Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tyramidsignalforstærkning til immunfluorescerende farvning af ZBP1-afhængig phosphorylering af RIPK3 og MLKL efter HSV-1-infektion i humane celler

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

Tyramidsignalforstærkning under immunfluorescerende farvning muliggør følsom påvisning af phosphoryleret RIPK3 og MLKL under ZBP1-induceret nekroptose efter HSV-1-infektion.

Abstract

Den kinase Receptor-interagerende serin / threonin protein kinase 3 (RIPK3) og dens substrat blandet afstamning kinase domæne-lignende (MLKL) er kritiske regulatorer af nekroptose, en inflammatorisk form for celledød med vigtige antivirale funktioner. Autophosphorylering af RIPK3 inducerer phosphorylering og aktivering af det poredannende bøddelprotein af nekroptose MLKL. Handel og oligomerisering af phosphoryleret MLKL ved cellemembranen resulterer i cellelyse, der er karakteristisk for nekroptotisk celledød. Nukleinsyresensoren ZBP1 aktiveres ved binding til venstrehåndet Z-form dobbeltstrenget RNA (Z-RNA) efter infektion med RNA- og DNA-vira. ZBP1-aktivering begrænser virusinfektion ved at inducere reguleret celledød, herunder nekroptose, af inficerede værtsceller. Immunofluorescensmikroskopi tillader visualisering af forskellige signaltrin nedstrøms for ZBP1-medieret nekroptose pr. Cellebasis. Følsomheden af standardfluorescensmikroskopi ved hjælp af nuværende kommercielt tilgængelige fosfospecifikke antistoffer mod human RIPK3 og MLKL udelukker imidlertid reproducerbar billeddannelse af disse markører. Her beskriver vi en optimeret farvningsprocedure for serin (S) phosphoryleret RIPK3 (S227) og MLKL (S358) i humane HT-29-celler inficeret med herpes simplex virus 1 (HSV-1). Inkluderingen af et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) i den immunfluorescerende farvningsprotokol muliggør specifik påvisning af S227 phosphoryleret RIPK3. Desuden øger TSA i høj grad følsomheden ved påvisning af S358 phosphoryleret MLKL. Sammen muliggør denne metode visualisering af disse to kritiske signalhændelser under induktionen af ZBP1-induceret nekroptose.

Introduction

Receptor-interagerende serin / threoninproteinkinase 3 (RIPK3) og blandet afstamningkinase domænelignende (MLKL) er centrale regulatorer af nekroptotisk celledød 1,2. Nekroptose er en lytisk og inflammatorisk form for reguleret celledød involveret i antiviral immunitet og autoinflammation. Nekroptose af virusinficerede celler lukker straks virusreplikation. Cellelyse efter nekroptoseinduktion frigiver også skadesrelaterede molekylære mønstre, som stimulerer antiviral immunitet 3,4. Nekroptose initieres ved aktivering af RIPK3 efter RIP homotypisk interaktionsmotiv (RHIM)-medierede interaktioner med et af tre opstrøms aktiverende molekyler: RIPK1 (ved TNF-receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domæneholdig adapterinducerende interferon-β (TRIF; ved Toll-lignende receptor 3 og 4 engagement) eller den antivirale nukleinsyresensor Z-DNA-bindende protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptose signalering fortsætter gennem en række fosforyleringshændelser, der begynder med autophosphorylering af RIPK3. Autophosphorylering af human RIPK3 ved serin (S)227 inde i dets kinasedomæne er en forudsætning for nekroptose ved at muliggøre interaktion med MLKL og anvendes almindeligvis som en biokemisk markør for human RIPK3-aktivering og nekrotaktisk celledød 1,5. Når den er aktiveret, phosphorylerer RIPK3 aktiveringssløjfen for MLKL ved threonin (T) 357 og S3581. Dette medfører en ændring i MLKL-konformation, hvilket resulterer i eksponering af det N-terminale fire helix-bundtdomæne. MLKL oligomeriserer derefter og trafikerer til cellemembranen, hvor den danner en pore gennem indsættelsen af de udsatte fire helixbundter i lipiddobbeltlaget, hvilket til sidst fører til celledød 2,6.

ZBP1 er en antiviral nukleinsyresensor, der genkender venstrehåndede Z-form nukleinsyrer, herunder dobbeltstrenget RNA i Z-konformationen (Z-RNA). Z-RNA-binding sker via to Zα-domæner placeret ved N-terminalen af ZBP1. Z-RNA akkumuleres under RNA- og DNA-virusinfektion menes at engagere ZBP1 7,8 direkte. Aktiveret ZBP1 rekrutterer RIPK3 gennem sine centrale RHIM'er og inducerer reguleret celledød, herunder nekroptose 9,10. Virus har vedtaget adskillige flugtmekanismer for at modvirke ZBP1-induceret værtscelle nekroptose11. For eksempel har herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktaseunderenhed 1, kendt som ICP6 og kodet af UL39, RHIM ved sin N-terminal, der interfererer med ZBP1-medieret RIPK3-aktivering i humane celler12,13,14,15. ZBP1 begrænser ikke kun viral replikation, men museundersøgelser har vist, at ZBP1-aktivering forårsager inflammatoriske sygdomme og stimulerer kræftimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoller, der detekterer signalhændelser, der forekommer under ZBP1-induceret nekroptose i humane celler, er derfor værdifulde til at vurdere ZBP1's rolle i disse processer.

Tyramidsignalforstærkning (TSA), også kaldet katalyseret reporteraflejring (CARD), er udviklet til at forbedre detektionsgrænsen og signal-støj-forholdet i antistofbaserede immunassays. Under TSA kan ethvert primært antistof bruges til at detektere antigenet af interesse. Peberrodsperoxidase (HRP), koblet til et sekundært antistof, katalyserer den lokale opbygning af biotinylerede tyramidradikaler i nærværelse af hydrogenperoxid. Disse aktiverede biotin-tyramidradikaler reagerer derefter med proksimale tyrosinrester for at danne kovalente bindinger. Potentielle tyramid-biotinsubstrater indbefatter selve antigenet, de primære og sekundære antistoffer og naboproteiner. Mens TSA forbedrer analysens følsomhed betydeligt, går noget af dets rumlige opløsning således tabt. I et sidste trin detekteres biotinmolekyler ved anvendelse af fluorescerende mærket streptavidin. HRP-reaktionen deponerer mange tyramid-biotinmolekyler på eller nær antigenet af interesse. Dette øger i høj grad antallet af streptavidin-fluorokrombindingssteder og forstærker derved i høj grad analysens følsomhed (figur 1). Alternativt kan tyramid kobles direkte til et fluorkrom, hvilket eliminerer behovet for streptavidin-koblede fluorophorer. Proteinimmunhistokemi og DNA/RNA in situ-hybridisering var blandt de første metoder, hvorved TSA blev anvendt til at forbedre signalintensiteten22,23. For nylig er TSA blevet kombineret med intracellulær flowcytometri24 og massespektrometri25.

Her præsenterer vi en protokol til påvisning af serin 227 phosphoryleret human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og phosphoryleret human MLKL (p-MLKL [S358]) ved aktivering af ZBP1 ved HSV-1-infektion ved anvendelse af immunfluorescensmikroskopi. Vi bruger en nekroptosefølsom HT-29 human kolorektal adenocarcinom cellelinje, der blev transduceret til stabilt at udtrykke human ZBP1. Disse celler blev inficeret med en HSV-1-stamme, der udtrykte et mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM), hvori fire kerneaminosyrer i den virale RHIM (VQCG) blev erstattet af alaniner (AAAA), hvilket gjorde ICP6 ude af stand til at blokere ZBP1-medieret nekroptose13,14,15. For at overvinde problemet med det lave signal/støj-forhold mellem de aktuelt kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod p-RIPK3 og p-MLKL i immunostaining26 udfører vi et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) (figur 1), hvilket resulterer i robust detektion af human p-RIPK3 (S227) og forbedrer detektionsfølsomheden af human p-MLKL (S358) med en størrelsesorden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af biotinyleret tyramid

  1. Forbered biotinyleret tyramid startende fra biotin-tyramid. For at fremstille en 10 mM stamopløsning opløses 3,6 mg biotin-tyramid i 1 ml DMSO. Opbevar det opløste produkt i aliquoter ved -20 °C for at bevare kvaliteten.

2. Vedligeholdelse af HT-29-celler i kultur

BEMÆRK: ZBP1-ekspressive HT-29 blev genereret ved transduktion med en lentivector27 , der koder for menneskelig ZBP1.

  1. Hold ZBP1-ekspressive HT-29-celler i McCoys 5A-medium suppleret med L-glutamin, natriumpyruvat og 10% føtalt bovint serum (fra nu af benævnt fuldt medium) og oprethold i en inkubator ved 37 ° C med 5% kuldioxid. Ideelt set skal du bruge celler med et lavt passagenummer (mindre end 10). Lad cellerne komme sig i mindst 5 dage efter optøningscyklussen inden forsøgets start.
  2. For at løsne cellerne fra dyrkningskolben fjernes mediet og cellerne vaskes med 5 ml PBS (forvarmet til 37 °C). Derefter tilsættes den passende mængde trypsin/EDTA (henholdsvis 0,05 % trypsin og 0,032 % EDTA, forvarmet til 37 °C) til cellerne (2 ml til en T75-kolbe, 3 ml til en T175-kolbe).
  3. Cellerne inkuberes med trypsin/EDTA i op til 10 minutter i en inkubator ved 37 °C med 5% kuldioxid. Tryk derefter på kolben og kontroller visuelt, om cellerne løsnes fra kolben ved hjælp af et mikroskop med 4x-20x objektiv forstørrelse.
  4. Hvis cellerne ikke er helt løsrevet, inkuberes der yderligere 5 minutter ved 37 °C. Når cellerne løsnes, stoppes den enzymatiske reaktion ved at tilsætte 6 ml fuldt medium til kolben.
  5. Saml cellesuspensionen i et 15 ml rør. Tæl cellerne ved hjælp af en trypanblå plet for at vurdere levedygtigheden; En 1:5 fortynding anbefales. Fortsæt kun med eksperimentet, hvis cellernes levedygtighed overstiger 90%.

3. Start af eksperimentet, såning og stimulering af cellerne

  1. Frø 90.000 ZBP1-ekspressive HT-29-celler i fuldt medium i en 1 cm² overfladeareal brøndplade, der tillader avanceret mikroskopi. Brug et slutvolumen på 200 μL pr. Brønd.
  2. Inkubere cellerne natten over ved 37 °C med 5% kuldioxid. Tag i betragtning, at der skal sås nogle ekstra brønde til farvningskontrol, hvilket forklares mere detaljeret i trin 5.6.
  3. Når cellerne når 70% -80% sammenløb, skal du tilføje en nekroptose-inducerende stimulus til cellerne. Her blev cellerne inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicitet af infektion [MOI] på 5, defineret som plaquedannende enheder (pfu) divideret med antallet af celler; pfu blev kvantificeret ved hjælp af et plaque-assay på Vero-celler) i 6 timer, 8 timer eller 10 timer.
  4. Som en positiv kontrol for nekroptoseinduktion stimuleres cellerne i 4 timer med en nekroptosefremkaldende cocktail indeholdende 30 ng / ml TNF, 20 μM af pan-caspasehæmmeren zVAD-fmk og 5 μM af SMAC-mimetisk BV6.
  5. Som en negativ kontrol for p-RIPK3 (S227) farvning skal du inkludere GSK'840 (1 μM) for at hæmme RIPK3-kinaseaktivitet og forhindre autophosphorylering af S227. Ideelt set tilsættes inhibitoren i en ubehandlet tilstand og efter nekroptosestimulering. Hæmmeren kan tilsættes samtidig med virusinfektion.
  6. Stimulationerne forberedes i fuldt medium, forvarmet til 37 °C. Brug et slutvolumen på 200 μL pr. brønd til alle stimuleringer.

4. Fastgørelse af cellerne

  1. Fjern mediet og vask cellerne med 200 μL 1x PBS. Derefter tilsættes 150 μL 4% PFA (allerede ækvilibreret ved stuetemperatur) til cellerne og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
    BEMÆRK: Hvis du bruger celler, der let løsnes, kan fikseringen af cellerne optimeres som følger. Fjern 100 μL medium fra brønden, så der forbliver et volumen på 100 μL på pladen. Tilsæt 100 μL 4% PFA til cellerne. Inkuber cellerne i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern derefter mediet/fikseringsmidlet fra brøndene og udskift med 150 μL 4% PFA. Inkuber cellerne i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur for at sikre fuldstændig fiksering af cellerne.
  2. Efter fiksering fjernes 4% PFA og cellerne vaskes 3x med 200 μL 1x PBS. Prøverne kan opbevares i et overskud (>200 μL) af 1x PBS ved 4 °C natten over indtil videre behandling.

5. Permeabilisering og primær farvning

  1. PBS fjernes og tilsættes 100 μL permeabiliseringsbuffer (0,5% Triton X-100 i PBS). Inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
  2. Fjern permeabiliseringsbufferen, og vask derefter brøndene med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber billedkammeret med vaskebuffer i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippende laboratorieryster (20-30 gyngende bevægelser pr. Minut).
  3. For at forhindre ikke-specifik binding af primære antistoffer tilsættes 100 μL blokerende medium og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer. Alternativt kan dette blokeringstrin erstattes af blokering med 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 i PBS i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Brøndene vaskes 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippelaboratorieryster.
  5. Efter fjernelse af vaskebufferen tilsættes de primære antistoffer til billeddannelseskammeret og inkuberes natten over ved 4 °C. Brug et slutvolumen på 100 μL til at dække brønden. Under inkubation natten over ved 4 °C må billeddannelseskammeret ikke placeres på en vippende laboratorieryster.
    BEMÆRK: Anti p-MLKL (S358; fortynding: 1:200) og anti-p-RIPK3 (S227; fortynding: 1:200) deler kanin som værtsart og bør derfor ikke kombineres i en brønd. For at overvåge virusinfektionen kombineres et primært antistof mod et viralt protein efter eget valg med p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227). Her blev cellerne inficeret med HSV-1-infektion efterfulgt af ICP0-farvning (fortynding: 1:50, værtsart: mus).
  6. Tag hensyn til de nødvendige farvningskontroller på dette tidspunkt. Medtag altid en ikke-primær antistoftilstand for at visualisere den potentielle baggrund for TSA-forstærkningstrin for at indstille maskeringstærsklen (se trin 9).
    BEMÆRK: I tilfælde af en co-farvningsprotokol (f.eks. Ved at kombinere p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227] med et antistof mod et viralt protein) skal du også bruge enkeltpletter. Brugen af enkeltpletter er vigtig for at korrigere for potentielt gennemblødningssignal i andre billeddannelseskanaler.

6. Forstærkning af tyramidsignal (TSA)

  1. Den primære antistofblanding fjernes, og brøndene vaskes 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1 % Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippelaboratorieryster.
  2. Fjern vaskebufferen, og tilsæt 100 μL HRP-mærket sekundært antistof, der genkender arten af primært antistof, der skal forstærkes. For at forstærke p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358) signalet tilsættes 100 μL anti-kanin-HRP og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur på en vippende laboratorieryster.
    BEMÆRK: Kun p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227) forstærkes. Farvningen af et viralt protein visualiseres ved hjælp af en standard indirekte farvningsmetode.
  3. Derefter vaskes brøndene 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippelaboratorieryster.
  4. I de næste trin tilsættes det biotinylerede tyramid til den mikroskopiske plade. Ved anvendelse af HRP-gruppen koblet til de sekundære antistoffer vil den enzymatiske reaktion udløse dannelsen af tyramidradikaler tæt på det primære mål (her p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227]).
  5. For at aktivere den enzymatiske aktivitet af HRP tilsættes et oxiderende substrat sammen med det biotinylerede tyramid. For at opnå dette skal TSA-bufferen (0,1 M borsyre [pH 8,5]) suppleres med 0,03 MH2O2; specifikt skal du tage 5 ml TSA-buffer og tilføje 5 μL 30% H2O2.
  6. Fortynd nu biotin-tyramid i H 2 O2-suppleretTSA-buffer fra 1: 1.000 til 1: 20.000.
    BEMÆRK: Fortyndingsfaktoren for biotin-tyramid skal optimeres pr. Batch.
  7. Fjern vaskebufferen fra brøndene, og tilsæt fortyndet biotintyramid til brøndene til et slutvolumen på 100 μL. Inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter på en vippende laboratorieryster.
  8. Derefter vaskes brøndene 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippelaboratorieryster.

7. Fluorophorer

BEMÆRK: Da signalet fra det primære antistof omdannes til en biotingruppe, visualiseres p-MLKL (S358) og p-RIPK3 (S227) ved hjælp af streptavidin koblet til en fluorophore (fluorophore 568, fortynding: 1:500). Derudover er kernerne farvet med DAPI (5 μg / ml). Hvis et viralt protein er inkluderet i farvningsprotokollen, skal du inkludere et passende fluorescerende mærket sekundært antistof mod værtsarten af dit primære antistof. I de repræsentative resultater blev der anvendt en mus anti-ICP0. Som et sekundært antistof gede-antimus koblet til fluorophore 633 (fortynding: 1:1.000) blev inkluderet.

  1. Lav farvningsblandingen i vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS) indeholdende ovennævnte antistoffer og pletter. Fjern vaskebufferen, tilsæt 100 μL farvningsblanding, og inkuber ved stuetemperatur i 1 time på en vippelaboratorieryster. Hold billedkammeret afskærmet fra lys fra dette trin og fremefter.
  2. Vask derefter brøndene 2x med vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved stuetemperatur på en vippelaboratorieryster.
  3. Til sidst skylles brøndene 2x med 1x PBS. Prøverne opbevares i et overskud (> 200 μL) af 1x PBS indtil billeddannelse. Alternativt nedsænkes prøverne i monteringsmedium for at bevare farvningen. Billedkammeret er nu klar til at blive visualiseret på et konfokalmikroskop.

