immunofluorescence analysis | |||
| anti-IBA1 rabbit antibody | Wako Chemical USA | NC9288364 | 1:350 dilution |
| anti-P2RY12 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 dilution |
| anti-TMEM119 rabbit antibody | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 dilution |
| Antibodies for Western blot analysis | |||
| anti-β-Tubulin rabbit antibody | Abcam | ab6046 | 1:500 dilution |
| anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody | Abclonal | A6344 | 1:1,000 dilution |
| anti-PSD95 mouse antibody | Millipore | MAB1596 | 1:500 dilution |
| Borate buffer components | |||
| Boric acid (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium chloride (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Sodium tetraborate (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Cell culture materials | |||
| 6-well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm Cell Strainers | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated | CELLTREAT | 229620 | |
| Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile | CELLTREAT | 229305 | |
| low adherence round-bottom 96-well plate | Corning | 7007 | |
| Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353847, | |
| Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning | 353872 | |
| Cell dissociation reagents | |||
| Accutase | Corning | 25058CI | dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation |
| TrypLE reagent | Life Technologies | 12-605-010 | dissociation reagents used for microglia differentiation |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Coating reagents for cell culture | |||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning™ | 354230 | Referred as to extracellular matrix coating reagent |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referred as to laminin 521 |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7405 | Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer |
| Components of iPSC media | |||
| mTeSR Plus Kit | STEMCELL Technology | 100-0276 | To prepare iPSC media mixed the components to 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | final concentration 50 ng/mL |
| iPSC media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | final concentration 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | final concentration 50 ng/mL |
| Components of PMP base media | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | final concentration 1x |
| Components of PMP complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | final concentration 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 100 ng/mL |
| PMP base media | final concentration 1x | ||
| Components of iMG base media | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | final concentration 100 U/mL |
| Components of iMG complete media | |||
| 55 mM 2-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | final concentration 55 µM |
| IL-34 | PeproTech or Biologend | 200-34 or 577904 | final concentration 100 ng/mL |
| iMG base media | final concentration 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | final concentration 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | final concentration 50 ng/mL |
| Components of Induction base media | |||
| DMEM/F12 with HEPES | Gibco | 11330032 | final concentration 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| Components of Complete induction media | |||
| Compound E | Calbiochem | 565790 | final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS |
| Induction base media | final concentration 1x | ||
| ROCK inhibitor Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | final concentration 10 μM |
| Components of Neuron media | |||
| B-27 Plus Neuronal Culture System | Gibco | A3653401 | final concentration 1x for media and suplemment |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | final concentration 1x |
| N2 supplement, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentration 1x |
| Non-essential amino acids (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | final concentration 1x |
| iPSC lines used in this study | |||
| KOLF2.1J: WT clone B03 | The Jackson Laboratories | ||
| WTC11 hNIL | National Institute of Health | ||
| Synaptosome isolation reagents | |||
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 87793 | Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes |
| Phagocytosis assay dyes | |||
| NucBlue Live Ready reagent | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Red, succinimidyl ester | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referred as to pH-sensitive dye |
| Other cell-culture reagents | |||
| Trypan Blue, 0.4% Solution | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstitute to 40 mM in sterile water |
| Cytochalasin D | Sigma | final concentration 10 µM | |
| DPBS with Calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | Referred as to DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017015 | Referred as to laminin |
| Software and Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 live cell imaging reader | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | version 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | refer as tube shaker | |
| Water sonicator | Elma | Mode Transsonic 310 |
References
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
- Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
- Wilgenburg, B. v, Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
- Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
