Summary
免疫蛍光染色中のチラミドシグナル増幅により、HSV-1感染後のZBP1誘発ネクロトーシス中のリン酸化RIPK3およびMLKLの高感度検出が可能になります。
Abstract
キナーゼ受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)およびその基質混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、重要な抗ウイルス機能を備えた炎症性細胞死型であるネクロプトーシスの重要な調節因子です。RIPK3の自己リン酸化は、ネクロトーシスMLKLの細孔形成実行タンパク質のリン酸化および活性化を誘導する。細胞膜でのリン酸化MLKLのトラフィッキングとオリゴマー化は、ネクロトーシス細胞死の特徴である細胞溶解をもたらします。核酸センサーZBP1は、RNAおよびDNAウイルスに感染した後、左巻きZ型二本鎖RNA(Z-RNA)に結合することによって活性化されます。ZBP1活性化は、感染した宿主細胞のネクロプトーシスを含む調節された細胞死を誘導することにより、ウイルス感染を制限します。免疫蛍光顕微鏡法は、ZBP1を介したネクロトーシスの下流にあるさまざまなシグナル伝達ステップを細胞ごとに視覚化することができます。しかしながら、ヒトRIPK3およびMLKLに対する現在市販のホスホ特異的抗体を用いた標準的な蛍光顕微鏡の感度は、これらのマーカーの再現可能なイメージングを妨げる。ここでは、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)に感染したヒトHT-29細胞におけるセリン(S)リン酸化RIPK3(S227)およびMLKL(S358)の最適化された染色手順について説明します。免疫蛍光染色プロトコルにチラミドシグナル増幅(TSA)ステップを含めることで、S227リン酸化RIPK3の特異的検出が可能になります。さらに、TSAはS358リン酸化MLKLの検出感度を大幅に向上させます。一緒に、この方法は、ZBP1誘発ネクロプトーシスの誘導中のこれら2つの重要なシグナル伝達イベントの視覚化を可能にします。
Introduction
受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ3(RIPK3)および混合系統キナーゼドメイン様(MLKL)は、ネクロトーシス細胞死の中心的な調節因子です1,2。ネクロトーシスは、抗ウイルス免疫と自己炎症に関与する調節された細胞死の溶解性および炎症性形態です。ウイルス感染細胞のネクロトーシスは、ウイルス複製を直ちにシャットダウンします。ネクロトーシス誘導後の細胞溶解は、抗ウイルス免疫を刺激する損傷関連の分子パターンも放出します3,4。ネクロトーシスは、RIPホモタイプ相互作用モチーフ(RHIM)を介した3つの上流活性化分子のうちの1つとのRIPK3の活性化によって開始されます:RIPK1(TNF受容体1[TNFR1]の関与時)、TIRドメイン含有アダプター誘導インターフェロンβ(TRIF;Toll様受容体3および4の関与時)、または抗ウイルス核酸センサーZ-DNA結合タンパク質1(ZBP1)1,2。.ネクロトーシスシグナル伝達は、RIPK3の自己リン酸化から始まる一連のリン酸化イベントを通じて進行します。キナーゼドメイン内のセリン(S)227でのヒトRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの相互作用を可能にすることによるネクロトーシスの前提条件であり、ヒトRIPK3活性化およびネクロトーシス細胞死の生化学的マーカーとして一般的に使用されています1,5。活性化されると、RIPK3はスレオニン(T)357およびS3581でMLKLの活性化ループをリン酸化します。これにより、MLKL立体構造が変化し、N末端4ヘリックスバンドルドメインが露出します。その後、MLKLはオリゴマー化して細胞膜に輸送し、脂質二重層に露出した4つのらせん束を挿入することで細孔を形成し、最終的に細胞死につながります2,6。
ZBP1は、Z立体構造中の二本鎖RNA(Z-RNA)を含む左巻きのZ型核酸を認識する抗ウイルス核酸センサーです。Z-RNA結合は、ZBP1のN末端に位置する2つのZαドメインを介して起こる。RNAおよびDNAウイルス感染中に蓄積するZ-RNAは、ZBP1 7,8に直接関与すると考えられている。活性化されたZBP1は、その中央RHIMを介してRIPK3をリクルートし、ネクロトーシスを含む調節された細胞死を誘導します9,10。ウイルスは、ZBP1誘導宿主細胞ネクロトーシスに対抗するために、数多くのエスケープメカニズムを採用しています11。例えば、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット1は、ICP6として知られ、UL39によってコードされ、そのN末端にRIMを有し、ヒト細胞におけるZBP1媒介RIPK3活性化を妨害する12,13,14,15。ZBP1はウイルス複製を制限するだけでなく、マウス研究はZBP1活性化が炎症性疾患を引き起こし、癌免疫を刺激することを示しています16、17、18、19、20、21。したがって、ヒト細胞におけるZBP1誘発ネクロトーシス中に発生するシグナル伝達イベントを検出するプロトコルは、これらのプロセスにおけるZBP1の役割を評価するために価値があります。
チラミドシグナル増幅(TSA)は、触媒レポーターデポジション(CARD)とも呼ばれ、抗体ベースのイムノアッセイにおける検出限界とS/N比を改善するために開発されました。TSAの際には、任意の一次抗体を使用して目的の抗原を検出することができます。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、二次抗体と結合し、過酸化水素の存在下でビオチン化チラミドラジカルの局所的な蓄積を触媒します。これらの活性化されたビオチン-チラミドラジカルは、近位チロシン残基と反応して共有結合を形成します。潜在的なチラミド-ビオチン基質には、抗原自体、一次抗体と二次抗体、および隣接タンパク質が含まれます。したがって、TSAはアッセイの感度を有意に向上させるが、その空間分解能の一部は失われる。最終ステップでは、蛍光標識ストレプトアビジンを使用してビオチン分子を検出します。HRP反応は、目的の抗原上または抗原の近くに多くのチラミド-ビオチン分子を沈着させます。これにより、ストレプトアビジン-蛍光色素結合部位の数が大幅に増加し、アッセイの感度が大幅に増幅されます(図1)。あるいは、チラミドを蛍光色素に直接結合させることができるため、ストレプトアビジン共役蛍光色素が不要になります。タンパク質免疫組織化学とDNA/RNAin situハイブリダイゼーションは、TSAがシグナル強度を改善するために採用された最初の方法の1つでした22,23。最近では、TSAは細胞内フローサイトメトリー24および質量分析25と組み合わされています。
ここでは、免疫蛍光顕微鏡を用いて、HSV-1感染によるZBP1の活性化時にセリン227リン酸化ヒトRIPK3(p-RIPK3[S227])およびリン酸化ヒトMLKL(p-MLKL [S358])を検出するためのプロトコルを提示する。ヒトZBP1を安定発現するように形質導入したネクロプトーシス感受性HT-29ヒト大腸腺癌細胞株を使用します。これらの細胞は、ウイルスRHIM(VQCG)内の4つのコアアミノ酸がアラニン(AAAA)に置換された変異ICP6タンパク質(HSV-1 ICP6mutRHIM)を発現するHSV-1株に感染し、それによってICP6がZBP1を介したネクロトーシスをブロックできないようにしました13,14,15。免疫染色26において、現在市販されているp-RIPK3およびp-MLKLに対する抗体のシグナル対ノイズ比が低いという問題を克服するために、チラミドシグナル増幅(TSA)ステップ(図1)を実行し、その結果、ヒトp-RIPK3の検出がロバストになり(S227)、ヒトp-MLKL(S358)の検出感度が桁違いに向上します。
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Protocol
1.ビオチン化チラミドの調製
- ビオチン-チラミドから始まるビオチン化チラミドを調製します。10 mMのストック溶液を作るには、3.6 mgのビオチン-チラミドを1 mLのDMSOに溶解します。溶解した製品を-20°Cでアリコートで保存し、品質を維持します。
2. HT-29細胞の培養液の維持
注:ZBP1発現HT-29は、ヒトZBP1をコードするレンチベクター27 による形質導入によって生成された。
- ZBP1発現HT-29細胞を、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および10%ウシ胎児血清(以下、フル培地と呼びます)を添加したマッコイの5A培地に保存し、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーター内で維持します。理想的には、通過数が少ない(10未満)セルを使用します。実験開始前の解凍サイクル後少なくとも5日間細胞を回復させてください。
- 培養フラスコから細胞を剥離するには、培地を取り出し、5 mLのPBS(37°Cに予熱)で細胞を洗浄します。次に、適量のトリプシン/EDTA(それぞれ0.05%トリプシンと0.032%EDTA、37°Cに予熱)を細胞に加えます(T75フラスコの場合は2 mL、T175フラスコの場合は3 mL)。
- 細胞をトリプシン/EDTAとともに、5%二酸化炭素を含む37°Cのインキュベーター内で最大10分間インキュベートします。その後、フラスコをタップし、4倍〜20倍の対物倍率の顕微鏡を使用して、細胞がフラスコから剥離したかどうかを視覚的に確認します。