8. Billeddannelse ved hjælp af et konfokalt mikroskop

  1. Tænd for konfokalmikroskopet og lasere mindst 10 minutter før billeddannelse.
  2. Brug et nedsænkningsmål for følsomhed. Brug helst 40x eller 63x objektiv forstørrelse. Før billeddannelse skal du rengøre nedsænkningsmålene med linserens ved hjælp af passende bomuldskugler. Beskidte mål (f.eks. på grund af støv) kan resultere i billeder af lavere kvalitet.
  3. Sæt en overskydende mængde olie på bunden af billedkammeret. Derudover tilsættes en dråbe olie på det valgte mål.
  4. Sæt billeddannelseskammeret på mikroskopet. Find fokusfeltet ved hjælp af DAPI-farvning eller ved hjælp af brightfield-billeddannelse. Flyt om nødvendigt rundt i billedkammeret for at sikre korrekt spredning af nedsænkningsolien.
  5. Opsæt de nødvendige billedspor på mikroskopet. Afhængigt af mikroskopet kan følgende trin variere (tabel 1).
    BEMÆRK: Når du opsætter billedsporene, skal du programmere sporene, så atomfarvningen måles sidst. 405 nm laseren kan bidrage til fotoblegning og dermed tab af specifikt signal i alle kanaler.
  6. Hvis du vil analysere en komplet celle for tilstedeværelsen af p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358), skal du måle z-stakke, der spænder over cellens højde. Her blev z-stablerne lavet af 40 skiver hver 0,16 μm, hvilket resulterede i et interval på 6,22 μm.

Spor Laser Bjælke splitter Filter
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Viralt gen: ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Kerne: DAPI 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
Mbs 488/561/633

Tabel 1: Billedspor til cellevisualisering.

9. Dataanalyse og kvantificering

  1. Upload de mikroskopiske billeder til softwaren. Brug det udvidede fokus til at visualisere alle oplysningerne om z-stakken i et 2D-billede.
  2. Derefter skal du programmere analyseprotokollen for at udtrække følgende oplysninger: antallet af celler pr. billede, summen af voxels, der viser p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ farvning. En voxel repræsenterer et tredimensionelt volumen, defineret som den tredimensionelle ækvivalent til en pixel.
  3. For at kvantificere antallet af celler pr. billede skal du segmentere kernen. For at reducere støj i segmenteringsresultaterne skal du tilføje en størrelsesbegrænsning til segmenteringen (>100 μm³). Antallet af segmenterede kerner repræsenterer antallet af celler i billedet.
  4. For at kvantificere mængden af p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxels skal du programmere en tærskelbaseret segmentering. Indstil tærsklen, så der ikke opfanges noget signal i billederne uden primært antistof (NP).
  5. Yderligere tilpasse tærsklen ved hjælp af billederne fra den ubehandlede mock tilstand. For at sikre følsom detektion af signalforøgelsen på grund af nekroptosestimulering skal du begrænse afhentningen af p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxels under mock-forhold ved at indstille en højere tærskel. Kontroller altid den programmerede analyseprotokol i flere billeder fra mock-tilstanden og nekroptose-inducerende virusinfektion.
  6. Kør analysen på alle billedsæt. Eksporter voxelkvantificering og kernesegmentering i en .txt fil til videre behandling i regnearkssoftware.
  7. Lav en pivottabel med dataene, der viser billednavnet, kernekvantificeringen og summen af detekterede voxels.
  8. Del derefter summen af positive voxels med antallet af celler i billedet. Dette resulterer i en relativ værdi af positive voxels pr. Celle. For at visualisere foldforøgelsen divideres den relative værdi af p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxels pr. celle med medianen af den ubehandlede tilstand (mock).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den immunfluorescerende påvisning af MLKL-phosphorylering og især RIPK3-phosphorylering i humane celler er teknisk udfordrende26. Vi præsenterer her en forbedret farvningsprotokol for human p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) ved aktivering af ZBP1. Protokollen indeholder et TSA-trin for at forbedre detektionsgrænsen og følsomheden af de fluorescerende signaler. For at validere metoden blev der udført en sammenligning side om side af den TSA-medierede immunfluorescens med standard indirekte fluorescerende farvning af både p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358).

HT-29-celler, der udtrykker human ZBP1, blev inficeret i 9 timer med en ICP6 RHIM-mutant HSV-1-stamme (HSV-1 ICP6mutRHIM) for at inducere ZBP1-medieret nekroptose og RIPK3-phosphorylering. HSV-1 ICP6mutRHIM-stammen bærer en VQCG til AAAA-mutation inden for ICP6 RHIM og er ikke i stand til at blokere nekroptosesignalering nedstrøms for ZBP114,15. Som tidligere rapporteret26 var standard indirekte immunfluorescens ikke følsom nok til at visualisere RIPK3 S227 phosphorylering med det nuværende kommercielt tilgængelige antistof, selv når lasereffekten af det konfokale mikroskop blev øget til 30% (figur 2A). I modsætning hertil muliggjorde inkluderingen af et TSA-trin robust detektion af p-RIPK3 (S227) i cytosolen af celler inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM. P-RIPK3 -signalet (S227) nåede mætning, da lasereffekten blev indstillet til 2% (figur 2A). Kvantificering af de tredimensionelle z-stack-billeder (se trin 9) viste en omtrentlig 20-dobling i antallet af voxeller, der var positive for p-RIPK3 (S227) i HSV-1 ICP6mutRHIM-inficeret over mock-behandlede celler (figur 2B). Udeladelse af det primære anti-p-RIPK3 (S227) antistof fra den TSA-medierede farvningsprotokol som en ingen primær (NP) kontrol gav ikke et detekterbart signal. For at visualisere HSV-1 ICP6mutRHIM-inficerede celler blev prøverne co-farvet med et primært antistof rettet mod det umiddelbare tidlige virale protein ICP0 (figur 2A). Et lavt, men påviseligt p-RIPK3 (S227) signal var til stede i de mock-behandlede celler, som kan repræsentere den konstitutive autophosphorylering af human RIPK3 på dette sted5 (se diskussionen). I overensstemmelse med en tidligere rapport28 er RHIM af ICP6 ikke i stand til fuldt ud at blokere RIPK3 S227 phosphorylering, da vi opdagede øget p-RIPK3 (S227) farvning af celler inficeret med vildtype HSV-1 (HSV-1WT; Figur 2A,B). For yderligere at validere specificiteten af p-RIPK3 (S227) signalet blev cellerne behandlet med RIPK3-kinasehæmmeren GSK'840 før infektion. GSK'840 binder sig til kinasedomænet RIPK3, hvilket forhindrer dets aktivitet og derved hæmmer dets autophosphorylering29. GSK'840 forhindrede RIPK3-phosphorylering ved S227 ved ZBP1-aktivering (figur 2A,B), hvilket bekræftede specificiteten af den TSA-medierede p-RIPK3 (S227)-detektionsmetode.

For at følge MLKL-phosphorylering, en slutfasemarkør for nekroptose, blev ZBP1-ekspressive HT-29-celler inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM i 8 timer og 10 timer. Cellerne blev farvet med et antistof mod S358 phosphoryleret MLKL (p-MLKL [S358]) ved anvendelse af TSA. De mock-behandlede celler viste lav og noget punkteret cytosolisk farvning af p-MLKL (S358), mens stærk p-MLKL-farvning blev detekteret i cytosolen, kernen. og ved plasmamembranen i de celler, der var inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (figur 3A). Desuden blev p-MLKL (S358) signalet observeret i klynger. Dette er i overensstemmelse med poredannende funktioner af aktiverede phosphorylerede MLKL-oligomerer ved cellemembranen og dens nyligt rapporterede nukleare translokation ved influenza A-infektion 1,2,6,30. Som en positiv p-MLKL (S358) farvningskontrol stimulerede vi ZBP1-ekspressive HT-29-celler med en kombination af TNF, SMAC-mimetisk BV6 og pan-caspasehæmmer zVAD-fmk for at inducere TNFR1-medieret nekroptose (figur 3A). Udeladelse af det primære anti-p-MLKL (S358) antistof fra den TSA-medierede farvningsprotokol som en ingen primær kontrol gav ikke et detekterbart signal.

Dernæst udførte vi en side om side sammenligning af p-MLKL (S358) immunfluorescerende farvning med og uden TSA. ZBP1-ekspressive HT-29-celler blev inficeret i 9 timer med HSV-1 ICP6mutRHIM. Mens en lasereffekt på 40% var nødvendig for at detektere et specifikt p-MLKL (S358) signal i de inficerede celler ved hjælp af standard indirekte immunfluorescens, nåede de TSA-behandlede prøver allerede mættende signaler ved en lasereffekt på 6% uden at øge baggrundsfarvningen i de mock-behandlede prøver (figur 3B). Desuden viste kvantificeringen af de tredimensionelle z-stack-billeder en over 10 gange stigning i antallet af voxeller, der var positive for p-MLKL (S358), når de brugte TSA sammenlignet med standard indirekte immunfluorescens. Dette viser, at TSA forbedrer både detektionstærsklen og følsomheden for p-MLKL (S358; Figur 3C).

Endelig inficerede vi ZBP1-ekspressive HT-29-celler med influenza A-virus (IAV) PR8-stamme i 9 timer for at validere den TSA-medierede immunfluorescensprotokol for andre ZBP1-afhængige nekroptose virale stimuli. TSA tillod faktisk robust detektion af p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358), hvilket tyder på, at disse celler gennemgår nekroptose (figur 4A-D).

