Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tyramid signalforsterkning for immunfluorescerende farging av ZBP1-avhengig fosforylering av RIPK3 og MLKL etter HSV-1-infeksjon i humane celler

Published: October 20, 2022 doi: 10.3791/64332
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1VIB-UGent Center for Inflammation Research, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

Summary

Tyramidsignalforsterkning under immunfluorescerende farging muliggjør sensitiv påvisning av fosforylert RIPK3 og MLKL under ZBP1-indusert nekroptose etter HSV-1-infeksjon.

Abstract

Kinase Reseptor-interagerende serin / treonin protein kinase 3 (RIPK3) og dets substrat blandet avstamning kinase domene-lignende (MLKL) er kritiske regulatorer av nekroptose, en inflammatorisk form for celledød med viktige antivirale funksjoner. Autofosforylering av RIPK3 induserer fosforylering og aktivering av det poredannende bøddelproteinet til nekroptose MLKL. Smugling og oligomerisering av fosforylert MLKL ved cellemembranen resulterer i cellelyse, karakteristisk for nekroptotisk celledød. Nukleinsyresensoren ZBP1 aktiveres ved binding til venstrehendt Z-form dobbeltstrenget RNA (Z-RNA) etter infeksjon med RNA og DNA-virus. ZBP1-aktivering begrenser virusinfeksjon ved å indusere regulert celledød, inkludert nekroptose, av infiserte vertsceller. Immunfluorescensmikroskopi tillater visualisering av forskjellige signaltrinn nedstrøms for ZBP1-mediert nekroptose per celle. Sensitiviteten til standard fluorescensmikroskopi, ved bruk av nåværende kommersielt tilgjengelige fosfospesifikke antistoffer mot human RIPK3 og MLKL, utelukker imidlertid reproduserbar avbildning av disse markørene. Her beskriver vi en optimalisert fargeprosedyre for serin (S) fosforylert RIPK3 (S227) og MLKL (S358) i humane HT-29-celler infisert med herpes simplex virus 1 (HSV-1). Inkluderingen av et tyramidsignalforsterkningstrinn (TSA) i den immunfluorescerende fargeprotokollen tillater spesifikk påvisning av S227 fosforylert RIPK3. Videre øker TSA i stor grad følsomheten for deteksjon av S358 fosforylert MLKL. Sammen muliggjør denne metoden visualisering av disse to kritiske signalhendelsene under induksjonen av ZBP1-indusert nekroptose.

Introduction

Reseptorinteragerende serin/treoninproteinkinase 3 (RIPK3) og mixed lineage kinase domain-like (MLKL) er sentrale regulatorer av nekroptotisk celledød 1,2. Nekroptose er en lytisk og inflammatorisk form for regulert celledød involvert i antiviral immunitet og autoinflammasjon. Nekroptose av virusinfiserte celler slår umiddelbart av virusreplikasjon. Cellelyse etter nekroptoseinduksjon frigjør også skadeassosierte molekylære mønstre, noe som stimulerer antiviral immunitet 3,4. Nekroptose initieres ved aktivering av RIPK3 etter RIP homotypisk interaksjonsmotiv (RHIM)-mediert interaksjon med ett av tre oppstrøms aktiverende molekyler: RIPK1 (ved TNF-reseptor 1 [TNFR1] engasjement), TIR-domeneholdig adapterinduserende interferon-β (TRIF; ved Toll-lignende reseptor 3 og 4-engasjement), eller den antivirale nukleinsyresensoren Z-DNA-bindende protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptosesignalering fortsetter gjennom en rekke fosforyleringshendelser som begynner med autofosforylering av RIPK3. Autofosforyleringen av human RIPK3 ved serin (S)227 innenfor kinasedomenet er en forutsetning for nekroptose ved å muliggjøre interaksjonen med MLKL og brukes ofte som en biokjemisk markør for human RIPK3-aktivering og nekroptotisk celledød 1,5. Når den er aktivert, fosforylerer RIPK3 aktiveringssløyfen til MLKL ved treonin (T) 357 og S3581. Dette fører til en endring i MLKL-konformasjon, noe som resulterer i eksponering av N-terminal fire helixbuntdomenet. MLKL oligomeriserer deretter og trafikkerer til cellemembranen hvor den danner en pore gjennom innsetting av de eksponerte fire helixbuntene i lipid-dobbeltlaget, noe som til slutt fører til celledød 2,6.

ZBP1 er en antiviral nukleinsyresensor som gjenkjenner venstrehendte Z-formede nukleinsyrer, inkludert dobbeltstrenget RNA i Z-konformasjonen (Z-RNA). Z-RNA-binding skjer via to Zα-domener plassert ved N-enden av ZBP1. Z-RNA som akkumuleres under RNA- og DNA-virusinfeksjon, antas å engasjere ZBP1 7,8 direkte. Aktivert ZBP1 rekrutterer RIPK3 gjennom sine sentrale RHIMs og induserer regulert celledød, inkludert nekroptose 9,10. Virus har tatt i bruk en rekke rømningsmekanismer for å motvirke ZBP1-indusert vertscellenekroptose11. For eksempel har herpes simplex-viruset 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktase-underenhet 1, kjent som ICP6 og kodet av UL39, RHIM ved sin N-endestasjon som forstyrrer ZBP1-mediert RIPK3-aktivering i humane celler 12,13,14,15. ZBP1 begrenser ikke bare viral replikasjon, men musestudier har vist at ZBP1-aktivering forårsaker inflammatoriske sykdommer og stimulerer kreftimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoller som oppdager signalhendelser som oppstår under ZBP1-indusert nekroptose i humane celler, er derfor verdifulle for å vurdere rollen til ZBP1 i disse prosessene.

Tyramid signalforsterkning (TSA), også referert til som katalysert reporteravsetning (CARD), er utviklet for å forbedre grensen for deteksjon og signal-til-støy-forhold i antistoffbaserte immunoassays. Under TSA kan ethvert primært antistoff brukes til å oppdage antigenet av interesse. Pepperrotperoksidase (HRP), koblet til et sekundært antistoff, katalyserer den lokale oppbyggingen av biotinylerte tyramidradikaler i nærvær av hydrogenperoksid. Disse aktiverte biotin-tyramidradikalene reagerer deretter med proksimale tyrosinrester for å danne kovalente bindinger. Potensielle tyramidbiotinsubstrater inkluderer selve antigenet, de primære og sekundære antistoffene og nærliggende proteiner. Således, mens TSA forbedrer følsomheten til analysen betydelig, går noe av den romlige oppløsningen tapt. I et siste trinn oppdages biotinmolekyler ved bruk av fluorescerende merket streptavidin. HRP-reaksjonen avsetter mange tyramid-biotinmolekyler på eller nær antigenet av interesse. Dette øker antallet streptavidin-fluorokrombindingssteder kraftig, og forsterker dermed sensitiviteten til analysen (figur 1). Alternativt kan tyramid kobles direkte til en fluorokrom, noe som eliminerer behovet for streptavidinkoblede fluoroforer. Proteinimmunhistokjemi og DNA / RNA in situ hybridisering var blant de første metodene der TSA ble brukt for å forbedre signalintensiteten22,23. I senere tid er TSA kombinert med intracellulær flowcytometri24 og massespektrometri25.

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage serin 227 fosforylert human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og fosforylert human MLKL (p-MLKL [S358]) ved aktivering av ZBP1 ved HSV-1-infeksjon ved bruk av immunfluorescensmikroskopi. Vi bruker en nekroptosefølsom HT-29 human kolorektal adenokarsinomcellelinje som ble transdusert for å stabilt uttrykke human ZBP1. Disse cellene ble infisert med en HSV-1-stamme som uttrykker et mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) der fire kjerneaminosyrer i viral RHIM (VQCG) ble erstattet av alaniner (AAAA), og dermed gjorde ICP6 ute av stand til å blokkere ZBP1-mediert nekroptose13,14,15. For å overvinne problemet med det lave signal-til-støy-forholdet mellom de kommersielt tilgjengelige antistoffene rettet mot p-RIPK3 og p-MLKL i immunostaining26, utfører vi et tyramidsignalforsterkningstrinn (TSA) (figur 1), som resulterer i robust påvisning av human p-RIPK3 (S227) og forbedrer deteksjonsfølsomheten til human p-MLKL (S358) med en størrelsesorden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tilberedning av biotinylert tyramid

  1. Forbered biotinylert tyramid fra biotin-tyramid. For å lage en 10 mM stamløsning, oppløs 3,6 mg biotin-tyramid i 1 ml DMSO. Oppbevar det oppløste produktet i aliquots ved -20 °C for å bevare kvaliteten.

2. Opprettholde HT-29-celler i kultur

MERK: ZBP1-uttrykkende HT-29 ble generert ved transduksjon med en lentivector27 som koder for human ZBP1.

  1. Hold ZBP1-uttrykkende HT-29-celler i McCoys 5A-medium supplert med L-glutamin, natriumpyruvat og 10% føtalt bovint serum (fra nå av referert til som fullt medium) og vedlikehold i en inkubator ved 37 ° C med 5% karbondioksid. Ideelt sett bør du bruke celler med lavt passasjetall (mindre enn 10). La cellene komme seg i minst 5 dager etter tinesyklusen før forsøket starter.
  2. For å løsne cellene fra kulturflasken, fjern mediet og vask cellene med 5 ml PBS (forvarmet til 37 ° C). Deretter legger du til riktig mengde trypsin / EDTA (henholdsvis 0,05% trypsin og 0,032% EDTA, forvarmet til 37 ° C) til cellene (2 ml for en T75-kolbe, 3 ml for en T175-kolbe).
  3. Inkuber cellene med trypsin/EDTA i opptil 10 minutter i en inkubator ved 37 °C med 5 % karbondioksid. Etterpå trykker du på kolben og sjekker visuelt om cellene løsnet fra kolben ved hjelp av et mikroskop med 4x-20x objektiv forstørrelse.
  4. Hvis cellene ikke er helt løsrevet, ruger du i ytterligere 5 minutter ved 37 °C. Når cellene løsnes, stopp den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette 6 ml fullt medium til kolben.
  5. Samle cellesuspensjonen i et 15 ml rør. Telle cellene ved hjelp av en trypan blå flekk for å vurdere levedyktighet; En 1:5 fortynning anbefales. Bare fortsett med eksperimentet hvis levedyktigheten til cellene overstiger 90%.

