Summary
在这里，我们报告了一种使用流式细胞术根据心肌B淋巴细胞在血管内或内皮空间中的位置对心肌B淋巴细胞进行定量和分化的协议。
Abstract
越来越多的证据表明，B淋巴细胞在心肌生理学和心肌适应损伤的背景下起着重要作用。然而，文献报告了关于心肌B细胞患病率的对比数据。据报道，B细胞既是啮齿动物心脏中最普遍的免疫细胞之一，要么存在，但患病率明显低于骨髓细胞，或者相当罕见。同样，几组人描述急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加，但一组报告受损心肌B细胞数量没有变化。实施一种共享的、可重复的方法来评估心肌B细胞的患病率对于协调不同研究小组的观察结果至关重要，从而促进B细胞心肌相互作用研究的进展。根据我们的经验，文献中报道的看似相反的观察结果可能源于这样一个事实，即鼠心肌B细胞大多在血管内并与微血管内皮相连。因此，从小鼠心脏中回收的B细胞数量对用于清洁器官的灌注条件和所使用的消化方法非常敏感。在这里，我们报告了一个优化的协议，该协议以特定的方式考虑了这两个关键变量。该协议能够对鼠心肌B细胞的数量进行可重复的，基于流式细胞术的分析，并允许研究人员区分血管外与血管内心肌B细胞。
Introduction
B淋巴细胞是高度特化的免疫细胞，在适应性和先天免疫反应中都起着重要作用1。B细胞有两个主要群体：较小的B1细胞群，主要在胚胎生命期间产生，以及成年后在骨髓中产生的B2细胞群占主导地位1。在骨髓中成熟后，B细胞迁移到原代和次级淋巴器官。从那里，它们在通过血管和淋巴管的淋巴器官之间不断循环2。B细胞在其表面表达特异性抗体，其作为受体发挥作用。当B细胞遇到与其受体结合的抗原时，可以触发激活信号。活化的B细胞要么迁移到发现抗原的组织，要么回到骨髓，在那里它们可以成熟为产生抗体的浆细胞3，4。
最近，人们认识到心脏含有大量的B细胞。对啮齿动物的研究表明，B细胞在胚胎发育早期定植在心脏5，并且心肌相关B细胞大多是血管内幼稚的B2细胞粘附在内皮6，7上，其中B1细胞的比例很小7。仍有许多不确定的领域，但现有数据表明，B细胞在幼稚的心脏和心肌适应损伤的背景下都起着重要作用。
对幼稚鼠心脏的研究表明，在基线时心肌B细胞大多位于血管内间隙，粘附在内皮上（发现>95%的小鼠心脏B细胞位于血管内间隙）。发现这些B细胞的基因表达模式与从外周血分离的循环B细胞的基因表达模式不同。对B细胞缺陷动物的幼稚心脏和同系对照的分析发现，缺乏B细胞的动物心脏较小，射血分数较高6。所有这些证据表明，B细胞可能调节心肌生长和/或心肌功能，不仅间质，而且血管内B细胞都可能负责这种观察。还发现B细胞调节心肌常驻巨噬细胞的表型8。
一些研究表明，B细胞在心肌适应损伤的背景下起着重要作用8，9，10，11，12，13。B细胞在受伤的心脏中短暂积累，可能是通过CXCL13-CXCR5依赖机制11，13。从那里，B细胞通过几种机制促进不良心脏重塑，包括细胞因子介导的单核细胞募集9，12。此外，B细胞可以产生针对心脏蛋白的抗体，这些抗体可以通过几种机制促进心脏损伤的扩展和不良心脏重塑14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25.B细胞还可以通过分泌IL-10对受伤的心脏发挥保护作用10。
随着研究B细胞在幼稚和受伤心脏中的作用的小组数量的增加，定义共享协议以正确量化和评估心肌B细胞变得越来越重要，从而避免已经开始出现在文献中的不一致。事实上，据报道，B细胞都是啮齿动物心脏中最常见的免疫细胞之一7，并且其患病率明显低于骨髓细胞26，27，或者相当罕见28。同样，有几组人描述急性缺血性心肌损伤后心肌B细胞数量增加7、9、13，但有一组报告受损心肌B细胞数量没有变化29。对心脏免疫细胞的研究很少给出灌注条件的细节，对消化条件也没有达成共识。由于在啮齿动物心脏中，很大一部分B细胞在血管内，并且从心肌中提取免疫细胞高度依赖于所使用的消化方法，因此文献中报道的差异可能是器官灌注和组织消化差异的结果。
这里介绍的是一种基于流式细胞术的鼠心肌B细胞定量的详细方法，该方法通过优化灌注和消化条件来最大限度地提高B细胞回收率，并允许区分血管内与血管外心肌B细胞6。该协议是对区分血管内和间质免疫细胞的其他类似方案的改编和优化28，30，31。
在该协议中，我们将心肌灌注标准化，以消除漂浮在血管内空间中的B细胞，而无需去除粘附在微血管内皮上的生物学相关B细胞。此外，基于先前描述使用静脉注射抗体来区分血管内和间质免疫细胞的方案32，并利用B细胞表达表面标志物B22033的事实，我们演示了如何通过在动物处死和心脏灌注前立即血管内注射B220特异性抗体来区分血管内和血管外心肌B细胞。该协议与任何有兴趣包括幼稚和受伤心脏中心肌B细胞分析的科学家的研究相关。该协议的广泛实施将减少研究小组之间的不一致，将允许分析血管内和血管外心肌B细胞库的变化，从而促进心脏免疫学领域发现的进步。
总之，该协议代表了一种优化的工作流程，可通过流式细胞术量化和分析心肌B细胞，同时区分位于血管外空间和血管内间隙的细胞。
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Protocol
本手稿中描述的所有实验均在约翰霍普金斯大学医学院IACUC的批准下进行。
1. 准备工作
- 准备FACS缓冲液，如 表1中所述。
- 确保有足够的CO2 对动物实施安乐死。
- 准备解剖空间（放置工作台垫并将胶带和解剖工具放在附近）。
- 标记15 mL试管，在每个试管中放入3 mL含钙和镁的HBSS（参见材料表）并将它们放在冰上（每个心脏一个管，一个额外的用于参考组/流式细胞术对照）。此外，用HBSS填充小（35毫米）培养皿。
- 打开温控摇床，将其设置为37°C，并在4°C的温度下预冷离心机。
- 准备注射泵并将流速设置为 3 mL/min。用HBSS填充20 mL注射器，用缓冲液灌注管路，并去除任何气泡。
2.血管内B细胞染色（体内）
- 称量C57BL / 6J品系的12周龄雄性小鼠。用 100 μL B220 抗体稀释液（PBS 中的 1：10）加载 3/10 cc 胰岛素注射器。用铝箔覆盖注射器以防止光线照射。
- 麻醉一只小鼠。
- 腹膜内注射2%2，2，2-三溴乙醇，剂量为400mg / kg，等待10-20分钟。
注意：监测鼠标的呼吸和运动。一旦鼠标停止移动，通过捏住脚趾来刺激疼痛;没有戒断反射表明充分麻醉。 - 如果在20分钟内没有达到足够的麻醉，则可以给予100mg / kg的额外剂量的麻醉剂，并且应每5分钟评估一次小鼠动力学，戒断反射和呼吸。
- 腹膜内注射2%2，2，2-三溴乙醇，剂量为400mg / kg，等待10-20分钟。
- 将鼠标放在实验室工作台上，放在向一侧倾斜的长凳垫上，轻轻拉下背部的皮肤，然后将身体轻轻按压在工作台上，使眼睛突出。
- 通过眶后注射注射步骤2.1中稀释的B220抗体。
- 将注射器从小鼠头部的矢状面45°引入眼睛。慢慢注入溶液。如果感觉到阻力，请取出注射器并再次进入。等待2分钟。
注意：延长孵育时间会危及区分血管内与血管外 B 细胞的能力，因为它会让注射的抗体有时间扩散到脉管系统外。
- 将注射器从小鼠头部的矢状面45°引入眼睛。慢慢注入溶液。如果感觉到阻力，请取出注射器并再次进入。等待2分钟。
- 按照IACUC规定对小鼠实施安乐死。
- 以 0.5 L/min 的速率打开流向安乐死室的 CO2 流量，或根据腔室大小推荐的流速。
- 将鼠标放在腔室中建议的时间，确保它不再呼吸。将其移除并进行颈椎脱位作为安乐死的次要方法。
- 一旦小鼠被安乐死，立即进行器官摘取和灌注。
3. 心脏收集
- 胸部开口。
- 在上腹部用镊子握住小鼠的皮肤。用剪刀在皮肤上开一个2毫米的开口，用镊子剥开皮肤，露出胸部和腹部的筋膜层，一个有光泽的半透明层。在上腹部通过筋膜和腹膜切开腹壁并露出剑突。使用止血钳夹住剑突。
- 用剪刀在每侧锁骨中线水平处垂直切开胸壁，抬起前胸壁以露出纵隔内容物，使用止血钳作为重物来保持开口。
- 心脏灌注和提取。
- 使用镊子去除心脏周围的任何脂肪或胸腺组织。
- 使用镊子从后面牢固地握住主动脉。将注射器针头（25G）引入心脏顶点。以 3 mL/min 的速率灌注 3 mL HBSS。
注意：监测灌注。肝脏应充盈，冠状血管中的血液应完全清除。建议使用校准为 1 mL/min 的注射泵以保持稳定的流量。 - 用剪刀剪主动脉并取出心脏。用HBSS清洗培养皿中的心脏以去除任何残留的血液。使用剪刀和镊子去除脂肪，结缔组织和胸腺，并干燥心脏。称量孤立的心脏并注意以毫克为单位的重量。用刀片在室温下将心脏切成小块（1-2毫米）。
注意：成年小鼠心脏的重量可能在0.090-0.210毫克之间。 - 测量心脏组织的质量，并将 60 mg 要消化的碎心脏放入含有 3 mL HBSS 的 15 mL 管中。保留剩余的心脏组织并放入标有“参考对照组织”的管中;这将用于活死信号和自发荧光的补偿控制。
4. 心脏消化和细胞染色
- 向含有碎组织的每个管中加入酶（见 表1）。向管中加入 0.5 μL/mg 的 DNase 1（60 mg 心脏组织为 300 单位）、0.5 μL/mg 胶原酶 II（60 mg 心脏组织为 625 单位）和 0.2 μL/mg 透明质酸酶（60 mg 心脏组织为 50 单位）。
- 将消化反应以300rpm的速度放入摇床中30分钟。将振动架调整到倾斜度约 25°。
- 向每个15mL反应管中加入7mL HBSS，并在4°C下以250 x g 离心5分钟，加速和破碎设置为中等或缓慢。倒出上清液并将每个沉淀重悬于 5 mL ACK 裂解缓冲液中以去除红细胞。在室温下在ACK裂解缓冲液中孵育5分钟。
- 向每个管中加入 10 mL PBS，混合，然后用 40 μm 过滤器过滤到 50 mL 管中。确保所有碎屑都在过滤室内。用注射器柱塞粉碎过滤器上的任何碎屑，直到它完全悬浮在过滤室内。
- 通过过滤器添加PBS，直到体积达到每颗心脏25毫升;这将允许悬浮的细胞通过过滤器。向参比对照组织管中额外添加 25 mL PBS，并将体积分成不同的管（每个 25 mL）。将其中一个管标记为“未染色”，将另一个标记为“活死”。在4°C下以250× g 离心5分钟。
注意：此时，准备活死污渍的稀释液（稀释：1x PBS中的1：500）。 - 倒出上清液，将沉淀重悬于未染色管中的 100 μL PBS 中，其他每个沉淀重悬于 100 μL 活死染色稀释液中。在黑暗中在冰上孵育30分钟，用铝箔覆盖冰桶。
- 向每个样品中加入 500 μL FACS 缓冲液，并通过 40 μm 过滤器将其转移到标记的 FACS 管中。在4°C下以250× g 离心FACS管5分钟。 弃去上清液。将沉淀重悬于 500 μL FACS 缓冲液中。
- 向每个试管中加入 50 μL Fc 封闭溶液（参见 表 1），未染色和活死管除外。混合并孵育5分钟。
- 向每个试管中加入 50 μL 抗体混合物溶液（参见 表 1），未染色和活死管除外，并在黑暗中孵育 30 分钟，用铝箔覆盖冰桶。
- 向每个试管中加入2mL FACS缓冲液，并在4°C下以250× g 离心5分钟。 除去上清液并重悬于300-500μLFACS缓冲液中。
5. 流式细胞术
- 设置仪器控制设置。
注意：在该协议中，使用4激光Cytek Aurora流式细胞仪分析样品。另一种合适的流式细胞仪可用于检测感兴趣的标志物。- 打开仪器控制软件（参见 材料表）。在窗口顶部，选择“ 获取 ”选项卡，然后单击“ 新建 +”。将显示一个名为 “创建新实验” 的窗口。
- 在 “库”部分的“ 要筛选的类型”字段中，键入 PE、PerCP-Cy5.5、BV421、Alexa Fluor 700 和 Zombie Aqua，在键入每个内容后单击 “添加 ”。荧光基团名称应在右侧看到。然后单击 下一页 进入 组 标签。
- 在 组 选项卡中，单击带管子的符号以添加用于分析的心脏。
- 单击“ + 引用 ”组，将显示一个窗口。在荧光标记列中选择 僵尸水族，在控制类型列中选择 单元格，然后单击 保存。
- 点击 下一页 > 标记 标签;将显示一个包含荧光基团名称的表格。在每个荧光基团列的第一行中键入相应的细胞标记物， 然后输入：用于PerCP-Cy5.5的CD45;CD19 代表 BV421;用于Alexa Fluor 700的CD11b;用于PE的B220;和僵尸水的活死人。
- 单击“ 下一步 ”两次以转到 “获取 ”选项卡。在实验组的 要记录的事件 中键入 10，000，000，在参考组行的同一字段中键入 200，000。单击 保存并打开。其他设置应保持默认值， 停止时间 为 10，000 ，停止音量 为 3，000。
- 在左下角单击 仪器控制。将 电压 设置为 FSC-50、SSC-175、SSC-B-175。然后，选择 采集控件。对于 流量 选项，从下拉菜单中选择 高 。
- 使用细胞仪采集参比样品并在软件中解混。
- 涡旋未染色的心脏管并将其牢固地放置在样品进样口（SIP）上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后单击细胞仪软件采集控制面板中的“开始”并等待记录事件。对活死染色的心脏组织做同样的事情。
- 选择 “取消混合 ”菜单并设置以下控件：
- 选中库中列中 PE、PerCP-Cy5.5、BV421 和 Alexa Fluor 700 的复选框。确保在同一列中取消选中僵尸水。在底部，选中选项 自发荧光作为荧光标签.
- 单击 下一步 进入识别 阳性/负总体 选项卡。在此选项卡中，将显示 FSC-A 与 SSC-B-A 的图。单击并拖动多边形的点，以在 FSC-A 轴上选择 1.0 M 到 4.0 M 之间的区域，在 SSC-B-A 轴上选择 0.2 M 到 3.0 M 之间的区域。
- 在右侧的下一个图中，V5-A 将显示在 X 轴上。移动门以选择最右侧的一半峰值为正，将图左侧的区域选为负。在标题为参考组 - 未染色的图中，选择类似范围内的总体。为此，必须设置未染色的无正阴性。
- 获取实验样品。
- 对于每个包含单个小鼠样品的试管，涡旋试管并将其牢固地放置在SIP上。确保绿色指示箭头指向正确的样品，然后单击细胞仪软件采集控制面板中的“开始”，并等待记录事件。
- 门控策略。
- 选择 “默认未混合工作表 ”选项卡。使用顶部的 点图工具 创建 FSC-A 与 SSC-A 图。使用 多边形选择工具在 FSC-A 轴上选择高于 0.4 M 的事件，在 SSC-A 轴上选择高于 0.8 M 的事件。双击此选择，将显示一个新图。
- 从新创建的绘图中，右键单击 X 轴标签 并选择 AF-A;右键单击 Y 轴标签 ，然后选择 活死染色。单击顶部的 矩形选择工具 ，然后选择活死轴上低于 105 的所有 事件，这些事件对应于较低的活 死信号。双击此选择，将显示一个新图。
- 在新图中，右键单击以选择 PerCP-Cy5.5-A 作为 X 轴， SSC-A 作为 Y 轴。使用 矩形选择工具，在 PerCP-Cy5.5-A 轴上选择与 CD45 阳性细胞对应的高于 104 的事件 。双击选择，将显示一个新图。
- 在新图上，右键单击以选择 FSC-A 作为 X 轴， FSC-H 作为 Y 轴。使用 面选择工具选择遵循 FSC-A 值和 SSC-A 值相同的趋势的事件;这样，细胞双联体将被移除，选择中的群体将被称为CD45 +群体。双击选择以显示包含 CD45+ 群体的新图。
- 从 CD45+ 群体图中，右键单击以在 X 轴上选择 BV421 ，在 Y 轴上选择 SSC-A。使用 多边形选择工具，选择 BV421 轴上右侧的人口。这是B细胞群。在此群体中双击两次以创建两个包含 B 细胞群体的新图。
- 右键单击以设置第一个 B 单元图，其中 PE-A 在 X 轴上， BV421-A 在 Y 轴上。右侧的群体对应于血管内 B 细胞，左侧的群体代表间质 B 细胞。使用 面选择工具 对两者进行选择。
- 右键单击以设置第二个B细胞图，X轴上为 Alexa Fluor 700-A ，Y轴上为 SSC-A 。左侧的群体对应于CD11b-细胞，右侧的事件（如果有的话）对应于CD11b +细胞。
- 右键单击每个选择，然后单击“门属性”。单击计数和父级百分比以显示大小和百分比。记录事件数和百分比以进行进一步的数据分析。
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Representative Results
采集完成并收集所有事件后，应根据标准流式细胞术实践分析数据。分析的重点将根据每个实验的个别目标而有所不同。在这种情况下，进行血管内和血管外B细胞的定量，并将其表示为每毫克组织的细胞数。
使用光谱细胞仪时，建议从初始设门开始分析，以去除大小不在免疫细胞对应范围内的碎片，然后去除活死染色+信号。这允许检测对应于白细胞的CD45阳性细胞的清洁群体（图1）。去除双峰后，在幼稚的未受伤心脏中，预计约20%的CD45 +细胞将是CD19 + B细胞（图2A，该代表性实验中的18.1%B细胞）。在这些细胞中，平均5.5%位于间质空间，而94.5%位于血管内空间（图2B）。在心脏中发现的整个B细胞群中，只有约1.6%对应于基于表面标记CD11b的B1细胞（通常被认为足以将鼠CD19 +细胞分类为具有高度置信度的B1细胞1，34，35），另外98.4%对应于B2细胞（图2C）。
图 1：用于检测和表征心肌相关 B 细胞的流式细胞术门控策略。 （A） FSC-A 与 SSC-A：该图显示了收集的所有事件，并绘制了所选区域以使用白细胞大小范围内的事件来丰富分析。（B）自发荧光与活死染色：所选区域对应于较低的活死信号。绘制的门去除了死细胞和一些与活死染色结合的其他细胞碎片。（C）CD45信号与SSC-A：所选区域对应于CD45 +细胞（即心肌白细胞）。（D） FSC-A vs. FSC-H：绘制此门以去除细胞双峰（未选择的事件）。（E）CD19信号与SSC-A：所选区域对应于心肌B细胞。（F）B220与CD19：黑色方块内的区域对应于心肌内B细胞（CD19+，B220-），红色方块内的区域对应于血管内B细胞群。（G）CD11b与SSC-A：黑色圆圈内的区域对应于CD11b +（B1细胞），红色圆圈内的区域对应于CD11b-（B2细胞）。每个面板上显示的百分比表示显示的人口与父母人口的平均百分比。请点击此处查看此图的大图。
图2：报告每毫克心肌组织平均B细胞数的代表性图。 （A）CD45+和CD19+细胞/小鼠心肌组织的平均数量。显示的百分比对应于来自亲本群体的细胞百分比（CD45+）。（B）CD19+细胞的平均数量和血管内间隙间质（血管外）空间中B细胞的百分比。（C）表达B1或B2细胞标志物的心肌B细胞的绝对数量和百分比。误差线对应于平均值的标准误差。请点击此处查看此图的大图。
表 1： 此表包含该程序所需的溶液和试剂。 请按此下载此表格。
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Discussion
越来越多的证据表明，B细胞在心肌生理学和心肌重塑/适应损伤的背景下起着重要作用7，8，9，10，11，12，13，36。流式细胞术是研究任何组织中免疫细胞群的绝佳工具，几乎是任何专注于心脏中B细胞的研究的强制性工具。
关于B细胞和心脏的新兴文献已经报道了非常基本的方面的对比发现，例如心脏中B细胞的数量和心肌B细胞数量的变化。据报道，B细胞是啮齿动物心脏中最普遍的免疫细胞7。然而，其他研究评估了与其他骨髓细胞相比的相对患病率，并显示明显较低的数字26，27。Pinto等人26 发现B细胞约占总白细胞的9%，而Yu等人27 报告了10%。Adamo等人7报告说， B细胞相对于白细胞数量的平均百分比约为20%，这与本手稿中报告的18.1%非常接近。其他研究报告，B细胞在心肌中的患病率非常低28。
几个关键的实验步骤可以解释文献中报道的B细胞数量的变化。也就是说，心脏灌注、组织切碎和消化的差异会显着影响每毫克心脏组织回收的 B 细胞数量。用不含钙的钙螯合剂的缓冲液灌注，或具有较高体积或灌注速率的灌注，可能会分离附着在内皮上的B细胞并降低恢复率。过细的组织切碎可能导致组织过度消化和细胞活力丧失。细胞活力的降低也可能是长时间消化或酶浓度较高的结果。
在野生型小鼠中，对应于B细胞的CD45 +细胞的百分比可能在15%-30%之间。根据所使用的小鼠品系、年龄和遗传背景，该值可能会有所不同。但是，研究组中的百分比应保持相似。属于同一组的小鼠之间B细胞数量和百分比的巨大差异表明可能发生实验错误。低百分比可能表明灌注强度和时间过剩。CD45+细胞的整体减少可能表明组织被过度消化。
此处描述的方案已经过优化，可从消化的鼠心脏中提供一致的B细胞产量，并允许区分血管内与血管外B细胞6。血管内与血管外B细胞的区分是通过在处死前立即在血管内注射抗体来实现的。血管内注射的抗体很容易扩散到整个脉管系统，并遇到所有血管内B细胞。如果尽快处死动物并及时收获心脏，抗体就没有时间在血管外间隙扩散并染色血管外 B 细胞。由于抗体血管内注射和器官收获之间的时间至关重要，因此建议接种抗体并一次收集一个小鼠心脏。如果对血管内与血管外 B 细胞的区分不感兴趣，则可以省略血管内注射抗体。 图1 中显示的门控策略将保持不变，除了最后一步，由于缺乏B220标记，这是不可能的。根据实验设计，所示面板中的任何荧光团都可以修改为适合所用面板的颜色。此外，重要的是要考虑到表面标记的选择可以根据执行它的小组的需要进行修改;例如，如果在实验设计中认为B1细胞上的CD11b表达可以降低，则建议添加不同的标记物，例如IgM，IgD和CD537。
请注意，可能需要处理心脏才能运行流式细胞术的补偿对照。建议在首次优化实验时执行此操作。在接下来的实验中，在心脏收集时保存一些组织可能就足够了，因为它将提供足够的细胞来运行阴性的“未染色”对照和阳性的“活死”染色对照。其他颜色的单独对照可以从先前的实验中导入或使用珠子生成。
可以在不改变实验结果的情况下修改协议的某些步骤。例如，可以根据研究人员的经验将麻醉方法更改为首选方法;使用异氟醚代替2，2，2-三溴乙醇可以减少麻醉给药和心脏采集之间的时间。此外，心脏灌注可以在不使用注射泵的情况下手动完成，只要缓慢、轻柔和一致地进行。
尽管方案执行准确，但缺乏经验的操作人员可能会在同一实验会话中或不同实验会话之间的样品之间遇到高度差异。根据经验，一旦科学家有机会完全熟悉工作流程，这种可变性就会消失。因此，建议任何想要实施该协议的人在收集其研究项目的关键数据之前，在两到三次试运行中评估其可重复性。
总之，现有的从心脏分离免疫细胞并通过流式细胞术分析它们的方法通常不考虑免疫细胞附着在内皮上的能力，并且要么不标准化灌注，要么实施广泛的灌注，假设血管内空间中的任何免疫细胞都是必须清除的污染物。这忽略了粘附在内皮上的血管内免疫细胞具有生物学相关性的概念。这里介绍的方案已经过优化，以最大限度地提高心肌免疫细胞的恢复，特别注意心肌B细胞，血管内和血管外。我们希望所有在心脏免疫学领域工作的科学家都会对这个协议感兴趣，并有兴趣探索B细胞在健康和受伤的心脏中可能发挥的功能。
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Disclosures
Luigi Adamo是i-Cordis，LLC的联合创始人，该公司专注于开发用于治疗心力衰竭的免疫调节分子，对B细胞调节药物吡非尼酮的衍生物特别感兴趣。其余作者没有冲突要声明。
Acknowledgments
这项研究由NHLBI授予Luigi Adamo的5K08HLO145108-03和1R01HL160716-01资助。
用于开展这项研究的Aurora流式细胞仪由NIH资助S10OD026859资助。我们感谢JHU Ross流式细胞术核心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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