Summary
ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。
Abstract
初期の赤血球前駆細胞は、もともとin vitroでのコロニー形成能によって定義され、BFU-eおよびCFU-eとして知られるバースト形成およびコロニー形成の「ユニット」に分類されました。最近まで、新たに単離された成体マウス骨髄から純粋なBFU-eおよびCFU-e前駆細胞を直接前向きかつ完全に単離する方法は利用できませんでした。このギャップに対処するために、マウス骨髄のシングルセルRNA-seq(scRNAseq)データセットを、細胞表面マーカーをコードする遺伝子の発現について分析しました。この解析は細胞運命アッセイと組み合わされ、マウス骨髄または脾臓におけるBFU-eおよびCFU-e前駆細胞の完全かつ純粋なサブセットを同定し、単離することを可能にする新しいフローサイトメトリーアプローチの開発を可能にしました。このアプローチは、好塩基球/肥満細胞および巨核球電位に富むサブセットを含む、他の前駆細胞サブセットも同定する。この方法は、新鮮な骨髄または脾臓細胞をKitおよびCD55に向けられた抗体で標識することからなる。これらのマーカーの両方を発現する前駆細胞は、次に5つの主要な集団に細分される。集団1(P1またはCFU-e、キット+ CD55 + CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)には、すべてのCFU-e前駆細胞が含まれており、さらにP1-low(CD71 med CD150高)とP1-hi(CD71高CD150低)に細分され、それぞれCFU-eの初期と後期に対応します。集団2(P2またはBFU-e、キット+ CD55 + CD49f 中/低CD105中/高CD71低CD150高)には、すべてのBFU-e前駆細胞が含まれています。集団P3(P3、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150低CD41低)は、好塩基球/肥満細胞前駆細胞が豊富です。集団4(P4、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150高CD41 +)は巨核球前駆細胞が豊富です。集団5(P5、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150高CD41-)には、赤血球、好塩基球/肥満細胞、および巨核球能(EBMP)および赤血球/巨核球/好塩基球バイアス多電位前駆細胞(MPP)を持つ前駆細胞が含まれています。この新しいアプローチにより、赤血球やその他の造血前駆細胞を分析する際の精度が向上し、フローサイトメトリーで定義された各集団のトランスクリプトーム情報を参照することもできます。
Introduction
赤血球形成は、早期赤血球形成と赤血球終末分化の2つの主要な段階に分けることができます(図1)1,2,3。初期の赤血球形成では、造血幹細胞は赤血球系にコミットし、半固体培地でのコロニー形成の可能性に基づいて1970年代に最初に同定された初期の赤血球前駆細胞を生じさせます4,5,6,7,8,9 .大まかに言えば、赤血球前駆細胞は2つのカテゴリーに分けられます:それぞれが「バースト形成ユニットエリスロイド」またはBFU-e 4,5,6と呼ばれる「バースト」(より小さな赤血球細胞クラスターの大きな集合体)を引き起こす初期の前駆細胞。そしてそれらの子孫は、それぞれが単一の小さな赤血球細胞クラスターまたはコロニーを形成し、「コロニー形成ユニット赤血球」またはCFU-e 7,8,9と名付けられる。BFU-eおよびCFU-eはまだ末端赤血球遺伝子を発現しておらず、形態学的に認識できません。CFU-eは、自己複製または増殖細胞分裂を数回行った後、グロビンなどの赤血球遺伝子が誘導される転写スイッチを受け、赤血球末端分化(ETD)に移行します1,10。ETDの間、赤芽球は網状赤血球を形成するために核形成する前に3〜5回の成熟細胞分裂を受け、赤血球に成熟します。
末端分化中の赤芽球は、もともとその形態に基づいて、前赤芽球、好塩基球、多色、およびオルソクロマティックに分類されていました。フローサイトメトリーの出現により、細胞サイズ(前方散乱、FSCで測定)と2つの細胞表面マーカーCD71およびTer11911、12、13に基づく将来の選別と分離が可能になりました(図1)。これおよび同様のフローサイトメトリーアプローチ14は、ETDの分子的および細胞的側面の研究に革命をもたらし、in vivoおよびin vitroでの赤芽球の発生段階特異的分析を可能にしました10、15、16、17、18、19、20。CD71/Ter119アプローチは現在、赤血球前駆体の分析に日常的に使用されています。
最近まで、マウス組織からCFU-eおよびBFU-eを直接高純度で前向きに単離するための同様のアクセス可能なフローサイトメトリーアプローチは、研究者には知られていませんでした。代わりに、研究者らは、多くの場合、同じフローサイトメトリーサブセット内で共精製する非赤血球細胞の存在下で、これらの前駆細胞のほんの一部のみを単離するフローサイトメトリー戦略を使用してきました21。その結果、BFU-eおよびCFU-eの調査は、初期の骨髄前駆細胞からBFU-eおよびCFU-eを誘導および増幅するin vitro分化系に限定されていました。次いで、CFU-eをBFU-eから区別するフローサイトメトリー戦略をこれらの赤血球前駆細胞富化培養物に適用することができる22,23。別のアプローチでは、妊娠中期にマウス胎児肝臓のTer119陰性画分が非常に濃縮されている胎児CFU-eおよびBFU-eを利用します10,24,25。しかしながら、これらのアプローチのいずれも、in vivoでの生理学的状態における成人のBFU-eおよびCFU-eの調査を可能にしない。コロニー形成アッセイに基づいて、これらの細胞がそれぞれわずか0.025%および0.3%の頻度で成体骨髄に存在することを思い出すと、課題の大きさが理解されるかもしれません6。
ここで説明するプロトコルは、採取したばかりのKit+マウス骨髄細胞のシングルセルトランスクリプトミクス解析に基づく新しいフローサイトメトリーアプローチです(Kitは骨髄の初期前駆細胞集団のすべてによって発現されます)1。私たちのアプローチには、Pronkらによってすでに使用されていたいくつかの細胞表面マーカーが含まれています21,26。シングルセルトランスクリプトームを使用して、赤血球および他の初期造血前駆細胞を同定する細胞表面マーカーの組み合わせを決定しました(図2)。具体的には、系統陰性(Lin-)Kit+細胞のCD55+画分を5つの集団に細分することができ、そのうち3つは赤血球軌道の連続したセグメントを生成します(図2)。これらの各集団のトランスクリプトーム同一性は、ソート、続いてscRNAseq、およびソートされた単一細胞トランスクリプトームの元のトランスクリプトームマップへの投影によって確認されました(5つの集団のそれぞれおよび骨髄データセット全体の遺伝子発現は https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html で探索できます)1.各集団の細胞運命の可能性は、従来のコロニー形成アッセイ(図2)および新規のハイスループット単一細胞運命アッセイ1,27を用いて確認された。これらの解析は、新しいフローサイトメトリーアプローチにより、新鮮な成人骨髄および脾臓のすべてのBFU-eおよびCFU-e前駆細胞の高純度分離が得られることを示しています。具体的には、集団1(P1)にはCFU-eのみが含まれ、他の造血前駆細胞は含まれず、集団2(P2)には骨髄のBFU-e前駆細胞と少数のCFU-eがすべて含まれ、他の前駆細胞は含まれていません1。以下の詳細なプロトコルは、生理食塩水または赤血球生成刺激ホルモンエリスロポエチン(Epo)のいずれかを注射したマウスにおける実験例でさらに説明される。
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Protocol
すべての実験は、動物プロトコルA-1586に従って実施され202200017マサチューセッツ大学チャン医科大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
注:ここでは2つのプロトコルについて詳しく説明します:最初にフローサイトメトリー分析(セクション1)、次にフローサイトメトリーソーティングのプロトコル調整(セクション2)。以下のプロトコルでは、10チャンネルのフローサイトメーター/ソーターを使用しています。セットアップの例を 表 1 に示します (ステップ 1.14.5 を参照)。このプロトコルを9つのチャネルのみで実行することもできます。 表 2 の凡例を参照してください。
1. フローサイトメトリー解析
- 成人(>6週齢)のBalb / CまたはC57BL6マウスを、施設動物管理および使用委員会によって承認された適切な方法を使用して安楽死させます(例:.、CO2 吸入とそれに続く頸部脱臼)。.フローサイトメトリー解析では、1匹のマウスの骨髄(BM)で十分です。ソートの場合、マウスの数はダウンストリームアプリケーションによって異なります。各集団の細胞収量を以下に示します(ステップ2.3.3)。
- 組織収穫:
- 氷上で3 mLの冷(4°C)染色バッファー(「SB5」:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.08%グルコース、5 mM EDTA)を含む5 mL蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブを調製します。これを使用して、収穫した組織を配置します。
- 各マウスから解剖した組織ごとに別々のチューブを準備します。複数のマウスの組織をプールしないでください。.
- 両方の大腿骨と両方の脛骨を収穫します。SB5でチューブに入れる前に、骨からすべての筋肉を取り除きます。
- 腹部の左側の切開部を通して脾臓を解剖します。
- 骨髄細胞抽出:
- 解剖したばかりの大腿骨と脛骨を冷染色バッファー(SB5)に直接入れ、骨髄(BM)を抽出する準備ができるまでチューブを氷上に置いておきます。きれいな滅菌モルタルをバケツの氷の上に置きます。骨をチューブからSB5と一緒にモルタルに移します。
- 各骨の端の約1 mmを解剖ハサミで切り取り、骨の開口部がちょうど見えるようにします。
- 26 Gの針とSB5で満たされた3 mLシリンジを使用して、骨髄を骨から洗い流し、乳鉢に集めます。骨が無色になるまで、毎回新鮮なバッファーを使用してこのプロセスを3〜5回繰り返します。
- フラッシュした骨髄を100μmメッシュフィルターでろ過し、氷上に置いた50 mL遠沈管に細胞を回収します。
- 乳鉢と乳棒を使用して、洗い流された骨を5〜10mLのSB5で粉砕します。粉砕した骨とバッファーの混合物を100 μmのセルストレーナーでろ過し、ステップ1.3.4で収集した細胞とプールします。
- 脾臓細胞抽出:
- 氷の上に置いた空の50 mL遠心チューブに100 μmメッシュフィルターを設置します。メッシュフィルターに単一の脾臓を置きます。
- 0.5〜1 mLのSB5を脾臓に追加して、乾燥しないようにします。
- 3 mLまたは5 mLのシリンジプランジャーのゴム側を使用して、メッシュを通して脾臓をすりつぶします。一度にSB5、5 mLを追加し、すべての細胞がチューブに集められるまでマッシュを続けます。
- この時点から、骨髄と脾臓細胞は同じ方法で扱われます。
- セルを900 x g、4°Cで10分間スピンダウンします。真空吸引セットアップを使用して上清を吸引します。
- シングルセル懸濁液を作るには、細胞を2 mLのSB5に再懸濁し、大きなオリフィスチップを備えたP1000を使用して50回上下にピペットします( 材料の表を参照)。これらは、壊れやすい細胞への損傷を防ぐために広い先端開口部を持っています。
- 細胞をカウントするには、上下に20回ピペッティングして再懸濁します。SB5で細胞を1:100の比率で希釈します。希釈した細胞10 μLをトリパンブルー10 μLと混合し、血球計算盤および/またはセルカウンターでカウントします。
- セルを900 x g、4°Cで10分間スピンダウンします。上清を吸引し、細胞をSB5の33 x 106 生細胞/mLで再懸濁します。
- 表3の各抗体を等量混合してLin-FITCカクテルを調製した。
- シングルカラーコントロールと「蛍光マイナスワン」(FMO)コントロール用に細胞を準備します。ステップ1.14(フローサイトメトリー分析用のサンプル)および/またはステップ2.1(フローサイトメトリーソーティング)のサンプル細胞の調製および染色と並行して、ステップ1.11〜1.12を実行します。
- 50 μL(1.6 x 106 細胞)の細胞懸濁液を氷上のFACSチューブに移して、染色されていない細胞コントロール用の細胞を準備します。50 μL(1.6 x 106 セル)の細胞懸濁液を氷上のFACSチューブに移して、各シングルカラーコントロール(11チューブ)の細胞を準備します。
- 300 μL(10 x 106 細胞)の細胞懸濁液を氷上の別のFACSチューブに移して、次の色(キット、CD41、CD150、CD49f [4本のチューブ])のFMOコントロールを準備します。
- 細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- FMOおよびシングルカラーコントロールの抗体染色
- FACSチューブ内で33 x 106 細胞/mL(総容量300 μL)でFMOを染色します。コントロールごとに、FMOの同名の抗体を除くすべての抗体を追加します。たとえば、キットFMOの場合は、キット抗体を省略します。各抗体について、 表2と同様に希釈液および終濃度を使用する。
- 単色コントロールをFACSチューブで20 x 106 細胞/mL(総容量50 μL)で染色します。各コントロールについて、 表2に列挙した濃度で単一の抗体を添加する。
- 各コントロールチューブを3,000 rpm(毎分回転)で2〜3秒間ボルテックスし、4°Cでインキュベートし、光から保護された暗闇で2.5時間揺れます。内容物がキャップに触れないように、チューブの長さに平行な回転軸で、水平から約10°から60°の角度でチューブを揺り動かします。
- SB5で細胞を洗浄する:細胞懸濁液の容量をSB5で4 mLに構成します。細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- 細胞の再懸濁:
- 染色されていないすべての単色コントロール(DAPIコントロールを除く)を300 μLのSB5に再懸濁し、40 μmのフィルターメッシュを通して新しいFACSチューブにろ過します。
- DAPIストック(100%エタノール溶液1 mg / mL)をSB5中で1:10,000に希釈して、DAPI/SB5溶液を作ります。
- FMOを1.8 mLのDAPI/SB5に再懸濁し、40 μmのフィルターメッシュを通して新しいFACSチューブにろ過します。
- DAPIシングルカラーコントロールを300 μLのDAPI/SB5に再懸濁し、40 μmのフィルターメッシュを通して新しい4 mL FACSチューブにろ過します。
- サンプル調製:細胞がフローサイトメトリー分析用に調製されている場合は、ステップ1.14に進みます。並べ替えのためにセルを準備する場合は、手順 2.1 に進みます。
- フローサイトメトリー分析サンプルを、FACSチューブ内の総容量300 μL(10 x 10 6細胞)で33 x 106細胞/mLで染色します。
- 抗体マスターミックスを調製する。マスターミックスの容量をサンプル数で決定し、サンプルあたり300 μLを使用します。 表2 に記載されているすべての抗体をSB5で示された希釈率で希釈してマスターミックスを作成します。マスターミックス中のウサギIgGは、Fcブロックとして機能します。
- 各チューブを3,000 rpmで2〜3秒間ボルテックスし、4°Cでインキュベートし、光から保護された暗闇で2.5時間揺れます。
- SB5で細胞を洗浄する:細胞懸濁液の容量をSB5で4 mLに構成します。細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- ステップ1.12.5.2で調製した1.8 mLのDAPI/SB5にフローサイトメトリー分析用のサンプルを再懸濁し、40 μmのフィルターメッシュを通してFACSチューブにろ過します。
- 表2の抗体コンジュゲートと生存率色素DAPIを収容するために、10チャンネルのサイトメーターでサンプルを分析します。チャネル設定の例を表 1 に示します。9つのチャネルのみを使用することもできます。表 2 の凡例を参照してください。
- フローサイトメトリーデータの解析中は、ステップ2.4で詳述されているように、シングルカラーコントロールとFMOコントロールを使用して、標準的なスペクトル補正アプローチを使用します。
2. フローサイトメトリーソーティングのプロトコル調整
- リンの調製
- 10匹のマウスの同じ組織(BMまたは脾臓)から抽出したすべての細胞を50 mLチューブにプールします。プールされた各サンプルを、大きなオリフィスチップを持つP1000を使用してピペッティングして再懸濁します。
- 細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- セクション 1 の説明に従って、リッチされていないセルを使用して単色コントロールと FMO コントロールを準備します。
- 磁気ビーズを使用した選別のためのリン細胞の 濃縮 Lin細胞の 濃縮:
- SB5で細胞を1 x 108 細胞/mLで再懸濁し、15 mLチューブに移します。正常ラット血清および 表4 に列挙したビオチン化抗体を添加し、4°Cで1時間揺動しながらインキュベートする。
- 細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。細胞を15 mLの冷たいSB5に再懸濁します。
- 細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。細胞を冷たいSB5に1 x 108 細胞/mLで再懸濁し、氷上に保ちます。
- 磁性ナノビーズを3,000rpmで5〜10秒間ボルテックスします。細胞10 mLごとに1 mLの磁気ナノビーズを取ります。
- ナノビーズを5 mL FACSチューブで洗浄します。SB5で容量を4mLにメイクし、900 x gでスピンし、4°Cで5分間、上清を吸引します。
- ナノビーズを500 μLのSB5に再懸濁し、ステップ2.1.7で調製した細胞と混合します。4°Cで15分間揺動しながらインキュベートします。
- 細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を吸引します。細胞をSB5で1 x 108 細胞/mLで再懸濁します。
- チューブを4°Cの磁石に5分間置きます。
- 上清を新しい15mLチューブに注意深く注ぎます。
- ステップ2.1.13の上清を入れたチューブを磁石の上に置き、4°Cで5分間待ちます。上清を新しい15mLチューブに注意深く注ぎます。
- ステップ2.1.14で上清から細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンし、上清を吸引する。
- Lin-濃縮細胞を1 mLのSB5に再懸濁します。
- 10 μLの細胞をSB5で1:100で希釈します。希釈した細胞10 μLをトリパンブルー10 μLと混合し、血球計算盤および/またはセルカウンターでカウントします。
- ステップ2.1.17の細胞数に基づいて、Lin-enriched細胞を33 x 106 cells/mLで再懸濁します。
- 濃縮細胞の染色:
- 表2に記載されているすべての抗体を加えて、FACSチューブで33 x 106細胞/mLで濃縮細胞サンプルを染色します。各チューブを3,000 rpmで2〜3秒間ボルテックスし、4°Cでインキュベートし、光から保護された暗闇で2.5時間揺れます。
- SB5で細胞を洗浄する:SB5でFACSチューブの容量を4mLに構成します。細胞を900 x g、4°Cで10分間スピンダウンし、上清を除去します。
- ステップ1.12.5.2で調製した4〜6 mLのDAPI/SB5にフローサイトメトリー分析用のサンプルを再懸濁し、40 μmのフィルターメッシュを通して新しい4 mL FACSチューブにろ過します。
- サンプルソート:
- CFU-eセルは高圧下で損傷しやすいため、CFU-eの収率を最大化するために、大きなノズルと低圧でサンプルを選別します。この研究で使用するフローサイトメーターには、14 psiと100 μmのノズル、または12 psiと130 μmのノズルを使用します。以下の手順 2.4 の説明に従って、並べ替えゲートを設定します。
- 収集バッファーの準備:20%ウシ胎児血清をPBSに加えます。
- ソートされた母集団の純度を確認するには、ステップ 1.12.5.2 で説明されているように、DAPI を含むバッファーで、選別された各母集団から少量のアリコートを再実行します。
注:通常、合計10匹のマウス(約1 x 109 細胞)からのBMは、約70%の生存率で、P1-hi、P1-low、およびP2集団のそれぞれについて少なくとも50,000〜100,000個の細胞を生成します。
- 図 3 に示すゲーティング戦略を使用して、分析またはソート ゲートを設定します。
- 前方散乱(FSC)パラメータを使用して、サイズに基づいて破片を除去します。FSC高さ対FSC面積のヒストグラムを使用して、細胞凝集体を除外し、単一細胞を選択します。横方散乱 (SSC) の高さと SSC 領域のヒストグラムで繰り返します。
- 生細胞が不透過性であるDNA色素DAPI陽性の細胞をゲーティングすることにより、死細胞を排除します。
- Lin-Ter119-Kit+細胞を選択し、その中からCD55を発現する亜集団を選択します。
- CD49fとCD105の発現に基づいて、Lin-Ter119-Kit+CD55+細胞を2つの主要な集団、P6とP7に細分化します。
- CD150およびCD41の発現に基づいて、P6をさらにP3(好塩基球または肥満細胞前駆細胞)、P4(巨核球前駆細胞)、およびP5(EBMPおよび赤血球バイアスMPP)に細分化する。
- CD150とCD71の発現に基づいて、P7をさらにP2(BFU-e)、初期CFU-e(P1-低)、および後期CFU-e(P1-hi)に細分化します。
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Representative Results
このプロトコルでは、採取したばかりの骨髄細胞および脾臓細胞中のBFUおよびCFU-eを同定するためのフローサイトメトリーアプローチについて説明しています。それはマウスから新鮮なBMと脾臓を採取し、すぐに組織を氷の上に置くことから始まります。すべての手順は、細胞の生存率を維持するために寒さで行われます。細胞は、分化した血液系統のマーカーを発現するすべての細胞を除外することを可能にする「系統」抗体カクテルで標識される(フローサイトメトリー分析の場合はFITC-Linカクテル、表 3、系統陰性細胞の場合は磁気ビーズ濃縮、 表4)。細胞はまた、系統陰性細胞画分内の多くの初期前駆細胞集団を区別することを可能にするマーカーに対する抗体で標識されている。標識の後には、フローサイトメトリーのソーティングまたは分析が行われます。フローサイトメトリーソーティングのアプローチは、フローサイトメトリー分析のアプローチと似ていますが、多数の細胞をソーティングする時間と費用を削減するために、Lin- 細胞画分の磁気ビーズ濃縮が先行しています。前駆細胞を選別する場合、BMは複数のマウスからプールされ、その数は下流の用途に依存する。典型的には、合計10匹のマウス(約1 x 109 細胞)からのBMは、約70%の生存率を有するP1-hi、P1-low、およびP2集団のそれぞれについて少なくとも50,000〜100,000個の細胞を生じる。
このプロトコルによって同定された脾臓由来集団とBM由来集団の主な違いは、脾臓由来細胞におけるP6集団とその亜集団P4 / P5 / P3の頻度がはるかに低いことです。
フローサイトメトリー解析の一例として、マウスにおけるEpo投与の効果を調べた。Epoは、低酸素症などのストレス条件下での基礎赤血球形成と加速赤血球形成の両方に不可欠なEpo受容体(EpoR)に結合して活性化します。低酸素症は血中Epoレベル28,18の上昇を刺激し、次にCFU-e 1,29および赤血球前駆体の増殖を促進する。
Epo(0.25 U / g体重)または等量のビヒクル(生理食塩水)を24時間ごとに1回3日間マウスに皮下注射しました。.BMおよび脾臓は72時間で採取された。Epo刺激は、BMと脾臓の両方で初期および後期のCFU-e集団(P1-lowおよびP1-hi)の拡大をもたらしました(図4 および 図5)。
図1:決定的な赤血球形成の2つの主要な段階。 赤血球生成は、前駆細胞がコロニー形成能に基づいて定義される初期段階と、赤芽球形成段階が形態に基づいて定義される赤血球終末分化(ETD)として知られる後期段階に分けることができます。フローサイトメトリー法により、FSC、Ter119、およびCD71を使用して、発生特異的な赤芽球段階の前向き単離が可能になりました。対照的に、BFU-eおよびCFU-eの前駆細胞を高純度の組織から直接単離するための同等の方法はありませんでした。BFU-eコロニーの一部のみが示されていることに注意してください。縮尺記号は、CFU-e コロニーと BFU-e コロニーの両方に適用されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CFU-eおよびBFU-eを組織から直接単離するための新しいフローサイトメトリー戦略。この原稿では、scRNAseqデータの分析に基づいて、P1からP5の5つの新しいフローサイトメトリー集団を特定するためのプロトコルについて説明しています。(A)新鮮なBalb / C成体骨髄単一細胞トランスクリプトームの力指向グラフ投影(「スプリングプロット」)。色は、トランスクリプトーム情報と集団バランス分析(PBA)アルゴリズム1に基づいて予測された細胞運命の可能性を示しています。フローサイトメトリー集団P1〜P5のそれぞれに対応するプロットの領域が示されている。描かれた領域は、元のデータの手描きの近似であり、Tusiら1に見られる可能性があります。この対応は、ソートされたP1〜P5集団の各々のscRNAseqを行うことによって確認された1。E =赤血球;Ba =好塩基球性または肥満細胞前駆細胞;メグ=巨核球前駆細胞;Ly =リンパ球前駆細胞;D =樹状突起前駆細胞。M =単球性前駆細胞。G =顆粒球前駆細胞。(B)コロニー形成アッセイ、Tusiら1から再プロット。P1〜P5集団およびCD55+細胞をこのプロトコルに記載されているように選別し、各集団を関連するコロニー形成アッセイのために播種した。赤血球コロニーは、示された日に採点された。UF =単焦点;MF =多焦点;CFU-MK =コロニー形成単位巨核球;CFU-GM =コロニー形成単位顆粒球/単球;CFU-GEMM =コロニー形成単位顆粒球、赤血球、単球、巨核球。(C)5つの集団のそれぞれを定義する細胞表面マーカー、およびそれらの細胞運命の可能性。細胞運命電位は、トランスクリプトーム情報および細胞運命アッセイの結果の両方であり、コロニー形成および単一細胞運命アッセイの両方である1,27。注目すべきことに、P1集団は、CD71マーカーの発現に基づいてP1-hiとP1-low1に分割されました。Tusiらのデータに基づいています1。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメトリーゲーティング戦略。 集団 P1 から P5 の完全なゲーティング戦略。100 μLの0.9%滅菌生理食塩水を皮下注射したBalb / Cマウスから採取したばかりの骨髄(BM)または脾臓(SP)は、最初に主集団のためにゲートされ、破片を捨てます。これに続いて、シングレットを選択し、死細胞を破棄し、Ter119陰性、系統陰性、および発現キットである細胞をゲーティングします。Ter119-Lin-Kit+CD55+をP6とP7にさらに細分化した後、最終的に集団P1からP5に細分化します(図2も参照)。Ter119チャネルは、同じサンプル上の赤芽球の分析を可能にします(Ter119/CD71アプローチ12を使用)。ただし、このプロトコルには別のTer119チャネルは必須ではなく、Ter119抗体をマスターミックスから除外し、代わりにLin-FITCカクテルの一部として含めることができます。Ter119陽性細胞に対する除外ステップは、このゲーティング戦略には示されていない。数値は、表示されているヒストグラム内の各ゲートのパーセンテージです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Epo刺激後の骨髄および脾臓の初期赤血球前駆細胞の分析。 採取したばかりの骨髄(BM)または脾臓(SP)の代表的なフローサイトメトリープロット。Balb / Cマウスに、0.25 U / g体重のEpoまたは等量の生理食塩水を皮下注射しました。. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 生体内のEpoに対するBMおよび脾臓前駆細胞の応答。 新たに採取された(A)骨髄細胞および(B)脾臓細胞におけるEpo注射後の集団P1〜P5における絶対細胞数の変化を示す要約統計量;*p = 0.02です。 図4に記載されるような実験。n=各群に4匹のマウス。絶対細胞数を計算するために、BMまたは脾臓のいずれかの各集団における細胞の頻度( 図4から)に、各マウスから採取されたBMまたは脾臓細胞の総数を乗じ、マウスの体重(グラム)で割った。注目すべきことに、BMの初期のCFU-eのみが統計的有意性に達し(p = 0.02)、比較的低いEpo用量と各グループの少数のマウスの組み合わせである可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 検出器アレイ | ティッカー | ダイクロイックミラー | バンドパスフィルター | 蛍光色素が検出されました |
| 青色レーザー (488 nm) | ある | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | リンフィット (+Ter119-FITC) | |
| C | 488/10 | |||
| バイオレットレーザー (405 nm) | ある | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| 赤色レーザー (640 nm) | ある | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700敗 | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| 紫外線レーザー (355 nm) | ある | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | ダピ | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YGレーザー (561 nm) | ある | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
表1:LSRIIサイトメーターにおけるチャネルレイアウトの例。 記載されたプロトコルおよびLSRIIフローサイトメーターにおけるそれらの配置において使用される抗体のパネルは、データを収集する。
| 試薬または抗体 | 共役 | 在庫濃度 (ミリグラム/ミリリットル) | 希釈係数 | 細胞懸濁液中の最終濃度(μg/mL) | クローン |
| CD71 | PE/Cy7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| TER-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | TER-119 |
| CD55 (DAF) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | リコ-3 |
| CD105 | ペ | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (スラム) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | ゴーH3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cキット) | APC/Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| リンカクテル | フィット | 0.08(カクテル中の各抗体に対して) | 83 | 1(カクテルに含まれる抗体ごとに) | |
| ウサギ IgG | 10 | 50 | 200 |
表2:抗体マスターミックス成分。 抗体マスターミックスの組成。Ter119チャネルは、同じサンプル上の赤芽球の分析を可能にします(Ter119/CD71アプローチ12を使用)。ただし、このプロトコルには別のTer119チャネルは必須ではなく、Ter119抗体をマスターミックスから除外し、代わりにLin-FITCカクテルの一部として含めることができます。
| 試薬または抗体 | 共役 | 在庫濃度 (ミリグラム/ミリリットル) | クローン |
| Ly-6G および Ly-6C | フィット | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | フィット | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | フィット | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | フィット | 0.5 | RM4-5 |
| CD8a | フィット | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 キー | フィット | 0.5 | BM8 |
表3:リンカクテル成分。 抗体マスターミックスの一部として使用したLinカクテルの組成(マスターミックスの詳細を 表2に参照)。
| 試薬または抗体 | 共役 | 在庫濃度 (ミリグラム/ミリリットル) | 希釈係数 | 細胞懸濁液中の最終濃度(μg/mL) | クローン |
| Ly-6G および Ly-6C | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | RM4-5 |
| CD8a | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 キー | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| TER-119 | ビオチン | 0.5 | 200 | 2.5 | TER-119 |
| 正常ラット血清 | 50 |
表4:磁気ビーズ濃縮のための抗体。 抗体は、細胞選別の前にBMまたは脾臓のいずれかのLin− 画分を富化するために用いられる。
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Discussion
BFU-eおよびCFU-eの前駆細胞を高純度で新鮮な組織から直接前向きに単離する能力は、以前は研究者にとって避けられていませんでした。scRNAseqおよび細胞運命アッセイ1,27を使用して検証された私たちの新しいアプローチは、これを行うためのツールを提供します。
ソートプロトコルと分析プロトコルの両方を正常に実行するための重要なポイントがいくつかあります。まず、低密度セルの損失を防ぐために、セルを900 x g で回転させる必要があります。CFU-e段階の多くの細胞は、そうでなければ失われる可能性のある大きくて低密度の細胞です。第二に、細胞凝集体を破壊し、壊れやすいP1およびP2細胞の損失を防ぐために、上下にピペッティングするときに大きなオリフィスチップを使用する必要があります。多くのCFU-e前駆細胞は赤芽球性島マクロファージ(EBI)と関連しており、正常に解離しないと失われるため、このステップは重要です。第三に、細胞は染色前にEDTA含有バッファー(「SB5」)とともにインキュベートされ、EBIの解離に役立ちます。第4に、フローサイトメトリーデータの取得中、取得速度は7,000イベント/秒または使用しているフローサイトメーター機器の推奨速度を超えてはなりません。
P1およびP2集団には、それぞれ骨髄のCFU-eおよびBFU-e前駆細胞がすべて含まれており、他の前駆細胞タイプは含まれていません1。P1集団はさらに、CD711の発現に基づいて初期CFU-e(P1-low)および後期CFU-e(P1-hi)に分けられる。これらの高純度フローサイトメトリー集団は、 in vivoでのBFU-eおよびCFU-e前駆細胞集団の全体像を提供します。
1つの欠点は、P2集団に初期のCFU-e前駆細胞のごく一部が含まれていることです。ただし、BMのすべてのBFU-e細胞が含まれており、他の細胞タイプは含まれていません。P1集団には、P2に存在するごく一部を除いて、BMのすべてのCFU-eが含まれています。P1およびP2集団とは異なり、P3〜P5は非常に濃縮されていますが、純粋な祖先集団ではありません。
このフローサイトメトリーツールを赤血球生成のマウスモデルに適用することで、赤血球生成に対する生理学的および病理学的摂動中の細胞および分子応答の決定が可能になります。示された例では、マウスにホルモンEpoを注射した。このアプローチは、遺伝子改変マウス、例えばヘモグロビン症のマウスモデルにおいて、 インビボでの変化した赤血球前駆細胞のより正確な分子分析のために使用され得る。
データの可用性:
図 4 および 図5 の実験に関連する追加データは、リクエストに応じて入手できます。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
この作業は、NIH助成金R01DK130498、R01DK120639、およびR01HL141402によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
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