3. Starte eksperimentet, såing og stimulering av cellene

  1. Frø 90 000 ZBP1-uttrykkende HT-29-celler i fullt medium i en 1 cm² overflate brønnplate som tillater high end mikroskopi. Bruk et sluttvolum på 200 μL per brønn.
  2. Inkuber cellene over natten ved 37 °C med 5 % karbondioksid. Ta hensyn til at det må sås noen ekstra brønner for fargekontroll, noe som forklares nærmere i trinn 5.6.
  3. Når cellene når 70% -80% sammenløp, legg til en nekroptosefremkallende stimulus til cellene. Her ble cellene infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplikasjon av infeksjon [MOI] på 5, definert som plakkdannende enheter (pfu) dividert med antall celler; pfu ble kvantifisert ved hjelp av en plakkanalyse på Vero-celler) i 6 timer, 8 timer eller 10 timer.
  4. Som en positiv kontroll for nekroptoseinduksjon, stimulere cellene i 4 timer med en nekroptoseinduserende cocktail som inneholder 30 ng / ml TNF, 20 μM av pan-caspasehemmeren zVAD-fmk og 5 μM av SMAC mimetisk BV6.
  5. Som en negativ kontroll for p-RIPK3 (S227) farging, inkluder GSK'840 (1 μM) for å hemme RIPK3-kinaseaktivitet og forhindre autofosforylering av S227. Ideelt sett legg til inhibitoren i ubehandlet tilstand og etter nekroptosestimulering. Inhibitoren kan tilsettes samtidig med virusinfeksjon.
  6. Forbered stimuleringene i fullt medium, forvarmet til 37 °C. Bruk et sluttvolum på 200 μL per brønn for alle stimuleringer.

4. Feste cellene

  1. Fjern mediet og vask cellene med 200 μL 1x PBS. Tilsett deretter 150 μL 4% PFA (allerede likevektet ved romtemperatur) til cellene og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
    MERK: Hvis du bruker celler som løsner lett, kan fiksering av cellene optimaliseres som følger. Fjern 100 μL medium fra brønnen, slik at et volum på 100 μL forblir på platen. Tilsett 100 μL 4% PFA til cellene. Inkuber cellene i 5 minutter ved romtemperatur. Fjern deretter medium/fiksativ fra brønnene og erstatt med 150 μL på 4% PFA. Inkuber cellene i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur for å sikre fullstendig fiksering av cellene.
  2. Etter fiksering, fjern 4% PFA og vask cellene 3x med 200 μL 1x PBS. Prøvene kan lagres i et overskudd (>200 μL) på 1x PBS ved 4 °C over natten inntil videre behandling.

5. Permeabilisering og primærfarging

  1. Fjern PBS og tilsett 100 μL permeabiliseringsbuffer (0,5% Triton X-100 i PBS). Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
  2. Fjern permeabiliseringsbufferen og vask deretter brønnene med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber bildekammeret med vaskebuffer i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorie shaker (20-30 gyngebevegelser per min).
  3. For å forhindre ikke-spesifikk binding av primære antistoffer, tilsett 100 μL blokkeringsmedium og inkuber ved romtemperatur i 2 timer. Alternativt kan dette blokkeringstrinnet erstattes av blokkering med 3% BSA, 0,1% Triton-X-100 i PBS i 1 time ved romtemperatur.
  4. Vask brønnene 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorierister.
  5. Etter at vaskebufferen er fjernet, tilsett de primære antistoffene i bildekammeret og inkuber over natten ved 4 °C. Bruk et sluttvolum på 100 μL for å dekke brønnen. Under inkubasjon over natten ved 4 °C må du ikke plassere bildekammeret på en shaker på et vippelaboratorium.
    MERK: Anti p-MLKL (S358; fortynning: 1:200) og anti-p-RIPK3 (S227; fortynning: 1:200) deler kanin som vertsart og bør derfor ikke kombineres i en brønn. For å overvåke virusinfeksjonen, kombiner et primært antistoff mot et virusprotein av valg med p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227). Her ble cellene infisert med HSV-1-infeksjon etterfulgt av ICP0-farging (fortynning: 1:50, vertsart: mus).
  6. Ta hensyn til de nødvendige fargekontrollene på dette tidspunktet. Inkluder alltid en ikke-primær antistofftilstand for å visualisere den potensielle bakgrunnen til TSA-forsterkningstrinnet for å stille inn maskeringsterskelen (se trinn 9).
    MERK: I tilfelle av en co-farging protokoll (f.eks kombinere p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227] med et antistoff mot et viralt protein) bruk enkelt flekker også. Bruk av enkeltflekker er viktig for å korrigere for potensielt gjennomfallende signal i andre bildekanaler.

