Summary
Relatamos aqui um protocolo para a quantificação e diferenciação de linfócitos B miocárdicos com base em sua localização no espaço intravascular ou endotelial utilizando citometria de fluxo.
Abstract
Um crescente corpo de evidências mostra que os linfócitos B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e da adaptação miocárdica à lesão. No entanto, a literatura relata dados contrastantes sobre a prevalência de células B miocárdicas. Foi relatado que as células B estão entre as células imunes mais prevalentes no coração do roedor ou estão presentes, mas com uma prevalência marcadamente menor do que as células mielóides, ou como sendo bastante raras. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado. A implementação de um método compartilhado e reprodutível para avaliar a prevalência de células B miocárdicas é fundamental para harmonizar as observações de diferentes grupos de pesquisa e, assim, promover o avanço do estudo das interações miocárdicas de células B. Com base em nossa experiência, as observações aparentemente contrastantes relatadas na literatura provavelmente decorrem do fato de que as células B miocárdicas murinas são principalmente intravasculares e conectadas ao endotélio microvascular. Portanto, o número de células B recuperadas de um coração murino é extremamente sensível às condições de perfusão usadas para limpar o órgão e ao método de digestão usado. Aqui relatamos um protocolo otimizado que leva em conta essas duas variáveis críticas de uma maneira específica. Este protocolo capacita a análise reprodutível, baseada em citometria de fluxo, do número de células B miocárdicas murinas e permite que os pesquisadores distingam células B miocárdicas extravasculares versus intravasculares.
Introduction
Os linfócitos B são células imunes altamente especializadas que desempenham um papel importante nas respostas imunes adaptativas e inatas1. Existem duas populações principais de células B: uma população menor de células B1 que são produzidas principalmente durante a vida embrionária, e uma população preponderante de células B2 que são produzidas na vida adulta na medula óssea1. Após a maturação na medula óssea, as células B migram para os órgãos linfoides primários e secundários. A partir daí, recirculam continuamente entre os órgãos linfoides que viajam através dos vasos sanguíneos e dos vasos linfáticos2. As células B expressam anticorpos específicos em sua superfície, que funcionam como receptores. Quando as células B encontram um antígeno que se liga ao seu receptor, um sinal de ativação pode ser acionado. As células B ativadas migram para o tecido onde o antígeno foi encontrado ou retornam à medula óssea, onde podem amadurecer em plasmócitos produtores de anticorpos 3,4.
Recentemente, tem sido apreciado que o coração abriga uma população considerável de células B. Estudos em roedores mostraram que as células B colonizam o coração precocemente durante o desenvolvimento embrionário5, e que as células B associadas à miocárdia são principalmente intravasculares, células B2 ingênuas aderidas ao endotélio6,7, com uma pequena porcentagem de células B1 7. Ainda existem muitas áreas de incerteza, mas os dados disponíveis indicam que as células B desempenham um papel importante tanto no coração ingênuo quanto no contexto da adaptação miocárdica à lesão.
Estudos no coração murino ingênuo mostraram que, no início do estudo, as células B miocárdicas estão localizadas principalmente no espaço intravascular, aderidas ao endotélio (>95% das células B cardíacas murinas estavam localizadas no espaço intravascular). Verificou-se que essas células B têm padrões de expressão gênica diferentes daqueles das células B circulantes isoladas do sangue periférico. A análise de corações ingênuos de animais deficientes em células B e controles singênicos descobriu que os animais sem células B tinham corações menores e maior fração de ejeção6. Todas essas evidências sugerem que as células B podem modular o crescimento miocárdico e/ou a função miocárdica, e que não apenas as células B intersticiais, mas também intravasculares, podem ser responsáveis por tais observações. Observou-se também que as células B modulam o fenótipo dos macrófagos residentes no miocárdio8.
Diversos estudos têm demonstrado que as células B desempenham um papel importante no contexto da adaptação miocárdica à lesão 8,9,10,11,12,13. As células B se acumulam transitoriamente no coração lesado, provavelmente através de um mecanismo dependente da CXCL13-CXCR511,13. A partir daí, as células B promovem o remodelamento cardíaco adverso por meio de vários mecanismos que incluem o recrutamento de monócitos mediados por citocinas 9,12. Além disso, as células B podem produzir anticorpos contra proteínas cardíacas que podem promover a extensão do dano cardíaco e o remodelamento cardíaco adverso através de diversos mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . As células B também podem exercer efeitos protetores sobre o coração lesado através da secreção de IL-1010.
À medida que cresce o número de grupos que investigam o papel das células B no coração ingênuo e lesado, torna-se cada vez mais importante definir protocolos compartilhados para quantificar e avaliar adequadamente as células B miocárdicas e, assim, evitar inconsistências que já começaram a aparecer na literatura. Até agora, as células B têm sido relatadas como sendo uma das células imunes mais prevalentes no coração de roedores7 e estando presentes em uma prevalência marcadamente menor do que as células mieloides26,27, ou como sendo bastante raras28. Da mesma forma, vários grupos descreveram que o número de células B miocárdicas aumenta após lesão miocárdica isquêmica aguda 7,9,13, mas um grupo não relatou alterações no número de células B do miocárdio lesado29. Estudos sobre células imunes cardíacas raramente dão detalhes sobre as condições de perfusão e não há consenso sobre as condições de digestão. Como no coração de roedores uma grande proporção de células B é intravascular e a extração de células imunes do miocárdio é altamente dependente do método de digestão utilizado, as diferenças relatadas na literatura podem ser o resultado de diferenças na perfusão de órgãos e digestão tecidual.
Apresenta-se aqui um método detalhado para quantificação baseada em citometria de fluxo de células B miocárdicas murinas que maximiza o rendimento da recuperação de células B, otimizando as condições de perfusão e digestão e permite a discriminação de células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares6. Esse protocolo é uma adaptação e otimização de outros protocolos similares que distinguem entre células imunes intravasculares e intersticiais 28,30,31.
Neste protocolo, padronizamos a perfusão miocárdica para eliminar as células B que flutuam no espaço intravascular sem remover as células B biologicamente relevantes aderidas ao endotélio microvascular. Além disso, com base em protocolos anteriores que descreveram o uso de injeção intravenosa de anticorpos para distinguir células imunes intravasculares de intersticiais32, e aproveitando o fato de que as células B expressam o marcador de superfície B22033, demonstramos como distinguir células B miocárdicas intravasculares versus extravasculares através da injeção intravascular de um anticorpo específico B220 imediatamente antes do sacrifício animal e da perfusão cardíaca. Este protocolo é relevante para a pesquisa de qualquer cientista interessado em incluir a análise de células B miocárdicas no coração ingênuo e ferido. A implementação generalizada deste protocolo reduzirá as inconsistências entre os grupos de pesquisa, permitirá a análise de alterações nos pools intravascular e extravascular de células B miocárdicas e, assim, reforçará o avanço das descobertas no campo da imunologia cardíaca.
Em resumo, o protocolo representa um fluxo de trabalho otimizado para quantificar e analisar as células B miocárdicas via citometria de fluxo e, ao mesmo tempo, distinguir entre as células localizadas no espaço extravascular e no espaço intravascular.
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Protocol
Todos os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados com a aprovação da IACUC da Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Preparações
- Prepare o buffer FACS, conforme descrito na Tabela 1.
- Certifique-se de que há CO2 suficiente para eutanasiar os animais.
- Prepare o espaço de dissecação (coloque a almofada de bancada e coloque a fita adesiva e as ferramentas de dissecação nas proximidades).
- Rotule os tubos de 15 ml, coloque 3 ml de HBSS com cálcio e magnésio em cada tubo (ver Tabela de Materiais) e coloque-os no gelo (um tubo por coração e um extra para o grupo de referência/controlos de citometria de fluxo). Além disso, encha as pequenas placas de Petri (35 mm) com HBSS.
- Ligue o agitador com temperatura controlada, ajuste-o para 37 °C e pré-arrefeca a centrífuga a uma temperatura de 4 °C.
- Prepare a bomba da seringa e ajuste o caudal para 3 ml/min. Encha uma seringa de 20 ml com HBSS, prima a linha do tubo com tampão e remova quaisquer bolhas.
2. Coloração intravascular de células B (in vivo)
- Pese um rato macho de 12 semanas de idade da estirpe C57BL/6J. Carregue uma seringa de insulina de 3/10 cc com 100 μL da diluição do anticorpo B220 (1:10, em PBS). Cubra a seringa com papel alumínio para proteger da luz.
- Anestesiar um rato.
- Aplicar uma injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 2% com uma dose de 400 mg/kg e esperar 10-20 min.
NOTA: Monitore a respiração e o movimento do mouse. Uma vez que o rato pare de se mover, estimule a dor beliscando o dedo do pé; a ausência de um reflexo de abstinência indica anestesia adequada. - Se a anestesia adequada não for alcançada no curso de 20 min, uma dose adicional de anestésico a 100 mg/kg pode ser administrada, e uma avaliação da cinética do camundongo, reflexo de abstinência e respiração deve ser feita a cada 5 min.
- Aplicar uma injeção intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol a 2% com uma dose de 400 mg/kg e esperar 10-20 min.
- Coloque o mouse no banco de laboratório em uma almofada de banco inclinada para um lado, puxe suavemente a pele das costas para baixo e pressione levemente o corpo contra o banco para fazer o olho se projetar.
- Injete o anticorpo B220 diluído a partir da etapa 2.1 por injeção retroorbital.
- Introduza a seringa no olho a 45° do plano sagital da cabeça do rato. Injete lentamente a solução. Se a resistência for sentida, retire a seringa e entre novamente. Aguarde 2 min.
NOTA: O tempo de incubação prolongado comprometeria a capacidade de discriminar as células B intravasculares versus extravasculares, pois daria tempo para o anticorpo injetado se difundir fora da vasculatura.
- Introduza a seringa no olho a 45° do plano sagital da cabeça do rato. Injete lentamente a solução. Se a resistência for sentida, retire a seringa e entre novamente. Aguarde 2 min.
- Eutanasiar o rato de acordo com os regulamentos da IACUC.
- Abra o fluxo de CO2 para a câmara de eutanásia a uma taxa de 0,5 L/min, ou a taxa de fluxo recomendada com base no tamanho da sua câmara.
- Coloque o rato na câmara durante o tempo recomendado, garantindo que já não está a respirar. Removê-lo e realizar luxação cervical como um método secundário de eutanásia.
- Uma vez que o rato é sacrificado, proceda prontamente à extração de órgãos e perfusão.
3. Coleção de corações
- Abertura do peito.
- Segure a pele do rato com pinça na área epigástrica. Faça uma abertura de 2 mm na pele usando uma tesoura e use a pinça para descascar a pele para revelar a camada da fáscia, uma camada translúcida brilhante, do peito e do abdômen. Corte no epigástrio através da fáscia e peritônio para abrir a parede abdominal e revelar o processo xifoide. Aperte o processo xifoide usando pinça hemostática.
- Com a tesoura, faça um corte vertical através da parede torácica ao nível da linha médio-clavicular de cada lado e levante a parede torácica anterior para revelar o conteúdo do mediastino, usando pinça hemostática como peso para manter a abertura.
- Perfusão e extração cardíaca.
- Usando fórceps, remova qualquer gordura ou tecido tímico ao redor do coração.
- Segure a aorta com segurança por trás usando fórceps. Introduza a agulha da seringa (25 G) no ápice do coração. Perfundir com 3 mL de HBSS a uma taxa de 3 mL/min.
NOTA: Monitore a perfusão. O fígado deve encher, e o sangue nos vasos coronários deve ser totalmente removido. Recomenda-se o uso de uma bomba de seringa calibrada para 1 mL / minuto para manter um fluxo constante. - Corte a aorta usando uma tesoura e tire o coração. Lave o coração na placa de Petri com HBSS para remover qualquer sangue restante. Usando tesoura e fórceps, remova a gordura, o tecido conjuntivo e o timo, e seque o coração. Pese o coração isolado e observe o peso em miligramas. Pique o coração à temperatura ambiente em pequenos pedaços (1-2 mm) com uma lâmina.
NOTA: Corações de ratos adultos podem pesar entre 0,090-0,210 mg. - Meça a massa de tecido cardíaco e coloque 60 mg do coração picado para ser digerido em um tubo de 15 mL com 3 mL de HBSS. Reter o tecido cardíaco restante e colocar num tubo rotulado como "Tecido de controlo de referência"; isso será usado para controle de compensação para sinal de mortos-vivos e autofluorescência.
4. Digestão do coração e coloração celular
- Adicionar enzimas a cada tubo que contenha tecido picado (ver Tabela 1). Adicionar 0,5 μL/mg de DNase 1 (300 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco), 0,5 μL/mg de colagenase II (625 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco) e 0,2 μL/mg de hialuronidase (50 Unidades para 60 mg de tecido cardíaco) ao tubo.
- Coloque a reação de digestão no agitador por 30 min a 300 rpm. Ajuste o rack do agitador para cerca de 25° de inclinação.
- Adicionar 7 ml de HBSS a cada um dos tubos de reação de 15 ml e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C com aceleração e ruptura ajustadas para moderada ou lenta. Decantar o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 5 mL de tampão de lise ACK para remover os glóbulos vermelhos. Incubar no tampão de lise ACK durante 5 min à temperatura ambiente.
- Adicione 10 mL de PBS a cada tubo, misture e, em seguida, filtre em um tubo de 50 mL com um filtro de 40 μm. Certifique-se de que todos os detritos estão dentro da câmara de filtro. Esmague quaisquer detritos no filtro com um êmbolo de seringa até que esteja completamente suspenso dentro da câmara de filtro.
- Adicionar PBS através do filtro até que o volume atinja 25 mL por coração; isso permitirá que as células suspensas passem pelo filtro. Adicione mais 25 mL de PBS ao tubo de tecido de controle de referência e divida o volume em tubos diferentes (25 mL cada). Rotule um dos tubos como "Não manchado" e o outro como "Morto-vivo". Centrífuga a 250 x g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: Neste ponto, prepare a diluição para a mancha de mortos-vivos (diluição: 1:500 em 1x PBS). - Decantar o sobrenadante, ressuspender o pellet no tubo não corado em 100 μL de PBS e cada um dos outros pellets em 100 μL da diluição da mancha de mortos-vivos. Incube no gelo por 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.
- Adicionar 500 μL de tampão FACS a cada amostra e transferi-lo para um tubo FACS rotulado através de um filtro de 40 μm. Centrifugar os tubos FACS a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspeite o pellet em 500 μL de tampão FACS.
- Adicionar 50 μL de solução de bloqueio de Fc (ver quadro 1) a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e vivos. Misture e incube por 5 min.
- Adicionar 50 μL de solução de mistura de anticorpos (ver Tabela 1) a cada tubo, com excepção dos tubos não corados e mortos-vivos, e incubar durante 30 minutos no escuro, cobrindo o balde de gelo com papel alumínio.
- Adicionar 2 ml de tampão FACS a cada tubo e centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e ressuscite em 300-500 μL de buffer FACS.
5. Citometria de fluxo
- Configure as configurações de controle do instrumento.
NOTA: Neste protocolo a amostra é analisada com um citômetro de fluxo Cytek Aurora de 4 lasers. Outro citômetro de fluxo apropriado poderia ser usado para detectar os marcadores de interesse.- Abra o software de controle do instrumento (consulte Tabela de materiais). Na parte superior da janela, selecione a guia Aquisição e clique em Novo +. Uma janela chamada Criar Novo Experimento será exibida.
- Na seção Biblioteca, no campo Tipo a ser filtrado, digite PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, clicando em Adicionar depois de digitar cada um. Os nomes dos fluoróforos devem ser vistos à direita. Em seguida, clique em Avançar para prosseguir para a guia Grupo .
- Na guia Grupo , clique no símbolo com um tubo para adicionar o coração para a análise.
- Clique no grupo + Referência e uma janela será exibida. Na coluna de etiqueta fluorescente, selecione Zombie Aqua e, na coluna de tipo de controlo, selecione Células e, em seguida, clique em Guardar.
- Clique na guia Avançar > Marcadores ; uma tabela será exibida com os nomes dos fluoróforos. Digite o marcador celular correspondente na primeira linha de cada coluna de fluoróforo e digite Enter: CD45 para PerCP-Cy5.5; CD19 para BV421; CD11b para Alexa Fluor 700; B220 para PE; e mortos-vivos para Zombie Aqua.
- Clique em Avançar duas vezes para ir para a guia Aquisição . Em Eventos a Registrar do grupo experimento, digite 10.000.000 e no mesmo campo para o grupo de referência tipo de linha 200.000. Clique em Salvar e Abrir. As outras configurações devem permanecer como padrão, Tempo de parada para 10.000 e Parando o volume para 3.000.
- No canto inferior esquerdo, clique em Controle de instrumentos. Defina a tensão para FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Em seguida, selecione o Controle de aquisição. Para a opção Taxa de fluxo , selecione Alta no menu suspenso.
- Adquira amostras de referência com um citômetro e desmisture o software.
- Vórtice do tubo cardíaco não manchado e coloque-o firmemente na porta de injeção da amostra (SIP). Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta, clique em Iniciar no painel de Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados. Faça o mesmo para o tecido cardíaco manchado de mortos-vivos.
- Selecione o menu Unmix e defina os seguintes controles:
- Marque as caixas de seleção para PE, PerCP-Cy5.5, BV421 e Alexa Fluor 700 na coluna da biblioteca. Certifique-se de que Zombie Aqua está desmarcado na mesma coluna. Na parte inferior, marque a opção de Autofluorescência como uma Etiqueta Fluorescente.
- Clique em Avançar para prosseguir para a guia Identificar Populações Positivas/Negativas . Nesta guia, um gráfico de FSC-A vs. SSC-B-A será exibido. Clique e arraste os pontos do polígono para selecionar uma área entre 1,0 M e 4,0 M no eixo FSC-A e entre 0,2 M e 3,0 M no eixo SSC-B-A.
- No próximo gráfico à direita, V5-A será exibido no eixo X. Mova os portões para selecionar metade do pico na extrema direita como positivo e uma região no lado esquerdo do gráfico como negativo. No gráfico intitulado Grupo de Referência - Não Manchado, selecione uma população em um intervalo semelhante. Para isso, o não manchado não positivo-negativo tem que ser definido.
- Adquirir amostras experimentais.
- Para cada tubo que contenha uma amostra para um rato individual, vortex o tubo e coloque-o firmemente no SIP. Verifique se a seta do indicador verde está apontando para a amostra correta, clique em Iniciar no painel Controle de Aquisição do software do citômetro e aguarde até que os eventos sejam registrados.
- Estratégia de confinamento.
- Selecione a guia Planilha Não Mista Padrão . Crie um gráfico FSC-A vs. SSC-A usando a ferramenta Gráfico de pontos na parte superior. Selecione eventos maiores que 0,4 M no eixo FSC-A e maiores que 0,8 M no eixo SSC-A usando a ferramenta de seleção de polígonos. Clique duas vezes nesta seleção e um novo gráfico será exibido.
- No gráfico recém-criado, clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo X e selecione AF-A; clique com o botão direito do mouse no rótulo do eixo Y e selecione Mancha de morto-vivo. Clique na ferramenta de seleção de retângulo na parte superior e selecione todos os eventos abaixo de 105 no eixo de mortos-vivos que correspondem ao sinal de morto-vivo inferior. Clique duas vezes nesta seleção e um novo gráfico será exibido.
- No novo gráfico, clique com o botão direito do mouse para selecionar PerCP-Cy5.5-A para o eixo X e SSC-A para o eixo Y. Usando a ferramenta Seleção de retângulo, selecione os eventos superiores a 104 no eixo PerCP-Cy5.5-A que correspondem às células CD45 positivas. Clique duas vezes na seleção e um novo gráfico será exibido.
- No novo gráfico, clique com o botão direito do mouse para selecionar FSC-A para o eixo X e FSC-H para o eixo Y. Usando a ferramenta de seleção Polygon, selecione os eventos que seguem uma tendência na qual o valor FSC-A e o valor SSC-A são os mesmos; com isso, os duplicados de células serão removidos e a população na seleção será referida como a população CD45+. Clique duas vezes na seleção para exibir um novo gráfico com a população CD45+.
- No gráfico de população CD45+, clique com o botão direito do mouse para selecionar BV421 no eixo X vs. SSC-A no eixo Y. Usando a ferramenta de seleção de polígonos, selecione a população à direita no eixo BV421 . Esta é a população de células B. Clique duas vezes nesta população para criar dois novos gráficos com a população de células B.
- Clique com o botão direito do mouse para configurar o primeiro gráfico de células B com PE-A no eixo X e BV421-A no eixo Y. A população à direita corresponde às células B intravasculares, e a população à esquerda representa as células B intersticiais. Use a ferramenta de seleção de polígono para fazer uma seleção de ambos.
- Clique com o botão direito do mouse para configurar o segundo gráfico de células B com Alexa Fluor 700-A no eixo X e SSC-A no eixo Y. A população à esquerda corresponde às células CD11b-, e os eventos à direita (se houver) correspondem às células CD11b+.
- Clique com o botão direito do mouse em cada seleção e, em seguida, clique em Propriedades do Portão. Clique em Contar e % Pai para exibir os tamanhos e porcentagens. Registre o número de eventos e porcentagens para análise de dados adicional.
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Representative Results
Uma vez concluída a aquisição e coletados todos os eventos, os dados devem ser analisados de acordo com a prática padrão de citometria de fluxo. O foco da análise irá variar dependendo do objetivo individual de cada experimento. Neste caso, a quantificação de células B intravasculares e extravasculares foi buscada, e foi expressa como o número de células por mg de tecido.
Ao usar um citômetro espectral, recomenda-se iniciar a análise com um bloqueio inicial para remover detritos com tamanhos que não estão em uma faixa correspondente às células imunes, seguido pela remoção do sinal de mancha morta viva +. Isso permite a detecção de uma população limpa de células CD45 positivas correspondentes aos leucócitos (Figura 1). Após a remoção de dubletos, em um coração ingênuo e não lesionado, espera-se que cerca de 20% das células CD45+ sejam células B CD19+ (Figura 2A, 18,1% de células B neste experimento representativo). Dessas células, em média, 5,5% estão localizadas no espaço intersticial, enquanto 94,5% estão localizadas no espaço intravascular (Figura 2B). De toda a população de células B encontrada no coração, apenas cerca de 1,6% corresponde a células B1 com base no marcador de superfície CD11b (que normalmente é considerado suficiente para classificar uma célula CD19+ murina como uma célula B1 com alto grau de confiança 1,34,35), e os outros 98,4% correspondem a células B2 (Figura 2C).
Figura 1: Estratégia de bloqueio por citometria de fluxo utilizada para detectar e caracterizar células B associadas a miocárdios. (A) FSC-A vs. SSC-A: O gráfico mostra todos os eventos coletados, e a área selecionada é desenhada para enriquecer a análise com eventos que estão na faixa de tamanho dos leucócitos. (B) Autofluorescência vs. coloração de mortos-vivos: A área selecionada corresponde ao sinal de morto-vivo inferior. O portão desenhado remove células mortas e alguns outros detritos celulares que se ligam à coloração de mortos-vivos. (C) Sinal CD45 vs. SSC-A: A área selecionada corresponde às células CD45+ (isto é, leucócitos miocárdicos). (D) FSC-A vs. FSC-H: Esta porta é desenhada para remover duplicatas de células (eventos não selecionados). (E) Sinal CD19 vs. CSC-A: A área selecionada corresponde às células B miocárdicas. (F) B220 vs. CD19: A área dentro do quadrado preto corresponde às células B intramiocárdicas (CD19+, B220-), e a área dentro do quadrado vermelho corresponde à população intravascular de células B. (G) CD11b vs. SSC-A: A área dentro do círculo preto corresponde ao CD11b+ (células B1), e a área dentro do círculo vermelho corresponde ao CD11b- (células B2). As porcentagens exibidas em cada painel representam a porcentagem média que a população exibida representa da população parental. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Gráficos representativos relatando o número médio de células B por miligrama de tecido miocárdico . (A) Número médio de células CD45+ e CD19+/mg de tecido miocárdico murino. A porcentagem exibida corresponde à porcentagem de células da população parental (CD45+). (B) Número médio de células CD19+ e a porcentagem de células B que estão no espaço intersticial (extravascular) dos espaços intravasculares. (C) Número absoluto e porcentagem de células B miocárdicas que expressam marcadores de células B1 ou B2. As barras de erro correspondem ao erro padrão da média. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Esta tabela contém as soluções e os reagentes necessários para o procedimento. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Um crescente corpo de evidências indica que as células B desempenham um papel importante no contexto da fisiologia miocárdica e do remodelamento/adaptação miocárdica à lesão 7,8,9,10,11,12,13,36. A citometria de fluxo é uma excelente ferramenta para estudar populações de células imunes em qualquer tecido e quase uma ferramenta obrigatória para qualquer estudo que se concentre em células B no coração.
A literatura emergente sobre células B e coração já relata achados contrastantes em aspectos muito básicos, como o número de células B no coração e alterações no número de células B miocárdicas com lesão. As células B têm sido relatadas como a célula imune mais prevalente em corações de roedores7. No entanto, outros estudos avaliaram sua prevalência relativa em comparação com outras células mieloides e mostraram números marcadamente menores26,27. Pinto et al.26 encontraram que as células B constituíam cerca de 9% do total de leucócitos, enquanto Yu et al.27 relataram 10%. Adamo et al.7 relataram que a porcentagem média de células B em relação ao número de leucócitos foi de cerca de 20%, o que é muito próximo dos 18,1% relatados neste manuscrito. Outros estudos relataram que as células B têm uma prevalência muito baixa no miocárdio28.
Várias etapas experimentais críticas poderiam explicar as variabilidades no número de células B relatadas na literatura. Ou seja, diferenças na perfusão do coração, picagem de tecido e digestão podem afetar significativamente o número de células B recuperadas por mg de tecido cardíaco. A perfusão com tampões contendo agentes quelantes de cálcio e sem cálcio, ou perfusão com maior volume ou taxa de perfusão, poderia separar as células B ligadas ao endotélio e reduzir o rendimento de recuperação. Picar o tecido excessivamente fino pode levar à digestão excessiva do tecido e à perda de viabilidade celular. Uma redução na viabilidade celular também pode ser o resultado da digestão por um tempo prolongado ou com concentrações enzimáticas mais altas.
A porcentagem de células CD45+ que correspondem a células B pode estar em uma faixa entre 15% e 30% em um rato do tipo selvagem. Dependendo da linhagem de camundongo usada, da idade e do histórico genético, esse valor pode variar. No entanto, o percentual deve permanecer semelhante no grupo estudado. A grande variabilidade no número e porcentagem de células B entre camundongos pertencentes ao mesmo grupo sugere que um erro experimental pode estar ocorrendo. Baixas porcentagens podem indicar um excesso na força e no tempo de perfusão. A redução global nas células CD45+ pode indicar que o tecido está sendo digerido em excesso.
O protocolo aqui descrito foi otimizado para fornecer um rendimento consistente de células B do coração murino digerido e para permitir a discriminação de células B intravasculares versus extravasculares6. A discriminação das células B intravasculares versus extravasculares é alcançada através da injeção intravascular de um anticorpo imediatamente antes do sacrifício. O anticorpo injetado por via intravascular se difunde prontamente por toda a vasculatura e encontra todas as células B intravasculares. Se o animal for sacrificado em breve e o coração for prontamente colhido, o anticorpo não tem tempo para se difundir no espaço extravascular e manchar as células B extravasculares. Uma vez que o tempo entre a injeção intravascular do anticorpo e a colheita de órgãos é crítico, recomenda-se inocular com o anticorpo e coletar um coração de rato individual de cada vez. A injeção intravascular de anticorpos pode ser omitida se a discriminação de células B intravasculares versus extravasculares não for de interesse. A estratégia de bloqueio apresentada na Figura 1 permaneceria a mesma, exceto pela última etapa, o que não seria possível devido à falta de rotulagem B220. Dependendo do projeto experimental, qualquer fluoróforo do painel mostrado pode ser modificado para uma cor que se encaixe com o painel usado. Além disso, é importante considerar que a seleção dos marcadores de superfície poderia ser modificada de acordo com as necessidades do grupo que a realiza; por exemplo, se no delineamento experimental acredita-se que a expressão de CD11b em células B1 possa ser reduzida, recomenda-se a adição de diferentes marcadores, como IgM, IgD e CD537.
Por favor, note que pode ser necessário processar um coração apenas para executar controles de compensação para citometria de fluxo. Isso é recomendado na primeira vez que o experimento é otimizado. Nos experimentos a seguir, salvar algum tecido no momento da coleta do coração poderia ser suficiente, pois forneceria células suficientes para executar um controle negativo "não manchado" e um controle positivo de manchas "mortas vivas". Controles individuais para as outras cores podem ser importados de experimentos anteriores ou gerados usando contas.
Algumas etapas do protocolo podem ser modificadas sem alterar os resultados do experimento. Por exemplo, o método de anestesia pode ser alterado para um preferido, dependendo da experiência do pesquisador; o uso de isoflurano em vez de 2,2,2-tribromoetanol poderia reduzir o tempo gasto entre a administração da anestesia e a coleta cardíaca. Além disso, a perfusão do coração pode ser feita manualmente sem o uso de uma bomba de seringa, desde que seja realizada de forma lenta, suave e consistente.
Apesar da execução precisa do protocolo, operadores inexperientes poderiam encontrar alta variabilidade entre amostras dentro de uma mesma sessão experimental ou entre diferentes sessões experimentais. Com base na experiência, essa variabilidade desaparece quando o cientista teve a oportunidade de se familiarizar totalmente com o fluxo de trabalho. Portanto, recomenda-se que qualquer pessoa que queira implementar este protocolo avalie sua reprodutibilidade em dois a três ensaios antes de coletar dados cruciais sobre seus projetos de pesquisa.
Em resumo, os métodos existentes para isolar as células imunes do coração e analisá-las via citometria de fluxo normalmente não consideram a capacidade das células imunes de se ligarem ao endotélio e não padronizam a perfusão ou implementam perfusão extensiva, com a suposição de que qualquer célula imune no espaço intravascular é um contaminante que deve ser purgado. Isso ignora a noção de que as células imunes intravasculares aderidas ao endotélio têm relevância biológica. O protocolo aqui apresentado foi otimizado para maximizar a recuperação das células imunes miocárdicas com atenção específica às células B miocárdicas, intravasculares e extravasculares. Esperamos que este protocolo seja de interesse para todos os cientistas que trabalham no campo da imunologia cardíaca e estão interessados em explorar a função que as células B podem desempenhar em corações saudáveis e feridos.
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Disclosures
Luigi Adamo é co-fundador da i-Cordis, LLC, uma empresa focada no desenvolvimento de moléculas imunomoduladoras para o tratamento da insuficiência cardíaca, com um interesse específico em derivados da droga moduladora de células B pirfenidona. Os demais autores não têm conflitos a declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelas bolsas NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 concedidas a Luigi Adamo.
O citômetro de fluxo Aurora usado para desenvolver este estudo foi financiado pelo NIH Grant S10OD026859. Reconhecemos o apoio do JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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