Summary

Flowcytometribasert kvantifisering og analyse av myokardceller

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Her rapporterer vi en protokoll for kvantifisering og differensiering av myokardiale B-lymfocytter basert på deres plassering i det intravaskulære eller endotelialrommet ved hjelp av flowcytometri.

Abstract

En økende mengde bevis viser at B-lymfocytter spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardtilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten av myokard-B-celler. B-celler har blitt rapportert å være både blant de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet eller å være til stede, men med en markant lavere prevalens enn myeloide celler, eller å være ganske sjeldne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade, men én gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokard. Implementering av en felles, reproduserbar metode for å vurdere forekomsten av myokardiale B-celler er avgjørende for å harmonisere observasjoner fra ulike forskningsgrupper og dermed fremme utviklingen av studiet av B-celle myokardinteraksjoner. Basert på vår erfaring stammer de tilsynelatende kontrasterende observasjonene som er rapportert i litteraturen sannsynligvis fra det faktum at murine myokard-B-celler for det meste er intravaskulære og koblet til det mikrovaskulære endotelet. Derfor er antall B-celler gjenvunnet fra et murine hjerte utsøkt følsomt for perfusjonsbetingelsene som brukes til å rense orgelet og til fordøyelsesmetoden som brukes. Her rapporterer vi en optimalisert protokoll som tar hensyn til disse to kritiske variablene på en bestemt måte. Denne protokollen muliggjør reproduserbar, flowcytometribasert analyse av antall murine myokardiale B-celler og lar forskere skille ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardiale B-celler.

Introduction

B-lymfocytter er høyt spesialiserte immunceller som spiller en viktig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Det er to hovedpopulasjoner av B-celler: en mindre populasjon av B1-celler som hovedsakelig produseres under embryonalt liv, og en overveiende populasjon av B2-celler som produseres i voksenlivet i benmargen1. Etter modning i benmargen migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra resirkulerer de kontinuerlig mellom lymfoide organer som beveger seg gjennom blodkar og lymfekar2. B-celler uttrykker spesifikke antistoffer på overflaten, som fungerer som reseptorer. Når B-celler møter et antigen som binder seg til reseptoren, kan et aktiveringssignal utløses. Aktiverte B-celler migrerer enten til vevet der antigenet ble funnet eller går tilbake til benmargen hvor de kan modnes til antistoffproduserende plasmaceller 3,4.

Nylig har det blitt verdsatt at hjertet har en betydelig populasjon av B-celler. Studier på gnagere har vist at B-celler koloniserer hjertet tidlig under embryonal utvikling5, og at myokardassosierte B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler som holder seg til endotelet6,7, med en liten prosentandel av B1-celler7. Det er fortsatt mange usikkerhetsområder, men tilgjengelige data indikerer at B-celler spiller en viktig rolle både i det naive hjertet og i sammenheng med myokardtilpasning til skade.

Studier i det naive murine hjertet har vist at ved baseline myokardiale B-celler hovedsakelig er lokalisert i det intravaskulære rommet, festet til endotelet (>95% av murine hjerte B-celler ble funnet å være lokalisert i det intravaskulære rommet). Disse B-cellene ble funnet å ha genuttrykksmønstre som er forskjellige fra sirkulerende B-celler isolert fra perifert blod. Analyse av naive hjerter fra B-cellefattige dyr og syngeneiske kontroller fant at dyr som manglet B-celler hadde mindre hjerter og høyere ejeksjonsfraksjon6. Alt dette beviset tyder på at B-celler kan modulere myokardvekst og / eller myokardfunksjon, og at ikke bare interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for slike observasjoner. B-celler ble også funnet å modulere fenotypen av myokardiale bosatt makrofager8.

Flere studier har vist at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardtilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjertet, sannsynligvis gjennom en CXCL13-CXCR5-avhengig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer som inkluderer cytokinmediert monocytrekruttering 9,12. I tillegg kan B-celler produsere antistoffer mot hjerteproteiner som kan fremme forlengelse av hjerteskader og ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også utøve beskyttende effekter på det skadede hjertet gjennom utskillelsen av IL-1010.

Etter hvert som antall grupper som undersøker B-cellenes rolle i det naive og skadede hjertet vokser, blir det mer og mer viktig å definere delte protokoller for å kvantifisere og vurdere myokardiale B-celler på riktig måte og dermed unngå inkonsekvenser som allerede har begynt å vises i litteraturen. Så langt har B-celler faktisk både blitt rapportert å være en av de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet7 og å være til stede ved en markant lavere prevalens enn myeloide celler26,27, eller å være ganske sjeldne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade 7,9,13, men en gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokardiet29. Studier på hjerteimmunceller gir sjelden detaljer om perfusjonsforhold, og det er ingen konsensus om fordøyelsesforholdene. Siden en stor andel B-celler i gnagerhjertet er intravaskulære og ekstraksjon av immunceller fra myokardiet er svært avhengig av fordøyelsesmetoden som brukes, kan forskjellene rapportert i litteraturen være et resultat av forskjeller i organperfusjon og vevsfordøyelse.

Presentert her er en detaljert metode for flowcytometribasert kvantifisering av murine myokardiale B-celler som maksimerer utbyttet av B-celleutvinning ved å optimalisere perfusjons- og fordøyelsesforhold og tillater diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære myokard-B-celler6. Denne protokollen er en tilpasning og optimalisering av andre lignende protokoller som skiller mellom intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.

I denne protokollen standardiserer vi myokardperfusjon for å eliminere B-celler som flyter i det intravaskulære rommet uten å fjerne biologisk relevante B-celler festet til det mikrovaskulære endotelet. Videre, ved å bygge på tidligere protokoller som har beskrevet bruken av intravenøs injeksjon av antistoffer for å skille intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og dra nytte av det faktum at B-celler uttrykker overflatemarkøren B22033, demonstrerer vi hvordan man skiller intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler gjennom intravaskulær injeksjon av et B220-spesifikt antistoff umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusjon. Denne protokollen er relevant for forskningen til enhver forsker som er interessert i å inkludere analysen av myokardiale B-celler i det naive og skadede hjertet. Den utbredte implementeringen av denne protokollen vil redusere uoverensstemmelser mellom forskningsgrupper, vil tillate analyse av endringer i intravaskulære og ekstravaskulære myokardiale B-cellebassenger, og vil dermed styrke utviklingen av funn innen hjerteimmunologi.

Oppsummert representerer protokollen en optimalisert arbeidsflyt for å kvantifisere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri, og samtidig skille mellom celler lokalisert i det ekstravaskulære rommet og det intravaskulære rommet.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet i dette manuskriptet ble utført med godkjenning av IACUC ved Johns Hopkins University School of Medicine. 1. Forberedelser Klargjør FACS-bufferen, som beskrevet i tabell 1. Sørg for at det er nok CO2 til å avlive dyrene. Forbered disseksjonsplassen (plasser benkputen og plasser tape- og disseksjonsverktøyene i nærheten). Merk 15 ml rørene, sett 3 ml HBSS med kalsium og magne…

Representative Results

Når innsamlingen er fullført og alle hendelsene er samlet inn, skal dataene analyseres i henhold til standard flowcytometripraksis. Fokuset på analysen vil variere avhengig av det individuelle målet for hvert eksperiment. I dette tilfellet ble kvantifisering av intravaskulære og ekstravaskulære B-celler forfulgt, og det ble uttrykt som antall celler per mg vev. Når du bruker et spektralt cytometer, anbefales det å starte analysen med en innledende gating for å fjerne rusk med størrel…

Discussion

En økende mengde bevis indikerer at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardremodellering / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et utmerket verktøy for å studere immuncellepopulasjoner i ethver…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble finansiert av NHLBI-tilskudd 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.

Aurora Flow Cytometer som ble brukt til å utvikle denne studien ble finansiert av NIH Grant S10OD026859. Vi anerkjenner støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody 101222 BioLegend 100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue QBIAP303 Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1605-0000 SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP 114-055-101 Quality Biological 0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1615-5500 SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips 11213810 USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips 11267810 USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430052 Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT951 ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol T48402 Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips 11208810 USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT953 ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style 352054 Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430290 Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer 118-156-101 Quality Biological Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 22638289 Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 22638246 Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 UPC 109153 Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse RWD-AICMV-100 Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL 309626 BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD 2613 Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody 115537 BioLegend 50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile T9009 Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940  CD USPE AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL UX-34502-46 Cole-Parmer
Collagenase 2 LS004176 Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb Y992611-AG AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP M-08-12 AirGas USA
DNase I – 40,000 U D4527 Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller 4430000018 Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E 30100606 Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge 5810R Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes Eppendorf
FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) Z740287 Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] 14025076 gibco 1x
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight 13018-14 Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL 302831 BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 M1-940-PG AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate 4033-CS150 McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance NV2201 Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] 10010023 gibco 1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody 103208 BioLegend 200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody 103132 BioLegend 100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene FB0875711YZ Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 M08-1 AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator LED-6W AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) 305122 BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) 553141 BD Becton, Dickinson and Company Biosciences 0.5 mg/mL
R 4.1.1 The R Foundation
Razor Blades 9501250000 Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet Y12244A320-AG AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets Rotor A-4-62 Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister 86.1254.001 Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape L8394 Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0 Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA MTLL230-6005 Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long CG-730-003 Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL Z683566 Millipore Sigma
Syringe pump 55-1199 (95-240) Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 9371W13 Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119835 Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119827 Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. T8913 (Millipore Sigma) Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 SI-0236 Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips 89259-946 Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" 82027-578 Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I 12620-946 Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit 423102 BioLegend

References

  1. Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
  2. Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
  3. Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
  4. Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
  5. Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
  6. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
  7. Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
  8. Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
  9. Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
  10. Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
  11. Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
  12. Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
  13. Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
  14. Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
  15. Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
  16. Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
  17. Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
  18. Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
  19. Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
  20. Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
  21. Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
  22. Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
  23. Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier–an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy–impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
  24. Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
  25. Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
  26. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  27. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
  28. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  29. Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
  30. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  31. Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
  32. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
  33. Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
  34. Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
  35. Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
  36. Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
  37. Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).

Play Video

Cite This Article
Bermea, K. C., Rousseau, S. T., Adamo, L. Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells. J. Vis. Exp. (186), e64344, doi:10.3791/64344 (2022).

View Video