Tyramidsignalforstærkning til immunfluorescerende farvning af ZBP1-afhængig phosphorylering af RIPK3 og MLKL efter HSV-1-infektion i humane celler
Summary
Tyramidsignalforstærkning under immunfluorescerende farvning muliggør følsom påvisning af phosphoryleret RIPK3 og MLKL under ZBP1-induceret nekroptose efter HSV-1-infektion.
Abstract
Den kinase Receptor-interagerende serin / threonin protein kinase 3 (RIPK3) og dens substrat blandet afstamning kinase domæne-lignende (MLKL) er kritiske regulatorer af nekroptose, en inflammatorisk form for celledød med vigtige antivirale funktioner. Autophosphorylering af RIPK3 inducerer phosphorylering og aktivering af det poredannende bøddelprotein af nekroptose MLKL. Handel og oligomerisering af phosphoryleret MLKL ved cellemembranen resulterer i cellelyse, der er karakteristisk for nekroptotisk celledød. Nukleinsyresensoren ZBP1 aktiveres ved binding til venstrehåndet Z-form dobbeltstrenget RNA (Z-RNA) efter infektion med RNA- og DNA-vira. ZBP1-aktivering begrænser virusinfektion ved at inducere reguleret celledød, herunder nekroptose, af inficerede værtsceller. Immunofluorescensmikroskopi tillader visualisering af forskellige signaltrin nedstrøms for ZBP1-medieret nekroptose pr. Cellebasis. Følsomheden af standardfluorescensmikroskopi ved hjælp af nuværende kommercielt tilgængelige fosfospecifikke antistoffer mod human RIPK3 og MLKL udelukker imidlertid reproducerbar billeddannelse af disse markører. Her beskriver vi en optimeret farvningsprocedure for serin (S) phosphoryleret RIPK3 (S227) og MLKL (S358) i humane HT-29-celler inficeret med herpes simplex virus 1 (HSV-1). Inkluderingen af et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) i den immunfluorescerende farvningsprotokol muliggør specifik påvisning af S227 phosphoryleret RIPK3. Desuden øger TSA i høj grad følsomheden ved påvisning af S358 phosphoryleret MLKL. Sammen muliggør denne metode visualisering af disse to kritiske signalhændelser under induktionen af ZBP1-induceret nekroptose.
Introduction
Receptor-interagerende serin / threoninproteinkinase 3 (RIPK3) og blandet afstamningkinase domænelignende (MLKL) er centrale regulatorer af nekroptotisk celledød 1,2. Nekroptose er en lytisk og inflammatorisk form for reguleret celledød involveret i antiviral immunitet og autoinflammation. Nekroptose af virusinficerede celler lukker straks virusreplikation. Cellelyse efter nekroptoseinduktion frigiver også skadesrelaterede molekylære mønstre, som stimulerer antiviral immunitet 3,4. Nekroptose initieres ved aktivering af RIPK3 efter RIP homotypisk interaktionsmotiv (RHIM)-medierede interaktioner med et af tre opstrøms aktiverende molekyler: RIPK1 (ved TNF-receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domæneholdig adapterinducerende interferon-β (TRIF; ved Toll-lignende receptor 3 og 4 engagement) eller den antivirale nukleinsyresensor Z-DNA-bindende protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptose signalering fortsætter gennem en række fosforyleringshændelser, der begynder med autophosphorylering af RIPK3. Autophosphorylering af human RIPK3 ved serin (S)227 inde i dets kinasedomæne er en forudsætning for nekroptose ved at muliggøre interaktion med MLKL og anvendes almindeligvis som en biokemisk markør for human RIPK3-aktivering og nekrotaktisk celledød 1,5. Når den er aktiveret, phosphorylerer RIPK3 aktiveringssløjfen for MLKL ved threonin (T) 357 og S3581. Dette medfører en ændring i MLKL-konformation, hvilket resulterer i eksponering af det N-terminale fire helix-bundtdomæne. MLKL oligomeriserer derefter og trafikerer til cellemembranen, hvor den danner en pore gennem indsættelsen af de udsatte fire helixbundter i lipiddobbeltlaget, hvilket til sidst fører til celledød 2,6.
ZBP1 er en antiviral nukleinsyresensor, der genkender venstrehåndede Z-form nukleinsyrer, herunder dobbeltstrenget RNA i Z-konformationen (Z-RNA). Z-RNA-binding sker via to Zα-domæner placeret ved N-terminalen af ZBP1. Z-RNA akkumuleres under RNA- og DNA-virusinfektion menes at engagere ZBP1 7,8 direkte. Aktiveret ZBP1 rekrutterer RIPK3 gennem sine centrale RHIM’er og inducerer reguleret celledød, herunder nekroptose 9,10. Virus har vedtaget adskillige flugtmekanismer for at modvirke ZBP1-induceret værtscelle nekroptose11. For eksempel har herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktaseunderenhed 1, kendt som ICP6 og kodet af UL39, RHIM ved sin N-terminal, der interfererer med ZBP1-medieret RIPK3-aktivering i humane celler12,13,14,15. ZBP1 begrænser ikke kun viral replikation, men museundersøgelser har vist, at ZBP1-aktivering forårsager inflammatoriske sygdomme og stimulerer kræftimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoller, der detekterer signalhændelser, der forekommer under ZBP1-induceret nekroptose i humane celler, er derfor værdifulde til at vurdere ZBP1’s rolle i disse processer.
Tyramidsignalforstærkning (TSA), også kaldet katalyseret reporteraflejring (CARD), er udviklet til at forbedre detektionsgrænsen og signal-støj-forholdet i antistofbaserede immunassays. Under TSA kan ethvert primært antistof bruges til at detektere antigenet af interesse. Peberrodsperoxidase (HRP), koblet til et sekundært antistof, katalyserer den lokale opbygning af biotinylerede tyramidradikaler i nærværelse af hydrogenperoxid. Disse aktiverede biotin-tyramidradikaler reagerer derefter med proksimale tyrosinrester for at danne kovalente bindinger. Potentielle tyramid-biotinsubstrater indbefatter selve antigenet, de primære og sekundære antistoffer og naboproteiner. Mens TSA forbedrer analysens følsomhed betydeligt, går noget af dets rumlige opløsning således tabt. I et sidste trin detekteres biotinmolekyler ved anvendelse af fluorescerende mærket streptavidin. HRP-reaktionen deponerer mange tyramid-biotinmolekyler på eller nær antigenet af interesse. Dette øger i høj grad antallet af streptavidin-fluorokrombindingssteder og forstærker derved i høj grad analysens følsomhed (figur 1). Alternativt kan tyramid kobles direkte til et fluorkrom, hvilket eliminerer behovet for streptavidin-koblede fluorophorer. Proteinimmunhistokemi og DNA/RNA in situ-hybridisering var blandt de første metoder, hvorved TSA blev anvendt til at forbedre signalintensiteten22,23. For nylig er TSA blevet kombineret med intracellulær flowcytometri24 og massespektrometri25.
Her præsenterer vi en protokol til påvisning af serin 227 phosphoryleret human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og phosphoryleret human MLKL (p-MLKL [S358]) ved aktivering af ZBP1 ved HSV-1-infektion ved anvendelse af immunfluorescensmikroskopi. Vi bruger en nekroptosefølsom HT-29 human kolorektal adenocarcinom cellelinje, der blev transduceret til stabilt at udtrykke human ZBP1. Disse celler blev inficeret med en HSV-1-stamme, der udtrykte et mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM), hvori fire kerneaminosyrer i den virale RHIM (VQCG) blev erstattet af alaniner (AAAA), hvilket gjorde ICP6 ude af stand til at blokere ZBP1-medieret nekroptose13,14,15. For at overvinde problemet med det lave signal/støj-forhold mellem de aktuelt kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod p-RIPK3 og p-MLKL i immunostaining26 udfører vi et tyramidsignalforstærkningstrin (TSA) (figur 1), hvilket resulterer i robust detektion af human p-RIPK3 (S227) og forbedrer detektionsfølsomheden af human p-MLKL (S358) med en størrelsesorden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne immunofluorescerende farvningsprotokol beskriver brugen af tyramidsignalforstærkning (TSA) for at øge følsomheden for signalhændelser af den humane nekrostotiske signalvej, der er vanskelige at detektere, herunder phosphorylering af RIPK3 og MLKL26. Inkluderingen af et TSA-trin forbedrer detektionstærsklen for p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) betydeligt og øger følsomheden af p-MLKL (S358) belastning. TSA afslørede et p-RIPK3 (S227) signal, der allerede var til stede i de mock-behandl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke VIB Bioimaging Core for træning, support og adgang til instrumentparken. J.N. er støttet af et ph.d.-stipendium fra Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i J.M.-gruppen blev støttet af et Odysseus II-tilskud (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), et juniorforskningsstipendium (G031022N) fra Research Foundation Flanders (FWO), et CRIG-tilskud til ung efterforsker proof-of-concept og af Gent Universitet. Forskning i P.V.-gruppen blev støttet af EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO seniorforskningsbevillinger (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG og GIGG konsortier og VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