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af TSA-protokollen. Celler sås og stimuleres i en brøndplade, der er kompatibel med avanceret mikroskopi. Derefter fikseres prøverne i 4% PFA, permeabiliseres og blokeres for at forhindre specifik binding af primære antistoffer. For at visualisere phosphoryleret RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og MLKL (p-MLKL [S358]) inkuberes specifikke antistoffer, der genkender disse vigtige fosforyleringssteder, natten over på billeddannelseskammeret. Dernæst tilsættes et sekundært antistof koblet til en hesteradiseperoxidase (HRP). Denne HRP-gruppe muliggør aktivering af biotinyleret tyramid i nærværelse afH2O2. Derefter koparres det aktive biotin-tyramid kovalent med tyrosinrester i nærheden af det HRP-mærkede sekundære antistof. Disse omfatter tyrosiner på proteinerne af interesse - i dette tilfælde p-RIPK3 eller p-MLKL, som angivet i figuren - og de af naboproteiner og på de primære og sekundære antistoffer selv (ikke vist). Dette tyramidsignalforstærkningstrin øger i høj grad farvningsprotokollens følsomhed. I et sidste trin tilsættes streptavidin koblet til en fluorescerende gruppe for at visualisere de biotinylerede molekyler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: HSV-1 ICP6mutRHIM inducerer ZBP1-afhængig phosphorylering af human RIPK3 ved S227. (A) Repræsentative konfokale billeder af humane ZBP1-udtrykkende HT-29-celler, der sammenligner TSA-farvning med en standard indirekte (ingen TSA) immunfluorescensfarvningsprotokol for p-RIPK3 (S227). De mock- og virusinficerede prøver (HSV-1WT eller HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) blev inkuberet i 9 timer. Som en negativ kontrol blev RIPK3-kinasehæmmeren GSK'840 (1 μM) inkluderet. En ingen primær (NP) farvningskontrol af celler inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer, hvor både de primære anti-p-RIPK3 (S227) og ICP0 antistoffer blev udeladt, er inkluderet. Den lasereffekt, der er nødvendig for at detektere det specifikke p-RIPK3 (S227) signal, er angivet på billederne. ICP0 blev brugt til at plette de virusinficerede celler, og DAPI blev brugt til at plette kernen. Skalabjælkerne er 10 μm. (B) Relativ kvantificering af p-RIPK3 (S227)+ voxels ved hjælp af TSA-farvningsprotokollen. Hver prik repræsenterer et billede, og den røde bjælke repræsenterer medianen. Voxel-tællingsværdier præsenteres i forhold til medianen af voxeltællingen af billeder i mock-tilstand. Statistikker blev udført ved hjælp af en envejs ANOVA med flere sammenligninger ved hjælp af Tukey-korrektion. p > 0,05 (n.s.), s≤ 0,05 (*), s≤ 0,01 (**). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: HSV-1 ICP6mutRHIM inducerer ZBP1-afhængig phosphorylering af human MLKL ved S358. (A) Repræsentative konfokale billeder af humane ZBP1-udtrykkende HT-29-celler. Cellerne blev enten mock-behandlet eller inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 8 timer og 10 timer. TSA blev brugt til at detektere p-MLKL (S358). ICP0 blev brugt til at plette de virusinficerede celler, og DAPI blev brugt til at plette kernen. En ingen primær (NP) farvningskontrol af celler, der var inficeret i 10 timer med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5), hvor den primære anti-p-MLKL (S358) blev udeladt, vises. Som en positiv kontrol blev cellerne stimuleret i 4 timer med 30 ng / ml TNF, 5 μM BV6 og 20 μM ZVAD-fmk, som inducerer nekroptose via TNFR1. Skalabjælkerne er 10 μm. (B) Repræsentative konfokale billeder af humane ZBP1-ekspressive HT-29-celler, der sammenligner TSA-farvning med en standard indirekte (ingen TSA) immunfluorescensfarvningsprotokol for p-MLKL (S358). Cellerne blev enten mock-behandlet eller inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer. En NP-farvningskontrol af celler inficeret med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer, hvor de primære anti-p-MLKL (S358) og ICP0 antistoffer blev udeladt, er inkluderet. Den lasereffekt, der er nødvendig for at detektere det specifikke p-MLKL (S358) signal, er angivet på billederne. (C) Relativ kvantificering af p-MLKL (S358)+ voxels ved hjælp af standard (ingen TSA) og TSA-farvningsprotokol. Hver prik repræsenterer et billede, og den røde bjælke repræsenterer medianen. Voxeltællingsværdierne præsenteres i forhold til medianen af voxeltællingen af billeder i mock-tilstanden. Statistikker blev udført ved hjælp af en envejs ANOVA med flere sammenligninger ved hjælp af Tukey-korrektion. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Influenza A-virus inducerer ZBP1-afhængig phosphorylering af human RIPK3 og MLKL. (A,C) Repræsentative konfokale billeder af humane ZBP1-udtrykkende HT-29-celler. Cellerne blev enten mock-behandlet eller inficeret med influenza A-virus (IAV), PR8-stamme (MOI = 4) i 9 timer og farvet til p-RIPK3 (S227; A) eller p-MLKL (S358; C) ved hjælp af TSA-protokollen. Skalabjælkerne er 10 μm. (B,D) Relativ kvantificering af p-RIPK3 (S227)+ (B) eller p-MLKL (S358; D) voxels. Hver prik i (B, D) repræsenterer et billede, og den røde bjælke repræsenterer medianen. Voxeltællingsværdierne præsenteres i forhold til medianen af voxeltællingen af billeder i mock-tilstanden. Statistikker blev udført ved hjælp af en Mann-Whitney-test. s≤ 0,05 (*), s. ≤ 0,01 (**). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne immunofluorescerende farvningsprotokol beskriver brugen af tyramidsignalforstærkning (TSA) for at øge følsomheden for signalhændelser af den humane nekrostotiske signalvej, der er vanskelige at detektere, herunder phosphorylering af RIPK3 og MLKL26. Inkluderingen af et TSA-trin forbedrer detektionstærsklen for p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) betydeligt og øger følsomheden af p-MLKL (S358) belastning. TSA afslørede et p-RIPK3 (S227) signal, der allerede var til stede i de mock-behandlede prøver. I humane celler er autophosphorylering af RIPK3 ved S227 en forudsætning for nekroptoseaktivering ved at muliggøre en stabil interaktion med MLKL. Denne proces forekommer allerede på basale niveauer og resulterer i dannelsen af en stabil inaktiv p-RIPK3 (S227)/MLKL dimer før nekroptoseinduktion 2,5,31. Tilsvarende detekterer anti-p-RIPK3-antistoffet, der anvendes i denne undersøgelse, også p-RIPK3 (S227) i ubehandlede celler ved western blotting26.

