Tyramid signalforsterkning for immunfluorescerende farging av ZBP1-avhengig fosforylering av RIPK3 og MLKL etter HSV-1-infeksjon i humane celler
Summary
Tyramidsignalforsterkning under immunfluorescerende farging muliggjør sensitiv påvisning av fosforylert RIPK3 og MLKL under ZBP1-indusert nekroptose etter HSV-1-infeksjon.
Abstract
Kinase Reseptor-interagerende serin / treonin protein kinase 3 (RIPK3) og dets substrat blandet avstamning kinase domene-lignende (MLKL) er kritiske regulatorer av nekroptose, en inflammatorisk form for celledød med viktige antivirale funksjoner. Autofosforylering av RIPK3 induserer fosforylering og aktivering av det poredannende bøddelproteinet til nekroptose MLKL. Smugling og oligomerisering av fosforylert MLKL ved cellemembranen resulterer i cellelyse, karakteristisk for nekroptotisk celledød. Nukleinsyresensoren ZBP1 aktiveres ved binding til venstrehendt Z-form dobbeltstrenget RNA (Z-RNA) etter infeksjon med RNA og DNA-virus. ZBP1-aktivering begrenser virusinfeksjon ved å indusere regulert celledød, inkludert nekroptose, av infiserte vertsceller. Immunfluorescensmikroskopi tillater visualisering av forskjellige signaltrinn nedstrøms for ZBP1-mediert nekroptose per celle. Sensitiviteten til standard fluorescensmikroskopi, ved bruk av nåværende kommersielt tilgjengelige fosfospesifikke antistoffer mot human RIPK3 og MLKL, utelukker imidlertid reproduserbar avbildning av disse markørene. Her beskriver vi en optimalisert fargeprosedyre for serin (S) fosforylert RIPK3 (S227) og MLKL (S358) i humane HT-29-celler infisert med herpes simplex virus 1 (HSV-1). Inkluderingen av et tyramidsignalforsterkningstrinn (TSA) i den immunfluorescerende fargeprotokollen tillater spesifikk påvisning av S227 fosforylert RIPK3. Videre øker TSA i stor grad følsomheten for deteksjon av S358 fosforylert MLKL. Sammen muliggjør denne metoden visualisering av disse to kritiske signalhendelsene under induksjonen av ZBP1-indusert nekroptose.
Introduction
Reseptorinteragerende serin/treoninproteinkinase 3 (RIPK3) og mixed lineage kinase domain-like (MLKL) er sentrale regulatorer av nekroptotisk celledød 1,2. Nekroptose er en lytisk og inflammatorisk form for regulert celledød involvert i antiviral immunitet og autoinflammasjon. Nekroptose av virusinfiserte celler slår umiddelbart av virusreplikasjon. Cellelyse etter nekroptoseinduksjon frigjør også skadeassosierte molekylære mønstre, noe som stimulerer antiviral immunitet 3,4. Nekroptose initieres ved aktivering av RIPK3 etter RIP homotypisk interaksjonsmotiv (RHIM)-mediert interaksjon med ett av tre oppstrøms aktiverende molekyler: RIPK1 (ved TNF-reseptor 1 [TNFR1] engasjement), TIR-domeneholdig adapterinduserende interferon-β (TRIF; ved Toll-lignende reseptor 3 og 4-engasjement), eller den antivirale nukleinsyresensoren Z-DNA-bindende protein 1 (ZBP1)1,2 . Nekroptosesignalering fortsetter gjennom en rekke fosforyleringshendelser som begynner med autofosforylering av RIPK3. Autofosforyleringen av human RIPK3 ved serin (S)227 innenfor kinasedomenet er en forutsetning for nekroptose ved å muliggjøre interaksjonen med MLKL og brukes ofte som en biokjemisk markør for human RIPK3-aktivering og nekroptotisk celledød 1,5. Når den er aktivert, fosforylerer RIPK3 aktiveringssløyfen til MLKL ved treonin (T) 357 og S3581. Dette fører til en endring i MLKL-konformasjon, noe som resulterer i eksponering av N-terminal fire helixbuntdomenet. MLKL oligomeriserer deretter og trafikkerer til cellemembranen hvor den danner en pore gjennom innsetting av de eksponerte fire helixbuntene i lipid-dobbeltlaget, noe som til slutt fører til celledød 2,6.
ZBP1 er en antiviral nukleinsyresensor som gjenkjenner venstrehendte Z-formede nukleinsyrer, inkludert dobbeltstrenget RNA i Z-konformasjonen (Z-RNA). Z-RNA-binding skjer via to Zα-domener plassert ved N-enden av ZBP1. Z-RNA som akkumuleres under RNA- og DNA-virusinfeksjon, antas å engasjere ZBP1 7,8 direkte. Aktivert ZBP1 rekrutterer RIPK3 gjennom sine sentrale RHIMs og induserer regulert celledød, inkludert nekroptose 9,10. Virus har tatt i bruk en rekke rømningsmekanismer for å motvirke ZBP1-indusert vertscellenekroptose11. For eksempel har herpes simplex-viruset 1 (HSV-1) ribonukleotidreduktase-underenhet 1, kjent som ICP6 og kodet av UL39, RHIM ved sin N-endestasjon som forstyrrer ZBP1-mediert RIPK3-aktivering i humane celler 12,13,14,15. ZBP1 begrenser ikke bare viral replikasjon, men musestudier har vist at ZBP1-aktivering forårsaker inflammatoriske sykdommer og stimulerer kreftimmunitet 16,17,18,19,20,21. Protokoller som oppdager signalhendelser som oppstår under ZBP1-indusert nekroptose i humane celler, er derfor verdifulle for å vurdere rollen til ZBP1 i disse prosessene.
Tyramid signalforsterkning (TSA), også referert til som katalysert reporteravsetning (CARD), er utviklet for å forbedre grensen for deteksjon og signal-til-støy-forhold i antistoffbaserte immunoassays. Under TSA kan ethvert primært antistoff brukes til å oppdage antigenet av interesse. Pepperrotperoksidase (HRP), koblet til et sekundært antistoff, katalyserer den lokale oppbyggingen av biotinylerte tyramidradikaler i nærvær av hydrogenperoksid. Disse aktiverte biotin-tyramidradikalene reagerer deretter med proksimale tyrosinrester for å danne kovalente bindinger. Potensielle tyramidbiotinsubstrater inkluderer selve antigenet, de primære og sekundære antistoffene og nærliggende proteiner. Således, mens TSA forbedrer følsomheten til analysen betydelig, går noe av den romlige oppløsningen tapt. I et siste trinn oppdages biotinmolekyler ved bruk av fluorescerende merket streptavidin. HRP-reaksjonen avsetter mange tyramid-biotinmolekyler på eller nær antigenet av interesse. Dette øker antallet streptavidin-fluorokrombindingssteder kraftig, og forsterker dermed sensitiviteten til analysen (figur 1). Alternativt kan tyramid kobles direkte til en fluorokrom, noe som eliminerer behovet for streptavidinkoblede fluoroforer. Proteinimmunhistokjemi og DNA / RNA in situ hybridisering var blant de første metodene der TSA ble brukt for å forbedre signalintensiteten22,23. I senere tid er TSA kombinert med intracellulær flowcytometri24 og massespektrometri25.
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage serin 227 fosforylert human RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) og fosforylert human MLKL (p-MLKL [S358]) ved aktivering av ZBP1 ved HSV-1-infeksjon ved bruk av immunfluorescensmikroskopi. Vi bruker en nekroptosefølsom HT-29 human kolorektal adenokarsinomcellelinje som ble transdusert for å stabilt uttrykke human ZBP1. Disse cellene ble infisert med en HSV-1-stamme som uttrykker et mutant ICP6-protein (HSV-1 ICP6mutRHIM) der fire kjerneaminosyrer i viral RHIM (VQCG) ble erstattet av alaniner (AAAA), og dermed gjorde ICP6 ute av stand til å blokkere ZBP1-mediert nekroptose13,14,15. For å overvinne problemet med det lave signal-til-støy-forholdet mellom de kommersielt tilgjengelige antistoffene rettet mot p-RIPK3 og p-MLKL i immunostaining26, utfører vi et tyramidsignalforsterkningstrinn (TSA) (figur 1), som resulterer i robust påvisning av human p-RIPK3 (S227) og forbedrer deteksjonsfølsomheten til human p-MLKL (S358) med en størrelsesorden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne immunfluorescerende fargeprotokollen beskriver bruken av tyramidsignalforsterkning (TSA) for å øke følsomheten for signalhendelser i den humane nekroptotiske signalveien som er vanskelig å oppdage, inkludert fosforylering av RIPK3 og MLKL26. Inkluderingen av et TSA-trinn forbedrer signifikant deteksjonsterskelen for p-RIPK3 (S227) og p-MLKL (S358) og øker følsomheten til p-MLKL (S358) belastning. TSA avslørte et p-RIPK3 (S227) signal som allerede var tilstede i de mock-behandlede prø…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke VIB Bioimaging Core for opplæring, støtte og tilgang til instrumentparken. J.N. er støttet av et stipendiatstipend fra Research Foundation Flanders (FWO). Forskning i JM-gruppen ble støttet av et Odysseus II-stipend (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), et juniorforskningsstipend (G031022N) fra Research Foundation Flanders (FWO), et CRIG ungt etterforsker proof-of-concept-stipend, og av Ghent University. Forskning i P.V.-gruppen ble støttet av EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG og GIGG konsortier og VIB.
Materials
| Antibodies | |||
| Anti-rabbit HRP | Agilent Technologies Belgium | K4002 | Envision+ System-HRP Labelled Polymer anti-rabbit |
| Goat anti-mouse DyLight 633 | Thermofisher | 35513 | Secundary antibody |
| HSV-1 ICP0 | Santa Cruz | sc-53070 | Mouse anti-ICP0(HSV-1) antibody |
| IAV-PR8 mouse serum | In house production | xx | Mouse anti-IAV-PR8 polyclonal antibody |
| pMLKL | Abcam | ab187091 | Rabbit anti-MLKL-phospho S358 antibody |
| pRIPK3 | Abcam | ab209384 | Rabbit anti-RIPK3-phospho S227 antibody |
| Fluorophores | |||
| DAPI | Thermofisher | D21490 | To visualise the nucleus of the cells |
| Streptavidin coupled to Alexa Fluor 568 | Thermofisher | S11226 | To visulalise biotin molecules |
| Compounds | |||
| 30% H2O2 | Sigma | H1009 | Oxidising substrate, necessary for HRP activity |
| 4% PFA | SANBIO | AR1068 | To fix/crosslink the cells |
| Biotinyl-tyramide | R&D Systems | 6241 | To amplify signal, HRP substrate |
| BV-6 | Selleckchem | S7597 | BV6 IAP Inhibitor |
| For cell culture: to detach the cells | |||
| 8.0 g/L NaCl | |||
| 0.4 g/L disodium salt of EDTA | |||
| EDTA 0.04% | In house formulation | 1.1 g/L Na2HPO4 | |
| 0.2 g/L NaH2PO4 | |||
| 0.2 g/L KCl | |||
| 0.2 g/L Glucose | |||
| Fetal Bovine serum | TICO | FBS EU XXX | For cell culture, maintaining cell culture; lot number: 90439 |
| GSK'840 | Aobious | AOB0917 | RIPK3 kinase inhibitor |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For cell culture, maintaining cell culture |
| MAXblock | Active Motif | 15252 | Blocking solution |
| PBS | Gibco | 10444402 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | For cell culture, maintaining cell culture |
| TNF-α | In house production | – | Signaling molecule, able to trigger cell death in combination with BV6 and zVAD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-50ML | To permeabilise the cells |
| Trypan blue | Merck | 11732 | For cell counting, used as live/dead marker at 0,1% |
| Trypsine | Sigma-Aldrich | T4424 | For cell culture: to detach the cells |
| zVAD | Bachem | BACE4026865.0005 | Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone |
| Material | |||
| µ-Slide 8 well high glass bottom | iBidi | 80807 | To culture the cells |
| Cotton Preping Balls-size medium | Electron Microscopy Sciences | 71001-10 | To clean the objectives |
| Immersol 518 F / 30 °C | ZEISS | 444970-9000-000 | To visualise the sample at high magnifications |
| Lens Cleaner | ZEISS | 000000-0105-200 | To clean the objectives |
| LSM880 Fast Airyscan confocal microscope | To visualise the sample | ||
| Software | |||
| Excel | Office | xx | To process the data |
| Prism 9 | Graphpad | xx | To analyse the data- statistical testing and graph generation |
| Volocity 6.3 | Volocity | xx | To perform quantifications |
| Zen black | ZEISS | xx | To aquire and process images |
| Zen blue | ZEISS | xx | To visualise images |
| Viruses | |||
| HSV-1 (mutRHIM) F strain | produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 as a trigger for necroptosis; RHIM core domain of UL39/ICP6 is mutated (VQCG>AAAA) |
| HSV-1 (WT) F strain | Produced by Dr. Jiahuai Han | in house replication | HSV-1 (WT) as a negative control for necroptosis induction (ICP6 inhibition) |
| IAV PR8 | in house stock | in house replication | IAV as a trigger for necroptosis |
References
- Meng, Y., Sandow, J. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The regulation of necroptosis by post-translational modifications. Cell Death & Differentiation. 28 (3), 861-883 (2021).
- Petrie, E. J., Czabotar, P. E., Murphy, J. M. The structural basis of necroptotic cell death signaling. Trends in Biochemical Sciences. 44 (1), 53-63 (2019).
- Mocarski, E. S., Guo, H., Kaiser, W. J. Necroptosis: The Trojan horse in cell autonomous antiviral host defense. Virology. 479-480, 160-166 (2015).
- Nailwal, H., Chan, F. K. Necroptosis in anti-viral inflammation. Cell Death & Differentiation. 26 (1), 4-13 (2019).
- Meng, Y., et al. Human RIPK3 maintains MLKL in an inactive conformation prior to cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 6783 (2021).
- Samson, A. L., Garnish, S. E., Hildebrand, J. M., Murphy, J. M. Location, location, location: A compartmentalized view of TNF-induced necroptotic signaling. Science Signalling. 14 (668), (2021).
- Koehler, H., et al. Vaccinia virus E3 prevents sensing of Z-RNA to block ZBP1-dependent necroptosis. Cell Host Microbe. 29 (8), 1266-1276 (2021).
- Balachandran, S., Mocarski, E. S. Viral Z-RNA triggers ZBP1-dependent cell death. Current Opinion in Virology. 51, 134-140 (2021).
- Kuriakose, T., Kanneganti, T. D. ZBP1: Innate sensor regulating cell death and inflammation. Trends in Immunology. 39 (2), 123-134 (2018).
- Maelfait, J., Liverpool, L., Rehwinkel, J. Nucleic acid sensors and programmed cell death. Journal of Molecular Biology. 432 (2), 552-568 (2020).
- Verdonck, S., Nemegeer, J., Vandenabeele, P., Maelfait, J. Viral manipulation of host cell necroptosis and pyroptosis. Trends in Microbiology. 30 (6), 593-605 (2022).
- Guo, H., et al. Herpes simplex virus suppresses necroptosis in human cells. Cell Host & Microbe. 17 (2), 243-251 (2015).
- Yu, X., et al. Herpes simplex virus 1 (HSV-1) and HSV-2 mediate species-specific modulations of programmed necrosis through the viral ribonucleotide reductase large subunit R1. Journal of Virology. 90 (2), 1088-1095 (2016).
- Huang, Z., et al. RIP1/RIP3 binding to HSV-1 ICP6 initiates necroptosis to restrict virus propagation in mice. Cell Host & Microbe. 17 (2), 229-242 (2015).
- Guo, H., et al. Species-independent contribution of ZBP1/DAI/DLM-1-triggered necroptosis in host defense against HSV1. Cell Death & Disease. 9 (8), 816 (2018).
- Devos, M., et al. Sensing of endogenous nucleic acids by ZBP1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation. The Journal of Experimental Medicine. 217 (7), 20191913 (2020).
- Jiao, H., et al. Z-nucleic-acid sensing triggers ZBP1-dependent necroptosis and inflammation. Nature. 580 (7803), 391-395 (2020).
- de Reuver, R., et al. ADAR1 prevents autoinflammation by suppressing spontaneous ZBP1 activation. Nature. 607 (7920), 784-789 (2022).
- Jiao, H., et al. ADAR1 averts fatal type I interferon induction by ZBP1. Nature. 607 (7920), 776-783 (2022).
- Hubbard, N. W., et al. ADAR1 mutation causes ZBP1-dependent immunopathology. Nature. 607 (7920), 769-775 (2022).
- Zhang, T., et al. ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis. Nature. 606 (7914), 594-602 (2022).
- Adams, J. C. Biotin amplification of biotin and horseradish peroxidase signals in histochemical stains. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 40 (10), 1457-1463 (1992).
- Speel, E. J., Hopman, A. H., Komminoth, P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization. Methods in Molecular Biology. 326, 33-60 (2006).
- Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1020-1031 (2010).
- Dopie, J., Sweredoski, M. J., Moradian, A., Belmont, A. S. Tyramide signal amplification mass spectrometry (TSA-MS) ratio identifies nuclear speckle proteins. The Journal of Cell Biology. 219 (9), 201910207 (2020).
- Samson, A. L., et al. A toolbox for imaging RIPK1, RIPK3, and MLKL in mouse and human cells. Cell Death and Differentiation. 28 (7), 2126-2144 (2021).
- De Groote, P., et al. Generation of a new gateway-compatible inducible lentiviral vector platform allowing easy derivation of co-transduced cells. Biotechniques. 60 (5), 252-259 (2016).
- Ali, M., Roback, L., Mocarski, E. S. Herpes simplex virus 1 ICP6 impedes TNF receptor 1-induced necrosome assembly during compartmentalization to detergent-resistant membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 294 (3), 991-1004 (2019).
- Mandal, P., et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Moleular Cell. 56 (4), 481-495 (2014).
- Zhang, T., et al. Influenza virus Z-RNAs induce ZBP1-mediated necroptosis. Cell. 180 (6), 1115-1129 (2020).
- Garnish, S. E., et al. Conformational interconversion of MLKL and disengagement from RIPK3 precede cell death by necroptosis. Nature Communications. 12 (1), 2211 (2021).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Parra, E. R., et al. Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies. Cancers. 12 (2), 255 (2020).