6. Tyramid signalforsterkning (TSA)

  1. Fjern den primære antistoffblandingen og vask brønner 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorierister.
  2. Fjern vaskebufferen og tilsett 100 μL HRP-merket sekundært antistoff som gjenkjenner arten av primært antistoff som må forsterkes. For å forsterke p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358) signalet, tilsett 100 μL anti-kanin-HRP og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorieskaker.
    MERK: Bare p-MLKL (S358) eller p-RIPK3 (S227) vil bli forsterket. Fargingen av et viralt protein vil bli visualisert ved hjelp av en standard indirekte fargemetode.
  3. Vask deretter brønnene 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorierister.
  4. I de neste trinnene legger du det biotinylerte tyramid til den mikroskopiske platen. Ved å bruke HRP-gruppen koblet til de sekundære antistoffene, vil den enzymatiske reaksjonen utløse dannelsen av tyramidradikaler i nærheten av det primære målet (her p-MLKL [S358] eller p-RIPK3 [S227]).
  5. For å aktivere den enzymatiske aktiviteten til HRP, tilsett et oksiderende substrat sammen med det biotinylerte tyramid. For å oppnå dette, supplere TSA-bufferen (0,1 M borsyre [pH 8,5]) med 0,03 M H 2 O2; ta spesielt 5 ml TSA-buffer og tilsett 5 μL på 30% H 2 O2.
  6. Fortynn nå biotin-tyramid i H 2 O2-supplertTSA-buffer fra 1: 1000 til 1: 20.000.
    MERK: Fortynningsfaktoren til biotin-tyramid må optimaliseres per batch.
  7. Fjern vaskebufferen fra brønnene og tilsett fortynnet biotin-tyramid til brønnene til et sluttvolum på 100 μL. Inkuber ved romtemperatur i 10 minutter på en vippelaboratorierister.
  8. Vask deretter brønnene 3x med 100 μL vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorierister.

7. Fluoroforer

MERK: Siden signalet til det primære antistoffet omdannes til en biotingruppe, visualiseres p-MLKL (S358) og p-RIPK3 (S227) ved bruk av streptavidin koblet til en fluorophore (fluorofor 568, fortynning: 1:500). I tillegg er kjernene farget med DAPI (5 μg / ml). Hvis et viralt protein er inkludert i fargeprotokollen, ta med et egnet fluorescerende merket sekundært antistoff mot vertsarten til ditt primære antistoff. I de representative resultatene ble det brukt en mus anti-ICP0. Som et sekundært antistoff geit anti-mus koblet til fluorofor 633 (fortynning: 1:1,000) ble inkludert.

  1. Lag fargeblandingen i vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS) som inneholder antistoffene og flekkene nevnt ovenfor. Fjern vaskebufferen, tilsett 100 μL fargeblanding, og inkuber ved romtemperatur i 1 time på en vippelaboratorierister. Hold bildekammeret skjermet fra lyset fra dette trinnet og fremover.
  2. Vask deretter brønnene 2x med vaskebuffer (0,1% Triton X-100 i PBS). Inkuber vasketrinnene i 5 minutter ved romtemperatur på en vippelaboratorierister.
  3. Skyll til slutt brønnene 2x med 1x PBS. Oppbevar prøvene i et overskudd (> 200 μL) på 1x PBS til avbildning. Alternativt kan du senke prøvene i monteringsmedium for å bevare fargingen. Bildekammeret er nå klart til å visualiseres på et konfokalt mikroskop.

8. Avbildning ved hjelp av et konfokalt mikroskop

  1. Slå på konfokalmikroskopet og lasere minst 10 minutter før bildebehandling.
  2. Bruk et innlevelsesmål for følsomhet. Bruk helst 40x eller 63x objektiv forstørrelse. Før avbildning, rengjør nedsenkingsmålene med linserens ved hjelp av passende bomullsballer. Skitne mål (f.eks. på grunn av støv) kan føre til lavere bildekvalitet.
  3. Sett en overflødig mengde olje på bunnen av bildekammeret. I tillegg legger du til en dråpe olje på målet om valg.
  4. Sett bildekammeret på mikroskopet. Finn fokusfeltet ved hjelp av DAPI-farging eller ved hjelp av brightfield-bildebehandling. Flytt om nødvendig rundt bildekammeret for å sikre riktig spredning av nedsenkningsoljen.
  5. Sett opp de nødvendige bildesporene på mikroskopet. Avhengig av mikroskopet kan følgende trinn variere (tabell 1).
    MERK: Når du setter opp bildesporene, programmerer du sporene slik at atomfargingen måles sist. 405 nm laseren kan bidra til fotobleking og dermed tap av spesifikt signal i alle kanalene.
  6. Hvis du vil analysere en komplett celle for tilstedeværelsen av p-RIPK3 (S227) eller p-MLKL (S358), måler du z-stabler som spenner over cellens høyde. Her ble z-stablene laget av 40 skiver hver 0,16 μm, noe som resulterte i et område på 6,22 μm.

Spor Laser Beam splitter Filter
pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358) 561 MBS -405 + BP 570-620 + LP645
MBS 488/561/633 + SBS SP615
Viralt gen: ICP0 633 MBS -405 + BP 420-480 + LP605
MBS 488/561/633 + SBS LP570
Kjerne: DAPI 405 MBS -405 + BP 420-480 + BP 495-550
MBS 488/561/633

Tabell 1: Bildespor for cellevisualisering.

9. Dataanalyse og kvantifisering

  1. Last opp de mikroskopiske bildene til programvaren. Bruk det utvidede fokuset til å visualisere all informasjonen i z-stakken i et 2D-bilde.
  2. Deretter programmerer du analyseprotokollen for å trekke ut følgende informasjon: antall celler per bilde, summen av voxels som viser p-RIPK3 (S227) + eller p-MLKL (S358) + farging. En voxel representerer et tredimensjonalt volum, definert som den tredimensjonale ekvivalenten til en piksel.
  3. For å kvantifisere antall celler per bilde, segmenter kjernen. Hvis du vil redusere støy i segmenteringsresultatene, legger du til en størrelsesbegrensning i segmenteringen (>100 μm³). Antall segmenterte kjerner representerer antall celler i bildet.
  4. For å kvantifisere mengden p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxels, programmer en terskelbasert segmentering. Still inn terskelen slik at ingen signal fanges opp i bildene uten primært antistoff (NP).
  5. Tilpass terskelen ytterligere ved hjelp av bildene fra den ubehandlede mock-tilstanden. For å sikre sensitiv deteksjon av signaløkningen på grunn av nekroptosestimulering, begrens hentingen av p-RIPK3 (S227)+ eller p-MLKL (S358)+ voxels i hånlige forhold ved å sette en høyere terskel. Sjekk alltid den programmerte analyseprotokollen i flere bilder fra mock-tilstanden og nekroptosefremkallende virusinfeksjon.
  6. Kjør analysen på alle bildesett. Eksporter voxel-kvantifisering og kjernesegmentering i en .txt-fil for videre behandling i regnearkprogramvare.
  7. Lag en pivottabell med dataene som viser bildenavnet, kjernekvantifiseringen og summen av oppdagede voxels.
  8. Deretter deler du summen av positive voxels med antall celler i bildet. Dette resulterer i en relativ verdi av positive voxels per celle. For å visualisere foldeøkningen, del den relative verdien av p-RIPK3 (S227) + eller p-MLKL (S358) + voxels per celle med medianen av den ubehandlede tilstanden (mock).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunfluorescerende påvisning av MLKL-fosforylering og spesielt RIPK3-fosforylering i humane celler er teknisk utfordrende26. Vi presenterer her en forbedret fargeprotokoll for human p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) ved aktivering av ZBP1. Protokollen inkluderer et TSA-trinn for å forbedre deteksjonsgrensen og følsomheten til fluorescerende signaler. For å validere metoden ble det utført en side-ved-side-sammenligning av TSA-mediert immunfluorescens med standard indirekte fluorescerende farging av både p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358).

HT-29-celler som uttrykker human ZBP1 ble infisert i 9 timer med en ICP6 RHIM mutant HSV-1-stamme (HSV-1 ICP6mutRHIM) for å indusere ZBP1-mediert nekroptose og RIPK3-fosforylering. HSV-1 ICP6mutRHIM-stammen bærer en VQCG til AAAA-mutasjon i ICP6 RHIM og er ikke i stand til å blokkere nekroptosesignalering nedstrøms ZBP114,15. Som tidligere rapportert26, var standard indirekte immunfluorescens ikke følsom nok til å visualisere RIPK3 S227 fosforylering med det nåværende kommersielt tilgjengelige antistoffet, selv når laserkraften til det konfokale mikroskopet ble økt til 30% (figur 2A). I motsetning til dette aktiverte inkluderingen av et TSA-trinn robust deteksjon av p-RIPK3 (S227) i cytosolen til celler infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM. p-RIPK3 (S227)-signalet nådde metning når lasereffekten ble satt til 2 % (figur 2A). Kvantifisering av de tredimensjonale z-stack-bildene (se trinn 9) viste en ca. 20 ganger økning i antall voxels som var positive for p-RIPK3 (S227) i HSV-1ICP6 mutRHIM-infiserte over liksombehandlede celler (figur 2B). Å utelate det primære anti-p-RIPK3 (S227) antistoffet fra den TSA-medierte fargeprotokollen som en ingen primær (NP) kontroll ga ikke et detekterbart signal. For å visualisere HSV-1ICP6 mutRHIM-infiserte celler ble prøvene farget sammen med et primært antistoff rettet mot det umiddelbare tidlige virale proteinet ICP0 (figur 2A). Et lavt, men detekterbart p-RIPK3 (S227) signal var tilstede i de mock-behandlede cellene, noe som kan representere den konstitutive autofosforyleringen av human RIPK3 på dette stedet5 (se diskusjonen). I tråd med en tidligere rapport28 er RHIM av ICP6 ikke i stand til å blokkere RIPK3 S227 fosforylering fullt ut, da vi oppdaget økt p-RIPK3 (S227) farging av celler infisert med villtype HSV-1 (HSV-1WT; Figur 2A,B). For ytterligere å validere spesifisiteten til p-RIPK3 (S227) signalet, ble cellene behandlet med RIPK3-kinasehemmeren GSK'840 før infeksjon. GSK'840 binder seg til kinasedomenet til RIPK3, forhindrer dets aktivitet og hemmer dermed autofosforyleringen29. GSK'840 forhindret RIPK3-fosforylering ved S227 ved ZBP1-aktivering (figur 2A, B), og bekreftet spesifisiteten til den TSA-medierte p-RIPK3 (S227) deteksjonsmetoden.

For å følge MLKL-fosforylering, en sluttfasemarkør for nekroptose, ble ZBP1-uttrykkende HT-29-celler infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM i 8 timer og 10 timer. Cellene ble farget med et antistoff mot S358 fosforylert MLKL (p-MLKL [S358]) ved bruk av TSA. De mock-behandlede cellene viste lav og noe punktert cytosolisk farging av p-MLKL (S358), mens sterk p-MLKL-farging ble påvist i cytosolkjernen. og ved plasmamembranen i cellene som var infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (figur 3A). Videre ble p-MLKL (S358) signalet observert i klynger. Dette er i tråd med poredannende funksjoner av aktiverte fosforylerte MLKL-oligomerer ved cellemembranen og dens nylig rapporterte nukleære translokasjon ved influensa A-infeksjon 1,2,6,30. Som en positiv p-MLKL (S358) fargekontroll stimulerte vi ZBP1-uttrykkende HT-29-celler med en kombinasjon av TNF, SMAC-mimetisk BV6 og pan-caspase-hemmer zVAD-fmk for å indusere TNFR1-mediert nekroptose (figur 3A). Utelatelse av det primære anti-p-MLKL (S358) antistoffet fra TSA-mediert fargeprotokoll som ingen primær kontroll ga ikke et påvisbart signal.

Deretter utførte vi en side-ved-side-sammenligning av p-MLKL (S358) immunfluorescerende farging med og uten TSA. ZBP1-uttrykkende HT-29-celler ble infisert i 9 timer med HSV-1 ICP6mutRHIM. Mens en lasereffekt på 40% var nødvendig for å oppdage et spesifikt p-MLKL (S358) signal i de infiserte cellene ved hjelp av standard indirekte immunfluorescens, nådde de TSA-behandlede prøvene allerede mettende signaler med en lasereffekt på 6% uten å øke bakgrunnsfargingen i de mock-behandlede prøvene (figur 3B). Videre viste kvantifisering av de tredimensjonale z-stack-bildene en over 10 ganger økning i antall voxels som var positive for p-MLKL (S358) ved bruk av TSA sammenlignet med standard indirekte immunfluorescens. Dette viser at TSA forbedrer både deteksjonsterskelen og følsomheten for p-MLKL (S358; Figur 3C).

Til slutt, for å validere den TSA-medierte immunfluorescensprotokollen for andre ZBP1-avhengige nekroptosevirusstimuli, infiserte vi ZBP1-uttrykkende HT-29-celler med influensa A-virus (IAV) PR8-stamme i 9 timer. IAV induserer både ZBP1-mediert apoptose og nekroptose i humane celler30. Faktisk tillot TSA robust påvisning av p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358), noe som indikerer at disse cellene gjennomgår nekroptose (figur 4A-D).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av TSA-protokollen. Celler blir sådd og stimulert i en brønnplate, kompatibel med high-end mikroskopi. Etterpå blir prøvene fiksert i 4% PFA, permeabilisert og blokkert for å forhindre aspesifikk binding av primære antistoffer. For å visualisere fosforylert RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og MLKL (p-MLKL [S358]), inkuberes spesifikke antistoffer som gjenkjenner disse viktige fosforyleringsstedene over natten på bildekammeret. Deretter tilsettes et sekundært antistoff, koblet til en hest reddik peroksidase (HRP). Denne HRP-gruppen muliggjør aktivering av biotinylert tyramid i nærvær av H 2 O2. Deretter kobles det aktive biotin-tyramid kovalent til tyrosinrester i nærheten av det HRP-merkede sekundære antistoffet. Disse inkluderer tyrosiner på proteiner av interesse - i dette tilfellet p-RIPK3 eller p-MLKL, som angitt i figuren - og de av naboproteiner og på de primære og sekundære antistoffene selv (ikke vist). Dette stimuleringstrinnet for tyrafidsignal øker følsomheten til fargeprotokollen kraftig. I et siste trinn tilsettes streptavidin koblet til en fluorescerende gruppe for å visualisere de biotinylerte molekylene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: HSV-1 ICP6mutRHIM induserer ZBP1-avhengig fosforylering av human RIPK3 ved S227. (A) Representative konfokale bilder av humane ZBP1-uttrykkende HT-29-celler, som sammenligner TSA-farging med en standard indirekte (ingen TSA) immunfluorescensfargeprotokoll for p-RIPK3 (S227). De mock- og virusinfiserte prøvene (HSV-1WT eller HSV-1 ICP6mutRHIM [MOI = 5]) ble inkubert i 9 timer. Som negativ kontroll ble RIPK3-kinasehemmeren GSK'840 (1 μM) inkludert. En ingen primær (NP) fargekontroll av celler infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer der både de primære anti-p-RIPK3 (S227) og ICP0 antistoffene ble utelatt, er inkludert. Lasereffekten som er nødvendig for å oppdage det spesifikke p-RIPK3 (S227) signalet, er angitt på bildene. ICP0 ble brukt til å farge de virusinfiserte cellene, og DAPI ble brukt til å farge kjernen. Skalastengene er 10 μm. (B) Relativ kvantifisering av p-RIPK3 (S227)+ voxels ved bruk av TSA-fargeprotokollen. Hver prikk representerer et bilde, og den røde linjen representerer medianen. Voxel-telleverdier presenteres i forhold til medianen av voxel-tellingen av bilder i mock-tilstanden. Statistikk ble gjort ved hjelp av en enveis ANOVA med flere sammenligninger ved hjelp av Tukey-korreksjon. s > 0,05 (n.s.), s≤ 0,05 (*), s≤ 0,01 (**). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: HSV-1 ICP6mutRHIM induserer ZBP1-avhengig fosforylering av human MLKL ved S358. (A) Representative konfokale bilder av humane ZBP1-uttrykkende HT-29-celler. Cellene ble enten liksombehandlet eller infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 8 timer og 10 timer. TSA ble brukt til å påvise p-MLKL (S358). ICP0 ble brukt til å farge de virusinfiserte cellene, og DAPI ble brukt til å farge kjernen. En ingen primær (NP) fargekontroll av celler som var infisert i 10 timer med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) der den primære anti-p-MLKL (S358) ble utelatt, er vist. Som en positiv kontroll ble cellene stimulert i 4 timer med 30 ng / ml TNF, 5 μM BV6 og 20 μM ZVAD-fmk, noe som induserer nekroptose via TNFR1. Skalastengene er 10 μm. (B) Representative konfokale bilder av humane ZBP1-uttrykkende HT-29-celler, som sammenligner TSA-farging med en standard indirekte (ingen TSA) immunfluorescensfargingsprotokoll for p-MLKL (S358). Cellene ble enten liksombehandlet eller infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer. NP-fargekontroll av celler infisert med HSV-1 ICP6mutRHIM (MOI = 5) i 9 timer der de primære anti-p-MLKL- (S358) og ICP0-antistoffene ble utelatt, er inkludert. Laserkraften som er nødvendig for å oppdage det spesifikke p-MLKL (S358) signalet, er angitt på bildene. (C) Relativ kvantifisering av p-MLKL (S358)+ voxels ved bruk av standard (ingen TSA) og TSA-fargeprotokoll. Hver prikk representerer et bilde, og den røde linjen representerer medianen. Voxel-tallverdiene presenteres i forhold til medianen av voxel-antallet bilder i mock-tilstanden. Statistikk ble gjort ved hjelp av en enveis ANOVA med flere sammenligninger ved hjelp av Tukey-korreksjon. p > 0,05 (n.s.), p ≤ 0,0001 (****). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Influensa A-virus induserer ZBP1-avhengig fosforylering av human RIPK3 og MLKL. (A,C) Representative konfokale bilder av humane ZBP1-uttrykkende HT-29-celler. Cellene ble enten liksombehandlet eller infisert med influensa A-virus (IAV), PR8-stamme (MOI = 4) i 9 timer og farget for p-RIPK3 (S227; A) eller p-MLKL (S358; C) bruk av TSA-protokollen. Skalastolpene er 10 μm. (B,D) Relativ kvantifisering av p-RIPK3 (S227)+ (B) eller p-MLKL (S358; D) voxels. Hver prikk i (B,D) representerer et bilde, og den røde linjen representerer medianen. Voxel-tallverdiene presenteres i forhold til medianen av voxel-antallet bilder i mock-tilstanden. Statistikken ble gjort ved hjelp av en Mann-Whitney-test. s≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne immunfluorescerende fargeprotokollen beskriver bruken av tyramidsignalforsterkning (TSA) for å øke følsomheten for signalhendelser i den humane nekroptotiske signalveien som er vanskelig å oppdage, inkludert fosforylering av RIPK3 og MLKL26. Inkluderingen av et TSA-trinn forbedrer signifikant deteksjonsterskelen for p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) og øker følsomheten til p-MLKL (S358) belastning. TSA avslørte et p-RIPK3 (S227) signal som allerede var tilstede i de mock-behandlede prøvene. I humane celler er autofosforylering av RIPK3 ved S227 en forutsetning for nekroptoseaktivering ved å muliggjøre en stabil interaksjon med MLKL. Denne prosessen skjer allerede på basale nivåer og resulterer i dannelsen av en stabil inaktiv p-RIPK3 (S227)/MLKL-dimer før nekroptoseinduksjon 2,5,31. På samme måte oppdager anti-p-RIPK3-antistoffet som ble brukt i denne studien også p-RIPK3 (S227) i ubehandlede celler ved vestlig blotting26.

Fosforyleringen av MLKL av RIPK3 i aktiveringssløyfen, ved T357 og S358, resulterer i dissosiasjon av det inaktive p-RIPK3 (S227) / MLKL-komplekset og induserer en konformasjonsendring der MLKL eksponerer sitt N-terminale fire helixbuntdomene. Aktivert p-MLKL oligomeriserer deretter og trafikkerer til cellemembranen hvor den setter inn sine fire helixbunter i lipid-dobbeltlaget, noe som resulterer i cellelyse 1,2,6. Ved hjelp av denne TSA-immunfluorescensprotokollen oppdaget vi en sterk økning i S358 MLKL-fosforylering under ZBP1-indusert nekroptose. p-MLKL (S358) gruppert i cytosolen og ved plasmamembranen og ble også funnet i kjernen ved ZBP1-aktivering. Faktisk har ZBP1 blitt rapportert å stimulere MLKL-mediert forstyrrelse av kjernemembranen i sammenheng med IAV-infeksjon 8,30. Det skal imidlertid bemerkes at TSA ikke bare deponerer biotin-tyramid på antigenet av interesse og de primære / sekundære antistoffene, men også på naboproteiner. TSA er derfor ikke ideelt egnet til å utlede informasjon om nøyaktig subcellulær lokalisering av de påviste proteinene, og vi anbefaler ikke TSA for samlokaliseringsstudier.

Gjentatte fryse-tine-sykluser påvirker stabiliteten til det biotinylerte tyramid. For å forhindre en reduksjon i signalfølsomheten, anbefaler vi å aliquot tyramid og bruke en frisk aliquot for hvert eksperiment. Forsiktighet bør utvises med batch-til-batch forskjeller i biotin-tyramid aksjer. Hvis den endelige konsentrasjonen av biotin-tyramid er for høy, vil ikke-spesifikk bakgrunn av TSA-forsterkningen maskere det spesifikke signalet. For å kontrollere for dette, anbefaler vi titrering av hvert nytt biotin-tyramid parti og å inkludere en ingen primær fargekontroll der det primære antistoffet utelates.

I den presenterte protokollen var TSA begrenset til ett mål. Påvisning av fosforylert RIPK3 og MLKL ble ikke kombinert i samme farging, da begge primære antistoffene ble oppdrettet i samme art. Protokollen kan tilpasses for å oppdage flere TSA-forsterkede signaler (f.eks. p-RIPK3 [S227] og p-MLKL [S358]) i samme prøve ved bruk av multipleks immunfluorescerende TSA32,33. Endelig kan TSA-mediert forsterkning for immunfluorescensmikroskopi brukes til anerkjennelse av biomarkører av andre signalveier med rapporterte dårlige signal-til-støy-forhold.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke VIB Bioimaging Core for opplæring, støtte og tilgang til instrumentparken. J.N. er støttet av et stipendiatstipend fra Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i JM-gruppen ble støttet av et Odysseus II-stipend (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), et juniorforskningsstipend (G031022N) fra Research Foundation Flanders (FWO), et CRIG ungt etterforsker proof-of-concept-stipend, og av Ghent University. Forskning i P.V.-gruppen ble støttet av EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG og GIGG konsortier og VIB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-rabbit HRP Agilent Technologies Belgium K4002 Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit
Goat anti-mouse DyLight 633 Thermofisher 35513 Secundary antibody
HSV-1 ICP0 Santa Cruz sc-53070 Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody
IAV-PR8 mouse serum In house production xx Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody
pMLKL Abcam ab187091 Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody
pRIPK3 Abcam ab209384 Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody
Fluorophores
DAPI Thermofisher D21490 To visualise the nucleus of the cells
Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 Thermofisher S11226 To visulalise biotin molecules
Compounds
30% H2O2 Sigma H1009 Oxidising substrate, necessary for HRP activity
4% PFA SANBIO AR1068 To fix/crosslink the cells
Biotinyl-tyramide R&D Systems 6241 To amplify signal, HRP substrate
BV-6 Selleckchem S7597 BV6 IAP Inhibitor
         For cell culture: to detach the cells
         8.0 g/L NaCl
         0.4 g/L disodium salt of EDTA
EDTA 0.04% In house formulation 1.1 g/L Na2HPO4
         0.2 g/L NaH2PO4
         0.2 g/L KCl
         0.2 g/L Glucose
Fetal Bovine serum TICO FBS EU XXX For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439
GSK'840 Aobious AOB0917 RIPK3 kinase inhibitor
L-Glutamine Sigma-Aldrich G7513 For cell culture, maintaining cell culture
MAXblock Active Motif 15252 Blocking solution
PBS Gibco 10444402
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636 For cell culture, maintaining cell culture
TNF-α In house production - Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML To permeabilise the cells
Trypan blue Merck 11732 For cell counting, used as live/dead marker at 0,1%
Trypsine Sigma-Aldrich T4424 For cell culture: to detach the cells
zVAD Bachem BACE4026865.0005 Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone
Material
µ-Slide 8 well high glass bottom iBidi 80807 To culture the cells
Cotton Preping Balls-size medium Electron Microscopy Sciences 71001-10 To clean the objectives
Immersol 518 F / 30 °C ZEISS 444970-9000-000 To visualise the sample at high magnifications
Lens Cleaner ZEISS 000000-0105-200 To clean the objectives
LSM880 Fast Airyscan confocal microscope To visualise the sample
Software
Excel Office xx To process the data
Prism 9 Graphpad xx To analyse the data- statistical testing and graph generation
Volocity 6.3 Volocity xx To perform quantifications
Zen black ZEISS xx To aquire and process images
Zen blue ZEISS xx To visualise images
Viruses
HSV-1 (mutRHIM) F strain produced by  Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA)
HSV-1 (WT) F strain Produced by Dr. Jiahuai Han in house replication HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition)
IAV PR8 in house stock in house replication IAV as a trigger for necroptosis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
  2. Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
  3. Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
  4. Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
  5. Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
  6. Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
  7. Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
  8. Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
  9. Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
  10. Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
  11. Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
  12. Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
  13. Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
  14. Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
  15. Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
  16. Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
  17. Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
  18. de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
  19. Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
  20. Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
  21. Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
  22. Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
  23. Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
  24. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
  25. Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
  26. Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
  27. De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
  28. Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
  29. Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
  30. Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
  31. Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
  32. Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
  33. Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 188
Tyramid signalforsterkning for immunfluorescerende farging av ZBP1-avhengig fosforylering av RIPK3 og MLKL etter HSV-1-infeksjon i humane celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nemegeer, J., Lemeire, K.,… More

Nemegeer, J., Lemeire, K., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells. J. Vis. Exp. (188), e64332, doi:10.3791/64332 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter