Her rapporterer vi en protokoll for kvantifisering og differensiering av myokardiale B-lymfocytter basert på deres plassering i det intravaskulære eller endotelialrommet ved hjelp av flowcytometri.
En økende mengde bevis viser at B-lymfocytter spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardtilpasning til skade. Litteraturen rapporterer imidlertid kontrasterende data om forekomsten av myokard-B-celler. B-celler har blitt rapportert å være både blant de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet eller å være til stede, men med en markant lavere prevalens enn myeloide celler, eller å være ganske sjeldne. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade, men én gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokard. Implementering av en felles, reproduserbar metode for å vurdere forekomsten av myokardiale B-celler er avgjørende for å harmonisere observasjoner fra ulike forskningsgrupper og dermed fremme utviklingen av studiet av B-celle myokardinteraksjoner. Basert på vår erfaring stammer de tilsynelatende kontrasterende observasjonene som er rapportert i litteraturen sannsynligvis fra det faktum at murine myokard-B-celler for det meste er intravaskulære og koblet til det mikrovaskulære endotelet. Derfor er antall B-celler gjenvunnet fra et murine hjerte utsøkt følsomt for perfusjonsbetingelsene som brukes til å rense orgelet og til fordøyelsesmetoden som brukes. Her rapporterer vi en optimalisert protokoll som tar hensyn til disse to kritiske variablene på en bestemt måte. Denne protokollen muliggjør reproduserbar, flowcytometribasert analyse av antall murine myokardiale B-celler og lar forskere skille ekstravaskulære vs. intravaskulære myokardiale B-celler.
B-lymfocytter er høyt spesialiserte immunceller som spiller en viktig rolle i både adaptive og medfødte immunresponser1. Det er to hovedpopulasjoner av B-celler: en mindre populasjon av B1-celler som hovedsakelig produseres under embryonalt liv, og en overveiende populasjon av B2-celler som produseres i voksenlivet i benmargen1. Etter modning i benmargen migrerer B-celler til primære og sekundære lymfoide organer. Derfra resirkulerer de kontinuerlig mellom lymfoide organer som beveger seg gjennom blodkar og lymfekar2. B-celler uttrykker spesifikke antistoffer på overflaten, som fungerer som reseptorer. Når B-celler møter et antigen som binder seg til reseptoren, kan et aktiveringssignal utløses. Aktiverte B-celler migrerer enten til vevet der antigenet ble funnet eller går tilbake til benmargen hvor de kan modnes til antistoffproduserende plasmaceller 3,4.
Nylig har det blitt verdsatt at hjertet har en betydelig populasjon av B-celler. Studier på gnagere har vist at B-celler koloniserer hjertet tidlig under embryonal utvikling5, og at myokardassosierte B-celler for det meste er intravaskulære, naive B2-celler som holder seg til endotelet6,7, med en liten prosentandel av B1-celler7. Det er fortsatt mange usikkerhetsområder, men tilgjengelige data indikerer at B-celler spiller en viktig rolle både i det naive hjertet og i sammenheng med myokardtilpasning til skade.
Studier i det naive murine hjertet har vist at ved baseline myokardiale B-celler hovedsakelig er lokalisert i det intravaskulære rommet, festet til endotelet (>95% av murine hjerte B-celler ble funnet å være lokalisert i det intravaskulære rommet). Disse B-cellene ble funnet å ha genuttrykksmønstre som er forskjellige fra sirkulerende B-celler isolert fra perifert blod. Analyse av naive hjerter fra B-cellefattige dyr og syngeneiske kontroller fant at dyr som manglet B-celler hadde mindre hjerter og høyere ejeksjonsfraksjon6. Alt dette beviset tyder på at B-celler kan modulere myokardvekst og / eller myokardfunksjon, og at ikke bare interstitielle, men også intravaskulære B-celler kan være ansvarlige for slike observasjoner. B-celler ble også funnet å modulere fenotypen av myokardiale bosatt makrofager8.
Flere studier har vist at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardtilpasning til skade 8,9,10,11,12,13. B-celler akkumuleres forbigående i det skadede hjertet, sannsynligvis gjennom en CXCL13-CXCR5-avhengig mekanisme11,13. Derfra fremmer B-celler ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer som inkluderer cytokinmediert monocytrekruttering 9,12. I tillegg kan B-celler produsere antistoffer mot hjerteproteiner som kan fremme forlengelse av hjerteskader og ugunstig hjerteombygging gjennom flere mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan også utøve beskyttende effekter på det skadede hjertet gjennom utskillelsen av IL-1010.
Etter hvert som antall grupper som undersøker B-cellenes rolle i det naive og skadede hjertet vokser, blir det mer og mer viktig å definere delte protokoller for å kvantifisere og vurdere myokardiale B-celler på riktig måte og dermed unngå inkonsekvenser som allerede har begynt å vises i litteraturen. Så langt har B-celler faktisk både blitt rapportert å være en av de mest utbredte immuncellene i gnagerhjertet7 og å være til stede ved en markant lavere prevalens enn myeloide celler26,27, eller å være ganske sjeldne 28. Tilsvarende har flere grupper beskrevet at antall myokard-B-celler øker etter akutt iskemisk myokardskade 7,9,13, men en gruppe rapporterte ingen endringer i antall B-celler i det skadde myokardiet29. Studier på hjerteimmunceller gir sjelden detaljer om perfusjonsforhold, og det er ingen konsensus om fordøyelsesforholdene. Siden en stor andel B-celler i gnagerhjertet er intravaskulære og ekstraksjon av immunceller fra myokardiet er svært avhengig av fordøyelsesmetoden som brukes, kan forskjellene rapportert i litteraturen være et resultat av forskjeller i organperfusjon og vevsfordøyelse.
Presentert her er en detaljert metode for flowcytometribasert kvantifisering av murine myokardiale B-celler som maksimerer utbyttet av B-celleutvinning ved å optimalisere perfusjons- og fordøyelsesforhold og tillater diskriminering av intravaskulære vs. ekstravaskulære myokard-B-celler6. Denne protokollen er en tilpasning og optimalisering av andre lignende protokoller som skiller mellom intravaskulære og interstitielle immunceller 28,30,31.
I denne protokollen standardiserer vi myokardperfusjon for å eliminere B-celler som flyter i det intravaskulære rommet uten å fjerne biologisk relevante B-celler festet til det mikrovaskulære endotelet. Videre, ved å bygge på tidligere protokoller som har beskrevet bruken av intravenøs injeksjon av antistoffer for å skille intravaskulære fra interstitielle immunceller32, og dra nytte av det faktum at B-celler uttrykker overflatemarkøren B22033, demonstrerer vi hvordan man skiller intravaskulære vs. ekstravaskulære myokardiale B-celler gjennom intravaskulær injeksjon av et B220-spesifikt antistoff umiddelbart før dyreofring og hjerteperfusjon. Denne protokollen er relevant for forskningen til enhver forsker som er interessert i å inkludere analysen av myokardiale B-celler i det naive og skadede hjertet. Den utbredte implementeringen av denne protokollen vil redusere uoverensstemmelser mellom forskningsgrupper, vil tillate analyse av endringer i intravaskulære og ekstravaskulære myokardiale B-cellebassenger, og vil dermed styrke utviklingen av funn innen hjerteimmunologi.
Oppsummert representerer protokollen en optimalisert arbeidsflyt for å kvantifisere og analysere myokardiale B-celler via flowcytometri, og samtidig skille mellom celler lokalisert i det ekstravaskulære rommet og det intravaskulære rommet.
En økende mengde bevis indikerer at B-celler spiller en viktig rolle i sammenheng med myokardfysiologi og myokardremodellering / tilpasning til skade 7,8,9,10,11,12,13,36. Flowcytometri er et utmerket verktøy for å studere immuncellepopulasjoner i ethver…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble finansiert av NHLBI-tilskudd 5K08HLO145108-03 og 1R01HL160716-01 tildelt Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som ble brukt til å utvikle denne studien ble finansiert av NIH Grant S10OD026859. Vi anerkjenner støtten fra JHU Ross Flow Cytometry Core.
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |