Summary
Tyramide signaalversterking tijdens immunofluorescente kleuring maakt de gevoelige detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL mogelijk tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose na HSV-1-infectie.
Abstract
De kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) en zijn substraat mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn kritische regulatoren van necroptose, een inflammatoire vorm van celdood met belangrijke antivirale functies. Autofosforylering van RIPK3 induceert fosforylering en activering van het porievormende beulseiwit van necroptosis MLKL. Handel en oligomerisatie van gefosforyleerde MLKL aan het celmembraan resulteert in cellyse, kenmerkend voor necroptotische celdood. De nucleïnezuursensor ZBP1 wordt geactiveerd door binding aan linkshandig Z-vormig dubbelstrengs RNA (Z-RNA) na infectie met RNA- en DNA-virussen. ZBP1-activering beperkt virusinfectie door gereguleerde celdood, inclusief necroptose, van geïnfecteerde gastheercellen te induceren. Immunofluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van verschillende signaalstappen stroomafwaarts van ZBP1-gemedieerde necroptose per cel mogelijk. De gevoeligheid van standaard fluorescentiemicroscopie, met behulp van de huidige in de handel verkrijgbare fosfo-specifieke antilichamen tegen humane RIPK3 en MLKL, sluit reproduceerbare beeldvorming van deze markers echter uit. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde kleuringsprocedure voor serine (S) gefosforyleerde RIPK3 (S227) en MLKL (S358) in menselijke HT-29-cellen die zijn geïnfecteerd met herpes simplex-virus 1 (HSV-1). De opname van een tyramide signaal amplificatie (TSA) stap in het immunofluorescente kleuring protocol maakt de specifieke detectie van S227 gefosforyleerde RIPK3 mogelijk. Bovendien verhoogt TSA de gevoeligheid van de detectie van S358 gefosforyleerde MLKL aanzienlijk. Samen maakt deze methode de visualisatie van deze twee kritieke signaleringsgebeurtenissen mogelijk tijdens de inductie van ZBP1-geïnduceerde necroptose.
Introduction
Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3) en mixed lineage kinase domain-like (MLKL) zijn centrale regulatoren van necroptotische celdood 1,2. Necroptose is een lytische en inflammatoire vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij antivirale immuniteit en auto-inflammatie. Necroptose van met virus geïnfecteerde cellen sluit onmiddellijk de virusreplicatie uit. Cellyse na necroptose-inductie geeft ook schadegerelateerde moleculaire patronen vrij, die antivirale immuniteit stimuleren 3,4. Necroptose wordt geïnitieerd door de activering van RIPK3 na RIP homotypische interactie motief (RHIM)-gemedieerde interacties met een van de drie upstream activerende moleculen: RIPK1 (bij TNF receptor 1 [TNFR1] engagement), TIR-domein-bevattende adapter-inducerende interferon-β (TRIF; op Toll-like receptor 3 en 4 engagement), of de antivirale nucleïnezuursensor Z-DNA binding protein 1 (ZBP1)1,2 . Necroptose signalering verloopt door een reeks fosforylering gebeurtenissen beginnend met de autofosforylering van RIPK3. De autofosforylering van humaan RIPK3 bij serine (S)227 binnen zijn kinasedomein is een voorwaarde voor necroptose door de interactie met MLKL mogelijk te maken en wordt vaak gebruikt als biochemische marker voor humane RIPK3-activering en necroptotische celdood 1,5. Eenmaal geactiveerd, fosforyleert RIPK3 de activeringslus van MLKL bij threonine (T) 357 en S3581. Dit veroorzaakt een verandering in MLKL-conformatie, wat resulteert in blootstelling van het N-terminal vier helixbundeldomein. MLKL oligomeriseert vervolgens en verkeert naar het celmembraan waar het een porie vormt door het inbrengen van de blootgestelde vier helixbundels in de lipide bilayer, wat uiteindelijk leidt tot celdood 2,6.
ZBP1 is een antivirale nucleïnezuursensor die linkshandige Z-vorm nucleïnezuren herkent, waaronder dubbelstrengs RNA in de Z-conformatie (Z-RNA). Z-RNA-binding vindt plaats via twee Zα-domeinen die zich op het N-eindpunt van ZBP1 bevinden. Van Z-RNA dat zich ophoopt tijdens RNA- en DNA-virusinfectie wordt verondersteld ZBP1 7,8 direct te betrekken. Geactiveerd zbp1 rekruteert RIPK3 via zijn centrale RHIMs en induceert gereguleerde celdood, waaronder necroptose 9,10. Virussen hebben tal van ontsnappingsmechanismen aangenomen om ZBP1-geïnduceerde gastheercelnederroptose tegen te gaan11. Bijvoorbeeld, het herpes simplex virus 1 (HSV-1) ribonucleotide reductase subunit 1, bekend als ICP6 en gecodeerd door UL39, herbergt RHIM op zijn N-terminus dat interfereert met ZBP1-gemedieerde RIPK3-activering in menselijke cellen 12,13,14,15. ZBP1 beperkt niet alleen virale replicatie, maar muisstudies hebben aangetoond dat ZBP1-activering ontstekingsziekten veroorzaakt en kankerimmuniteit stimuleert 16,17,18,19,20,21. Protocollen die signaleringsgebeurtenissen detecteren die optreden tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose in menselijke cellen zijn daarom waardevol om de rol van ZBP1 in deze processen te beoordelen.
Tyramide signaalversterking (TSA), ook wel katalyseerde reporter depositie (CARD) genoemd, is ontwikkeld om de detectiegrens en signaal-ruisverhouding in op antilichamen gebaseerde immunoassays te verbeteren. Tijdens TSA kan elk primair antilichaam worden gebruikt om het antigeen van belang te detecteren. Mierikswortelperoxidase (HRP), gekoppeld aan een secundair antilichaam, katalyseert de lokale opbouw van gebiotinyleerde tyramideradicalen in aanwezigheid van waterstofperoxide. Deze geactiveerde biotine-tyramideradicalen reageren vervolgens met proximale tyrosineresiduen om covalente bindingen te vormen. Potentiële tyramide-biotinesubstraten omvatten het antigeen zelf, de primaire en secundaire antilichamen en naburige eiwitten. Dus, terwijl TSA de gevoeligheid van de test aanzienlijk verbetert, gaat een deel van de ruimtelijke resolutie verloren. In een laatste stap worden biotinemoleculen gedetecteerd met behulp van fluorescerend gelabeld streptavidin. De HRP-reactie zet veel tyramide-biotinemoleculen af op of in de buurt van het antigeen van belang. Dit verhoogt het aantal streptavidin-fluorochrome bindingsplaatsen aanzienlijk, waardoor de gevoeligheid van de test aanzienlijk wordt versterkt (figuur 1). Als alternatief kan tyramide direct worden gekoppeld aan een fluorochroom, waardoor de noodzaak voor streptavidin-gekoppelde fluoroforen wordt geëlimineerd. Eiwitimmunohistochemie en DNA/RNA in situ hybridisatie behoorden tot de eerste methoden waarbij TSA werd gebruikt om de signaalintensiteiten te verbeteren22,23. Meer recent is TSA gecombineerd met intracellulaire flowcytometrie24 en massaspectrometrie25.
Hier presenteren we een protocol om serine 227 gefosforyleerde humane RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) en gefosforyleerde humane MLKL (p-MLKL [S358]) te detecteren bij de activering van ZBP1 door HSV-1-infectie met behulp van immunofluorescentiemicroscopie. We gebruiken een necroptose-gevoelige HT-29 menselijke colorectale adenocarcinoom cellijn die werd getransduceerd om stabiel menselijk ZBP1 tot expressie te brengen. Deze cellen werden geïnfecteerd met een HSV-1-stam die een mutant ICP6-eiwit (HSV-1 ICP6mutRHIM) tot expressie bracht waarin vier kernaminozuren binnen het virale RHIM (VQCG) werden vervangen door alanines (AAAA), waardoor de ICP6 niet in staat was om ZBP1-gemedieerde necroptose te blokkeren 13,14,15. Om het probleem van de lage signaal-ruisverhouding van de momenteel in de handel verkrijgbare antilichamen gericht tegen p-RIPK3 en p-MLKL in immunostaining26 te overwinnen, voeren we een tyramide signaalversterking (TSA) stap uit (Figuur 1), die resulteert in de robuuste detectie van humane p-RIPK3 (S227) en de detectiegevoeligheid van menselijke p-MLKL (S358) met een orde van grootte verbetert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van gebiotinyleerd tyramide
- Bereid gebiotinyleerd tyramide vanaf biotine-tyramide. Om een 10 mM stockoplossing te maken, lost u 3,6 mg biotine-tyramide op in 1 ml DMSO. Bewaar het opgeloste product in aliquots bij −20 °C om de kwaliteit te behouden.
2. Behoud van HT-29 cellen in cultuur
OPMERKING: ZBP1-expresserende HT-29 werden gegenereerd door transductie met een lentivector27 die codeert voor menselijk ZBP1.
- Houd ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in McCoy's 5A-medium aangevuld met L-glutamine, natriumpyruvaat en 10% foetaal runderserum (vanaf nu aangeduid als volledig medium) en onderhoud in een incubator op 37 °C met 5% koolstofdioxide. Gebruik idealiter cellen met een laag passagegetal (minder dan 10). Laat de cellen ten minste 5 dagen na de dooicyclus herstellen voordat het experiment begint.
- Om de cellen los te maken van de kweekkolf, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 5 ml PBS (voorverwarmd tot 37 °C). Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid trypsine/EDTA (respectievelijk 0,05% trypsine en 0,032% EDTA, voorverwarmd tot 37 °C) toe aan de cellen (2 ml voor een T75-kolf, 3 ml voor een T175-kolf).
- Incubeer de cellen met trypsine/EDTA gedurende maximaal 10 minuten in een incubator bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Tik daarna op de kolf en controleer visueel of de cellen loskomen van de kolf met behulp van een microscoop met 4x-20x objectiefvergroting.
