Summary
Здесь мы сообщаем протокол количественной оценки и дифференцировки В-лимфоцитов миокарда на основе их расположения во внутрисосудистом или эндотелиальном пространстве с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Растущее количество доказательств показывает, что В-лимфоциты играют важную роль в контексте физиологии миокарда и адаптации миокарда к травмам. Однако в литературе приводятся контрастные данные о распространенности В-клеток миокарда. Сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов или присутствуют, но с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки, или довольно редки. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокарда, но одна группа не сообщила об изменениях в количестве В-клеток поврежденного миокарда. Реализация общего, воспроизводимого метода оценки распространенности В-клеток миокарда имеет решающее значение для гармонизации наблюдений различных исследовательских групп и, таким образом, способствует продвижению изучения взаимодействий миокарда В-клеток. Основываясь на нашем опыте, кажущиеся контрастными наблюдения, о которых сообщается в литературе, вероятно, связаны с тем фактом, что мышиные В-клетки миокарда в основном внутрисосудистые и связаны с микрососудистым эндотелием. Поэтому количество В-клеток, извлеченных из мышиного сердца, чрезвычайно чувствительно к условиям перфузии, используемым для очистки органа, и к используемому методу пищеварения. Здесь мы сообщаем об оптимизированном протоколе, который учитывает эти две критические переменные определенным образом. Этот протокол обеспечивает воспроизводимый, основанный на проточной цитометрии анализ количества мышиных В-клеток миокарда и позволяет исследователям различать внесосудистые и внутрисосудистые В-клетки миокарда.
Introduction
В-лимфоциты являются узкоспециализированными иммунными клетками, которые играют важную роль как в адаптивных, так и во врожденных иммунных реакциях1. Существует две основные популяции В-клеток: меньшая популяция клеток В1, которые в основном вырабатываются во время эмбриональной жизни, и преобладающая популяция клеток В2, которые производятся во взрослой жизни в костном мозге1. После созревания в костном мозге В-клетки мигрируют в первичные и вторичные лимфоидные органы. Оттуда они непрерывно рециркулируют между лимфоидными органами, проходящими через кровеносные сосуды, и лимфатическими сосудами2. В-клетки экспрессируют специфические антитела на своей поверхности, которые функционируют как рецепторы. Когда В-клетки сталкиваются с антигеном, который связывается с их рецептором, может быть запущен активирующий сигнал. Активированные В-клетки либо мигрируют в ткань, где был обнаружен антиген, либо возвращаются в костный мозг, где они могут созревать в плазматические клетки, продуцирующие антитела 3,4.
В последнее время было признано, что сердце содержит значительную популяцию В-клеток. Исследования на грызунах показали, что В-клетки колонизируют сердце на ранних стадиях эмбрионального развития5, и что В-клетки, ассоциированные с миокардом, в основном являются внутрисосудистыми, наивными B2-клетками, прилипшими к эндотелию 6,7, с небольшим процентом клеток B17. Есть еще много областей неопределенности, но имеющиеся данные указывают на то, что В-клетки играют важную роль как в наивном сердце, так и в контексте адаптации миокарда к травме.
Исследования на наивного мышиного сердца показали, что на исходном уровне В-клетки миокарда в основном располагаются во внутрисосудистом пространстве, прилипают к эндотелию (>95% мышиных сердечных В-клеток оказались расположенными во внутрисосудистом пространстве). Было обнаружено, что эти В-клетки имеют паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов циркулирующих В-клеток, выделенных из периферической крови. Анализ наивных сердец у животных с дефицитом В-клеток и сингенного контроля показал, что животные, лишенные В-клеток, имели меньшие сердца и более высокую фракциювыброса 6. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клетки могут модулировать рост миокарда и / или функцию миокарда, и что не только интерстициальные, но и внутрисосудистые В-клетки могут быть ответственны за такие наблюдения. Было также обнаружено, что В-клетки модулируют фенотип резидентных макрофагов миокарда8.
Несколько исследований показали, что В-клетки играют важную роль в контексте адаптации миокарда к травме 8,9,10,11,12,13. В-клетки временно накапливаются в поврежденном сердце, вероятно, через CXCL13-CXCR5 зависимый механизм 11,13. Оттуда В-клетки способствуют неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов, которые включают цитокин-опосредованный моноцит, рекрутирующий 9,12. Кроме того, В-клетки могут вырабатывать антитела против сердечных белков, которые могут способствовать расширению сердечных повреждений и неблагоприятному ремоделированию сердца с помощью нескольких механизмов 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . В-клетки также могут оказывать защитное воздействие на поврежденное сердце через секрецию IL-1010.
По мере роста числа групп, изучающих роль В-клеток в наивном и поврежденном сердце, становится все более и более важным определить общие протоколы для правильной количественной оценки и оценки В-клеток миокарда и, таким образом, избежать несоответствий, которые уже начали появляться в литературе. До сих пор сообщалось, что В-клетки являются одними из наиболее распространенных иммунных клеток в сердце грызунов7 и присутствуют с заметно более низкой распространенностью, чем миелоидные клетки26,27 или довольно редко28. Аналогичным образом, несколько групп описали, что количество В-клеток миокарда увеличивается после острого ишемического повреждения миокардана 7,9,13, но одна группа сообщила об отсутствии изменений в количестве В-клеток поврежденного миокарда29. Исследования сердечных иммунных клеток редко дают подробную информацию об условиях перфузии, и нет единого мнения об условиях пищеварения. Поскольку в сердце грызунов большая часть В-клеток является внутрисосудистой, а извлечение иммунных клеток из миокарда сильно зависит от используемого метода пищеварения, различия, о которых сообщается в литературе, могут быть результатом различий в перфузии органов и переваривании тканей.
Здесь представлен подробный метод количественной оценки В-клеток мышиного миокарда на основе проточной цитометрии, который максимизирует выход восстановления В-клеток за счет оптимизации условий перфузии и пищеварения и позволяет различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда6. Этот протокол является адаптацией и оптимизацией других подобных протоколов, которые различают внутрисосудистые и интерстициальные иммунные клетки 28,30,31.
В этом протоколе мы стандартизируем перфузию миокарда для устранения В-клеток, плавающих во внутрисосудистом пространстве, без удаления биологически значимых В-клеток, прилипших к микрососудистому эндотелию. Более того, основываясь на предыдущих протоколах, которые описывали использование внутривенного введения антител для различения внутрисосудистых и интерстициальных иммунных клеток32, и используя тот факт, что В-клетки экспрессируют поверхностный маркер B22033, мы демонстрируем, как различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки миокарда посредством внутрисосудистой инъекции B220-специфического антитела непосредственно перед жертвоприношением животных и сердечной перфузией. Этот протокол актуален для исследований любого ученого, заинтересованного во включении анализа В-клеток миокарда в наивное и травмированное сердце. Широкое внедрение этого протокола уменьшит несоответствия между исследовательскими группами, позволит анализировать изменения во внутрисосудистых и внесосудистых пулах В-клеток миокарда и, таким образом, будет способствовать продвижению открытий в области иммунологии сердца.
Таким образом, протокол представляет собой оптимизированный рабочий процесс для количественной оценки и анализа В-клеток миокарда с помощью проточной цитометрии и в то же время различения клеток, расположенных во внесосудистом пространстве и внутрисосудистом пространстве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные в этой рукописи, были выполнены с одобрения IACUC в Медицинской школе Университета Джона Хопкинса.
1. Препараты
- Подготовьте буфер FACS, как описано в таблице 1.
- Убедитесь, что есть достаточно CO2 для усыпления животных.
- Подготовьте пространство для рассечения (поместите коврик для скамейки и поместите ленту и инструменты для рассечения рядом).
- Маркируйте пробирки объемом 15 мл, поместите 3 мл HBSS с кальцием и магнием в каждую трубку (см. Таблицу материалов) и поместите их на лед (одна трубка на сердце и дополнительная для контрольной группы / проточной цитометрии). Кроме того, наполните небольшие (35 мм) чашки Петри HBSS.
- Включите шейкер с контролируемой температурой, установите его на 37 °C и предварительно охладите центрифугу при температуре 4 °C.
- Подготовьте шприцевой насос и установите расход на 3 мл/мин. Заполните шприц объемом 20 мл HBSS, загрунтуйте линию трубки буфером и удалите пузырьки.
2. Внутрисосудистое окрашивание В-клеток (in vivo)
- Взвесьте 12-недельного самца мыши штамма C57BL/6J. Нагрузите инсулиновый шприц объемом 3/10 куб. см 100 мкл разведения антител B220 (1:10, в PBS). Накройте шприц алюминиевой фольгой для защиты от света.
- Обезболить одну мышь.
- Применяют внутрибрюшинную инъекцию 2% 2,2,2-трибромэтанола в дозе 400 мг/кг и ждут 10-20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием и движением мыши. Как только мышь перестанет двигаться, стимулируйте боль, защемляя палец ноги; отсутствие рефлекса отмены указывает на адекватную анестезию. - Если адекватная анестезия не достигается в течение 20 мин, можно вводить дополнительную дозу анестетика в 100 мг/кг, а также каждые 5 мин следует проводить оценку кинетики мыши, рефлекса отмены и дыхания.
- Применяют внутрибрюшинную инъекцию 2% 2,2,2-трибромэтанола в дозе 400 мг/кг и ждут 10-20 мин.
- Положите мышь на лабораторную скамью на подставку, наклоненную в одну сторону, осторожно потяните вниз кожу спины и слегка прижмите тело к скамье, чтобы глаз выступал.
- Вводят разбавленное антитело B220 со стадии 2.1 путем ретроорбитальной инъекции.
- Введите шприц в глаз под углом 45° от сагиттальной плоскости головы мыши. Медленно вводят раствор. Если сопротивление ощущается, снимите шприц и войдите снова. Подождите 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное время инкубации поставит под угрозу способность различать внутрисосудистые и внесосудистые В-клетки, поскольку это даст время введенному антителу диффундировать за пределы сосудистой системы.
- Введите шприц в глаз под углом 45° от сагиттальной плоскости головы мыши. Медленно вводят раствор. Если сопротивление ощущается, снимите шприц и войдите снова. Подождите 2 мин.
- Усыплите мышь в соответствии с правилами IACUC.
- Откройте поток CO2 в камеру эвтаназии со скоростью 0,5 л/мин или рекомендуемой скоростью потока в зависимости от размера вашей камеры.
- Поместите мышь в камеру на рекомендуемое время, убедившись, что она больше не дышит. Удалить его и выполнить вывих шейки матки как вторичный метод эвтаназии.
- Как только мышь будет усыплена, быстро приступайте к извлечению органов и перфузии.
3. Коллекция сердца
- Открытие грудной клетки.
- Держите кожу мыши щипцами в эпигастральной области. Сделайте 2-миллиметровое отверстие в коже с помощью ножниц и используйте щипцы, чтобы очистить кожу, чтобы раскрыть слой фасций, блестящий полупрозрачный слой, груди и живота. Разрезать эпигастрий через фасцию и брюшину, чтобы открыть брюшную стенку и выявить мечевидный отросток. Зажмите мечевидный отросток с помощью гемостатических щипцов.
- Ножницами сделайте вертикальный разрез через стенку грудной клетки на уровне средней ключичной линии с каждой стороны и поднимите переднюю стенку грудной клетки, чтобы выявить содержание средостения, используя гемостатические щипцы в качестве веса для поддержания отверстия.
- Перфузия и экстракция сердца.
- Используя щипцы, удалите любой жир или ткань тимуса, окружающую сердце.
- Надежно удерживайте аорту сзади с помощью щипцов. Вводят шприцевую иглу (25 г) в верхушку сердца. Перфюсировать с 3 мл HBSS со скоростью 3 мл/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за перфузией. Печень должна заполняться, а кровь в коронарных сосудах должна быть полностью удалена. Для поддержания устойчивого потока рекомендуется использовать шприцевой насос, откалиброванный до 1 мл/мин. - Вырежьте аорту ножницами и выньте сердце. Вымойте сердце в чашке Петри с HBSS, чтобы удалить оставшуюся кровь. С помощью ножниц и щипцов удалите жир, соединительную ткань и тимус, высушите сердце. Взвесьте изолированное сердце и отметьте вес в миллиграммах. Измельчите сердце при комнатной температуре на мелкие кусочки (1-2 мм) лезвием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердца взрослых мышей могут весить от 0,090 до 0,210 мг. - Измерьте массу сердечной ткани и поместите 60 мг измельченного сердца для переваривания в пробирку объемом 15 мл с 3 мл HBSS. Сохранить оставшуюся ткань сердца и поместить в трубку с надписью «Эталонная контрольная ткань»; это будет использоваться для управления компенсацией для живого мертвого сигнала и автофлуоресценции.
4. Сердечное пищеварение и окрашивание клеток
- Добавьте ферменты в каждую пробирку, содержащую измельченную ткань (см. таблицу 1). Добавьте в трубку 0,5 мкл/мг ДНКазы 1 (300 единиц на 60 мг сердечной ткани), 0,5 мкл/мг коллагеназы II (625 единиц на 60 мг сердечной ткани) и 0,2 мкл/мг гиалуронидазы (50 единиц на 60 мг сердечной ткани).
- Поместите реакцию пищеварения в шейкер на 30 мин при 300 об/мин. Отрегулируйте стойку шейкера примерно на 25° наклона.
- Добавьте 7 мл HBSS в каждую из реакционных трубок 15 мл и центрифугу при 250 x g в течение 5 мин при 4 °C с ускорением и разрывом, установленными на умеренный или медленный. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в 5 мл буфера лизиса ACK для удаления эритроцитов. Инкубировать в буфере лизиса ACK в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мл PBS в каждую трубку, перемешайте, а затем отфильтруйте в трубку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 40 мкм. Убедитесь, что весь мусор находится внутри фильтрующей камеры. Разбивайте любой мусор на фильтре шприцевым плунжером до тех пор, пока он полностью не будет полностью взвешен в камере фильтра.
- Добавляйте PBS через фильтр до тех пор, пока объем не достигнет 25 мл на сердце; это позволит взвешенным ячейкам проходить через фильтр. Добавьте дополнительные 25 мл PBS в контрольную тканевую трубку Reference и разделите объем на разные трубки (по 25 мл каждая). Пометьте одну из трубок «Неокрашенная», а другую как «Живой-мертвый». Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подготовьте разведение для живого мертвого пятна (разбавление: 1:500 в 1x PBS). - Декантируйте супернатант, повторно суспендируйте гранулу в неокрашенной трубке в 100 мкл PBS и каждую из других гранул в 100 мкл разведения живого мертвого пятна. Инкубировать на льду в течение 30 мин в темноте, покрывая ведро со льдом алюминиевой фольгой.
- Добавьте 500 мкл буфера FACS к каждому образцу и передайте его в маркированную трубку FACS через фильтр 40 мкм. Центрифугируйте трубки FACS при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл буфера FACS.
- Добавьте 50 мкл блокирующего раствора Fc (см. Таблицу 1) в каждую трубку, за исключением неокрашенных и живых мертвых трубок. Перемешать и инкубировать в течение 5 мин.
- Добавляют 50 мкл раствора смеси антител (см. Таблицу 1) в каждую пробирку, за исключением неокрашенных и живо-мертвых трубок, и инкубируют в течение 30 мин в темноте, покрывая ведро со льдом алюминиевой фольгой.
- Добавьте 2 мл буфера FACS в каждую трубку и центрифугу при 250 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалить супернатант и повторно суспендировать в 300-500 мкл буфера FACS.
5. Проточная цитометрия
- Настройка параметров управления прибором.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе образец анализируется с помощью 4 лазеров Cytek Aurora проточного цитометра. Другой подходящий проточный цитометр может быть использован для обнаружения маркеров, представляющих интерес.- Откройте программное обеспечение управления прибором (см. Таблицу материалов). В верхней части окна выберите вкладку Приобретение и нажмите на кнопку Новый +. Отобразится окно Создать новый эксперимент .
- В разделе Библиотека в поле Тип для фильтрации введите PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 и Zombie Aqua, нажав кнопку Добавить после ввода каждого из них. Названия флуорофоров должны быть видны справа. Затем нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Группа .
- На вкладке Группа щелкните символ с трубкой, чтобы добавить сердце для анализа.
- Нажмите на группу + Ссылка , и появится окно. В столбце флуоресцентных тегов выберите Zombie Aqua, а в столбце тип элемента управления выберите Ячейки, а затем нажмите кнопку Сохранить.
- Нажмите далее > вкладке Маркеры ; отобразится таблица с названиями флуорофоров. Введите соответствующий маркер ячейки в первой строке каждого столбца флуорофора и введите Enter: CD45 для PerCP-Cy5.5; CD19 для BV421; CD11b для Alexa Fluor 700; B220 для ПЭ; и живые мертвецы для Zombie Aqua.
- Дважды нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Приобретение . В поле События для записи экспериментальной группы введите 10 000 000, а в том же поле для строки ссылочной группы введите 200 000. Нажмите кнопку Сохранить и открыть. Остальные параметры должны оставаться по умолчанию: время остановки равно 10 000 и остановка громкости до 3 000.
- В левом нижнем углу нажмите на Управление приборами. Установите напряжение на FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Затем выберите Элемент управления получением. Для параметра Скорость потока выберите Высокий в раскрывающемся меню.
- Приобретайте эталонные образцы с помощью цитометра и разминируйте в программном обеспечении.
- Вихрь неокрашенной сердечной трубки и надежно поместите ее на порт для инъекций образца (SIP). Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец, затем нажмите кнопку Пуск на панели управления получением программного обеспечения цитометра и дождитесь записи событий. Сделайте то же самое для живой мертвой ткани сердца.
- Выберите меню Unmix и установите следующие элементы управления:
- Установите флажки PE, PerCP-Cy5.5, BV421 и Alexa Fluor 700 в столбце из библиотеки. Убедитесь, что Zombie Aqua не отмечен в том же столбце. В нижней части проверьте опцию Автофлуоресценция в качестве флуоресцентной метки.
- Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти на вкладку Определение положительных и отрицательных групп населения . На этой вкладке отобразится график FSC-A против SSC-B-A. Щелкните и перетащите точки многоугольника, чтобы выбрать область от 1,0 М до 4,0 М по оси FSC-A и от 0,2 М до 3,0 М по оси SSC-B-A.
- На следующем графике справа V5-A будет отображаться по оси X. Переместите ворота, чтобы выбрать половину пика справа как положительную, а область в левой части графика как отрицательную. На участке под названием Reference Group - Unstained выберите популяцию в аналогичном диапазоне. Для этого должно быть установлено незапятнанное отсутствие положительно-отрицательного.
- Приобретайте экспериментальные образцы.
- Для каждой трубки, содержащей образец для отдельной мыши, вихрьте трубку и надежно поместите ее на SIP. Убедитесь, что зеленая стрелка индикатора указывает на правильный образец, затем нажмите кнопку Пуск на панели управления приобретением программного обеспечения цитометра и дождитесь записи событий.
- Стратегия гейтинга.
- Выберите вкладку Несмешанный лист по умолчанию . Создайте график FSC-A и SSC-A с помощью инструмента «Точечная диаграмма» сверху. Выделите события выше 0,4 М на оси FSC-A и выше 0,8 М на оси SSC-A с помощью инструмента выделения «Полигон». Дважды щелкните в этом выделении, и отобразится новый график.
- На вновь созданном графике щелкните правой кнопкой мыши на метке оси X и выберите AF-A; Щелкните правой кнопкой мыши метку оси Y и выберите Живое мертвое пятно. Нажмите на инструмент выбора прямоугольника сверху и выберите все события ниже 105 на оси live-dead, которые соответствуют нижнему сигналу live-dead. Дважды щелкните в этом выделении, и отобразится новый график.
- На новом графике щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать PerCP-Cy5.5-A для оси X и SSC-A для оси Y. С помощью инструмента «Прямоугольное выделение» выделите события выше 104 на оси PerCP-Cy5.5-A, соответствующие положительным ячейкам CD45. Дважды щелкните по выделению, и отобразится новый график.
- На новом графике щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать FSC-A для оси X и FSC-H для оси Y. С помощью инструмента выделения «Полигон» выберите события, следующие за трендом, по которому значения FSC-A и SSC-A совпадают; при этом клеточные дублеты будут удалены, а популяция в отборе будет называться популяцией CD45+. Дважды щелкните по выделению, чтобы отобразить новый график с населением CD45+.
- На графике населения CD45+ щелкните правой кнопкой мыши, чтобы выбрать BV421 по оси X и SSC-A по оси Y. С помощью инструмента «Выделение полигонов» выделите популяцию справа по оси BV421 . Это популяция В-клеток. Дважды щелкните в этой популяции, чтобы создать два новых участка с популяцией В-клеток.
- Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы настроить первый график B-ячейки с PE-A по оси X и BV421-A по оси Y. Популяция справа соответствует внутрисосудистым В-клеткам, а популяция слева представляет собой интерстициальные В-клетки. Используйте инструмент выделения «Полигон» для выделения обоих элементов.
- Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы настроить второй график B-cell с Alexa Fluor 700-A на оси X и SSC-A на оси Y. Популяция слева соответствует CD11b-клеткам, а события справа (если таковые имеются) соответствуют клеткам CD11b+.
- Щелкните правой кнопкой мыши каждый выбор и выберите Свойства ворот. Нажмите Count и % Parent , чтобы отобразить размеры и проценты. Запишите количество событий и проценты для дальнейшего анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После завершения сбора и сбора всех событий данные должны быть проанализированы в соответствии со стандартной практикой проточной цитометрии. Фокус анализа будет варьироваться в зависимости от индивидуальной цели каждого эксперимента. В этом случае проводилась количественная оценка внутрисосудистых и внесосудистых В-клеток, и она выражалась как количество клеток на мг ткани.
При использовании спектрального цитометра рекомендуется начинать анализ с начальной решетки для удаления мусора с размерами, которые не находятся в диапазоне, соответствующем иммунным клеткам, с последующим удалением сигнала живого мертвого пятна+. Это позволяет обнаружить чистую популяцию CD45-положительных клеток, соответствующих лейкоцитам (рисунок 1). После удаления дублетов в наивном неповрежденном сердце ожидается, что около 20% клеток CD45+ будут CD19+ В-клетками (Рисунок 2A, 18,1% В-клеток в этом репрезентативном эксперименте). Из этих клеток в среднем 5,5% расположены в интерстициальном пространстве, в то время как 94,5% расположены во внутрисосудистом пространстве (рисунок 2В). Из всей популяции В-клеток, обнаруженных в сердце, только около 1,6% соответствует клеткам B1 на основе поверхностного маркера CD11b (который обычно считается достаточным для классификации мышиной клетки CD19+ как клетки B1 с высокой степенью достоверности 1,34,35), а остальные 98,4% соответствуют клеткам B2 (рисунок 2C).
Рисунок 1: Стратегия проточной цитометрии, используемая для обнаружения и характеристики В-клеток, связанных с миокардом. (A) FSC-A против SSC-A: График показывает все собранные события, а выбранная область рисуется для обогащения анализа событиями, которые находятся в диапазоне размеров лейкоцитов. (B) Автофлуоресценция в сравнении с окрашиванием в реальном времени: выбранная область соответствует более низкому сигналу живого мертвея. Нарисованные ворота удаляют мертвые клетки и некоторые другие клеточные обломки, которые связываются с живым мертвым окрашиванием. (C) Сигнал CD45 против SSC-A: выбранная область соответствует клеткам CD45+ (т.е. лейкоцитам миокарда). (D) FSC-A против FSC-H: Этот затвор используется для удаления дублетов ячеек (невыбранных событий). (E) Сигнал CD19 против SSC-A: выбранная область соответствует В-клеткам миокарда. (F) B220 против CD19: область внутри черного квадрата соответствует внутримиокардиальным В-клеткам (CD19+, B220-), а область внутри красного квадрата соответствует внутрисосудистой популяции В-клеток. (G) CD11b против SSC-A: область внутри черного круга соответствует CD11b+ (ячейки B1), а область внутри красного круга соответствует CD11b- (ячейки B2). Проценты, отображаемые на каждой панели, представляют собой средний процент, который отображаемая популяция представляет из родительской популяции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные графики, сообщающие о среднем количестве В-клеток на миллиграмм ткани миокарда. (А) Среднее количество cd45+ и CD19+ клеток/мг мышиной ткани миокарда. Отображаемый процент соответствует проценту клеток из родительской популяции (CD45+). (B) Среднее количество cd19+ клеток и процент В-клеток, которые находятся в интерстициальном (внесосудистом) пространстве внутрисосудистых пространств. (C) Абсолютное количество и процентное содержание В-клеток миокарда, экспрессирующих маркеры В1 или В2 клеток. Полосы погрешностей соответствуют стандартной погрешности среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Эта таблица содержит растворы и реагенты, необходимые для процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растущее количество доказательств указывает на то, что В-клетки играют важную роль в контексте физиологии миокарда и ремоделирования миокарда / адаптации к травме 7,8,9,10,11,12,13,36. Проточная цитометрия является отличным инструментом для изучения популяций иммунных клеток в любой ткани и почти обязательным инструментом для любого исследования, которое фокусируется на В-клетках в сердце.
Новая литература по В-клеткам и сердцу уже сообщает о контрастных результатах по очень основным аспектам, таким как количество В-клеток в сердце и изменения числа В-клеток миокарда с травмой. В-клетки были зарегистрированы как наиболее распространенные иммунные клетки в сердцах грызунов7. Тем не менее, другие исследования оценивали их относительную распространенность по сравнению с другими миелоидными клетками и показали заметно более низкие цифры26,27. Pinto et al.26 обнаружили, что В-клетки составляли около 9% от общего количества лейкоцитов, в то время как Yu et al.27 сообщили о 10%. Adamo et al.7 сообщили, что средний процент В-клеток по отношению к числу лейкоцитов составил около 20%, что очень близко к 18,1%, о которых сообщается в этой рукописи. Другие исследования показали, что В-клетки имеют очень низкую распространенность в миокарде28.
Несколько критических экспериментальных шагов могут объяснить изменчивость числа В-клеток, о которых сообщается в литературе. А именно, различия в перфузии сердца, измельчении тканей и пищеварении могут существенно повлиять на количество В-клеток, восстановленных на мг сердечной ткани. Перфузия с буферами, содержащими хелатирующие агенты кальция и не содержащие кальция, или перфузия с более высоким объемом или скоростью перфузии могут отделить В-клетки, прикрепленные к эндотелию, и снизить выход восстановления. Чрезмерно мелкодисперсный измельчитель тканей может привести к перевариванию ткани и потере жизнеспособности клеток. Снижение жизнеспособности клеток также может быть результатом переваривания в течение длительного времени или с более высокими концентрациями ферментов.
Процент клеток CD45+, соответствующих В-клеткам, может находиться в диапазоне от 15% до 30% у мыши дикого типа. В зависимости от используемого штамма мыши, возраста и генетического фона это значение может варьироваться. Однако процент должен оставаться аналогичным в исследуемой группе. Большая изменчивость количества и процента В-клеток между мышами, принадлежащими к одной группе, говорит о том, что может произойти экспериментальная ошибка. Низкие проценты могут указывать на избыток силы и времени перфузии. Глобальное сокращение клеток CD45+ может указывать на то, что ткань переваривается.
Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для обеспечения постоянного выхода В-клеток из переваренного мышиного сердца и для обеспечения дискриминации внутрисосудистых и внесосудистых В-клеток6. Дискриминация внутрисосудистых и внесосудистых В-клеток достигается путем внутрисосудистой инъекции антител непосредственно перед жертвоприношением. Введенное внутрисосудистое антитело легко диффундирует по всей сосудистой системе и сталкивается со всеми внутрисосудистыми В-клетками. Если животное приносится в жертву достаточно быстро и сердце своевременно заготавливается, антитело не успевает диффундировать во внесосудистом пространстве и окрашивать внесосудистые В-клетки. Поскольку время между внутрисосудистой инъекцией антитела и извлечением органов имеет решающее значение, рекомендуется инокулировать антителом и собирать по одному индивидуальному сердцу мыши за раз. Внутрисосудистая инъекция антител может быть опущена, если дискриминация внутрисосудистых и внесосудистых В-клеток не представляет интереса. Стратегия гаширования, показанная на рисунке 1 , останется прежней, за исключением последнего шага, который был бы невозможен из-за отсутствия маркировки B220. В зависимости от экспериментального дизайна, любой флуорофор с показанной панели может быть изменен на цвет, который соответствует используемой панели. Кроме того, важно учитывать, что выбор поверхностных маркеров может быть изменен в соответствии с потребностями группы, выполняющей его; например, если в экспериментальном проекте считается, что экспрессия CD11b на клетках B1 может быть снижена, рекомендуется добавление различных маркеров, таких как IgM, IgD и CD537.
Обратите внимание, что может потребоваться обработать сердце только для того, чтобы запустить контроль компенсации для проточной цитометрии. Это рекомендуется при первой оптимизации эксперимента. В следующих экспериментах сохранения некоторой ткани в момент сбора сердца может быть достаточно, так как это обеспечит достаточное количество клеток для проведения отрицательного «незапятнанного» контроля и положительного контроля «живо-мертвого» пятна. Отдельные элементы управления для других цветов могут быть либо импортированы из предыдущих экспериментов, либо сгенерированы с использованием бусин.
Некоторые этапы протокола могут быть изменены без изменения результатов эксперимента. Например, метод анестезии может быть изменен на предпочтительный в зависимости от опыта исследователя; использование изофлурана вместо 2,2,2-трибромэтанола может сократить время, затрачиваемое между введением анестезии и сердечным сбором. Кроме того, перфузия сердца может быть выполнена вручную без использования шприцевого насоса, если она выполняется медленно, мягко и последовательно.
Несмотря на точное выполнение протокола, неопытные операторы могут столкнуться с высокой изменчивостью между образцами в пределах одной экспериментальной сессии или между различными экспериментальными сессиями. Основываясь на опыте, эта изменчивость исчезает, как только ученый имеет возможность полностью ознакомиться с рабочим процессом. Поэтому всем, кто хочет внедрить этот протокол, рекомендуется оценить его воспроизводимость в двух-трех пробных запусках, прежде чем собирать важные данные о своих исследовательских проектах.
Таким образом, существующие методы выделения иммунных клеток из сердца и их анализа с помощью проточной цитометрии обычно не учитывают способность иммунных клеток прикрепляться к эндотелию и либо не стандартизируют перфузию, либо осуществляют обширную перфузию, предполагая, что любая иммунная клетка во внутрисосудистом пространстве является загрязнителем, который должен быть очищен. Это игнорирует представление о том, что внутрисосудистые иммунные клетки, прилипшие к эндотелию, имеют биологическое значение. Представленный здесь протокол был оптимизирован для максимального восстановления иммунных клеток миокарда с особым вниманием к В-клеткам миокарда, внутрисосудистым и внесосудистым. Мы ожидаем, что этот протокол будет интересен всем тем ученым, которые работают в области иммунологии сердца и заинтересованы в изучении функции, которую В-клетки могут играть в здоровых и поврежденных сердцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Луиджи Адамо является соучредителем i-Cordis, LLC, компании, ориентированной на разработку иммуномодулирующих молекул для лечения сердечной недостаточности, с особым интересом к производным В-клеточного модулирующего препарата пирфенидона. У остальных авторов нет конфликтов, которые можно было бы объявить.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантами NHLBI 5K08HLO145108-03 и 1R01HL160716-01, присужденными Луиджи Адамо.
Проточный цитометр Aurora, используемый для разработки этого исследования, финансировался грантом NIH S10OD026859. Мы признаем поддержку ядра проточной цитометрии JHU Ross.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al.
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al.
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