- 細胞が完全に剥離していない場合は、37°Cでさらに5分間インキュベートします。 細胞が剥離したら、フラスコに6 mLのフル培地を加えて酵素反応を停止します。
- 細胞懸濁液を15 mLチューブに集めます。トリパンブルー染色を使用して細胞をカウントし、生存率を評価します。1:5希釈をお勧めします。細胞の生存率が90%を超える場合にのみ実験を進めてください。
3.細胞の実験、播種、刺激の開始
- 90,000個のZBP1発現HT-29細胞を、ハイエンドの顕微鏡観察を可能にする1cm²の表面積ウェルプレートにフル培地で播種します。ウェルあたり200 μLのエンドボリュームを使用してください。
- 細胞を5%二酸化炭素で37°Cで一晩インキュベートします。染色コントロールのためにいくつかの追加のウェルを播種する必要があることを考慮してください(これはステップ5.6で詳しく説明します)。
- 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、ネクロプトーシスを誘発する刺激を細胞に追加します。ここでは、細胞をHSV-1 ICP6mutRHIM (感染多重度[MOI]5、プラーク形成単位(pfu)を細胞数で割った値として定義;pfuをVero細胞のプラークアッセイを用いて6時間、8時間、または10時間定量した。
- ネクロトーシス誘導のポジティブコントロールとして、30 ng/mL TNF、20 μMの汎カスパーゼ阻害剤zVAD-fmk、および5 μMのSMAC模倣体BV6を含むネクロプトーシス誘発カクテルで細胞を4時間刺激します。
- p-RIPK3(S227)染色の陰性対照として、RIPK3キナーゼ活性を阻害し、S227の自己リン酸化を防止するGSK'840(1μM)が挙げられる。理想的には、未処理の状態で、そしてネクロトーシス刺激の後に阻害剤を添加する。阻害剤はウイルス感染と同時に添加することができる。
- 37°Cに予熱したフルメディウムで刺激を準備します。 すべての刺激にウェルあたり200 μLのエンドボリュームを使用してください。
4.セルの固定
- 培地を除去し、200 μLの1x PBSで細胞を洗浄します。次に、150 μLの4%PFA(室温で平衡化済み)を細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。
注:簡単に剥離できるセルを使用している場合は、次のようにセルの固定を最適化できます。ウェルから100 μLの培地を取り出すと、プレート上に100 μLの容量が残ります。100 μLの4%PFAを細胞に加えます。細胞を室温で5分間インキュベートします。その後、ウェルから培地/固定液を取り出し、150 μLの4%PFAと交換します。細胞を完全に固定するために、室温でさらに20分間細胞をインキュベートします。 - 固定後、4%PFAを除去し、200 μLの1x PBSで細胞を3倍洗浄します。サンプルは、さらなる処理が行われるまで、4°Cで一晩、1x PBSの過剰(>200 μL)で保存できます。
5.透過処理と一次染色
- PBSを除去し、100 μLの透過処理バッファー(PBS中の0.5%Triton X-100)を加えます。室温で30分間インキュベートします。
- 透過処理バッファーを除去し、続いて100 μLの洗浄バッファー(PBS中の0.1%Triton X-100)でウェルを洗浄します。イメージングチャンバーを洗浄バッファーとともに、傾斜した実験室のシェーカーで室温で5分間インキュベートします(毎分20〜30回の揺動運動)。
- 一次抗体の非特異的結合を防ぐために、100 μLのブロッキング培地を添加し、室温で2時間インキュベートします。あるいは、このブロッキングステップは、室温で1時間、PBS中の3%BSA、0.1%Triton-X-100でブロッキングすることによって置き換えてもよい。
- ウェルを100 μLの洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
- 洗浄バッファーを除去した後、一次抗体をイメージングチャンバーに加え、4°Cで一晩インキュベートします。 ウェルを覆うために100 μLのエンドボリュームを使用します。4°Cで一晩インキュベーション中は、イメージングチャンバーを傾斜した実験用シェーカーに置かないでください。
注:抗p-MLKL(S358;希釈:1:200)および抗p-RIPK3(S227;希釈:1:200)はウサギを宿主種として共有するため、1つのウェルに組み合わせないでください。ウイルス感染を監視するには、選択したウイルスタンパク質に対する一次抗体をp-MLKL(S358)またはp-RIPK3(S227)と組み合わせます。ここでは、細胞をHSV-1感染感染に感染させた後、ICP0染色を行った(希釈:1:50、宿主種:マウス)。 - この時点で必要な染色コントロールを考慮してください。TSA増幅ステップの潜在的なバックグラウンドを視覚化するために、常に一次抗体なし条件を含めてマスキング閾値を設定します(ステップ9を参照)。
注:共染色プロトコル(例:p-MLKL [S358]またはp-RIPK3 [S227]をウイルスタンパク質に対する抗体と組み合わせる)の場合は、単一の染色も使用します。単一の染色の使用は、他のイメージングチャネルの潜在的なブリードスルー信号を補正するために重要です。
6. チラミドシグナル増幅(TSA)
- 一次抗体ミックスを除去し、100 μLの洗浄バッファー(PBS溶液0.1% Triton X-100)でウェルを3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
- 洗浄バッファーを除去し、増幅が必要な一次抗体の種を認識するHRP標識二次抗体を100 μL加えます。p-RIPK3(S227)またはp-MLKL(S358)シグナルを増幅するには、抗ウサギHRPを100 μL添加し、傾斜ラボ用シェーカーで室温で30分間インキュベートします。
注:p-MLKL(S358)またはp-RIPK3(S227)のみが増幅されます。ウイルスタンパク質の染色は、標準的な間接染色法を使用して視覚化されます。 - その後、ウェルを100 μLの洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
- 次のステップでは、ビオチン化チラミドを顕微鏡プレートに追加します。二次抗体に結合したHRP基を用いて、酵素反応は一次標的に近接したチラミドラジカルの形成を引き起こす(ここでは、p-MLKL [S358]またはp-RIPK3 [S227])。
- HRPの酵素活性を活性化するには、ビオチン化チラミドと一緒に酸化基質を追加します。これを達成するには、TSAバッファー(0.1 Mホウ酸[pH 8.5])に0.03 M H 2 O2を補給します。具体的には、5 mLのTSAバッファーを取り、5 μLの30%H2O2を加えます。
- 次に、ビオチン-チラミドをH2O2添加TSAバッファーで1:1,000から1:20,000の範囲で希釈します。
注:ビオチン-チラミドの希釈係数は、バッチごとに最適化する必要があります。 - ウェルから洗浄バッファーを取り出し、希釈したビオチン-チラミドをウェルに添加して終末容量を100 μLにします。 傾斜した実験用シェーカーで室温で10分間インキュベートします。
- 次に、ウェルを100 μLの洗浄バッファー(PBS中の0.1%Triton X-100)で3回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
7. 蛍光色素
注:一次抗体のシグナルはビオチン基に変換されるため、p-MLKL(S358)およびp-RIPK3(S227)は、蛍光色素に結合したストレプトアビジンを使用して視覚化されます(フルオロフォア568、希釈:1:500)。さらに、核をDAPI(5 μg/mL)で染色します。ウイルスタンパク質が染色プロトコルに含まれている場合は、一次抗体の宿主種に対する適切な蛍光標識二次抗体を含めます。代表的な結果では、マウス抗ICP0を使用した。二次抗体として、フルオロフォア633に結合したヤギ抗マウス(希釈:1:1,000)が含まれていた。
- 上記の抗体と染色剤を含む洗浄バッファー(0.1% Triton X-100 PBS溶液)で染色ミックスを作ります。洗浄バッファーを除去し、染色ミックス100 μLを加え、傾斜ラボ用シェーカーで室温で1時間インキュベートします。このステップ以降、イメージングチャンバーを光から遮蔽してください。
- 次に、ウェルを洗浄バッファー(PBS中の0.1%トリトンX-100)で2回洗浄します。洗浄ステップを傾斜した実験用シェーカーで室温で5分間インキュベートします。
- 最後に、ウェルを1x PBSで2回すすぎます。イメージングするまで、サンプルを1x PBSの過剰(>200 μL)で保存します。あるいは、サンプルを封入剤に浸して染色を保存します。これで、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。
8. 共焦点顕微鏡によるイメージング
- イメージングの少なくとも10分前に共焦点顕微鏡とレーザーの電源を入れます。
- 感度のために液浸対物レンズを使用してください。好ましくは、40倍または63倍の対物倍率を使用する。イメージングする前に、適切なコットンボールを使用してレンズクリーナーで液浸対物レンズを清掃します。対物レンズが汚れていると(ほこりなど)、画像の品質が低下する可能性があります。
- イメージングチャンバーの底に過剰量のオイルを入れます。さらに、選択した目的にオイルを一滴加えます。
- イメージングチャンバーを顕微鏡の上に置きます。DAPI染色または明視野イメージングを使用してフォーカスフィールドを見つけます。必要に応じて、イメージングチャンバーの周りを移動して、液浸オイルが適切に広がるようにします。
- 顕微鏡に必要なイメージングトラックを設定します。顕微鏡によって、以下の手順は異なる場合があります(表1)。
注意: イメージングトラックを設定するときは、核染色が最後に測定されるようにトラックをプログラムしてください。405 nmレーザーは、光退色に寄与し、したがって、すべてのチャネルで特定の信号が失われる可能性があります。 - p-RIPK3 (S227) または p-MLKL (S358) の存在について完全なセルを分析するには、セルの高さにまたがる Z スタックを測定します。ここでは、zスタックは0.16μmごとに40スライスで構成されており、6.22μmの範囲になりました。
| トラック | レーザー | ビームスプリッター | フィルター |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| ウイルス遺伝子: ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| 核: ダピ | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
表1:細胞可視化のためのイメージングトラック。
9.データ分析と定量化
- 顕微鏡画像をソフトウェアにアップロードします。拡張フォーカスを使用して、Z スタックのすべての情報を 2D 画像で視覚化します。
- 次に、以下の情報を抽出するために解析プロトコルをプログラムする:画像当たりの細胞数、p-RIPK3(S227)+またはp-MLKL(S358)+染色を示すボクセルの合計。ボクセルは、ピクセルに相当する 3 次元ボリュームを表します。
- 画像あたりの細胞数を定量化するには、核をセグメント化します。セグメンテーション結果のノイズを低減するには、セグメンテーションにサイズ制限(>100 μm³)を追加します。セグメント化された核の数は、画像内の細胞の数を表します。
- p-RIPK3 (S227)+ または p-MLKL (S358)+ ボクセルの量を定量化するには、しきい値ベースのセグメンテーションをプログラムします。一次抗体なし(NP)画像でシグナルがピックアップされないように閾値を設定します。
- 未処理のモック条件の画像を使用して、しきい値をさらに調整します。ネクロトーシス刺激による信号増加を高感度に検出するには、より高いしきい値を設定して、模擬条件でp-RIPK3(S227)+またはp-MLKL(S358)+ボクセルのピックアップを制限します。プログラムされた分析プロトコルを、模擬状態とネクロプトーシス誘発ウイルス感染からのいくつかの画像で常に確認してください。
- すべての画像セットに対して分析を実行します。ボクセル定量化と核セグメンテーションを.txtファイルにエクスポートして、スプレッドシートソフトウェアでさらに処理します。
- 画像名、核の定量化、検出されたボクセルの合計を示すデータのピボットテーブルを作成します。
- 次に、正のボクセルの合計を画像内のセル数で割ります。これにより、セルあたりの正のボクセルの相対値が得られます。フォールドの増加を視覚化するには、セルあたりの p-RIPK3 (S227)+ または p-MLKL (S358)+ ボクセルの相対値を未処理条件の中央値 (mock) で割ります。
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Representative Results
ヒト細胞におけるMLKLリン酸化、特にRIPK3リン酸化の免疫蛍光検出は技術的に困難です26。ここでは、ZBP1の活性化時のヒトp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の染色プロトコルの改善を紹介します。このプロトコルには、蛍光シグナルの検出限界と感度を改善するためのTSAステップが含まれています。この方法を検証するために、TSAを介した免疫蛍光とp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の両方の標準的な間接蛍光染色を並べて比較しました。
ヒトZBP1を発現するHT-29細胞にICP6 RIM変異体HSV-1株(HSV-1 ICP6mutRHIM)を9時間感染させ、ZBP1媒介ネクロトーシスおよびRIPK3リン酸化を誘導した。HSV-1 ICP6mutRHIM株は、ICP6 RIM内でVQCGからAAAAへの変異を持ち、ZBP1の下流のネクロトーシスシグナル伝達を遮断することができません14,15。既往報告26のように、標準的な間接免疫蛍光は、共焦点顕微鏡のレーザー出力が30%に増加した場合でも、現在市販の抗体によるRIPK3 S227リン酸化を視覚化するのに十分な感度ではなかった(図2A)。対照的に、TSAステップを含めることで、HSV-1 ICP6mutRHIMに感染した細胞の細胞質ゾルにおけるp-RIPK3(S227)の堅牢な検出が可能になりました。p-RIPK3(S227)信号は、レーザ出力を2%に設定すると飽和状態に達しました(図2A)。3次元Zスタック画像の定量化(ステップ9を参照)は、模擬処理細胞よりもHSV-1 ICP6mutRHIM感染においてp-RIPK3陽性(S227)のボクセル数が約20倍増加したことを示した(図2B)。一次抗p-RIPK3(S227)抗体を非一次(NP)対照としてTSA媒介染色プロトコルから除外しても、検出可能なシグナルが得られなかった。HSV-1 ICP6mutRHIM感染細胞を可視化するために、サンプルを即時初期ウイルスタンパク質ICP0に対する一次抗体で共染色した(図2A)。模擬処理された細胞には、低いが検出可能なp-RIPK3(S227)シグナルが存在し、これはこの部位5におけるヒトRIPK3の構成的自己リン酸化を表している可能性があります(ディスカッションを参照)。以前の報告28と同様に、野生型HSV-1(HSV-1WT;図2A,B)。p-RIPK3(S227)シグナルの特異性をさらに検証するために、細胞を感染前にRIPK3キナーゼ阻害剤GSK'840で処理した。GSK'840はRIPK3のキナーゼドメインに結合し、その活性を妨げ、それによってその自己リン酸化を阻害します29。GSK'840は、ZBP1活性化時にS227でRIPK3リン酸化を防止し(図2A、B)、TSAを介したp-RIPK3(S227)検出法の特異性を確認しました。
ネクロプトーシスの末期マーカーであるMLKLリン酸化を追跡するために、ZBP1発現HT-29細胞をHSV-1 ICP6mutRHIMに8時間および10時間感染させた。細胞をTSAを用いてS358リン酸化MLKL(p-MLKL[S358])に対する抗体で染色した。模擬処理した細胞は、p-MLKLの低層でやや点状の細胞質染色(S358)を示し、細胞質ゾル核では強いp-MLKL染色が検出された。HSV-1 ICP6mutRIMに感染した細胞内の原形質膜で(図3A)。また、p-MLKL(S358)シグナルはクラスターで観測された。これは、細胞膜における活性化リン酸化MLKLオリゴマーの細孔形成機能、およびインフルエンザA感染時の核移行が最近報告されたことと一致しています1,2,6,30。陽性p-MLKL(S358)染色コントロールとして、TNF、SMAC模倣体BV6、および汎カスパーゼ阻害剤zVAD-fmkの組み合わせでZBP1発現HT-29細胞を刺激し、TNFR1を介したネクロトーシスを誘導しました(図3A)。一次コントロールなしとしてTSA媒介染色プロトコルから一次抗p-MLKL(S358)抗体を省略しても、検出可能なシグナルが得られませんでした。
次に、TSAの有無にかかわらずp-MLKL(S358)免疫蛍光染色を並べて比較した。ZBP1発現HT-29細胞をHSV-1 ICP6mutRHIMで9時間感染させた。標準的な間接免疫蛍光法を使用して感染細胞内の特定のp-MLKL(S358)シグナルを検出するには40%のレーザー出力が必要でしたが、TSA処理されたサンプルは、模擬処理されたサンプルのバックグラウンド染色を増加させることなく、すでに6%のレーザーパワーで飽和シグナルに達していました(図3B)。さらに、3次元zスタック画像の定量化は、標準的な間接免疫蛍光と比較して、TSAを使用した場合のp-MLKL(S358)陽性のボクセル数が10倍以上増加したことを示しました。これは、TSAがp-MLKLの検出閾値と感度の両方を改善することを示しています(S358; 図3C)。
最後に、他のZBP1依存性ネクロトーシスウイルス刺激に対するTSA媒介免疫蛍光プロトコルを検証するために、ZBP1発現HT-29細胞にインフルエンザAウイルス(IAV)PR8株を9時間感染させた。実際、TSAはp-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の堅牢な検出を可能にし、これらの細胞がネクロトーシスを受けていることを示しています(図4A-D)。
図1:TSAプロトコルの概略図。細胞は、ハイエンド顕微鏡法と互換性のあるウェルプレートに播種および刺激されます。その後、サンプルを4%PFAで固定し、透過処理してブロックし、一次抗体の非特異的結合を防ぎます。リン酸化RIPK3(p-RIPK3 [S227])およびMLKL(p-MLKL [S358])を可視化するために、これらの重要なリン酸化部位を認識する特異的抗体をイメージングチャンバー上で一晩インキュベートします。次に、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合した二次抗体を添加します。このHRP基は、H2O2の存在下でビオチン化チラミドの活性化を可能にする。続いて、活性ビオチン-チラミドは、HRP標識二次抗体に近接したチロシン残基に共有結合します。これらには、目的のタンパク質(この場合、図に示すようにp-RIPK3またはp-MLKL)上のチロシン、および隣接するタンパク質のチロシン、および一次抗体および二次抗体自体(図示せず)が含まれます。このチラミドシグナル増幅ステップは、染色プロトコルの感度を大幅に向上させます。最終ステップでは、蛍光基に結合したストレプトアビジンを添加して、ビオチン化分子を可視化します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HSV-1 ICP6変異RIMは、S227においてヒトRIPK3のZBP1依存性リン酸化を誘導する。 (A)TSA染色をp-RIPK3の標準的な間接(TSAなし)免疫蛍光染色プロトコルと比較した、ヒトZBP1発現HT-29細胞の代表的な共焦点画像(S227)。モックおよびウイルスに感染したサンプル(HSV-1WTまたはHSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5])を9時間インキュベートしました。陰性対照として、RIPK3キナーゼ阻害剤GSK'840(1μM)が含まれていた。一次抗p-RIPK3(S227)およびICP0抗体の両方が省略されたHSV-1 ICP6mutRHIM(MOI=5)に9時間感染した細胞の非一次(NP)染色対照が含まれる。特定のp-RIPK3(S227)信号を検出するために必要なレーザパワーが画像に示されています。ICP0はウイルス感染細胞の染色に使用され、DAPIは核の染色に使用されました。スケールバーは10μmです。 (B)TSA染色プロトコルを使用したp-RIPK3(S227)+ボクセルの相対定量。すべてのドットは画像を表し、赤いバーは中央値を表します。ボクセル数の値は、モック条件の画像のボクセル数の中央値を基準にして表示されます。統計は、テューキー補正を使用した多重比較の一元配置分散分析を使用して行われました。p > 0.05 (n.s), p≤ 0.05 (*), p≤ 0.01 (**). この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HSV-1 ICP6変異RIMは、S358においてヒトMLKLのZBP1依存的リン酸化を誘導する。 (A)ヒトZBP1発現HT-29細胞の代表的な共焦点画像。細胞を模擬処理するか、HSV-1 ICP6mutRHIM(MOI = 5)に8時間および10時間感染させ、TSAを使用してp-MLKLを検出しました(S358)。ICP0はウイルス感染細胞の染色に使用され、DAPIは核の染色に使用されました。一次抗p-MLKL(S358)が省略されたHSV-1 ICP6mutRHIM(MOI=5)に10時間感染させた細胞の非一次(NP)染色コントロールが示されている。ポジティブコントロールとして、細胞を30 ng/mL TNF、5 μM BV6、およびTNFR1を介してネクロトーシスを誘導する20 μM ZVAD-fmkで4時間刺激しました。スケールバーは10μmです。 (B)ヒトZBP1発現HT-29細胞の代表的な共焦点画像、TSA染色をp-MLKLの標準的な間接(TSAなし)免疫蛍光染色プロトコルと比較する(S358)。細胞を模擬処理するか、HSV-1 ICP6mutRHIM(MOI = 5)に9時間感染させた。一次抗p-MLKL(S358)およびICP0抗体が省略されたHSV-1 ICP6mutRHIM(MOI=5)に9時間感染させた細胞のNP染色コントロールが含まれる。特定のp-MLKL(S358)信号を検出するために必要なレーザー出力が画像に示されています。(C)標準(TSAなし)およびTSA染色プロトコルを使用したp-MLKL(S358)+ボクセルの相対定量。すべてのドットは画像を表し、赤いバーは中央値を表します。ボクセル数の値は、モック条件の画像のボクセル数の中央値を基準にして表示されます。統計は、テューキー補正を使用した多重比較の一元配置分散分析を使用して行われました。 p > 0.05 (n.s), p ≤ 0.0001 (****).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:インフルエンザAウイルスは、ヒトRIPK3およびMLKLのZBP1依存性リン酸化を誘導します。 (A、C)ヒトZBP1発現HT-29細胞の代表的な共焦点画像。細胞を模擬処理するか、インフルエンザAウイルス(IAV)、PR8株(MOI = 4)に9時間感染させ、p-RIPK3(S227;A) または p-MLKL (S358;C) TSA プロトコルを使用する。スケールバーは10μmです。 (B,D) p-RIPK3 (S227)+ (B) または p-MLKL (S358;D)ボクセル。(B、D)のすべてのドットは画像を表し、赤いバーは中央値を表します。ボクセル数の値は、モック条件の画像のボクセル数の中央値を基準にして表示されます。統計はマン・ホイットニー検定を用いて行った。p≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この免疫蛍光染色プロトコルでは、RIPK3およびMLKL26のリン酸化など、検出が困難なヒトネクロトーシスシグナル伝達経路のシグナル伝達イベントの感度を高めるためのチラミドシグナル増幅(TSA)の使用について説明しています。TSAステップを含めることで、p-RIPK3(S227)およびp-MLKL(S358)の検出閾値が大幅に向上し、p-MLKL(S358)ひずみの感度が向上します。TSAは、模擬処理されたサンプルにすでに存在するp-RIPK3(S227)シグナルを明らかにしました。ヒト細胞では、S227でのRIPK3の自己リン酸化は、MLKLとの安定した相互作用を可能にすることによるネクロトーシス活性化の前提条件です。このプロセスはすでに基礎レベルで発生しており、ネクロトーシス誘導の前に安定した不活性なp-RIPK3(S227)/MLKL二量体の形成をもたらします2,5,31。同様に、本研究で用いた抗p-RIPK3抗体も、ウェスタンブロッティングにより未処理細胞中のp-RIPK3(S227)を検出する26。
T357およびS358における活性化ループ内のRIPK3によるMLKLのリン酸化は、不活性なp-RIPK3(S227)/MLKL複合体の解離をもたらし、MLKLがそのN末端4つのらせんバンドルドメインを露出させる立体構造変化を誘発する。活性化されたp-MLKLはオリゴマー化して細胞膜に輸送され、そこで4つのらせん束が脂質二重層に挿入され、細胞溶解が起こります1,2,6。このTSA免疫蛍光プロトコルを使用して、ZBP1誘発ネクロプトーシス中のS358 MLKLリン酸化の強い増加を検出しました。p-MLKL(S358)は細胞質ゾル内および原形質膜にクラスター化し、ZBP1活性化時に核内にも見られた。実際、ZBP1は、IAV感染の状況においてMLKLを介した核膜の摂動を刺激することが報告されている8,30。ただし、TSAはビオチン-チラミドを目的の抗原および一次/二次抗体だけでなく、隣接するタンパク質にも沈着させることに注意してください。したがって、TSAは、検出されたタンパク質の正確な細胞内局在に関する情報を推測するのに理想的ではなく、共局在研究にTSAを推奨しません。
凍結融解サイクルの繰り返しは、ビオチン化チラミドの安定性に影響を与えます。信号感度の低下を防ぐために、チラミドを分注し、各実験に新しいアリコートを使用することをお勧めします。ビオチン-チラミドストックのバッチ間の違いには注意が必要です。.ビオチン-チラミドの最終濃度が高すぎると、TSA増幅の非特異的バックグラウンドが特異的シグナルをマスクします。これを制御するには、すべての新しいビオチン-チラミドバッチを滴定し、一次抗体を省略した一次染色コントロールを含めることをお勧めします。
提示されたプロトコルでは、TSAは1つのターゲットに制限されていました。リン酸化RIPK3とMLKLの検出は、両方の一次抗体が同じ種で産生されたため、同じ染色では組み合わせられませんでした。このプロトコルは、マルチプレックス免疫蛍光TSA32,33を使用して、同じサンプル内の複数のTSA増幅シグナル(p-RIPK3 [S227]およびp-MLKL [S358]など)を検出するように適合させることができます。最後に、免疫蛍光顕微鏡用のTSA媒介増幅は、S/N比が低いと報告されている他のシグナル伝達経路のバイオマーカーの認識に使用できます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
VIBバイオイメージングコアのトレーニング、サポート、インストゥルメントパークへのアクセスに感謝します。J.N.は、フランダース研究財団(FWO)の博士号フェローシップによってサポートされています。JMグループの研究は、オデュッセウスII助成金(G0H8618N)、EOS INLADIS(40007512)、フランダース研究財団(FWO)からのジュニア研究助成金(G031022N)、CRIG若手研究者の概念実証助成金、およびゲント大学の支援を受けました。P.V.グループの研究は、EOS MODEL-IDI(30826052)、EOS INFLADIS (40007512)、FWOシニア研究助成金(G.0C76.18N、G.0B71.18N、G.0B96.20N、G.0A9322N)、メトサレム(BOF16/MET_V/007)、iBOF20/IBF/039 ATLANTIS、Foundation Against Cancer(F/2016/865、F/2020/1505)、CRIGおよびGIGGコンソーシアム、およびVIBの支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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