Fosforylering af MLKL af RIPK3 inden for aktiveringssløjfen, ved T357 og S358, resulterer i dissociation af det inaktive p-RIPK3 (S227)/MLKL-kompleks og inducerer en konformationsændring, hvorved MLKL udsætter sit N-terminale fire helixbundtdomæne. Aktiveret p-MLKL oligomeriserer derefter og trafikerer til cellemembranen, hvor den indsætter sine fire helixbundter i lipiddobbeltlaget, hvilket resulterer i cellelyse 1,2,6. Ved hjælp af denne TSA-immunfluorescensprotokol opdagede vi en stærk stigning i S358 MLKL-phosphorylering under ZBP1-induceret nekroptose. p-MLKL (S358) grupperet i cytosolen og ved plasmamembranen og blev også fundet i kernen ved ZBP1-aktivering. Faktisk er ZBP1 blevet rapporteret at stimulere MLKL-medieret forstyrrelse af kernemembranen i forbindelse med IAV-infektion 8,30. Det skal dog bemærkes, at TSA ikke kun deponerer biotin-tyramid på antigenet af interesse og de primære / sekundære antistoffer, men også på naboproteiner. TSA er derfor ikke ideel til at udlede oplysninger om den præcise subcellulære lokalisering af de detekterede proteiner, og vi anbefaler ikke TSA til co-lokaliseringsundersøgelser.

Gentagne fryse-optøningscyklusser påvirker stabiliteten af det biotinylerede tyramid. For at forhindre et fald i signalfølsomheden anbefaler vi at aliquot tyramidet og bruge en frisk aliquot til hvert eksperiment. Der bør udvises forsigtighed med batch-til-batch-forskelle i biotin-tyramidbestandene. Hvis den endelige koncentration af biotin-tyramid er for høj, vil ikke-specifik baggrund for TSA-forstærkningen maskere det specifikke signal. For at kontrollere dette anbefaler vi at titrere hvert nyt biotin-tyramidparti og inkludere en ingen primær farvningskontrol, hvor det primære antistof udelades.

I den fremlagte protokol var TSA begrænset til et mål. Påvisning af phosphoryleret RIPK3 og MLKL blev ikke kombineret i samme farvning, da begge primære antistoffer blev rejst i samme art. Protokollen kan tilpasses til at detektere flere TSA-forstærkede signaler (f.eks. p-RIPK3 [S227] og p-MLKL [S358]) i samme prøve ved anvendelse af multiplex immunfluorescerende TSA32,33. Endelig kan TSA-medieret amplifikation til immunfluorescensmikroskopi anvendes til genkendelse af biomarkører for andre signalveje med rapporterede dårlige signal-støj-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke VIB Bioimaging Core for træning, support og adgang til instrumentparken. J.N. er støttet af et ph.d.-stipendium fra Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i J.M.-gruppen blev støttet af et Odysseus II-tilskud (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), et juniorforskningsstipendium (G031022N) fra Research Foundation Flanders (FWO), et CRIG-tilskud til ung efterforsker proof-of-concept og af Gent Universitet. Forskning i P.V.-gruppen blev støttet af EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO seniorforskningsbevillinger (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG og GIGG konsortier og VIB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).

Tags

Immunologi og infektion udgave 188
Tyramidsignalforstærkning til immunfluorescerende farvning af ZBP1-afhængig phosphorylering af RIPK3 og MLKL efter HSV-1-infektion i humane celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter