Amplificazione del segnale tiramido per la colorazione immunofluorescente della fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL dopo infezione da HSV-1 in cellule umane
Summary
L’amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.
Abstract
La proteina chinasi 3 (RIPK3) e la sua linea mista di substrato (MLKL) sono regolatori critici della necroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare con importanti funzioni antivirali. L’autofosforilazione di RIPK3 induce fosforilazione e attivazione della proteina boia che forma i pori della necroptosi MLKL. Il traffico e l’oligomerizzazione di MLKL fosforilato sulla membrana cellulare provocano la lisi cellulare, caratteristica della morte cellulare necroptotica. Il sensore di acido nucleico ZBP1 viene attivato legandosi all’RNA a doppio filamento sinistrorso a forma Z (Z-RNA) dopo l’infezione da virus a RNA e DNA. L’attivazione di ZBP1 limita l’infezione virale inducendo la morte cellulare regolata, compresa la necroptosi, delle cellule ospiti infette. La microscopia a immunofluorescenza consente la visualizzazione di diverse fasi di segnalazione a valle della necroptosi mediata da ZBP1 su base cellulare. Tuttavia, la sensibilità della microscopia a fluorescenza standard, che utilizza gli attuali anticorpi fosfo-specifici disponibili in commercio contro RIPK3 e MLKL umani, preclude l’imaging riproducibile di questi marcatori. Qui, descriviamo una procedura di colorazione ottimizzata per la serina (S) fosforilata RIPK3 (S227) e MLKL (S358) in cellule umane HT-29 infettate da herpes simplex virus 1 (HSV-1). L’inclusione di una fase di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) nel protocollo di colorazione immunofluorescente consente la rilevazione specifica di RIPK3 fosforilato S227. Inoltre, TSA aumenta notevolmente la sensibilità del rilevamento di MLKL fosforilato S358. Insieme, questo metodo consente la visualizzazione di questi due eventi di segnalazione critici durante l’induzione della necroptosi indotta da ZBP1.
Introduction
La proteina chinasi 3 serina/treonina interagente con recettore (RIPK3) e la chinasi mista (MLKL) sono regolatori centrali della morte cellulare necroptotica 1,2. La necroptosi è una forma litica e infiammatoria di morte cellulare regolata coinvolta nell’immunità antivirale e nell’autoinfiammazione. La necroptosi delle cellule infette da virus interrompe immediatamente la replicazione del virus. La lisi cellulare dopo induzione necroptosi rilascia anche modelli molecolari associati al danno, che stimolano l’immunità antivirale 3,4. La necroptosi è iniziata dall’attivazione di RIPK3 a seguito di interazioni mediate dal motivo di interazione omotipica (RHIM) RIP con una delle tre molecole attivanti a monte: RIPK1 (su coinvolgimento del recettore TNF 1 [TNFR1]), interferone-β che induce adattatori del dominio TIR (TRIF; su coinvolgimento dei recettori Toll-like 3 e 4) o la proteina legante il DNA 1 del sensore di acido nucleico antivirale (ZBP1)1,2 . La segnalazione della necroptosi procede attraverso una serie di eventi di fosforilazione a partire dall’autofosforilazione di RIPK3. L’autofosforilazione di RIPK3 umano alla serina (S)227 all’interno del suo dominio chinasico è un prerequisito per la necroptosi consentendo l’interazione con MLKL ed è comunemente usato come marcatore biochimico per l’attivazione di RIPK3 umano e la morte delle cellule necroptotiche 1,5. Una volta attivato, RIPK3 fosforila il ciclo di attivazione di MLKL a livello di treonina (T)357 e S3581. Ciò provoca un cambiamento nella conformazione MLKL, con conseguente esposizione del dominio del fascio a quattro eliche N-terminale. MLKL quindi oligomerizza e traffica verso la membrana cellulare dove forma un poro attraverso l’inserimento dei quattro fasci di eliche esposti nel doppio strato lipidico, portando infine alla morte cellulare 2,6.
ZBP1 è un sensore di acido nucleico antivirale che riconosce gli acidi nucleici sinistrorsi a forma Z, incluso l’RNA a doppio filamento nella conformazione Z (Z-RNA). Il legame Z-RNA avviene tramite due domini Zα posizionati al N-terminale di ZBP1. Si ritiene che lo Z-RNA che si accumula durante l’infezione da virus dell’RNA e del DNA coinvolga direttamente ZBP1 7,8. ZBP1 attivato recluta RIPK3 attraverso i suoi RHIM centrali e induce la morte cellulare regolata, inclusa la necroptosi 9,10. I virus hanno adottato numerosi meccanismi di fuga per contrastare la necroptosi delle cellule ospiti indotta da ZBP111. Ad esempio, la subunità 1 della ribonucleotide reduttasi del virus dell’herpes simplex 1 (HSV-1), nota come ICP6 e codificata da UL39, ospita RHIM al suo N-terminale che interferisce con l’attivazione di RIPK3 mediata da ZBP1 nelle cellule umane12,13,14,15. ZBP1 non solo limita la replicazione virale, ma studi sui topi hanno dimostrato che l’attivazione di ZBP1 causa malattie infiammatorie e stimola l’immunità al cancro 16,17,18,19,20,21. I protocolli che rilevano gli eventi di segnalazione che si verificano durante la necroptosi indotta da ZBP1 nelle cellule umane sono, quindi, preziosi per valutare il ruolo di ZBP1 in questi processi.
L’amplificazione del segnale di tiramido (TSA), nota anche come CARD (Catalyzed Reporter Deposition), è stata sviluppata per migliorare il limite di rilevazione e il rapporto segnale-rumore nei saggi immunologici basati su anticorpi. Durante la TSA, qualsiasi anticorpo primario può essere utilizzato per rilevare l’antigene di interesse. La perossidasi del rafano (HRP), accoppiata ad un anticorpo secondario, catalizza l’accumulo locale di radicali tiramidici biotinilati in presenza di perossido di idrogeno. Questi radicali biotina-tiramide attivati reagiscono quindi con residui di tirosina prossimale per formare legami covalenti. I potenziali substrati di tiramide-biotina includono l’antigene stesso, gli anticorpi primari e secondari e le proteine vicine. Pertanto, mentre la TSA migliora significativamente la sensibilità del test, parte della sua risoluzione spaziale viene persa. In una fase finale, le molecole di biotina vengono rilevate utilizzando streptavidina marcata con fluorescenza. La reazione HRP deposita molte molecole di tiramide-biotina sopra o vicino all’antigene di interesse. Ciò aumenta notevolmente il numero di siti di legame streptavidina-fluorocromo, amplificando così notevolmente la sensibilità del saggio (Figura 1). In alternativa, la tiramide può essere accoppiata direttamente a un fluorocromo, eliminando la necessità di fluorofori accoppiati a streptavidina. L’immunoistochimica delle proteine e l’ibridazione DNA/RNA in situ sono stati tra i primi metodi con cui la TSA è stata impiegata per migliorare l’intensità del segnale22,23. Più recentemente, la TSA è stata combinata con citometria a flusso intracellulare24 e spettrometria di massa25.
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la serina 227 fosforilata umana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) e la MLKL umana fosforilata (p-MLKL [S358]) dopo l’attivazione di ZBP1 da infezione da HSV-1 utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. Utilizziamo una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano HT-29 sensibile alla necroptosi che è stata trasdotta per esprimere stabilmente ZBP1 umano. Queste cellule sono state infettate con un ceppo HSV-1 che esprime una proteina ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) in cui quattro aminoacidi core all’interno del RHIM virale (VQCG) sono stati sostituiti da alanine (AAAA), rendendo così l’ICP6 incapace di bloccare la necroptosi 13,14,15 mediata da ZBP1. Per superare il problema del basso rapporto segnale-rumore degli anticorpi attualmente disponibili in commercio diretti contro p-RIPK3 e p-MLKL nell’immunocolorazione26, eseguiamo una fase di amplificazione del segnale del tiramide (TSA) (Figura 1), che si traduce nella robusta rilevazione di p-RIPK3 umano (S227) e migliora la sensibilità di rilevamento del p-MLKL umano (S358) di un ordine di grandezza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo di colorazione immunofluorescente descrive l’uso dell’amplificazione del segnale della tiramido (TSA) per aumentare la sensibilità agli eventi di segnalazione della via di segnalazione necroptotica umana che sono difficili da rilevare, compresa la fosforilazione di RIPK3 e MLKL26. L’inclusione di un gradino TSA migliora significativamente la soglia di rilevamento di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta la sensibilità dello sforzo p-MLKL (S358). TSA ha rivelato un segnale p-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il VIB Bioimaging Core per la formazione, il supporto e l’accesso al parco strumenti. J.N. è supportato da una borsa di dottorato della Research Foundation Flanders (FWO). La ricerca nel gruppo J.M. è stata sostenuta da un Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), un junior research grant (G031022N) dalla Research Foundation Flanders (FWO), un CRIG young investigator proof-of-concept grant e dall’Università di Gand. La ricerca nel gruppo P.V. è stata sostenuta da EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG e GIGG consortia e VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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