- Als de cellen niet volledig losstaan, incubeer dan nog eens 5 minuten bij 37 °C. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stopt u de enzymatische reactie door 6 ml vol medium aan de kolf toe te voegen.
- Verzamel de celsuspensie in een buis van 15 ml. Tel de cellen met behulp van een trypan blauwe vlek om de levensvatbaarheid te beoordelen; een verdunning van 1:5 wordt aanbevolen. Ga alleen verder met het experiment als de levensvatbaarheid van de cellen groter is dan 90%.
3. Het experiment starten, zaaien en stimuleren van de cellen
- Zaai 90.000 ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen in volledig medium in een putplaat met een oppervlakteoppervlak van 1 cm² die high-end microscopie mogelijk maakt. Gebruik een eindvolume van 200 μL per putje.
- Incubeer de cellen een nacht bij 37 °C met 5% koolstofdioxide. Houd er rekening mee dat er enkele extra putten moeten worden gezaaid voor kleuringscontroles, wat in stap 5.6 in meer detail wordt uitgelegd.
- Wanneer de cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, voegt u een necroptose-inducerende stimulus toe aan de cellen. Hier werden de cellen geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicity of infection [MOI] van 5, gedefinieerd als plaquevormende eenheden (pfu) gedeeld door het aantal cellen; de pfu werd gekwantificeerd met behulp van een plaquetest op Vero-cellen) gedurende 6 h, 8 h of 10 h.
- Als een positieve controle voor necroptose-inductie, stimuleer de cellen gedurende 4 uur met een necroptose-inducerende cocktail met 30 ng / ml TNF, 20 μM van de pan-caspaseremmer zVAD-fmk en 5 μM van de SMAC mimetische BV6.
- Als negatieve controle voor p-RIPK3 (S227) kleuring, neem GSK'840 (1 μM) op om RIPK3 kinase activiteit te remmen en de autofosforylering van S227 te voorkomen. Idealiter, voeg de remmer toe in een onbehandelde toestand en na necroptose stimulatie. De remmer kan gelijktijdig met een virale infectie worden toegevoegd.
- Bereid de stimulaties in volledig medium, voorverwarmd tot 37 °C. Gebruik een eindvolume van 200 μL per putje voor alle stimulaties.
4. De cellen bevestigen
- Verwijder het medium en was de cellen met 200 μL 1x PBS. Voeg vervolgens 150 μL van 4% PFA (al in evenwicht bij kamertemperatuur) toe aan de cellen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
OPMERKING: Als u cellen gebruikt die gemakkelijk kunnen worden losgemaakt, kan de fixatie van de cellen als volgt worden geoptimaliseerd. Verwijder 100 μL medium uit de put, zodat een volume van 100 μL op de plaat blijft. Voeg 100 μL 4% PFA toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder daarna het medium/fixatief uit de putjes en vervang het door 150 μL van 4% PFA. Incubeer de cellen nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur om volledige fixatie van de cellen te garanderen. - Verwijder na fixatie de 4% PFA en was de cellen 3x met 200 μL 1x PBS. De monsters kunnen worden bewaard in een overmaat (>200 μL) van 1x PBS bij 4 °C 's nachts tot verdere verwerking.
5. Permeabilisatie en primaire kleuring
- Verwijder de PBS en voeg 100 μL permeabilisatiebuffer toe (0,5% Triton X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Verwijder de permeabilisatiebuffer en was vervolgens de putjes met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de beeldkamer met wasbuffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder (20-30 schommelbewegingen per minuut).
- Om niet-specifieke binding van primaire antilichamen te voorkomen, voegt u 100 μL blokkerend medium toe en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Als alternatief kan deze blokkerende stap worden vervangen door blokkering met 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
- Voeg na het verwijderen van de wasbuffer de primaire antilichamen toe aan de beeldvormende kamer en incubeer een nacht bij 4 °C. Gebruik een eindvolume van 100 μL om de put te bedekken. Plaats tijdens de nachtelijke incubatie bij 4°C de beeldkamer niet op een kantelbare laboratoriumschudder.
OPMERKING: Anti p-MLKL (S358; verdunning: 1:200) en anti-p-RIPK3 (S227; verdunning: 1:200) delen konijn als gastheersoort en mogen daarom niet in één put worden gecombineerd. Om de virale infectie te controleren, combineert u een primair antilichaam tegen een viraal eiwit naar keuze met p-MLKL (S358) of p-RIPK3 (S227). Hier werden de cellen geïnfecteerd met HSV-1-infectie gevolgd door ICP0-kleuring (verdunning: 1:50, gastheersoort: muis). - Houd op dit moment rekening met de nodige kleuringscontroles. Neem altijd een no primary antibody condition op om de mogelijke achtergrond van de TSA-versterkingsstap te visualiseren om de maskeringsdrempel in te stellen (zie stap 9).
OPMERKING: In het geval van een co-kleuringsprotocol (bijvoorbeeld het combineren van p-MLKL [S358] of p-RIPK3 [S227] met een antilichaam tegen een viraal eiwit) gebruik ook enkele vlekken. Het gebruik van enkele vlekken is belangrijk om te corrigeren voor mogelijk doorbloedingssignaal in andere beeldkanalen.
6. Tyramide signaalversterking (TSA)
- Verwijder het primaire antilichaammengsel en was putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
- Verwijder de wasbuffer en voeg 100 μL HRP-gelabeld secundair antilichaam toe dat de soort primair antilichaam herkent dat moet worden versterkt. Om het p-RIPK3 (S227) of p-MLKL (S358) signaal te versterken, voegt u 100 μL anti-konijn-HRP toe en incubeert u gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
OPMERKING: Alleen p-MLKL (S358) of p-RIPK3 (S227) wordt versterkt. De kleuring van een viraal eiwit wordt gevisualiseerd met behulp van een standaard indirecte kleuringsmethode. - Was daarna de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
- Voeg in de volgende stappen de gebiotinyleerde tyramide toe aan de microscopische plaat. Met behulp van de HRP-groep gekoppeld aan de secundaire antilichamen, zal de enzymatische reactie de vorming van tyramideradicalen in de nabijheid van het primaire doelwit veroorzaken (hier p-MLKL [S358] of p-RIPK3 [S227]).
- Om de enzymatische activiteit van HRP te activeren, voegt u een oxiderend substraat toe samen met het gebiotinyleerde tyramide. Vul hiervoor de TSA-buffer (0,1 M boorzuur [pH 8,5]) aan met 0,03 M H2O2; neem specifiek 5 ml TSA-buffer en voeg 5 μL 30% H2O2 toe.
- Verdun nu de biotine-tyramide in H2O2-aangevulde TSA-buffer variërend van 1: 1.000 tot 1: 20.000.
OPMERKING: De verdunningsfactor van de biotine-tyramide moet per batch worden geoptimaliseerd. - Verwijder de wasbuffer uit de putjes en voeg verdund biotine-tyramide toe aan de putjes tot een eindvolume van 100 μL. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten op een kantelbare laboratoriumschudder.
- Was vervolgens de putjes 3x met 100 μL wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
7. Fluoroforen
OPMERKING: Aangezien het signaal van het primaire antilichaam wordt omgezet in een biotinegroep, worden p-MLKL (S358) en p-RIPK3 (S227) gevisualiseerd met behulp van streptavidin gekoppeld aan een fluorofoor (fluorofoor 568, verdunning: 1:500). Bovendien zijn de kernen gekleurd met DAPI (5 μg /ml). Als een viraal eiwit is opgenomen in het kleuringsprotocol, neem dan een geschikt fluorescerend gelabeld secundair antilichaam op tegen de gastheersoort van uw primaire antilichaam. In de representatieve resultaten werd een muis anti-ICP0 gebruikt. Als secundair antilichaam werd geiten antimuis gekoppeld aan fluorofoor 633 (verdunning: 1:1.000) opgenomen.
- Maak het kleuringsmengsel in wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS) met de hierboven genoemde antilichamen en vlekken. Verwijder de wasbuffer, voeg 100 μL kleuringsmengsel toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur op een kantelbare laboratoriumschudder. Houd de beeldkamer vanaf deze stap afgeschermd van licht.
- Was vervolgens de putjes 2x met wasbuffer (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubeer de wastreden gedurende 5 minuten op kamertemperatuur op een kantelbare laboratoriumschudder.
- Spoel tot slot de putjes 2x af met 1x PBS. Bewaar de monsters in een overmaat (> 200 μL) van 1x PBS tot beeldvorming. U kunt de monsters ook onderdompelen in een montagemedium om de kleuring te behouden. De beeldkamer is nu klaar om te worden gevisualiseerd op een confocale microscoop.
8. Beeldvorming met behulp van een confocale microscoop
- Schakel de confocale microscoop en lasers ten minste 10 minuten voordat u de afbeelding maakt.
- Gebruik een onderdompelingsdoel voor gevoeligheid. Gebruik bij voorkeur 40x of 63x objectiefvergroting. Reinig voordat u gaat fotograferen de onderdompelingsdoelstellingen met lensreiniger met behulp van geschikte wattenbollen. Vuile doelstellingen (bijvoorbeeld als gevolg van stof) kunnen leiden tot afbeeldingen van lagere kwaliteit.
- Plaats een overtollige hoeveelheid olie op de bodem van de beeldkamer. Voeg bovendien een druppel olie toe aan het doel van keuze.
- Leg de beeldkamer op de microscoop. Zoek het focusveld met behulp van DAPI-kleuring of met behulp van brightfield-beeldvorming. Beweeg indien nodig rond de beeldkamer om een goede verspreiding van de dompelolie te garanderen.
- Stel de benodigde beeldsporen in op de microscoop. Afhankelijk van de microscoop kunnen de volgende stappen variëren (tabel 1).
OPMERKING: Programmeer bij het instellen van de beeldsporen de sporen zodat de nucleaire kleuring als laatste wordt gemeten. De 405 nm laser kan bijdragen aan fotobleaching en daarmee het verlies van specifiek signaal in alle kanalen. - Als u een volledige cel wilt analyseren op de aanwezigheid van p-RIPK3 (S227) of p-MLKL (S358), meet u z-stacks die de hoogte van de cel overspannen. Hier werden de z-stacks gemaakt van 40 plakjes om de 0,16 μm, wat resulteerde in een bereik van 6,22 μm.
| Spoor | Laser | Bundelsplitser | Filter |
| pRIPK3 (S227) / pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| Viraal gen: ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Kern: DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
Tabel 1: Beeldvormingssporen voor celvisualisatie.
9. Data-analyse en kwantificering
- Upload de microscopische afbeeldingen naar de software. Gebruik de uitgebreide focus om alle informatie van de z-stack in een 2D-afbeelding te visualiseren.
- Programmeer vervolgens het analyseprotocol om de volgende informatie te extraheren: het aantal cellen per afbeelding, de som van voxels met p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ kleuring. Een voxel vertegenwoordigt een driedimensionaal volume, gedefinieerd als het driedimensionale equivalent van een pixel.
- Als u het aantal cellen per afbeelding wilt kwantificeren, segmenteert u de kern. Om ruis in de segmentatieresultaten te verminderen, voegt u een groottebeperking toe aan de segmentatie (>100 μm³). Het aantal gesegmenteerde kernen staat voor het aantal cellen in de afbeelding.
- Om de hoeveelheid p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels te kwantificeren, programmeert u een op drempels gebaseerde segmentatie. Stel de drempel zo in dat er geen signaal wordt opgepikt in de no primary antibody (NP) beelden.
- Pas de drempel verder aan met behulp van de afbeeldingen van de onbehandelde mock-conditie. Om gevoelige detectie van de signaaltoename als gevolg van necroptosestimulatie te garanderen, beperkt u de opname van p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels in schijnomstandigheden door een hogere drempel in te stellen. Controleer altijd het geprogrammeerde analyseprotocol in verschillende afbeeldingen van de nepconditie en necroptose-inducerende virale infectie.
- Voer de analyse uit op alle afbeeldingensets. Exporteer de voxelkwantificering en kernsegmentatie in een .txt bestand voor verdere verwerking in spreadsheetsoftware.
- Maak een draaitabel van de gegevens met de afbeeldingsnaam, de kernkwantificering en de som van gedetecteerde voxels.
- Deel vervolgens de som van positieve voxels door het aantal cellen in de afbeelding. Dit resulteert in een relatieve waarde van positieve voxels per cel. Om de vouwtoename te visualiseren, deelt u de relatieve waarde van p-RIPK3 (S227)+ of p-MLKL (S358)+ voxels per cel door de mediaan van de onbehandelde toestand (mock).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De immunofluorescentiedetectie van MLKL-fosforylering en vooral RIPK3-fosforylering in menselijke cellen is technisch uitdagend26. We presenteren hier een verbeterd kleuringsprotocol voor humane p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) bij de activering van ZBP1. Het protocol bevat een TSA-stap om de detectielimiet en gevoeligheid van de fluorescerende signalen te verbeteren. Om de methode te valideren, werd een zij-aan-zij vergelijking van de TSA-gemedieerde immunofluorescentie met standaard indirecte fluorescerende kleuring van zowel p-RIPK3 (S227) als p-MLKL (S358) uitgevoerd.
HT-29-cellen die menselijke ZBP1 tot expressie brengen, werden gedurende 9 uur geïnfecteerd met een ICP6 RHIM-mutante HSV-1-stam (HSV-1 ICP6mutRHIM) om ZBP1-gemedieerde necroptose en RIPK3-fosforylering te induceren. De HSV-1 ICP6mutRHIM-stam draagt een VQCG-naar-AAAA-mutatie binnen het ICP6 RHIM en is niet in staat om necroptosesignalering stroomafwaarts van ZBP1 14,15 te blokkeren. Zoals eerder gemeld26, was standaard indirecte immunofluorescentie niet gevoelig genoeg om RIPK3 S227 fosforylering te visualiseren met het huidige in de handel verkrijgbare antilichaam, zelfs wanneer het laservermogen van de confocale microscoop werd verhoogd tot 30% (figuur 2A). Daarentegen maakte de opname van een TSA-stap de robuuste detectie van p-RIPK3 (S227) in het cytosol van cellen geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM mogelijk. Het p-RIPK3 (S227) signaal bereikte verzadiging wanneer het laservermogen werd ingesteld op 2% (figuur 2A). Kwantificering van de driedimensionale z-stackbeelden (zie stap 9) toonde een ongeveer 20-voudige toename van het aantal voxels dat positief was voor p-RIPK3 (S227) in HSV-1 ICP6mutRHIM-geïnfecteerde over mock-behandelde cellen (figuur 2B). Het weglaten van het primaire anti-p-RIPK3 (S227) antilichaam uit het TSA-gemedieerde kleuringsprotocol als een no primary (NP) controle leverde geen detecteerbaar signaal op. Om HSV-1 ICP6mutRHIM-geïnfecteerde cellen te visualiseren, werden de monsters samen gekleurd met een primair antilichaam gericht tegen het onmiddellijke vroege virale eiwit ICP0 (figuur 2A). Een laag maar detecteerbaar p-RIPK3 (S227) signaal was aanwezig in de met mock behandelde cellen, wat de constitutieve autofosforylering van humaan RIPK3 op deze site kan vertegenwoordigen5 (zie de discussie). In overeenstemming met een eerder rapport28 is het RHIM van ICP6 niet in staat om RIPK3 S227 fosforylering volledig te blokkeren, omdat we verhoogde p-RIPK3 (S227) kleuring van cellen hebben gedetecteerd die zijn geïnfecteerd met wild-type HSV-1 (HSV-1WT; Figuur 2A,B). Om de specificiteit van het p-RIPK3 (S227) signaal verder te valideren, werden de cellen voorafgaand aan de infectie behandeld met de RIPK3-kinaseremmer GSK'840. GSK'840 bindt zich aan het kinasedomein van RIPK3, waardoor de activiteit ervan wordt voorkomen en daardoor de autofosforylering wordt geremd29. GSK'840 voorkwam RIPK3-fosforylering bij S227 bij ZBP1-activering (figuur 2A, B), wat de specificiteit van de TSA-gemedieerde p-RIPK3 (S227) detectiemethode bevestigde.
Om MLKL-fosforylering te volgen, een eindstadiummarker voor necroptose, werden ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM gedurende 8 uur en 10 uur. De cellen werden gekleurd met een antilichaam tegen S358 gefosforyleerde MLKL (p-MLKL [S358]) met behulp van TSA. De met mock behandelde cellen vertoonden een lage en enigszins punctate cytosolische kleuring van p-MLKL (S358), terwijl sterke p-MLKL-kleuring werd gedetecteerd in de cytosolkern. en bij het plasmamembraan in de cellen die besmet waren met HSV-1 ICP6mutRHIM (figuur 3A). Bovendien werd het p-MLKL (S358) signaal waargenomen in clusters. Dit is in lijn met de porievormende functies van geactiveerde gefosforyleerde MLKL-oligomeren aan het celmembraan en de recent gerapporteerde nucleaire translocatie bij influenza A-infectie 1,2,6,30. Als een positieve p-MLKL (S358) kleuringscontrole, stimuleerden we ZBP1-tot expressie brengende HT-29 cellen met een combinatie van TNF, de SMAC mimetische BV6 en pan-caspaseremmer zVAD-fmk om TNFR1-gemedieerde necroptose te induceren (figuur 3A). Het weglaten van het primaire anti-p-MLKL (S358) antilichaam uit het TSA-gemedieerde kleuringsprotocol als een geen primaire controle leverde geen detecteerbaar signaal op.
Vervolgens voerden we een zij-aan-zij vergelijking uit van p-MLKL (S358) immunofluorescente kleuring met en zonder TSA. ZBP1-expresserende HT-29-cellen werden gedurende 9 uur geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM. Terwijl een laservermogen van 40% nodig was om een specifiek p-MLKL (S358) signaal in de geïnfecteerde cellen te detecteren met behulp van standaard indirecte immunofluorescentie, bereikten de met TSA behandelde monsters al verzadigingssignalen bij een laservermogen van 6% zonder de achtergrondkleuring in de met mock behandelde monsters te verhogen (figuur 3B). Bovendien toonde kwantificering van de driedimensionale z-stackbeelden een meer dan 10-voudige toename van het aantal voxels dat positief was voor p-MLKL (S358) bij gebruik van TSA in vergelijking met standaard indirecte immunofluorescentie. Hieruit blijkt dat TSA zowel de detectiedrempel als de gevoeligheid voor p-MLKL (S358; Figuur 3C).
Ten slotte, om het TSA-gemedieerde immunofluorescentieprotocol voor andere ZBP1-afhankelijke necroptose virale stimuli te valideren, infecteerden we ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen met influenza A-virus (IAV) PR8-stam gedurende 9 h. IAV induceert zowel ZBP1-gemedieerde apoptose als necroptose in menselijke cellen30. TSA maakte inderdaad de robuuste detectie van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) mogelijk, wat erop wijst dat deze cellen necroptose ondergaan (figuur 4A-D).
Figuur 1: Schematische weergave van het TSA-protocol. Cellen worden gezaaid en gestimuleerd in een putplaat, compatibel met high-end microscopie. Daarna worden de monsters gefixeerd in 4% PFA, gepermeabiliseerd en geblokkeerd om aspecifieke binding van primaire antilichamen te voorkomen. Om gefosforyleerde RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) en MLKL (p-MLKL [S358]) te visualiseren, worden specifieke antilichamen die deze belangrijke fosforyleringsplaatsen herkennen' s nachts geïncubeerd op de beeldvormingskamer. Vervolgens wordt een secundair antilichaam toegevoegd, gekoppeld aan een paardenradijsperoxidase (HRP). Deze HRP-groep maakt de activering van gebiotinyleerd tyramide mogelijk in aanwezigheid van H2O2. Vervolgens koppelt de actieve biotine-tyramide covalent aan tyrosineresiduen in de nabijheid van het HRP-gelabelde secundaire antilichaam. Deze omvatten tyrosines op de eiwitten van belang - in dit geval p-RIPK3 of p-MLKL, zoals aangegeven in de figuur - en die van naburige eiwitten en op de primaire en secundaire antilichamen zelf (niet getoond). Deze tyramide signaalversterkingsstap verhoogt de gevoeligheid van het kleuringsprotocol aanzienlijk. In een laatste stap wordt streptavidin gekoppeld aan een fluorescerende groep toegevoegd om de gebiotinyleerde moleculen te visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: HSV-1 ICP6mutRHIM induceert ZBP1-afhankelijke fosforylering van humane RIPK3 bij S227. (A) Representatieve confocale beelden van menselijke ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen, waarbij TSA-kleuring wordt vergeleken met een standaard indirect (geen TSA) immunofluorescentiekleuringsprotocol voor p-RIPK3 (S227). De met mock- en virus geïnfecteerde monsters (HSV-1WT of HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) werden gedurende 9 uur geïncubeerd. Als negatieve controle werd de RIPK3-kinaseremmer GSK'840 (1 μM) geïncludeerd. Een geen primaire (NP) kleuringscontrole van cellen geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) gedurende 9 uur waarin zowel de primaire anti-p-RIPK3 (S227) als ICP0-antilichamen werden weggelaten, is inbegrepen. Het laservermogen dat nodig is om het specifieke p-RIPK3 (S227) signaal te detecteren, wordt op de beelden aangegeven. ICP0 werd gebruikt om de met het virus geïnfecteerde cellen te kleuren en DAPI werd gebruikt om de kern te kleuren. De schaalstaven zijn 10 μm. (B) Relatieve kwantificering van p-RIPK3 (S227)+ voxels met behulp van het TSA-kleuringsprotocol. Elke stip vertegenwoordigt een afbeelding en de rode balk vertegenwoordigt de mediaan. Voxel-telwaarden worden weergegeven ten opzichte van de mediaan van het aantal voxelafbeeldingen in de mock-toestand. Statistieken werden gemaakt met behulp van een eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen met behulp van Tukey-correctie. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), blz≤ 0,01 (**). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: HSV-1 ICP6mutRHIM induceert ZBP1-afhankelijke fosforylering van humane MLKL bij S358. (A) Representatieve confocale beelden van menselijke ZBP1-tot expressie brengende HT-29 cellen. De cellen werden ofwel nep behandeld of geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) gedurende 8 h en 10 h. TSA werd gebruikt om p-MLKL (S358) te detecteren. ICP0 werd gebruikt om de met het virus geïnfecteerde cellen te kleuren en DAPI werd gebruikt om de kern te kleuren. Een geen primaire (NP) kleuringscontrole van cellen die gedurende 10 uur zijn geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) waarin de primaire anti-p-MLKL (S358) is weggelaten, wordt weergegeven. Als positieve controle werden de cellen gedurende 4 uur gestimuleerd met 30 ng/ml TNF, 5 μM BV6 en 20 μM ZVAD-fmk, wat necroptose induceert via TNFR1. De schaalstaven zijn 10 μm. (B) Representatieve confocale beelden van menselijke ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen, waarbij TSA-kleuring wordt vergeleken met een standaard indirect (geen TSA) immunofluorescentiekleuringsprotocol voor p-MLKL (S358). De cellen werden ofwel nep behandeld of geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) gedurende 9 uur. Een NP-kleuringscontrole van cellen die zijn geïnfecteerd met HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) gedurende 9 uur waarin de primaire anti-p-MLKL (S358) en ICP0-antilichamen werden weggelaten, is inbegrepen. Het laservermogen dat nodig is om het specifieke p-MLKL (S358) signaal te detecteren, wordt op de beelden aangegeven. (C) Relatieve kwantificering van p-MLKL (S358)+ voxels met behulp van het standaard (geen TSA) en TSA-kleuringsprotocol. Elke stip vertegenwoordigt een afbeelding en de rode balk vertegenwoordigt de mediaan. De voxeltelwaarden worden weergegeven ten opzichte van de mediaan van het aantal voxelafbeeldingen in de mock-toestand. Statistieken werden gemaakt met behulp van een eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen met behulp van Tukey-correctie. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Influenza A-virus induceert ZBP1-afhankelijke fosforylering van menselijke RIPK3 en MLKL. (A,C) Representatieve confocale beelden van menselijke ZBP1-tot expressie brengende HT-29-cellen. De cellen werden ofwel nep behandeld of geïnfecteerd met influenza A-virus (IAV), PR8-stam (MOI = 4) gedurende 9 uur en gekleurd voor p-RIPK3 (S227; A) of p-MLKL (S358; C) met behulp van het TSA-protocol. De schaalstaven zijn 10 μm. (B,D) Relatieve kwantificering van p-RIPK3 (S227)+ (B) of p-MLKL (S358; D) voxels. Elke stip in (B,D) vertegenwoordigt een afbeelding en de rode balk vertegenwoordigt de mediaan. De voxeltelwaarden worden weergegeven ten opzichte van de mediaan van het aantal voxelafbeeldingen in de mock-toestand. Statistieken werden gedaan met behulp van een Mann-Whitney-test. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit immunofluorescente kleuringsprotocol beschrijft het gebruik van tyramide signaalversterking (TSA) om de gevoeligheid te verhogen voor signaleringsgebeurtenissen van de menselijke necroptotische signaleringsroute die moeilijk te detecteren zijn, waaronder de fosforylering van RIPK3 en MLKL26. De opname van een TSA-stap verbetert de detectiedrempel van p-RIPK3 (S227) en p-MLKL (S358) aanzienlijk en verhoogt de gevoeligheid van p-MLKL (S358) overbelasting. TSA onthulde een p-RIPK3 (S227) signaal dat al aanwezig was in de mock-treated monsters. In menselijke cellen is de autofosforylering van RIPK3 bij S227 een voorwaarde voor necroptoseactivering door een stabiele interactie met MLKL mogelijk te maken. Dit proces vindt al plaats op basale niveaus en resulteert in de vorming van een stabiele inactieve p-RIPK3 (S227)/MLKL-dimeer voorafgaand aan necroptose-inductie 2,5,31. Evenzo detecteert het anti-p-RIPK3-antilichaam dat in deze studie wordt gebruikt ook p-RIPK3 (S227) in onbehandelde cellen door western blotting26.
De fosforylering van MLKL door RIPK3 binnen de activeringslus, bij T357 en S358, resulteert in dissociatie van het inactieve p-RIPK3 (S227)/MLKL-complex en induceert een conformatieverandering waarbij MLKL zijn N-terminal vier helixbundeldomein blootlegt. Geactiveerde p-MLKL oligomeriseert vervolgens en verkeert naar het celmembraan waar het zijn vier helixbundels in de lipide bilayer inbrengt, wat resulteert in cellyse 1,2,6. Met behulp van dit TSA-immunofluorescentieprotocol detecteerden we een sterke toename van S358 MLKL-fosforylering tijdens ZBP1-geïnduceerde necroptose. p-MLKL (S358) clusterde zich in het cytosol en bij het plasmamembraan en werd ook gevonden in de kern bij activering van ZBP1. Van ZBP1 is inderdaad gemeld dat het MLKL-gemedieerde verstoring van het kernmembraan stimuleert in de context van IAV-infectie 8,30. Opgemerkt moet echter worden dat TSA niet alleen biotine-tyramide afzet op het antigeen van belang en de primaire / secundaire antilichamen, maar ook op naburige eiwitten. TSA is daarom niet bij uitstek geschikt om informatie af te leiden over de precieze subcellulaire lokalisatie van de gedetecteerde eiwitten, en we raden TSA niet aan voor colokalisatiestudies.
Herhaalde vries-dooicycli beïnvloeden de stabiliteit van de gebiotinyleerde tyramide. Om een afname van de signaalgevoeligheid te voorkomen, raden we aan om de tyramide te aliquoteren en voor elk experiment een verse aliquot te gebruiken. Voorzichtigheid is geboden bij batch-to-batch verschillen in de biotine-tyramidevoorraden. Als de uiteindelijke concentratie biotine-tyramide te hoog is, zal de niet-specifieke achtergrond van de TSA-versterking het specifieke signaal maskeren. Om dit te controleren, raden we aan om elke nieuwe biotine-tyramidebatch te titreren en een geen primaire kleuringscontrole op te nemen waarbij het primaire antilichaam wordt weggelaten.
In het gepresenteerde protocol was TSA beperkt tot één doelwit. De detectie van gefosforyleerde RIPK3 en MLKL werd niet gecombineerd in dezelfde kleuring, omdat beide primaire antilichamen bij dezelfde soort werden verhoogd. Het protocol kan worden aangepast om meerdere TSA-versterkte signalen (bijv. p-RIPK3 [S227] en p-MLKL [S358]) in hetzelfde monster te detecteren met behulp van multiplex immunofluorescente TSA32,33. Ten slotte kan TSA-gemedieerde amplificatie voor immunofluorescentiemicroscopie worden gebruikt voor de herkenning van biomarkers van andere signaalroutes met gerapporteerde slechte signaal-ruisverhoudingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de VIB Bioimaging Core bedanken voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark. J.N. wordt ondersteund door een doctoraatsbeurs van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO). Het onderzoek in de J.M.-groep werd ondersteund door een Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), een junior onderzoeksbeurs (G031022N) van het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO), een CRIG young investigator proof-of-concept grant, en van de Universiteit Gent. Onderzoek in de P.V.-groep werd ondersteund door EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG en GIGG consortia en VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
