Summary
L'amplificazione del segnale della tiramido durante la colorazione immunofluorescente consente la rilevazione sensibile di RIPK3 e MLKL fosforilati durante la necroptosi indotta da ZBP1 dopo infezione da HSV-1.
Abstract
La proteina chinasi 3 (RIPK3) e la sua linea mista di substrato (MLKL) sono regolatori critici della necroptosi, una forma infiammatoria di morte cellulare con importanti funzioni antivirali. L'autofosforilazione di RIPK3 induce fosforilazione e attivazione della proteina boia che forma i pori della necroptosi MLKL. Il traffico e l'oligomerizzazione di MLKL fosforilato sulla membrana cellulare provocano la lisi cellulare, caratteristica della morte cellulare necroptotica. Il sensore di acido nucleico ZBP1 viene attivato legandosi all'RNA a doppio filamento sinistrorso a forma Z (Z-RNA) dopo l'infezione da virus a RNA e DNA. L'attivazione di ZBP1 limita l'infezione virale inducendo la morte cellulare regolata, compresa la necroptosi, delle cellule ospiti infette. La microscopia a immunofluorescenza consente la visualizzazione di diverse fasi di segnalazione a valle della necroptosi mediata da ZBP1 su base cellulare. Tuttavia, la sensibilità della microscopia a fluorescenza standard, che utilizza gli attuali anticorpi fosfo-specifici disponibili in commercio contro RIPK3 e MLKL umani, preclude l'imaging riproducibile di questi marcatori. Qui, descriviamo una procedura di colorazione ottimizzata per la serina (S) fosforilata RIPK3 (S227) e MLKL (S358) in cellule umane HT-29 infettate da herpes simplex virus 1 (HSV-1). L'inclusione di una fase di amplificazione del segnale di tiramide (TSA) nel protocollo di colorazione immunofluorescente consente la rilevazione specifica di RIPK3 fosforilato S227. Inoltre, TSA aumenta notevolmente la sensibilità del rilevamento di MLKL fosforilato S358. Insieme, questo metodo consente la visualizzazione di questi due eventi di segnalazione critici durante l'induzione della necroptosi indotta da ZBP1.
Introduction
La proteina chinasi 3 serina/treonina interagente con recettore (RIPK3) e la chinasi mista (MLKL) sono regolatori centrali della morte cellulare necroptotica 1,2. La necroptosi è una forma litica e infiammatoria di morte cellulare regolata coinvolta nell'immunità antivirale e nell'autoinfiammazione. La necroptosi delle cellule infette da virus interrompe immediatamente la replicazione del virus. La lisi cellulare dopo induzione necroptosi rilascia anche modelli molecolari associati al danno, che stimolano l'immunità antivirale 3,4. La necroptosi è iniziata dall'attivazione di RIPK3 a seguito di interazioni mediate dal motivo di interazione omotipica (RHIM) RIP con una delle tre molecole attivanti a monte: RIPK1 (su coinvolgimento del recettore TNF 1 [TNFR1]), interferone-β che induce adattatori del dominio TIR (TRIF; su coinvolgimento dei recettori Toll-like 3 e 4) o la proteina legante il DNA 1 del sensore di acido nucleico antivirale (ZBP1)1,2 . La segnalazione della necroptosi procede attraverso una serie di eventi di fosforilazione a partire dall'autofosforilazione di RIPK3. L'autofosforilazione di RIPK3 umano alla serina (S)227 all'interno del suo dominio chinasico è un prerequisito per la necroptosi consentendo l'interazione con MLKL ed è comunemente usato come marcatore biochimico per l'attivazione di RIPK3 umano e la morte delle cellule necroptotiche 1,5. Una volta attivato, RIPK3 fosforila il ciclo di attivazione di MLKL a livello di treonina (T)357 e S3581. Ciò provoca un cambiamento nella conformazione MLKL, con conseguente esposizione del dominio del fascio a quattro eliche N-terminale. MLKL quindi oligomerizza e traffica verso la membrana cellulare dove forma un poro attraverso l'inserimento dei quattro fasci di eliche esposti nel doppio strato lipidico, portando infine alla morte cellulare 2,6.
ZBP1 è un sensore di acido nucleico antivirale che riconosce gli acidi nucleici sinistrorsi a forma Z, incluso l'RNA a doppio filamento nella conformazione Z (Z-RNA). Il legame Z-RNA avviene tramite due domini Zα posizionati al N-terminale di ZBP1. Si ritiene che lo Z-RNA che si accumula durante l'infezione da virus dell'RNA e del DNA coinvolga direttamente ZBP1 7,8. ZBP1 attivato recluta RIPK3 attraverso i suoi RHIM centrali e induce la morte cellulare regolata, inclusa la necroptosi 9,10. I virus hanno adottato numerosi meccanismi di fuga per contrastare la necroptosi delle cellule ospiti indotta da ZBP111. Ad esempio, la subunità 1 della ribonucleotide reduttasi del virus dell'herpes simplex 1 (HSV-1), nota come ICP6 e codificata da UL39, ospita RHIM al suo N-terminale che interferisce con l'attivazione di RIPK3 mediata da ZBP1 nelle cellule umane12,13,14,15. ZBP1 non solo limita la replicazione virale, ma studi sui topi hanno dimostrato che l'attivazione di ZBP1 causa malattie infiammatorie e stimola l'immunità al cancro 16,17,18,19,20,21. I protocolli che rilevano gli eventi di segnalazione che si verificano durante la necroptosi indotta da ZBP1 nelle cellule umane sono, quindi, preziosi per valutare il ruolo di ZBP1 in questi processi.
L'amplificazione del segnale di tiramido (TSA), nota anche come CARD (Catalyzed Reporter Deposition), è stata sviluppata per migliorare il limite di rilevazione e il rapporto segnale-rumore nei saggi immunologici basati su anticorpi. Durante la TSA, qualsiasi anticorpo primario può essere utilizzato per rilevare l'antigene di interesse. La perossidasi del rafano (HRP), accoppiata ad un anticorpo secondario, catalizza l'accumulo locale di radicali tiramidici biotinilati in presenza di perossido di idrogeno. Questi radicali biotina-tiramide attivati reagiscono quindi con residui di tirosina prossimale per formare legami covalenti. I potenziali substrati di tiramide-biotina includono l'antigene stesso, gli anticorpi primari e secondari e le proteine vicine. Pertanto, mentre la TSA migliora significativamente la sensibilità del test, parte della sua risoluzione spaziale viene persa. In una fase finale, le molecole di biotina vengono rilevate utilizzando streptavidina marcata con fluorescenza. La reazione HRP deposita molte molecole di tiramide-biotina sopra o vicino all'antigene di interesse. Ciò aumenta notevolmente il numero di siti di legame streptavidina-fluorocromo, amplificando così notevolmente la sensibilità del saggio (Figura 1). In alternativa, la tiramide può essere accoppiata direttamente a un fluorocromo, eliminando la necessità di fluorofori accoppiati a streptavidina. L'immunoistochimica delle proteine e l'ibridazione DNA/RNA in situ sono stati tra i primi metodi con cui la TSA è stata impiegata per migliorare l'intensità del segnale22,23. Più recentemente, la TSA è stata combinata con citometria a flusso intracellulare24 e spettrometria di massa25.
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare la serina 227 fosforilata umana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) e la MLKL umana fosforilata (p-MLKL [S358]) dopo l'attivazione di ZBP1 da infezione da HSV-1 utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. Utilizziamo una linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano HT-29 sensibile alla necroptosi che è stata trasdotta per esprimere stabilmente ZBP1 umano. Queste cellule sono state infettate con un ceppo HSV-1 che esprime una proteina ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) in cui quattro aminoacidi core all'interno del RHIM virale (VQCG) sono stati sostituiti da alanine (AAAA), rendendo così l'ICP6 incapace di bloccare la necroptosi 13,14,15 mediata da ZBP1. Per superare il problema del basso rapporto segnale-rumore degli anticorpi attualmente disponibili in commercio diretti contro p-RIPK3 e p-MLKL nell'immunocolorazione26, eseguiamo una fase di amplificazione del segnale del tiramide (TSA) (Figura 1), che si traduce nella robusta rilevazione di p-RIPK3 umano (S227) e migliora la sensibilità di rilevamento del p-MLKL umano (S358) di un ordine di grandezza.
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Protocol
1. Preparazione di tiramide biotinilata
- Preparare la tiramide biotinilata a partire dalla biotina-tiramide. Per preparare una soluzione madre da 10 mM, sciogliere 3,6 mg di biotina-tiramide in 1 ml di DMSO. Conservare il prodotto disciolto in aliquote a −20 °C per preservarne la qualità.
2. Mantenimento delle cellule HT-29 in coltura
NOTA: Gli HT-29 che esprimono ZBP1 sono stati generati per trasduzione con un lentivettore27 che codifica ZBP1 umano.
- Mantenere le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 nel mezzo 5A di McCoy integrato con L-glutammina, sodio-piruvato e siero bovino fetale al 10% (d'ora in poi indicato come mezzo completo) e mantenere in un incubatore a 37 ° C con il 5% di anidride carbonica. Idealmente, utilizzare celle con un numero di passaggio basso (inferiore a 10). Lasciare le cellule a recuperare per almeno 5 giorni dopo il ciclo di disgelo prima dell'inizio dell'esperimento.
- Per staccare le cellule dal pallone di coltura, rimuovere il terreno e lavare le cellule con 5 ml di PBS (preriscaldato a 37 °C). Quindi, aggiungere la quantità appropriata di tripsina/EDTA (0,05% tripsina e 0,032% EDTA, rispettivamente, preriscaldati a 37 °C) alle celle (2 mL per un matraccio T75, 3 mL per un matraccio T175).
- Incubare le cellule con tripsina/EDTA per un massimo di 10 minuti in un incubatore a 37 °C con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, toccare il pallone e controllare visivamente se le cellule si sono staccate dal pallone usando un microscopio con ingrandimento dell'obiettivo 4x-20x.
- Se le cellule non sono completamente staccate, incubare per altri 5 minuti a 37 °C. Quando le cellule sono staccate, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo 6 ml di mezzo pieno al pallone.
- Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. Contare le cellule usando una colorazione blu tripano per valutare la vitalità; Si raccomanda una diluizione 1:5. Procedere con l'esperimento solo se la vitalità delle cellule supera il 90%.
3. Avvio dell'esperimento, semina e stimolazione delle cellule
- Semina 90.000 cellule HT-29 che esprimono ZBP1 in mezzo intero in una piastra di pozzetto di superficie di 1 cm² che consente la microscopia di fascia alta. Utilizzare un volume finale di 200 μL per pozzetto.
- Incubare le cellule durante la notte a 37 °C con il 5% di anidride carbonica. Prendi in considerazione che alcuni pozzetti extra devono essere seminati per i controlli di colorazione, che è spiegato più dettagliatamente nel passaggio 5.6.
- Quando le cellule raggiungono il 70% -80% di confluenza, aggiungere uno stimolo che induce necroptosi alle cellule. Qui, le cellule sono state infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (molteplicità di infezione [MOI] di 5, definita come unità formanti placca (pfu) divisa per il numero di cellule; il pfu è stato quantificato utilizzando un saggio di placca sulle cellule Vero) per 6 ore, 8 ore o 10 ore.
- Come controllo positivo per l'induzione della necroptosi, stimolare le cellule per 4 ore con un cocktail che induce necroptosi contenente 30 ng/mL di TNF, 20 μM dell'inibitore pan-caspasi zVAD-fmk e 5 μM del bimetici SMAC BV6.
- Come controllo negativo per la colorazione p-RIPK3 (S227), includere GSK'840 (1 μM) per inibire l'attività della chinasi RIPK3 e prevenire l'autofosforilazione di S227. Idealmente, aggiungere l'inibitore in una condizione non trattata e dopo la stimolazione necroptosi. L'inibitore può essere aggiunto contemporaneamente all'infezione virale.
- Preparare le stimolazioni in mezzo intero, preriscaldato a 37 °C. Utilizzare un volume finale di 200 μL per pozzetto per tutte le stimolazioni.
4. Fissaggio delle celle
- Rimuovere il mezzo e lavare le celle con 200 μL di 1x PBS. Quindi, aggiungere 150 μL di PFA al 4% (già equilibrato a temperatura ambiente) alle cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
NOTA: se si utilizzano celle che si staccano facilmente, la fissazione delle celle può essere ottimizzata come segue. Rimuovere 100 μL di mezzo dal pozzetto, in modo che un volume di 100 μL rimanga sulla piastra. Aggiungere 100 μL di PFA al 4% alle cellule. Incubare le cellule per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il mezzo / fissativo dai pozzetti e sostituirlo con 150 μL di PFA al 4%. Incubare le cellule per altri 20 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa fissazione delle cellule. - Dopo la fissazione, rimuovere il 4% di PFA e lavare le cellule 3x con 200 μL di 1x PBS. I campioni possono essere conservati in un eccesso (>200 μL) di 1x PBS a 4 °C durante la notte fino a ulteriore elaborazione.
5. Permeabilizzazione e colorazione primaria
- Rimuovere il PBS e aggiungere 100 μL di tampone di permeabilizzazione (0,5% Triton X-100 in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e, successivamente, lavare i pozzetti con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare la camera di imaging con tampone di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile (20-30 movimenti oscillanti al minuto).
- Per evitare il legame non specifico degli anticorpi primari, aggiungere 100 μL di mezzo bloccante e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. In alternativa, questa fase di blocco può essere sostituita dal blocco con BSA al 3%, Triton-X-100 allo 0,1% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
- Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio, aggiungere gli anticorpi primari alla camera di imaging e incubare per una notte a 4 °C. Utilizzare un volume finale di 100 μL per coprire il pozzetto. Durante l'incubazione notturna a 4°C, non posizionare la camera di imaging su uno shaker da laboratorio inclinabile.
NOTA: Anti p-MLKL (S358; diluizione: 1:200) e anti-p-RIPK3 (S227; diluizione: 1:200) condividono il coniglio come specie ospite e non devono quindi essere combinati in un unico pozzetto. Per monitorare l'infezione virale, combinare un anticorpo primario contro una proteina virale di scelta con p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). Qui, le cellule sono state infettate con infezione da HSV-1 seguita da colorazione ICP0 (diluizione: 1:50, specie ospite: topo). - Prendi in considerazione i controlli di colorazione necessari a questo punto. Includi sempre una condizione anticorpale non primaria per visualizzare il potenziale sfondo della fase di amplificazione TSA per impostare la soglia di mascheramento (vedi passaggio 9).
NOTA: Nel caso di un protocollo di co-colorazione (ad esempio, combinando p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227] con un anticorpo contro una proteina virale) utilizzare anche singole coloranti. L'uso di singole macchie è importante per correggere il potenziale segnale di bleed-through in altri canali di imaging.
6. Amplificazione del segnale della tiramido (TSA)
- Rimuovere la miscela di anticorpi primari e lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 μL di anticorpo secondario marcato con HRP riconoscendo la specie di anticorpo primario che deve essere amplificata. Per amplificare il segnale p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), aggiungere 100 μL di HRP anti-coniglio e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
NOTA: solo p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227) saranno amplificati. La colorazione di una proteina virale verrà visualizzata utilizzando un metodo di colorazione indiretta standard. - Successivamente, lavare i pozzetti 3 volte con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
- Nei passaggi successivi, aggiungere la tiramide biotinilata alla piastra microscopica. Utilizzando il gruppo HRP accoppiato agli anticorpi secondari, la reazione enzimatica innescherà la formazione di radicali tiramidici in prossimità del bersaglio primario (qui, p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227]).
- Per attivare l'attività enzimatica della HRP, aggiungere un substrato ossidante insieme alla tiramide biotinilata. Per ottenere ciò, integrare il tampone TSA (acido borico 0,1 M [pH 8,5]) con 0,03 M H 2 O2; in particolare, prendere 5 ml di tampone TSA e aggiungere 5 μL di H2O2 al 30%.
- Ora, diluire la biotina-tiramide in H 2 O2-integratotampone TSA che va da 1: 1.000 a 1: 20.000.
NOTA: Il fattore di diluizione della biotina-tiramide deve essere ottimizzato per lotto. - Rimuovere il tampone di lavaggio dai pozzetti e aggiungere biotina-tiramide diluita ai pozzetti fino a un volume finale di 100 μL. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker da laboratorio inclinabile.
- Quindi, lavare i pozzetti 3x con 100 μL di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
7. Fluorofori
NOTA: Poiché il segnale dell'anticorpo primario viene convertito in un gruppo biotina, p-MLKL (S358) e p-RIPK3 (S227) vengono visualizzati utilizzando streptavidina accoppiata a un fluoroforo (fluoroforo 568, diluizione: 1:500). Inoltre, i nuclei sono colorati con DAPI (5 μg/mL). Se una proteina virale è inclusa nel protocollo di colorazione, includere un anticorpo secondario adatto marcato con fluorescenza contro la specie ospite dell'anticorpo primario. Nei risultati rappresentativi, è stato utilizzato un mouse anti-ICP0. Come anticorpo secondario è stato incluso un antitopo di capra accoppiato al fluoroforo 633 (diluizione: 1:1.000).
- Preparare la miscela colorante in tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS) contenente gli anticorpi e le macchie sopra menzionate. Rimuovere il tampone di lavaggio, aggiungere 100 μL di miscela colorante e incubare a temperatura ambiente per 1 ora su uno shaker da laboratorio inclinabile. Tenere la camera di imaging al riparo dalla luce da questo passaggio in poi.
- Quindi, lavare i pozzetti 2x con tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 in PBS). Incubare le fasi di lavaggio per 5 minuti a temperatura ambiente su uno shaker da laboratorio inclinabile.
- Infine, sciacquare i pozzetti 2x con 1x PBS. Conservare i campioni in un eccesso (> 200 μL) di 1x PBS fino all'imaging. In alternativa, immergere i campioni nel supporto di montaggio per preservare la colorazione. La camera di imaging è ora pronta per essere visualizzata su un microscopio confocale.
8. Imaging con un microscopio confocale
- Accendere il microscopio confocale e i laser almeno 10 minuti prima dell'imaging.
- Usa un obiettivo ad immersione per la sensibilità. Preferibilmente, utilizzare l'ingrandimento dell'obiettivo 40x o 63x. Prima dell'imaging, pulire gli obiettivi di immersione con il detergente per lenti utilizzando appositi batuffoli di cotone. Obiettivi sporchi (ad esempio, a causa della polvere) possono causare immagini di qualità inferiore.
- Mettere una quantità eccessiva di olio sul fondo della camera di imaging. Inoltre, aggiungi una goccia d'olio sull'obiettivo della scelta.
- Metti la camera di imaging sul microscopio. Trova il campo di messa a fuoco utilizzando la colorazione DAPI o l'imaging in campo chiaro. Se necessario, spostarsi intorno alla camera di imaging per garantire la corretta diffusione dell'olio ad immersione.
- Impostare le tracce di imaging necessarie sul microscopio. A seconda del microscopio, i seguenti passaggi possono variare (Tabella 1).
NOTA: quando si impostano le tracce di imaging, programmare le tracce in modo che la colorazione nucleare venga misurata per ultima. Il laser a 405 nm può contribuire al fotosbiancamento e, quindi, alla perdita di segnale specifico in tutti i canali. - Per analizzare una cella completa per la presenza di p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), misurare gli stack z che coprono l'altezza della cella. Qui, gli z-stack sono stati fatti di 40 fette ogni 0,16 μm, risultando in un intervallo di 6,22 μm.
| Pista | Laser | Divisore di fascio | Filtro |
| pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) | 561 | MBS -405 + | BP 570-620 + LP645 |
| MBS 488/561/633 + SBS SP615 | |||
| Gene virale: ICP0 | 633 | MBS -405 + | BP 420-480 + LP605 |
| MBS 488/561/633 + SBS LP570 | |||
| Nucleo: DAPI | 405 | MBS -405 + | BP 420-480 + BP 495-550 |
| MBS 488/561/633 |
Tabella 1: Tracce di imaging per la visualizzazione cellulare.
9. Analisi e quantificazione dei dati
- Carica le immagini microscopiche sul software. Utilizzare la messa a fuoco estesa per visualizzare tutte le informazioni dello z-stack in un'immagine 2D.
- Successivamente, programmare il protocollo di analisi per estrarre le seguenti informazioni: il numero di celle per immagine, la somma dei voxel che mostrano la colorazione p-RIPK3 (S227) + o p-MLKL (S358) +. Un voxel rappresenta un volume tridimensionale, definito come l'equivalente tridimensionale di un pixel.
- Per quantificare il numero di celle per immagine, segmentare il nucleo. Per ridurre il rumore nei risultati della segmentazione, aggiungere una limitazione delle dimensioni alla segmentazione (>100 μm³). Il numero di nuclei segmentati rappresenta il numero di cellule nell'immagine.
- Per quantificare la quantità di voxel p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+, programmare una segmentazione basata su soglia. Impostare la soglia in modo che nessun segnale venga rilevato nelle immagini senza anticorpi primari (NP).
- Adattare ulteriormente la soglia utilizzando le immagini della condizione di simulazione non trattata. Per garantire il rilevamento sensibile dell'aumento del segnale dovuto alla stimolazione della necroptosi, limitare il prelievo dei voxel p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ in condizioni simulate impostando una soglia più alta. Controllare sempre il protocollo di analisi programmato in diverse immagini dalla condizione simulata e dall'infezione virale che induce la necroptosi.
- Eseguite l'analisi su tutti i set di immagini. Esporta la quantificazione voxel e la segmentazione del nucleo in un file .txt per ulteriori elaborazioni nel software per fogli di calcolo.
- Crea una tabella pivot dei dati che mostra il nome dell'immagine, la quantificazione del nucleo e la somma dei voxel rilevati.
- Quindi, dividi la somma dei voxel positivi per il conteggio delle cellule nell'immagine. Ciò si traduce in un valore relativo di voxel positivi per cellula. Per visualizzare l'aumento di fold, dividere il valore relativo di p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ voxel per cellula per la mediana della condizione non trattata (mock).
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Representative Results
La rilevazione immunofluorescente della fosforilazione di MLKL e in particolare della fosforilazione di RIPK3 nelle cellule umane è tecnicamente impegnativa26. Presentiamo qui un protocollo di colorazione migliorato per p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) umani dopo l'attivazione di ZBP1. Il protocollo include una fase TSA per migliorare il limite di rilevamento e la sensibilità dei segnali fluorescenti. Per convalidare il metodo, è stato eseguito un confronto fianco a fianco dell'immunofluorescenza mediata da TSA con la colorazione fluorescente indiretta standard di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358).
Le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 umano sono state infettate per 9 ore con un ceppo HSV-1 mutante ICP6 RHIM (HSV-1 ICP6mutRHIM) per indurre necroptosi mediata da ZBP1 e fosforilazione di RIPK3. Il ceppomutRHIM di ICP6 HSV-1 porta una mutazione da VQCG a AAAA all'interno del RHIM ICP6 e non è in grado di bloccare la segnalazione di necroptosi a valle di ZBP114,15. Come riportato in precedenza26, l'immunofluorescenza indiretta standard non era abbastanza sensibile da visualizzare la fosforilazione di RIPK3 S227 con l'attuale anticorpo disponibile in commercio, anche quando la potenza laser del microscopio confocale era aumentata al 30% (Figura 2A). Al contrario, l'inclusione di una fase TSA ha permesso la robusta rilevazione di p-RIPK3 (S227) nel citosol delle cellule infettate da HSV-1 ICP6mutRHIM. Il segnale p-RIPK3 (S227) ha raggiunto la saturazione quando la potenza del laser è stata impostata al 2% (Figura 2A). La quantificazione delle immagini tridimensionali z-stack (vedi fase 9) ha mostrato un aumento di circa 20 volte del numero di voxel positivi per p-RIPK3 (S227) nelle cellule infettate damutRHIM da HSV-1 ICP6 rispetto alle cellule trattate con simulazione (Figura 2B). L'omissione dell'anticorpo primario anti-p-RIPK3 (S227) dal protocollo di colorazione mediato dalla TSA come controllo non primario (NP) non ha prodotto un segnale rilevabile. Per visualizzare le cellule infette damutRHIM di HSV-1 ICP6, i campioni sono stati co-colorati con un anticorpo primario diretto contro la proteina virale precoce immediata ICP0 (Figura 2A). Un segnale p-RIPK3 basso ma rilevabile (S227) era presente nelle cellule trattate con simulazione, che potrebbe rappresentare l'autofosforilazione costitutiva della RIPK3 umana in questo sito5 (vedi la discussione). In linea con un precedente rapporto28, il RHIM di ICP6 non è in grado di bloccare completamente la fosforilazione di RIPK3 S227, poiché abbiamo rilevato un aumento della colorazione p-RIPK3 (S227) delle cellule infettate da HSV-1 wild-type (HSV-1WT; Figura 2A,B). Per convalidare ulteriormente la specificità del segnale p-RIPK3 (S227), le cellule sono state trattate con l'inibitore della chinasi RIPK3 GSK'840 prima dell'infezione. GSK'840 si lega al dominio chinasico di RIPK3, impedendone l'attività e quindi inibendo la sua autofosforilazione29. GSK'840 ha impedito la fosforilazione di RIPK3 a S227 dopo l'attivazione di ZBP1 (Figura 2A,B), confermando la specificità del metodo di rilevazione p-RIPK3 (S227) mediato dalla TSA.
Per seguire la fosforilazione di MLKL, un marker allo stadio terminale per la necroptosi, le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 sono state infettate conmutRHIM di HSV-1 ICP6 per 8 ore e 10 ore. Le cellule sono state colorate con un anticorpo contro S358 fosforilato MLKL (p-MLKL [S358]) utilizzando TSA. Le cellule trattate con simulazione hanno mostrato una colorazione citosolica bassa e piuttosto puntuale di p-MLKL (S358), mentre una forte colorazione p-MLKL è stata rilevata nel citosol, nucleo. e alla membrana plasmatica nelle cellule che sono state infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (Figura 3A). Inoltre, il segnale p-MLKL (S358) è stato osservato nei cluster. Ciò è in linea con le funzioni di formazione dei pori degli oligomeri MLKL fosforilati attivati sulla membrana cellulare e la sua traslocazione nucleare recentemente riportata dopo l'infezione da influenza A 1,2,6,30. Come controllo positivo della colorazione p-MLKL (S358), abbiamo stimolato le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 con una combinazione di TNF, SMAC mimetico BV6 e inibitore pan-caspasi zVAD-fmk per indurre necroptosi TNFR1-mediata (Figura 3A). L'omissione dell'anticorpo primario anti-p-MLKL (S358) dal protocollo di colorazione mediato dalla TSA come controllo non primario non ha prodotto un segnale rilevabile.
Successivamente, abbiamo eseguito un confronto fianco a fianco della colorazione immunofluorescente p-MLKL (S358) con e senza TSA. Le cellule HT-29 che esprimono ZBP1 sono state infettate per 9 ore con HSV-1 ICP6mutRHIM. Mentre era necessaria una potenza laser del 40% per rilevare uno specifico segnale p-MLKL (S358) nelle cellule infette utilizzando l'immunofluorescenza indiretta standard, i campioni trattati con TSA hanno già raggiunto segnali di saturazione a una potenza laser del 6% senza aumentare la colorazione di fondo nei campioni trattati con simulazione (Figura 3B). Inoltre, la quantificazione delle immagini tridimensionali z-stack ha mostrato un aumento di oltre 10 volte del numero di voxel positivi per p-MLKL (S358) quando si utilizza TSA rispetto all'immunofluorescenza indiretta standard. Ciò dimostra che TSA migliora sia la soglia di rilevamento che la sensibilità per p-MLKL (S358; Figura 3C).
Infine, per convalidare il protocollo di immunofluorescenza mediata dalla TSA per altri stimoli virali di necroptosi dipendenti da ZBP1, abbiamo infettato cellule HT-29 che esprimono ZBP1 con il ceppo PR8 del virus dell'influenza A (IAV) per 9 ore. IAV induce sia l'apoptosi mediata da ZBP1 che la necroptosi nelle cellule umane30. Infatti, TSA ha permesso la robusta rilevazione di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358), indicativi di queste cellule sottoposte a necroptosi (Figura 4A-D).
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo TSA. Le cellule vengono seminate e stimolate in una piastra a pozzo, compatibile con la microscopia di fascia alta. Successivamente, i campioni vengono fissati in PFA al 4%, permeabilizzati e bloccati per prevenire un legame specifico degli anticorpi primari. Al fine di visualizzare RIPK3 fosforilati (p-RIPK3 [S227]) e MLKL (p-MLKL [S358]), anticorpi specifici che riconoscono questi siti chiave di fosforilazione vengono incubati durante la notte sulla camera di imaging. Successivamente, viene aggiunto un anticorpo secondario, accoppiato a una perossidasi di ravanello equino (HRP). Questo gruppo HRP consente l'attivazione della tiramide biotinilata in presenza di H2 O2. Successivamente, la biotina-tiramide attiva si accoppia covalentemente ai residui di tirosina in prossimità dell'anticorpo secondario marcato con HRP. Queste includono tirosine sulle proteine di interesse - in questo caso p-RIPK3 o p-MLKL, come indicato in figura - e quelle delle proteine vicine e sugli anticorpi primari e secondari stessi (non mostrato). Questa fase di amplificazione del segnale della tiramido aumenta notevolmente la sensibilità del protocollo di colorazione. In una fase finale, la streptavidina accoppiata a un gruppo fluorescente viene aggiunta per visualizzare le molecole biotinilate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: HSV-1 ICP6mutRHIM induce la fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 umano a S227. (A) Immagini confocali rappresentative di cellule HT-29 che esprimono ZBP1 umane, confrontando la colorazione TSA con un protocollo standard di colorazione a immunofluorescenza indiretta (senza TSA) per p-RIPK3 (S227). I campioni finti e infetti da virus (HSV-1WT o HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) sono stati incubati per 9 ore. Come controllo negativo, è stato incluso l'inibitore della chinasi RIPK3 GSK'840 (1 μM). È incluso un controllo di colorazione non primaria (NP) delle cellule infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) per 9 ore in cui sono stati omessi sia gli anticorpi primari anti-p-RIPK3 (S227) che ICP0. La potenza laser necessaria per rilevare il segnale specifico p-RIPK3 (S227) è indicata sulle immagini. ICP0 è stato utilizzato per colorare le cellule infette da virus e DAPI è stato utilizzato per colorare il nucleo. Le barre della scala sono 10 μm. (B) Quantificazione relativa dei voxel p-RIPK3 (S227)+ utilizzando il protocollo di colorazione TSA. Ogni punto rappresenta un'immagine e la barra rossa rappresenta la mediana. I valori del conteggio dei voxel sono presentati rispetto alla mediana del conteggio dei voxel delle immagini nella condizione fittizia. Le statistiche sono state fatte utilizzando un ANOVA unidirezionale con confronti multipli utilizzando la correzione Tukey. p > 0,05 (n.s.), p≤ 0,05 (*), p≤ 0,01 (**). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: HSV-1 ICP6mutRHIM induce la fosforilazione ZBP1-dipendente di MLKL umano a S358. (A) Immagini confocali rappresentative di cellule HT-29 umane che esprimono ZBP1. Le cellule sono state trattate fintamente o infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) per 8 ore e 10 ore. TSA è stato utilizzato per rilevare p-MLKL (S358). ICP0 è stato utilizzato per colorare le cellule infette da virus e DAPI è stato utilizzato per colorare il nucleo. Viene mostrato un controllo di colorazione non primario (NP) delle cellule che sono state infettate per 10 ore con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) in cui è stato omesso l'anti-p-MLKL primario (S358). Come controllo positivo, le cellule sono state stimolate per 4 ore con 30 ng/mL di TNF, 5 μM BV6 e 20 μM ZVAD-fmk, che induce necroptosi tramite TNFR1. Le barre della scala sono 10 μm. (B) Immagini confocali rappresentative di cellule HT-29 che esprimono ZBP1 umano, confrontando la colorazione TSA con un protocollo standard di colorazione a immunofluorescenza indiretta (senza TSA) per p-MLKL (S358). Le cellule sono state trattate con simulazione o infettate conmutRHIM di HSV-1 ICP6 (MOI = 5) per 9 ore. È incluso un controllo della colorazione NP delle cellule infettate con HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) per 9 ore in cui sono stati omessi gli anticorpi primari anti-p-MLKL (S358) e ICP0. La potenza laser necessaria per rilevare il segnale specifico p-MLKL (S358) è indicata sulle immagini. (C) Quantificazione relativa dei voxel p-MLKL (S358)+ utilizzando il protocollo di colorazione standard (no TSA) e TSA. Ogni punto rappresenta un'immagine e la barra rossa rappresenta la mediana. I valori del conteggio dei voxel sono presentati rispetto alla mediana del conteggio dei voxel delle immagini nella condizione fittizia. Le statistiche sono state fatte utilizzando un ANOVA unidirezionale con confronti multipli utilizzando la correzione Tukey. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Il virus dell'influenza A induce la fosforilazione ZBP1-dipendente di RIPK3 e MLKL umani. (A,C) Immagini confocali rappresentative di cellule umane che esprimono HT-29 che esprimono ZBP1. Le cellule sono state trattate fintamente o infettate con virus dell'influenza A (IAV), ceppo PR8 (MOI = 4) per 9 ore e colorate per p-RIPK3 (S227; A) o p-MLKL (S358; C) utilizzando il protocollo TSA. Le barre della scala sono 10 μm. (B,D) Quantificazione relativa di p-RIPK3 (S227)+ (B) o p-MLKL (S358; D) voxel. Ogni punto in (B,D) rappresenta un'immagine e la barra rossa rappresenta la mediana. I valori del conteggio dei voxel sono presentati rispetto alla mediana del conteggio dei voxel delle immagini nella condizione fittizia. Le statistiche sono state fatte usando un test di Mann-Whitney. p≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo di colorazione immunofluorescente descrive l'uso dell'amplificazione del segnale della tiramido (TSA) per aumentare la sensibilità agli eventi di segnalazione della via di segnalazione necroptotica umana che sono difficili da rilevare, compresa la fosforilazione di RIPK3 e MLKL26. L'inclusione di un gradino TSA migliora significativamente la soglia di rilevamento di p-RIPK3 (S227) e p-MLKL (S358) e aumenta la sensibilità dello sforzo p-MLKL (S358). TSA ha rivelato un segnale p-RIPK3 (S227) già presente nei campioni trattati con simulazione. Nelle cellule umane, l'autofosforilazione di RIPK3 a S227 è un prerequisito per l'attivazione della necroptosi consentendo un'interazione stabile con MLKL. Questo processo si verifica già a livello basale e provoca la formazione di un dimero p-RIPK3 (S227)/MLKL stabile e inattivo prima dell'induzione della necroptosi 2,5,31. Allo stesso modo, l'anticorpo anti-p-RIPK3 utilizzato in questo studio rileva anche p-RIPK3 (S227) in cellule non trattate mediante western blotting26.
La fosforilazione di MLKL da parte di RIPK3 all'interno del ciclo di attivazione, a T357 e S358, provoca la dissociazione del complesso inattivo p-RIPK3 (S227)/MLKL e induce un cambiamento conformazionale per cui MLKL espone il suo dominio N-terminale a quattro eliche. Il p-MLKL attivato quindi oligomerizza e traffica verso la membrana cellulare dove inserisce i suoi quattro fasci di eliche nel doppio strato lipidico, con conseguente lisi cellulare 1,2,6. Utilizzando questo protocollo di immunofluorescenza TSA, abbiamo rilevato un forte aumento della fosforilazione di S358 MLKL durante la necroptosi indotta da ZBP1. p-MLKL (S358) raggruppato all'interno del citosol e della membrana plasmatica ed è stato trovato anche all'interno del nucleo dopo l'attivazione di ZBP1. Infatti, è stato riportato che ZBP1 stimola la perturbazione mediata da MLKL della membrana nucleare nel contesto dell'infezione da IAV 8,30. Va notato, tuttavia, che la TSA non solo deposita biotina-tiramide sull'antigene di interesse e sugli anticorpi primari/secondari ma anche sulle proteine vicine. La TSA non è, quindi, ideale per dedurre informazioni sulla precisa localizzazione subcellulare delle proteine rilevate, e non raccomandiamo la TSA per gli studi di co-localizzazione.
Ripetuti cicli di gelo-disgelo influiscono sulla stabilità della tiramide biotinilata. Per evitare una diminuzione della sensibilità del segnale, si consiglia di aliquotare il tiramido e utilizzare una nuova aliquota per ogni esperimento. Si deve prestare attenzione alle differenze da lotto a lotto nelle scorte di biotina-tiramide. Se la concentrazione finale di biotina-tiramide è troppo alta, lo sfondo non specifico dell'amplificazione TSA maschererà il segnale specifico. Per controllare questo, raccomandiamo di titolare ogni nuovo lotto di biotina-tiramide e di includere un controllo di colorazione primaria in cui l'anticorpo primario viene omesso.
Nel protocollo presentato, la TSA era limitata a un obiettivo. La rilevazione di RIPK3 e MLKL fosforilati non è stata combinata nella stessa colorazione, poiché entrambi gli anticorpi primari sono stati allevati nella stessa specie. Il protocollo potrebbe essere adattato per rilevare più segnali amplificati da TSA (ad esempio, p-RIPK3 [S227] e p-MLKL [S358]) all'interno dello stesso campione utilizzando l'immunofluorescente multiplex TSA32,33. Infine, l'amplificazione mediata da TSA per la microscopia a immunofluorescenza può essere utilizzata per il riconoscimento di biomarcatori di altre vie di segnalazione con scarsi rapporti segnale-rumore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il VIB Bioimaging Core per la formazione, il supporto e l'accesso al parco strumenti. J.N. è supportato da una borsa di dottorato della Research Foundation Flanders (FWO). La ricerca nel gruppo J.M. è stata sostenuta da un Odysseus II Grant (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), un junior research grant (G031022N) dalla Research Foundation Flanders (FWO), un CRIG young investigator proof-of-concept grant e dall'Università di Gand. La ricerca nel gruppo P.V. è stata sostenuta da EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG e GIGG consortia e VIB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | - | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
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