Summary
Her beskriver vi en ny flowcytometrisk metode til prospektiv isolering af tidlige burstdannende enhedserythroid (BFU-e) og kolonidannende enhedserythroide (CFU-e) forfædre direkte fra frisk museknoglemarv og milt. Denne protokol, udviklet baseret på enkeltcelle transkriptomiske data, er den første til at isolere alle vævets erythroidforfædre med høj renhed.
Abstract
Tidlige erythroid-forfædre blev oprindeligt defineret af deres kolonidannende potentiale in vitro og klassificeret i burstdannende og kolonidannende "enheder" kendt som BFU-e og CFU-e. Indtil for nylig var metoder til direkte prospektiv og fuldstændig isolering af rene BFU-e- og CFU-e-forfædre fra frisk isoleret knoglemarv fra voksne mus ikke tilgængelige. For at løse dette hul blev et enkeltcelle RNA-seq (scRNAseq) datasæt af museknoglemarv analyseret for ekspression af gener, der koder for celleoverflademarkører. Denne analyse blev kombineret med celleskæbneassays, hvilket muliggjorde udviklingen af en ny flowcytometrisk tilgang, der identificerer og tillader isolering af komplette og rene undergrupper af BFU-e- og CFU-e-forfædre i museknoglemarv eller milt. Denne tilgang identificerer også andre stamceller, herunder delmængder beriget til basophil/mastcelle og megakaryocytiske potentialer. Metoden består i mærkning af frisk knoglemarv eller miltceller med antistoffer rettet mod Kit og CD55. Forfædre, der udtrykker begge disse markører, opdeles derefter i fem hovedpopulationer. Population 1 (P1 eller CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/lav CD105 med/høj CD71 med/høj) indeholder alle CFU-e-forfædrene og kan yderligere opdeles i P1-lav (CD71med CD150 høj) og P1-hi (CD71 høj CD150lav), svarende til henholdsvis tidlig og sen CFU-e; Population 2 (P2 eller BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/lav CD105 med/høj CD71lav CD150høj) indeholder alle BFU-e forfædrene; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/høj CD105 med/lav CD150 lav CD41 lav) er beriget for basophil/mastcelle forfædre; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/høj CD105med/lav CD150høj CD41+) er beriget for megakaryocytiske forfædre; og population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/høj CD105 med/lav CD150høj CD41-) indeholder forfædremed erythroid, basophil/mastcelle og megakaryocytisk potentiale (EBMP) og erythroid/megakaryocytisk/basophil-biased multipotentielle stamfædre (MPP'er). Denne nye tilgang tillader større præcision ved analyse af erythroid og andre hæmatopoietiske forfædre og giver også mulighed for henvisning til transkriptominformation for hver flowcytometrisk defineret population.
Introduction
Erythropoiesis kan opdeles i to hovedfaser: tidlig erythropoiesis og erythroid terminal differentiering (figur 1)1,2,3. I tidlig erythropoiesis forpligter hæmatopoietiske stamceller sig til erythroid-slægten og giver anledning til tidlige erythroid-forfædre, som først blev identificeret i 1970'erne baseret på deres kolonidannende potentiale i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . Generelt er erythroid-forfædre opdelt i to kategorier: tidligere forfædre, der hver giver anledning til en "burst" (et stort aggregat af mindre erythroidcelleklynger), kaldet "burst-forming unit erythroid" eller BFU-e 4,5,6; og deres afkom, som hver danner en enkelt, lille erythroidcelleklynge eller koloni, kaldet "kolonidannende enhed erythroid" eller CFU-e 7,8,9. BFU-e og CFU-e udtrykker endnu ikke terminale erythroidgener og er ikke morfologisk genkendelige. Efter en række selvfornyelses- eller ekspansionscelledelinger gennemgår CFU-e en transkriptionskontakt, hvor erythroidgener såsom globiner induceres og derved overgår til erythroid terminal differentiering (ETD)1,10. Under ETD gennemgår erythroblaster tre til fem modningscelledelinger, før de enukleerer til dannelse af reticulocytter, som modnes til røde blodlegemer.
Erythroblaster under terminal differentiering blev oprindeligt klassificeret baseret på deres morfologi i proerythroblaster, basofile, polykromatiske og ortokromatiske. Fremkomsten af flowcytometri tillod deres prospektive sortering og isolering baseret på cellestørrelse (målt ved fremadspredning, FSC) og to celleoverflademarkører, CD71 og Ter11911,12,13 (figur 1). Denne og lignende flowcytometriske tilgange 14 har revolutioneret undersøgelsen af de molekylære og cellulære aspekter af ETD, hvilket muliggør udviklingsfasespecifik analyse af erythroblaster in vivo og in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-tilgangen anvendes nu rutinemæssigt i analysen af erythroidprækursorer.
Indtil for nylig har en lignende, tilgængelig flowcytometrisk tilgang til direkte prospektiv isolering af CFU-e og BFU-e med høj renhed fra musevæv undgået efterforskere. I stedet har efterforskere brugt flowcytometriske strategier, der kun isolerer en brøkdel af disse forfædre, ofte i nærvær af ikke-erythroidceller, der co-renser inden for de samme flowcytometriske undergrupper21. Derfor var undersøgelsen af BFU-e og CFU-e begrænset til in vitro-differentieringssystemer, der udleder og forstærker BFU-e og CFU-e fra tidligere knoglemarvsprogenitorer. Det er derefter muligt at anvende flowcytometriske strategier, der adskiller CFU-e fra BFU-e i disse erythroide stamfaderberigede kulturer22,23. En alternativ tilgang gør brug af føtal CFU-e og BFU-e, som er højt beriget i den Ter119-negative fraktion af museføtal lever midt i drægtigheden 10,24,25. Ingen af disse fremgangsmåder tillader imidlertid undersøgelse af voksne BFU-e og CFU-e i deres fysiologiske tilstand in vivo. Udfordringens størrelse kan forstås, når man husker, at disse celler baseret på kolonidannelsesanalyser er til stede i den voksne knoglemarv med en frekvens på kun 0,025% og 0,3% henholdsvis6.
Protokollen beskrevet her er en ny flowcytometrisk tilgang baseret på enkeltcelletranskriptomisk analyse af nyhøstede Kit+ museknoglemarvsceller (Kit udtrykkes af alle de tidlige stamfaderpopulationer i knoglemarven)1. Vores tilgang indeholder nogle celleoverflademarkører, der allerede var i brug af Pronk et al.21,26. Enkeltcelletranskriptomer blev brugt til at bestemme kombinationer af celleoverflademarkører, der identificerer erythroid og andre tidlige hæmatopoietiske forfædre (figur 2). Specifikt kan CD55+ fraktionen af afstamningsnegative (Lin-) Kit+ celler opdeles i fem populationer, hvoraf tre giver sammenhængende segmenter af erythroidbanen (figur 2). De transkriptomiske identiteter af hver af disse populationer blev bekræftet ved sortering efterfulgt af scRNAseq og projektion af de sorterede enkeltcelletranskriptomer tilbage på det oprindelige transkriptomiske kort (genekspressionen i hver af de fem populationer og hele knoglemarvsdatasættet kan udforskes i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . Celleskæbnepotentialet for hver af populationerne blev bekræftet ved hjælp af traditionelle kolonidannelsesassays (figur 2) samt et nyt enkeltcelleskæbneassay med høj kapacitet 1,27. Disse analyser viser, at den nye flowcytometriske tilgang resulterer i isolering med høj renhed af alle BFU-e- og CFU-e-forfædre til frisk voksen knoglemarv og milt. Specifikt indeholder population 1 (P1) kun CFU-e og ingen andre hæmatopoietiske forfædre, og population 2 (P2) indeholder alle knoglemarvens BFU-e-forfædre og et lille antal CFU-e, men ingen andre forfædre1. Den detaljerede protokol nedenfor illustreres yderligere med et eksempelforsøg på mus, der blev injiceret med enten saltvand eller med det erythropoiesestimulerende hormon erythropoietin (Epo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med dyreprotokoller A-1586 og 202200017 godkendt af University of Massachusetts Chan Medical School Institutional Animal Care and Use Committee.
BEMÆRK: To protokoller er beskrevet her: først flowcytometrisk analyse (afsnit 1) efterfulgt af protokoljusteringer for flowcytometrisk sortering (afsnit 2). Protokollen nedenfor bruger et flowcytometer/sorteringsanlæg med 10 kanaler. Et eksempel på opsætning findes i tabel 1, der henvises til i trin 1.14.5. Det er også muligt at køre denne protokol med kun ni kanaler; se forklaringen i tabel 2.
1. Flow cytometrisk analyse
- Aflive voksne (>6 uger gamle) Balb/C- eller C57BL6-mus ved hjælp af en passende metode, der er godkendt af din Institutional Animal Care and Use Committee (f.eks. CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation). Til flowcytometrisk analyse vil knoglemarv (BM) fra en enkelt mus være tilstrækkelig. Ved sortering afhænger antallet af mus af downstream-applikationerne. Celleudbyttet for hver population er angivet nedenfor (trin 2.3.3).
- Høst af væv:
- Forbered 5 ml fluorescensaktiverede cellesorteringsrør (FACS) indeholdende 3 ml kold (4 °C) farvningsbuffer ("SB5": fosfatbufret saltvand (PBS), 0,2% bovint serumalbumin (BSA), 0,08% glucose, 5 mM EDTA) på is. Brug dette til at placere høstet væv.
- Forbered separate rør til hvert væv, der dissekeres fra hver mus. Saml ikke væv fra flere mus.
- Høst begge lårben og begge tibias. Fjern alle musklerne fra knoglerne, før du placerer dem i røret med SB5.
- Disseker milten gennem et snit på venstre side af maven.
- Ekstraktion af knoglemarvsceller:
- Placer de nydissekerede lårben og skinneben direkte i koldfarvningsbuffer (SB5) og hold rørene på is, indtil de er klar til at ekstrahere knoglemarven (BM). Placer en ren steriliseret mørtel på is i en spand. Overfør knoglerne til mørtel sammen med SB5 fra røret.
- Klip ca. 1 mm af enderne af hver knogle af med en dissektionssaks, så knoglens åbning bliver lige synlig.
- Brug en 26 G kanyle og en 3 ml sprøjte fyldt med SB5 til at skylle marven ud af knoglerne og samle den i mørtlen. Gentag processen 3-5 gange ved hjælp af frisk buffer hver gang, indtil knoglerne ser farveløse ud.
- Filtrer den skyllede marv gennem et 100 μm maskefilter og saml cellerne i et 50 ml centrifugerør placeret på is.
- Brug mørtel og støderi til at knuse de skyllede knogler i 5-10 ml SB5. Blandingen af knuste knogler filtreres og bufferen gennem 100 μm cellesien og pooles med celler opsamlet i trin 1.3.4.
- Miltcelleekstraktion:
- Opsæt et 100 μm netfilter på et tomt 50 ml centrifugerør placeret på is. Placer en enkelt milt på maskefilteret.
- Tilsæt 0,5-1 ml SB5 til milten for at sikre, at den ikke tørrer.
- Brug gummisiden af et 3 ml eller 5 ml sprøjtestempel til at mose milten gennem masken. Tilsæt mere SB5, 5 ml ad gangen, og fortsæt med at mose, indtil alle cellerne er opsamlet i røret.
- Fra dette tidspunkt behandles knoglemarven og miltcellerne på samme måde.
- Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 min. Opsug supernatanten ved hjælp af en vakuumaspirationsopsætning.
- For at lave en enkeltcellesuspension skal du resuspendere cellerne i 2 ml SB5 og pipet op og ned 50 gange ved hjælp af en P1000 med en stor åbningsspids (se materialetabel). Disse har brede spidsåbninger for at forhindre skade på skrøbelige celler.
- For at tælle cellerne skal du resuspendere ved at pipettere op og ned 20 gange. Fortynd cellerne i forholdet 1:100 i SB5. Bland 10 μL af de fortyndede celler med 10 μL trypanblåt og tæl på et hæmocytometer og/eller celletæller.
- Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 min. Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes ved 33 x 106 levende celler/ml i SB5.
- Forbered Lin-FITC-cocktailen ved at blande lige store mængder af hvert antistof i tabel 3.
- Forbered cellerne til enkeltfarvekontroller og FMO-kontrolelementer (Fluorescence minus one). Der udføres trin 1.11-1.12 parallelt med forberedelsen og farvningen af prøvecellerne i trin 1.14 (prøver til cytometrisk flowanalyse) og/eller trin 2.1 (flowcytometrisk sortering).
- Forbered cellerne til en ufarvet cellekontrol ved at overføre 50 μL (1,6 x 106 celler) af cellesuspensionen til et FACS-rør på is. Forbered cellerne til hver enkelt farvekontrol (11 rør) ved at overføre 50 μL (1,6 x 106 celler) af cellesuspensionen til et FACS-rør på is.
- Forbered FMO-kontroller til følgende farver (Kit, CD41, CD150, CD49f [fire rør]) ved at overføre 300 μL (10 x 106 celler) af cellesuspensionen til et separat FACS-rør på is.
- Centrifuger cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten op.
- Antistoffarvning af FMO'er og enkeltfarvekontroller
- Plet FMO'erne ved 33 x 106 celler / ml (i et samlet volumen på 300 μL) i FACS-rør. For hver kontrol skal du tilføje alle antistofferne undtagen FMO's navnebror antistof. For eksempel for Kit FMO skal du udelade Kit-antistoffet. For hvert antistof anvendes fortyndingen og slutkoncentrationen som vist i tabel 2.
- Plet enkeltfarvekontrollerne ved 20 x 106 celler/ml (i et samlet volumen på 50 μL) i FACS-rør; For hver kontrol tilsættes et enkelt antistof i den koncentration, der er anført i tabel 2.
- Vortex hvert kontrolrør i 2-3 s ved 3.000 rpm (rotationer pr. Minut) og inkuberes derefter ved 4 ° C, vugger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mod lys. Rokk rørene med en rotationsakse parallelt med rørets længde, mellem ca. 10° og en vinkel på 60° fra vandret, så indholdet ikke rører hætten.
- Cellerne vaskes med SB5: Der fyldes op til 4 ml cellesuspension med SB5. Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten til mig.
- Resuspension af celler:
- Resuspender de ubejdsede og alle enkeltfarvekontrollerne (undtagen DAPI-kontrollen) i 300 μL SB5, og filtrer gennem et 40 μm filternet ind i et nyt FACS-rør.
- Lav en DAPI/SB5-opløsning ved at fortynde DAPI-stammen (1 mg/ml i 100% ethanol) ved 1:10.000 i SB5.
- FMO'erne resuspenderes i 1,8 ml DAPI/SB5, og filtreres gennem et 40 μm filternet ind i et nyt FACS-rør
- Ophvirvl DAPI-enkeltfarvekontrollen igen i 300 μL DAPI/SB5, og filtrer gennem et 40 μm filternet til et nyt 4 ml FACS-rør.
- Prøveforberedelse: Hvis cellerne forberedes til flowcytometrisk analyse, skal du gå til trin 1.14. Hvis du forbereder cellerne til sortering, skal du gå videre til trin 2.1.
- Plet flowcytometriske analyseprøver ved 33 x 10 6 celler/ml i et samlet volumen på 300 μL (10 x 106 celler) i FACS-rør:
- Forbered antistofmasterblandingen. Masterblandingens volumen bestemmes ved hjælp af antallet af prøver med 300 μL pr. prøve. Masterblandingen fremstilles ved at fortynde alle antistofferne anført i tabel 2 ved den angivne fortynding i SB5. Kanin IgG i masterblandingen fungerer som en Fc-blok.
- Vortex hvert rør i 2-3 s ved 3.000 o / min og inkuberes derefter ved 4 ° C, vugger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mod lys.
- Cellerne vaskes med SB5: Der fyldes op til 4 ml cellesuspension med SB5. Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten til mig.
- Prøverne til cytometrisk flowanalyse resuspenderes i 1,8 ml DAPI/SB5 som fremstillet i trin 1.12.5.2, og der filtreres gennem et 40 μm filternet ind i et FACS-rør.
- Analyserer prøverne på et cytometer med 10 kanaler for at imødekomme antistofkonjugaterne i tabel 2 og levedygtighedsfarvestoffet DAPI. Et eksempel på kanalopsætning findes i tabel 1. Det er også muligt kun at bruge ni kanaler; se forklaringen til tabel 2 .
- Under analysen af flowcytometridataene skal du bruge standardspektrale kompensationsmetoder ved hjælp af enkeltfarvekontrollerne og FMO-kontrollerne som beskrevet i trin 2.4.
2. Protokoljusteringer for flowcytometrisk sortering
- Fremstilling af lin-
- Saml alle de ekstraherede celler fra det samme væv (enten BM eller milt) fra 10 mus i et 50 ml rør. Hver samleprøve resuspenderes ved pipettering med en P1000 med en stor åbningsspids.
- Centrifuger cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten op.
- Forbered enkeltfarve- og FMO-kontroller som beskrevet i afsnit 1 ved hjælp af ikke-forbedrede celler.
- Berigelse af Lin-celler til sortering ved hjælp af magnetisk perleberigelse af Lin-celler :
- Resuspender cellerne ved 1 x 108 celler/ml med SB5 og overfør dem til et 15 ml rør. Der tilsættes normalt rotteserum og de biotinylerede antistoffer, der er anført i tabel 4, og der inkuberes ved gyngning ved 4 °C i 1 time.
- Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten op. Resuspender cellerne i 15 ml kold SB5.
- Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten op. Resuspender cellerne ved 1 x 108 celler/ml i kold SB5 og hold dem på is.
- Vortex de magnetiske nanoperler ved 3.000 o/min i 5-10 s. Tag 1 ml magnetiske nanoperler for hver 10 ml celler.
- Vask nanoperlerne i et 5 ml FACS-rør. Der fyldes op til 4 ml med SB5, centrifugeres ved 900 x g, 4 °C i 5 min, og supernatanten suges op.
- Nanoperlerne resuspenderes i 500 μL SB5 og blandes med cellerne fremstillet i trin 2.1.7. Der inkuberes ved 4 °C med gyngning i 15 min.
- Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og sug supernatanten op. Resuspender cellerne ved 1 x 108 celler/ml med SB5.
- Anbring røret på en magnet ved 4 °C i 5 min.
- Hæld forsigtigt supernatanten i et nyt 15 ml glas.
- Fra trin 2.1.13 anbringes reagensglasset med supernatanten på en magnet ved 4 °C i 5 min. Hæld forsigtigt supernatanten i et nyt 15 ml glas.
- I trin 2.1.14 centrifugeres cellerne fra supernatanten ved 900 x g, 4 °C i 10 min, og supernatanten suges op.
- Resuspender de Lin-berigede celler i 1 ml SB5.
- 10 μL af cellerne fortyndes ved 1:100 i SB5. Bland 10 μL af de fortyndede celler med 10 μL trypanblåt og tæl på et hæmocytometer og/eller celletæller.
- Baseret på celletallet i trin 2.1.17 resuspenderes de Lin-berigede celler ved 33 x 106 celler/ml.
- Farvning af berigede celler:
- Plet de berigede celleprøver ved 33 x 106 celler/ml i FACS-rør ved at tilsætte alle antistofferne i tabel 2. Vortex hvert rør i 2-3 s ved 3.000 o / min og inkuberes derefter ved 4 ° C, vugger i 2,5 timer i mørket, beskyttet mod lys.
- Cellerne vaskes med SB5: Der fyldes op til 4 ml med BASS-rørene med SB5. Drej cellerne ned ved 900 x g, 4 °C i 10 minutter, og fjern supernatanten.
- Prøverne til flowcytometrisk analyse resuspenderes i 4-6 ml DAPI/SB5 som beskrevet i trin 1.12.5.2, og filtreres gennem et 40 μm filternet over i et nyt 4 ml FACS-rør.
- Prøvesortering:
- Sorter prøverne med en stor dyse og lavt tryk for at maksimere CFU-e-udbyttet, da CFU-e-celler let beskadiges under højt tryk. Til flowcytometeret, der anvendes i denne undersøgelse, skal du bruge 14 psi og en 100 μm dyse eller 12 psi med en 130 μm dyse. Konfigurer sorteringsportene som beskrevet under trin 2.4 nedenfor.
- Forbered opsamlingsbufferen: Tilsæt 20% føtalt bovint serum til PBS.
- For at kontrollere renheden af de sorterede populationer skal du gentage en lille prøve fra hver sorteret population i en buffer, der indeholder DAPI, som beskrevet i trin 1.12.5.2.
BEMÆRK: BM fra i alt 10 mus (ca. 1 x 109 celler) giver typisk mindst 50.000-100.000 celler for hver af P1-hi-, P1-lav- og P2-populationerne med en levedygtighed på ca. 70%.
- Brug gating-strategien vist i figur 3 til analyse eller opsætning af sorteringsportene.
- Brug parameteren forward-scatter (FSC) til at fjerne snavs baseret på størrelse. Brug FSC-højde versus FSC-områdehistogrammet til at udelukke celleaggregater og vælge enkelte celler; Gentag med sidepunktshistogrammet (SSC)-højde versus SSC-område.
- Ekskluder de døde celler ved at udskille de celler, der er positive for DNA-farvestoffet DAPI, som levedygtige celler er uigennemtrængelige for.
- Vælg Lin-Ter119-Kit+ celler, og vælg en subpopulation, der udtrykker CD55, ud fra disse.
- Opdel Lin- Ter119-Kit+CD55+ cellerne i to hovedpopulationer, P6 og P7, baseret på ekspressionen af CD49f og CD105.
- Baseret på ekspressionen af CD150 og CD41 opdeles P6 yderligere i P3 (basofile eller mastcelleprogenitorer), P4 (megakaryocytiske forfædre) og P5 (EBMP og erythroid-biased MPP).
- Baseret på ekspressionen af CD150 og CD71 opdeles P7 yderligere i P2 (BFU-e), tidlig CFU-e (P1-lav) og sen CFU-e (P1-hi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver en flowcytometrisk tilgang til identifikation af BFU-es og CFU-es i nyhøstede knoglemarvs- og miltceller. Det starter med at høste frisk BM og milt fra mus og straks placere vævet på is. Alle procedurer udføres i kulden for at bevare cellelevedygtigheden. Celler er mærket med en "afstamning" antistofcocktail, der tillader udelukkelse af alle celler, der udtrykker markører for differentierede blodlinjer (FITC-Lin-cocktailen, tabel 3, i tilfælde af flowcytometrisk analyse; eller magnetisk perleberigelse, tabel 4, for afstamningsnegative celler). Celler er også mærket med antistoffer mod markører, der giver os mulighed for at skelne mellem en række tidlige stampopulationer inden for den afstamningsnegative cellefraktion. Mærkning efterfølges af enten flowcytometrisk sortering eller analyse. Tilgangen til flowcytometrisk sortering svarer til flowcytometrisk analyse, men går forud for magnetisk perleberigelse for Lin-cellefraktionen for at reducere tiden og omkostningerne ved sortering af et stort antal celler. Ved sortering af forfædre samles BM fra flere mus, antallet afhænger af downstream-applikationen. Typisk giver BM fra i alt 10 mus (ca. 1 x 109 celler) mindst 50.000-100.000 celler for hver af P1-hi-, P1-lav- og P2-populationerne med en levedygtighed på ca. 70%.
Hovedforskellen mellem de milt- og BM-afledte populationer, der er identificeret ved denne protokol, er den meget lavere frekvens af P6-populationen og dens underpopulationer, P4 / P5 / P3, i miltafledte celler.
Som et eksempel på flowcytometrisk analyse blev effekten af administration af Epo hos mus undersøgt. Epo binder sig til og aktiverer Epo-receptoren (EpoR), som er afgørende for både basal og accelereret erythropoiesis under stressforhold som hypoxi. Hypoxi stimulerer en stigning i blodets Epo-niveauer 28,18, hvilket igen fremmer udvidelsen af CFU-e 1,29 og erythroidprækursorer.
Epo (0,25 E/g legemsvægt) eller et tilsvarende volumen vehikel (saltvand) blev injiceret subkutant i mus én gang hver 24. time i 3 dage. BM og milt blev høstet ved 72 timer. Epo-stimulering førte til udvidelse af de tidlige og sene CFU-e-populationer (P1-lav og P1-hi) i både BM og milt (figur 4 og figur 5).
Figur 1: To hovedfaser af endelig erythropoiesis. Erythropoiesis kan opdeles i en tidlig fase, hvor forfædre defineres ud fra deres kolonidannende potentiale, og en senere fase kendt som erythroid terminal differentiering (ETD), hvor erythroblaststadiet defineres baseret på morfologi. Flowcytometriske teknikker har muliggjort prospektiv isolering af udviklingsspecifikke erythroblaststadier ved anvendelse af FSC, Ter119 og CD71. Derimod har der ikke været en tilsvarende metode til isolering af BFU-e- og CFU-e-stamfædre direkte fra væv med høj renhed. Bemærk, at kun en brøkdel af BFU-e-kolonien vises. Skalabjælken gælder for både CFU-e- og BFU-e-kolonierne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: En ny flowcytometrisk strategi til isolering af CFU-e og BFU-e direkte fra væv. Dette manuskript beskriver en protokol til identifikation af fem nye flowcytometriske populationer, P1 til P5, baseret på en analyse af scRNAseq-dataene. (A) Kraftstyret grafprojektion ("Spring plot") af friske Balb/C voksne knoglemarvsenkeltcelletranskriptomer. Farverne angiver det forudsagte celleskæbnepotentiale baseret på transkriptomisk information og populationsbalanceanalysealgoritmen (PBA)1. De regioner i plottet, der svarer til hver af strømningscytometriske populationer P1 til P5, er angivet. De afgrænsede regioner er håndtegnede tilnærmelser af de oprindelige data, som findes i Tusi et al.1. Korrespondancen blev bekræftet ved at foretage scRNAseq af hver af de sorterede P1 til P5 populationer1. E = erythroid; Ba = basofile eller mastcellestamfædre; Meg = megakaryocytiske forfædre; Ly = lymfocytiske forfædre; D = dendritiske forfædre; M = monocytiske forfædre; G = granulocytiske forfædre. (B) Kolonidannelsesassays, omplottet fra Tusi et al.1. P1 til P5 populationerne og CD55+ cellerne blev sorteret som beskrevet i denne protokol, og hver population blev belagt til de relevante kolonidannelsesassays. Erythroidkolonier blev scoret på de angivne dage. UF = unifokal; MF = multi-fokal; CFU-MK = kolonidannende enhed megakaryocytisk; CFU-GM = kolonidannende enhed granulocytisk/monocytisk; CFU-GEMM = kolonidannende enhed granulocytisk, erythroid, monocytisk, megakaryocytisk. (C) Celleoverflademarkører, der definerer hver af de fem populationer samt deres celleskæbnepotentiale. Celleskæbnepotentiale er både resultatet af transkriptomisk information og af celleskæbneassays, både kolonidannelse og enkeltcelleskæbneassays 1,27. Det skal bemærkes, at P1-populationen blev opdelt baseret på udtrykket af CD71-markøren i P1-hi og P1-lav1. Baseret på data fra Tusi et al.1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Flow cytometrisk gating-strategi. Den komplette gating-strategi for populationer P1 til P5. Friskhøstet knoglemarv (BM) eller milt (SP) fra en Balb / C-mus subkutant injiceret med 100 μL 0,9% sterilt saltvand lukkes først for hovedpopulationen og kasserer affald; dette efterfølges af at vælge singlets, kassere døde celler og gating på celler, der er Ter119-negative, lineage-negative og express Kit. Yderligere underopdeling af Ter119-Lin-Kit+CD55+ i P6 og P7 efterfølges af den endelige underopdeling i populationerne P1 til P5 (se også figur 2). Ter119-kanalen tillader analyse af erythroblaster på den samme prøve (ved hjælp af Ter119/CD71-tilgang12). En separat Ter119-kanal er dog ikke afgørende for denne protokol, og Ter119-antistoffet kan udelades fra masterblandingen og inkluderes som en del af Lin-FITC-cocktailen i stedet. Udelukkelsestrinnet for Ter119-positive celler vises ikke i denne gating-strategi. Tal er procentdele af hver port inden for det viste histogram. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af knoglemarv og milt tidlige erythroid-forfædre efter Epo-stimulering. Repræsentative flowcytometriske plots af friskhøstet knoglemarv (BM) eller milt (SP). Balb/C-mus blev injiceret subkutant med enten 0,25 Epo/g legemsvægt eller med et tilsvarende volumen saltvand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: BM's og miltprogenitorernes respons på Epo in vivo. Sammenfattende statistikker, der viser ændringer i det absolutte celleantal i populationerne P1 til P5 efter injektion af Epo i nyhøstede (A) knoglemarvs- og (B) miltceller; *p = 0,02. Eksperiment som beskrevet i figur 4. n = 4 mus i hver gruppe. For at beregne det absolutte celletal blev frekvensen af celler i hver population i enten BM eller milt (fra figur 4) ganget med det samlede antal BM- eller miltceller høstet fra hver mus og divideret med musevægten i gram. Det skal bemærkes, at kun tidlig CFU-e i BM nåede statistisk signifikans (p = 0,02), sandsynligvis en kombination af en relativt lav Epo-dosis og et lille antal mus i hver gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Detektor Array | YDELSE | Dikroisk spejl | Båndpas-filter | Fluorofor detekteret |
| Blå laser (488 nm) | En | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | Lin-FITC (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| Violet laser (405 nm) | En | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| Rød laser (640 nm) | En | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| UV-laser (355 nm) | En | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | DAPI | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG Laser (561 nm) | En | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
Tabel 1: Eksempel på kanallayout i et LSRII-cytometer. Panelet af antistoffer, der anvendes i den beskrevne protokol og deres arrangement i LSRII-flowcytometeret til indsamling af dataene.
| Reagens eller antistof | Konjugat | Lager konc. (mg/ml) | Fortyndingsfaktor | Endelig konc. i cellesuspension (μg/ml) | Klon |
| CD71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | RIKO-3 |
| CD105 | PE | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (SLAM) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | GoH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| Lin cocktail | FITC | 0,08 (for hvert antistof i cocktailen) | 83 | 1 (for hvert antistof i cocktailen) | |
| Kanin IgG | 10 | 50 | 200 |
Tabel 2: Antistof master-mix komponenter. Sammensætning af antistofmasterblandingen. Ter119-kanalen tillader analyse af erythroblaster på den samme prøve (ved hjælp af Ter119/CD71-tilgang12). En separat Ter119-kanal er dog ikke afgørende for denne protokol, og Ter119-antistoffet kan udelades fra masterblandingen og inkluderes som en del af Lin-FITC-cocktailen i stedet.
| Reagens eller antistof | Konjugat | Lager konc. (mg/ml) | Klon |
| Ly-6G og Ly-6C | FITC | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | FITC | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | FITC | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | FITC | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | FITC | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | FITC | 0.5 | BM8 |
Tabel 3: Lin-cocktailkomponenter. Sammensætningen af Lin-cocktailen, der anvendes som en del af antistofmasterblandingen (se detaljer om masterblandingen i tabel 2).
| Reagens eller antistof | Konjugat | Lager konc. (mg/ml) | Fortyndingsfaktor | Endelig konc. i cellesuspension (μg/ml) | Klon |
| Ly-6G og Ly-6C | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | Biotin | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| Normalt rotteserum | 50 |
Tabel 4: Antistoffer mod magnetisk perleberigelse. Antistoffer, der anvendes til at berige Lin-fraktionen af enten BM eller milten før cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evnen til prospektivt at isolere BFU-e og CFU-e forfædre direkte fra frisk væv med høj renhed havde tidligere undgået efterforskere. Vores nye tilgang, valideret ved hjælp af scRNAseq og celleskæbneassays 1,27, tilbyder nu værktøjerne til at gøre dette.
Der er en række nøglepunkter for vellykket udførelse af både sorterings- og analyseprotokollerne. Først skal cellerne spindes ved 900 x g for at forhindre tab af celler med lav densitet. Mange celler på CFU-e-stadiet er store celler med lav densitet, der ellers kan gå tabt. For det andet er det nødvendigt at bruge store åbningsspidser, når du pipetterer op og ned for at hjælpe med at bryde celleaggregaterne og forhindre tab af skrøbelige P1- og P2-celler. Dette trin er vigtigt, da mange CFU-e-forfædre er forbundet med erythroblastiske ømakrofager (EBI'er) og ville gå tabt, hvis de ikke blev dissocieret. For det tredje inkuberes cellerne med en EDTA-holdig buffer ("SB5") inden farvning, hvilket hjælper med at adskille EBI'erne. For det fjerde bør erhvervelseshastigheden under flowcytometrisk dataindsamling ikke overstige 7.000 hændelser/s eller den anbefalede hastighed for det flowcytometerinstrument, der anvendes.
P1- og P2-populationerne indeholder henholdsvis alle CFU-e- og BFU-e-stamfædrene i knoglemarven og indeholder ingen andre stamcelletyper1. P1-populationen er yderligere opdelt i tidlig CFU-e (P1-lav) og sen CFU-e (P1-hi) baseret på ekspressionen af CD711. Disse meget rene flowcytometriske populationer giver et komplet billede af BFU-e- og CFU-e-stampopulationerne in vivo.
En ulempe er, at P2-populationen indeholder en lille brøkdel af tidlige CFU-e-forfædre. Det indeholder dog alle BFU-e-cellerne i BM og ingen andre celletyper. P1-populationen indeholder hele CFU-e i BM, bortset fra den lille fraktion, der er til stede i P2. I modsætning til P1- og P2-populationerne er P3 til P5 stærkt berigede, men ikke rene, stampopulationer.
Anvendelse af dette flowcytometriske værktøj til musemodeller af erythropoiesis ville nu muliggøre bestemmelse af cellulære og molekylære reaktioner under fysiologiske og patologiske forstyrrelser til erythropoiesis. I det viste eksempel blev mus injiceret med hormonet Epo. Denne fremgangsmåde kan anvendes i genetisk modificerede mus, for eksempel i musemodeller af hæmoglobinopatier, til en mere nøjagtig molekylær analyse af deres ændrede erythroidforfædre in vivo.
TILGÆNGELIGHED AF DATA:
Yderligere data i forbindelse med forsøgene i figur 4 og figur 5 kan rekvireres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH-bevillinger R01DK130498, R01DK120639 og R01HL141402
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
- Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
- Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
- Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. Robinson, W. A. , National Institutes of Health, US Government Printing Office. (1974).
- Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
- Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
- Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
- Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
- Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
- Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
- Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
- Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
- Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
- Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
- Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
- Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
- Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
- Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
- Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
- Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
- Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C.
