Summary
여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.
Abstract
초기 적혈구 전구 세포는 원래 시험관 내에서 콜로니 형성 잠재력에 의해 정의되었으며 BFU-e 및 CFU-e로 알려진 파열 형성 및 집락 형성 "단위"로 분류되었습니다. 최근까지, 새로 분리된 성인 마우스 골수로부터 순수한 BFU-e 및 CFU-e 전구세포를 직접 전향적이고 완전히 분리하는 방법은 이용 가능하지 않았다. 이러한 격차를 해소하기 위해 마우스 골수의 단일 세포 RNA-seq (scRNAseq) 데이터 세트를 분석하여 세포 표면 마커를 암호화하는 유전자의 발현을 분석했습니다. 이 분석은 세포 운명 분석과 결합되어 마우스 골수 또는 비장에서 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 완전하고 순수한 하위 집합을 식별하고 분리할 수 있는 새로운 유세포 분석 접근법을 개발할 수 있었습니다. 이 접근법은 또한 호염기구/비만 세포 및 거핵구 전위에 대해 풍부한 하위세트를 포함하는 다른 전구 하위세트를 식별한다. 이 방법은 신선한 골수 또는 비장 세포를 Kit 및 CD55로 향하는 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 이 두 마커를 모두 발현하는 전구 세포는 5 개의 주요 집단으로 세분됩니다. 집단 1(P1 또는 CFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)은 모든 CFU-e 전구 세포를 포함하며, 각각 초기 및 후기 CFU-e에 해당하는 P1-low(CD71med CD150 high) 및 P1-hi(CD71 high CD150low)로 더 세분화될 수 있다. 인구 2 (P2 또는 BFU-e, 키트 + CD55 + CD49f med / 낮은 CD105 med / 높은 CD71 낮은 CD150높음)는 모든 BFU-e 전구 세포를 포함합니다. 집단 P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f 중간/높은 CD105 중간/낮은 CD150낮은 CD41낮음)은 호염기구/비만 세포 전구체에 대해 풍부합니다. 인구 4 (P4, Kit + CD55 + CD49f 중간 / 높은 CD105중간 / 낮은 CD150높은 CD41 +)는 거대 핵 세포 전구 세포에 대해 풍부합니다. 및 인구 5(P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-)에는 적혈구, 호염기구/비만 세포 및 거대핵구 전위(EBMP) 및 적혈구/거핵세포/호염기구 편향 다중 전위 전구체(MPP)가 있는 전구체가 포함됩니다. 이 새로운 접근 방식은 적혈구 및 기타 조혈 전구 세포를 분석할 때 더 높은 정밀도를 허용하고 유세포 측정적으로 정의된 각 집단에 대한 전사체 정보를 참조할 수도 있습니다.
Introduction
적혈구 생성은 초기 적혈구 생성과 적혈구 말단 분화의 두 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다(그림 1)1,2,3. 초기 적혈구 생성에서 조혈 줄기 세포는 적혈구 계통에 전념하고 초기 적혈구 전구 세포를 생성하며, 이는 반고체 배지에서 집락 형성 잠재력을 기반으로 1970 년대에 처음 확인되었습니다 4,5,6,7,8,9 . 대체로 적혈구 전구 세포는 두 가지 범주로 나뉩니다 : 각각 "파열 형성 단위 적혈구"또는 BFU-e 4,5,6으로 명명 된 "파열"(더 작은 적혈구 세포 클러스터의 큰 집합체)을 일으키는 초기 전구 세포; 그리고 그들의 자손은 각각 "콜로니 형성 단위 적혈구" 또는 CFU-e 7,8,9로 명명된 하나의 작은 적혈구 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성합니다. BFU-e 및 CFU-e는 아직 말단 적혈구 유전자를 발현하지 않으며 형태 학적으로 인식 할 수 없습니다. 다수의 자가 갱신 또는 확장 세포 분열 후, CFU-e는 글로빈과 같은 적혈구 유전자가 유도되는 전사 전환을 거쳐 적혈구 말단 분화(ETD)1,10로 전환됩니다. ETD 동안, 적혈구 세포는 적혈구로 성숙하는 망상 적혈구를 형성하기 전에 3-5 개의 성숙한 세포 분열을 거칩니다.
말단 분화 중 적혈구 세포는 원래 형태에 따라 전 적혈구 모세포, 호 염기성, 다색 성 및 직교 색성으로 분류되었습니다. 유세포분석법의 출현으로 세포 크기(순방향 산란, FSC로 측정)와 두 개의 세포 표면 마커인 CD71 및 Ter11911,12,13을 기반으로 전향적 분류 및 분리가 가능해졌습니다(그림 1). 이것과 유사한 유세포분석접근법(14)은 ETD의 분자 및 세포 측면의 조사에 혁명을 일으켜, 생체내 및 시험관내 10,15,16,17,18,19,20의 발달 단계 특이적 분석을 가능하게 한다. CD71/Ter119 접근법은 이제 적혈구 전구체 분석에 일상적으로 사용됩니다.
최근까지 마우스 조직에서 CFU-e 및 BFU-e의 직접적이고 고순도 전향적 분리를 위한 유사하고 접근 가능한 유세포측정 접근 방식은 연구자를 피했습니다. 대신에, 연구자들은 종종 동일한 유세포측정 서브세트21 내에서 공동-정제되는 비-적혈구 세포의 존재 하에서, 이들 전구세포의 일부만을 단리하는 유동 세포측정 전략을 사용하였다. 결과적으로, BFU-e 및 CFU-e의 조사는 초기 골수 전구 세포로부터 BFU-e 및 CFU-e를 유도하고 증폭하는 시험관 내 분화 시스템으로 제한되었다. 이어서, 이들 적혈구 전구세포-농축 배양물(22,23)에서 CFU-e와 BFU-e를 구별하는 유세포측정 전략을 적용하는 것이 가능하다. 대안적인 접근법은 태아 CFU-e 및 BFU-e를 사용하는데, 이는 임신 중기10,24,25에서 마우스 태아 간의 Ter119- 음성 분획에서 고도로 풍부합니다. 그러나 이러한 접근법 중 어느 것도 생체 내 생리적 상태에서 성인 BFU-e 및 CFU-e를 조사 할 수 없습니다. 도전의 규모는 콜로니 형성 분석에 기초하여, 이들 세포가 각각 단지 0.025% 및 0.3%의 빈도로 성인 골수에 존재한다는 것을 상기할 때 이해될 수있다6.
여기에 설명된 프로토콜은 새로 수확한 Kit+ 마우스 골수 세포의 단일 세포 전사체 분석을 기반으로 하는 새로운 유세포 분석 접근 방식입니다(키트는 골수의 모든 초기 전구 집단에서 발현됨)1. 우리의 접근법에는 Pronk et al.21,26에 의해 이미 사용되었던 일부 세포 표면 마커가 포함되어 있습니다. 단일 세포 전사체는 적혈구 및 기타 초기 조혈 전구 세포를 식별하는 세포 표면 마커의 조합을 결정하는 데 사용되었습니다 (그림 2). 특히, 계통 음성(Lin-) Kit+ 세포의 CD55+ 분획은 5개의 집단으로 세분될 수 있으며, 그 중 3개는 적혈구 궤적의 연속 세그먼트를 생성합니다(그림 2). 이들 집단 각각의 전사체 정체성은 정렬한 다음, scRNAseq 및 정렬된 단일 세포 전사체를 원래의 전사체 맵에 다시 투영하여 확인하였다(5개 집단 각각의 유전자 발현 및 전체 골수 데이터 세트는 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 에서 탐색할 수 있음)1 . 각 집단의 세포 운명 잠재력은 전통적인 콜로니 형성 분석(그림 2)과 새로운 고처리량 단일 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 확인되었습니다. 이러한 분석은 새로운 유세포 분석 접근법이 신선한 성인 골수 및 비장의 모든 BFU-e 및 CFU-e 전구 세포의 고순도 분리를 초래한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 집단 1(P1)은 CFU-e만 포함하고 다른 조혈 전구 세포는 포함하지 않으며, 집단 2(P2)는 골수의 모든 BFU-e 전구 세포와 소수의 CFU-e를 포함하지만 다른 선조1는 포함하지않는다. 아래의 상세한 프로토콜은 식염수 또는 적혈구 생성 자극 호르몬 인 에리스로포이에틴 (Epo)을 주사 한 마우스에서의 예제 실험으로 더 설명됩니다.
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Protocol
모든 실험은 동물 프로토콜 A-1586에 따라 수행되었으며 매사추세츠 대학 찬 의과 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 202200017.
참고: 여기에는 두 가지 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다: 첫째, 유세포 분석 분석(섹션 1), 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정(섹션 2). 아래 프로토콜은 10개 채널이 있는 유세포분석기/분류기를 사용합니다. 예제 설정은 단계 1.14.5에서 참조된 표 1에 제공됩니다. 이 프로토콜을 9개의 채널로만 실행할 수도 있습니다. 표 2의 범례를 참조하십시오.
1. 유세포 분석
- 성체(>6주령) Balb/C 또는 C57BL6 마우스를 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 적절한 방법(예: CO2 흡입 후 자궁 경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다. 유세포 분석을 위해서는 단일 마우스의 골수 (BM)로 충분합니다. 정렬의 경우, 마우스의 수는 다운스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 각 집단에 대한 세포 수율은 다음과 같습니다 (단계 2.3.3).
- 조직 수확 :
- 얼음에 3mL의 냉(4°C) 염색 완충액("SB5": 인산염 완충 식염수(PBS), 0.2% 소 혈청 알부민(BSA), 0.08% 포도당, 5mM EDTA)이 포함된 5mL 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브를 준비합니다. 이것을 사용하여 수확 된 조직을 배치하십시오.
- 각 마우스에서 해부 된 각 조직에 대해 별도의 튜브를 준비하십시오. 여러 마우스의 조직을 풀링하지 마십시오.
- 대퇴골과 양쪽 경골을 모두 수확하십시오. SB5로 튜브에 넣기 전에 뼈에서 모든 근육을 제거하십시오.
- 복부 왼쪽의 절개를 통해 비장을 해부하십시오.
- 골수 세포 추출:
- 갓 해부된 대퇴골과 경골을 차가운 염색 완충액(SB5)에 직접 넣고 골수(BM)를 추출할 준비가 될 때까지 튜브를 얼음 위에 두십시오. 양동이의 얼음 위에 깨끗한 멸균 모르타르를 놓습니다. 튜브에서 SB5와 함께 뼈를 박격포로 옮깁니다.
- 해부 가위로 각 뼈 끝의 약 1mm를 잘라내어 뼈의 구멍이 보이도록합니다.
- 26G 바늘과 SB3로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 뼈에서 씻어내어 절구에 모으십시오. 뼈가 무색으로 보일 때까지 매번 신선한 완충액을 사용하여 3-5 회 반복하십시오.
- 플러시된 골수를 100μm 메쉬 필터를 통해 여과하고 얼음 위에 놓인 50mL 원심분리 튜브에 세포를 수집합니다.
- 절구와 유봉을 사용하여 5-10mL의 SB5에서 플러시 된 뼈를 분쇄하십시오. 분쇄된 뼈 및 완충액의 혼합물을 100 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하고 단계 1.3.4에서 수집된 세포와 함께 풀링한다.
- 비장 세포 추출:
- 얼음 위에 놓인 빈 50mL 원심분리 튜브에 100μm 메쉬 필터를 설치합니다. 메쉬 필터에 단일 비장을 놓습니다.
- 0.5-1mL의 SB5를 비장에 추가하여 건조되지 않도록 합니다.
- 3mL 또는 5mL 주사기 플런저의 고무면을 사용하여 비장을 메쉬에 으깨십시오. 한 번에 5mL씩 SB5를 더 추가하고 모든 세포가 튜브에 수집될 때까지 계속 으깨십시오.
- 이 시점부터 골수와 비장 세포는 같은 방식으로 치료됩니다.
- 세포를 900 x g, 4 °C에서 10분 동안 스핀다운합니다. 진공 흡인 설정을 사용하여 상청액을 흡인합니다.
- 단일 세포 현탁액을 만들려면 세포를 2mL의 SB5에 재현탁하고 큰 오리피스 팁이 있는 P1000을 사용하여 50회 위아래로 피펫합니다( 재료 표 참조). 여기에는 깨지기 쉬운 세포의 손상을 방지하는 데 도움이 되는 넓은 팁 구멍이 있습니다.
- 세포를 세려면 위아래로 20회 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포를 SB5에서 1:100의 비율로 희석합니다. 희석된 세포 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합하고 혈구계 및/또는 세포 카운터를 사용합니다.
- 세포를 900 x g, 4 °C에서 10분 동안 스핀다운합니다. 상청액을 흡인하고 SB5에서 33 x 106 라이브 셀/mL로 세포를 재현탁합니다.
- 표 3의 각 항체를 동일한 부피로 혼합하여 Lin-FITC 칵테일을 제조한다.
- 단색 컨트롤 및 "형광 빼기 1"(FMO) 컨트롤을 위해 셀을 준비합니다. 단계 1.11-1.12를 단계 1.14(유세포 분석용 샘플) 및/또는 단계 2.1(유세포 분석 분류)에서 샘플 세포의 준비 및 염색과 병행하여 수행합니다.
- 50 μL (1.6 x 106 세포)의 세포 현탁액을 얼음 위의 FACS 튜브로 옮겨 염색되지 않은 세포 대조군을 위해 세포를 준비합니다. 세포 현탁액 50 μL (1.6 x 106 세포)를 얼음 위의 FACS 튜브로 옮겨 각 단색 대조군 (11 튜브)에 대한 세포를 준비합니다.
- 300μL(10 x 106 세포)의 세포 현탁액을 얼음 위의 별도의 FACS 튜브로 옮겨 다음 색상(키트, CD41, CD150, CD49f[4개의 튜브])에 대한 FMO 대조군을 준비합니다.
- 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.
- FMO 및 단색 대조군의 항체 염색
- FACS 튜브에서 FMO를 33 x 106 cells/mL(총 부피 300μL)로 염색합니다. 각 대조군에 대해 FMO의 이름을 딴 항체를 제외한 모든 항체를 추가합니다. 예를 들어, 키트 FMO의 경우 키트 항체를 생략합니다. 각 항체에 대해, 표 2와 같이 희석 및 최종 농도를 사용한다.
- FACS 튜브에서 20 x 106 cells/mL(총 부피 50μL)에서 단색 대조군을 염색합니다. 각각의 대조군에 대해, 표 2에 열거된 농도의 단일 항체를 첨가한다.
- 각 컨트롤 튜브를 3,000rpm(분당 회전수)에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들립니다. 내용물이 캡에 닿지 않도록 튜브의 길이와 평행한 회전축으로 수평에서 약 10°에서 60° 각도 사이로 튜브를 흔듭니다.
- 세포를 SB5로 세척: SB5로 세포 현탁액의 부피를 4 mL로 구성한다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고, 상청액을 흡인한다.
- 세포 재현탁:
- 얼룩이 없는 모든 단색 컨트롤(DAPI 컨트롤 제외)을 300μL의 SB5에 다시 현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.
- SB5에서 1:10,000에서 DAPI 스톡(100% 에탄올 중 1mg/mL)을 희석하여 DAPI/SB5 용액을 만듭니다.
- FMO를 1.8mL의 DAPI/SB5에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 FACS 튜브로 필터링합니다.
- 300μL의 DAPI/SB5에 DAPI 단색 컨트롤을 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 4mL FACS 튜브로 필터링합니다.
- 샘플 준비: 세포가 유세포 분석을 위해 준비되는 경우 1.14단계로 이동합니다. 정렬을 위해 셀을 준비하는 경우 2.1단계로 건너뜁니다.
- FACS 튜브에서 총 부피 300μL(10 x 10 6 세포)의 33 x 106 cell/mL에서 유세포 분석 샘플을 염색합니다.
- 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플 수로 마스터 믹스의 부피를 결정하고 샘플당 300 μL를 사용합니다. 표시된 희석액에서 표 2 에 나열된 모든 항체를 SB5로 희석하여 마스터 믹스를 만든다. 마스터 믹스의 토끼 IgG는 Fc 블록 역할을합니다.
- 각 튜브를 3,000rpm에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들어줍니다.
- 세포를 SB5로 세척: SB5로 세포 현탁액의 부피를 4 mL로 구성한다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고, 상청액을 흡인한다.
- 유세포 분석을 위해 샘플을 1.12.5.2단계에서 준비한 대로 DAPI/SB5 1.8mL에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 FACS 튜브로 여과합니다.
- 표 2의 항체 접합체 및 생존율 염료 DAPI를 수용하기 위해 10개의 채널을 갖는 세포분석기 상에서 샘플을 분석한다. 채널 설정의 예는 표 1에 나와 있습니다. 9 개의 채널 만 사용할 수도 있습니다. 표 2 범례를 참조하십시오.
- 유세포 분석 데이터를 분석하는 동안 2.4 단계에 설명 된대로 단색 제어 및 FMO 제어를 사용하여 표준 스펙트럼 보상 접근법을 사용하십시오.
2. 유세포 분석 분류를 위한 프로토콜 조정
- 린의 제조
- 10마리의 마우스에서 동일한 조직(BM 또는 비장)에서 추출한 모든 세포를 50mL 튜브에 모읍니다. 큰 오리피스 팁이 있는 P1000을 사용하여 피펫팅하여 풀링된 각 샘플을 재현탁합니다.
- 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인한다.
- 농축되지 않은 세포를 사용하여 섹션 1에 설명된 대로 단색 및 FMO 컨트롤을 준비합니다.
- Lin- 세포의 자기 비드 농축을 사용하여 분류하기 위한 Lin- 세포 농축:
- 세포를 SB5로 1 x 108 cells/mL로 재현탁하고 15mL 튜브로 옮깁니다. 정상 래트 혈청 및 표 4 에 열거된 비오티닐화 항체를 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 흔들면서 인큐베이션한다.
- 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 차가운 SB5 15mL에 세포를 재현탁시킵니다.
- 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. 차가운 SB5에 세포를 1 x 108 cells/mL로 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오.
- 자성 나노 비드를 3,000rpm에서 5-10 초 동안 소용돌이시킵니다. 세포 10mL당 자성 나노비드 1mL를 섭취합니다.
- 5mL FACS 튜브에서 나노비드를 세척합니다. 부피를 SB5로 4mL로 구성하고, 900 x g, 4°C에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 흡인한다.
- 나노비드를 500μL의 SB5에 재현탁하고 단계 2.1.7에서 제조된 세포와 혼합합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 흔들면서 배양합니다.
- 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상청액을 흡인합니다. SB5를 사용하여 세포를 1 x 108 cells/mL로 재현탁합니다.
- 튜브를 4°C의 자석에 5분 동안 놓습니다.
- 상청액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 붓습니다.
- 단계 2.1.13의 상청액이 들어 있는 튜브를 4°C의 자석 위에 5분 동안 놓습니다. 상청액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 붓습니다.
- 단계 2.1.14의 상청액으로부터 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀시키고, 상청액을 흡인한다.
- Lin-농축된 세포를 1mL의 SB5에 재현탁시킵니다.
- 세포의 10 μL를 SB5에서 1:100으로 희석합니다. 희석된 세포 10μL를 트리판 블루 10μL와 혼합하고 혈구계 및/또는 세포 카운터를 사용합니다.
- 2.1.17단계의 세포 수에 기초하여, Lin-농축된 세포를 33 x 106 cells/mL에서 재현탁시킨다.
- 농축 된 세포의 염색 :
- 표 2에 나열된 모든 항체를 추가하여 FACS 튜브에서 33 x 106 cells/mL로 농축된 세포 샘플을 염색합니다. 각 튜브를 3,000rpm에서 2-3초 동안 소용돌이한 다음 4°C에서 배양하여 빛으로부터 보호되는 어둠 속에서 2.5시간 동안 흔들어줍니다.
- SB5로 세포 세척: SB5로 FACS 튜브의 부피를 4mL로 구성합니다. 세포를 900 x g, 4°C에서 10분 동안 스핀다운하고 상층액을 제거합니다.
- 유세포 분석을 위해 샘플을 4단계 6단계에서 준비한 대로 DAPI/SB5-1.12.5.2에 재현탁하고 40μm 필터 메쉬를 통해 새 4mL FACS 튜브로 여과합니다.
- 샘플 정렬:
- CFU-e 셀은 고압에서 쉽게 손상되므로 CFU-e 수율을 최대화하기 위해 큰 노즐과 저압으로 샘플을 분류하십시오. 이 연구에 사용된 유세포분석기의 경우 14psi 및 100μm 노즐 또는 12μm 노즐이 있는 130psi를 사용합니다. 아래 2.4단계에 설명된 대로 분류 게이트를 설정합니다.
- 수집 버퍼 준비: PBS에 20% 소 태아 혈청을 추가합니다.
- 정렬된 모집단의 순도를 확인하려면 1.12.5.2단계에 설명된 대로 DAPI가 포함된 버퍼에서 정렬된 각 모집단의 작은 부분 표본을 다시 실행합니다.
참고: 전형적으로, 총 10마리의 마우스(대략 1 x 109 세포)로부터의 BM은 대략 70%의 생존율을 갖는 P1-hi, P1-low 및 P2 집단 각각에 대해 적어도 50,000-100,000개의 세포를 산출한다.
- 그림 3에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 분류 게이트를 분석하거나 설정합니다.
- 전방 산란(FSC) 매개변수를 사용하여 크기에 따라 파편을 제거합니다. FSC 높이 대 FSC 영역 히스토그램을 사용하여 세포 응집체를 제외하고 단일 세포를 선택합니다. 측면 산란(SSC) 높이 대 SSC 영역 히스토그램으로 반복합니다.
- 생존 가능한 세포가 불투과성인 DNA 염료 DAPI에 양성인 세포를 게이팅하여 죽은 세포를 배제합니다.
- Lin-Ter119-Kit+ 세포를 선택하고 이들 중에서 CD55를 발현하는 아집단을 선택합니다.
- Lin-Ter119-Kit+CD55+ 세포를 CD49f 및 CD105의 발현에 따라 두 개의 주요 집단인 P6 및 P7로 세분화합니다.
- CD150 및 CD41의 발현에 따라 P6을 P3 (호염기구 또는 비만 세포 전구 세포), P4 (거대 핵 세포 전구 세포) 및 P5 (EBMP 및 적혈구 편향 MPP)로 더 세분화합니다.
- CD150 및 CD71의 발현에 기초하여, P7을 P2 (BFU-e), 초기 CFU-e (P1-low) 및 후기 CFU-e (P1-hi)로 더 세분화한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 새로 수확한 골수 및 비장 세포에서 BFU-es 및 CFU-es를 식별하기 위한 유세포 분석 접근 방식을 설명합니다. 생쥐에서 신선한 BM과 비장을 채취하고 즉시 조직을 얼음 위에 놓는 것으로 시작합니다. 모든 절차는 세포 생존력을 보존하기 위해 추위에서 수행됩니다. 세포는 분화된 혈통의 마커를 발현하는 모든 세포의 배제를 허용하는 "계통" 항체 칵테일로 표지된다 (유동 세포측정 분석의 경우 FITC-린 칵테일, 표 3; 또는 계통 음성 세포의 경우 자기 비드 농축, 표 4). 세포는 또한 혈통 음성 세포 분획 내에서 다수의 초기 전구 집단을 구별할 수 있게 하는 마커에 대한 항체로 표지됩니다. 라벨링 후에는 유세포 분석 분류 또는 분석이 수행됩니다. 유세포분석 분류에 대한 접근 방식은 유세포분석 분석과 유사하지만 많은 수의 세포를 분류하는 시간과 비용을 줄이기 위해 Lin- 세포 분획에 대한 자기 비드 농축이 선행됩니다. 전구 세포를 분류 할 때, BM은 여러 마우스로부터 풀링되며, 그 수는 다운 스트림 애플리케이션에 따라 다릅니다. 전형적으로, 총 10마리의 마우스(대략 1 x 109 세포)로부터의 BM은 대략 70%의 생존율을 갖는 P1-hi, P1-low 및 P2 집단 각각에 대해 적어도 50,000-100,000개의 세포를 산출한다.
이 프로토콜에 의해 확인 된 비장 및 BM 유래 집단의 주요 차이점은 비장 유래 세포에서 P6 집단과 그 하위 집단 인 P4 / P5 / P3의 빈도가 훨씬 낮다는 것입니다.
유세포 분석의 예로서, 마우스에서 Epo 투여의 효과를 조사하였다. Epo는 저산소증과 같은 스트레스 조건에서 기저 및 가속 적혈구 생성에 필수적인 Epo 수용체(EpoR)에 결합하고 활성화합니다. 저산소증은 혈중 Epo 수치 28,18의 증가를 자극하여 CFU-e 1,29 및 적혈구 전구체의 확장을 촉진합니다.
Epo (0.25 U/g 체중) 또는 동일한 부피의 비히클 (식염수)을 3일 동안 24h마다 한 번씩 마우스에 피하 주사하였다. BM 및 비장은 72 h에서 수확되었다. Epo 자극은 BM과 비장 모두에서 초기 및 후기 CFU-e 개체군(P1-low 및 P1-hi)의 확장을 가져왔습니다(그림 4 및 그림 5).
그림 1: 최종 적혈구 생성의 두 가지 주요 단계. 적혈구 생성은 전구 세포가 집락 형성 잠재력에 따라 정의되는 초기 단계와 적혈구 말단 분화 (ETD)로 알려진 후기 단계로 나눌 수 있으며, 여기서 적혈구 세포 단계는 형태에 따라 정의됩니다. 유세포 분석 기술은 FSC, Ter119 및 CD71을 사용하여 발달 특이적인 적혈구 세포 단계의 전향적 분리를 허용했습니다. 대조적으로, BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 조직으로부터 직접 분리하는 동등한 방법은 없었다. BFU-e 콜로니의 일부만 표시됩니다. 축척 막대는 CFU-e 및 BFU-e 콜로니 모두에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: CFU-e 및 BFU-e를 조직에서 직접 분리하기 위한 새로운 유세포 분석 전략. 이 원고는 scRNAseq 데이터의 분석을 기반으로 P1에서 P5까지의 5개의 새로운 유세포 분석 집단을 식별하기 위한 프로토콜을 설명합니다. (A) 신선한 Balb/C 성체 골수 단일 세포 전사체의 강제 유도 그래프 투영("스프링 플롯"). 색상은 전사체 정보와 개체군 균형 분석(PBA) 알고리즘1을 기반으로 예측된 세포 운명 잠재력을 나타냅니다. 각각의 유세포 분석 집단 P1 내지 P5에 대응하는 플롯의 영역이 표시됩니다. 묘사 된 영역은 Tusi et al.1에서 찾을 수있는 원본 데이터의 손으로 그린 근사치입니다. 상기 대응은 분류된 P1 내지 P5 집단1의 scRNAseq를 수행함으로써 확인되었다. E = 적혈구; Ba=호염기성 또는 비만세포 전구체; 메그 = 거대핵 구성 전구 세포; Ly = 림프구 전구 세포; D = 수지상 전구 세포; M = 단핵구 전구 세포; G = 과립구 전구 세포. (B) Tusi et al.1에서 재구성한 집락 형성 분석. P1 내지 P5 집단 및 CD55+ 세포를 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 분류하고, 각각의 집단을 관련 콜로니 형성 분석을 위해 도말하였다. 적혈구 콜로니는 표시된 날에 점수가 매겨졌습니다. UF = 단일 초점; MF = 다중 초점; CFU-MK = 집락 형성 단위 거대 핵구; CFU-GM = 집락 형성 단위 과립구 / 단핵구; CFU-GEMM = 집락 형성 단위 과립구, 적혈구, 단핵구, 거대 핵 세포. (C) 5 개의 집단 각각과 세포 운명 잠재력을 정의하는 세포 표면 마커. 세포 운명 잠재력은 전사체 정보와 세포 운명 분석, 콜로니 형성 및 단일 세포 운명 분석의 결과입니다 1,27. 참고로, P1 집단은 CD71 마커의 발현에 기초하여 P1-hi 및 P1-low1로 분할되었다. Tusi et al.1의 데이터를 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유세포분석 게이팅 전략. 인구 P1에서 P5에 대한 완전한 게이팅 전략. 100 μL의 0.9 % 멸균 식염수를 피하 주사 한 Balb / C 마우스에서 갓 수확 한 골수 (BM) 또는 비장 (SP)을 먼저 주요 집단에 대해 게이트하여 파편을 버립니다. 그런 다음 단일항을 선택하고, 죽은 세포를 버리고, Ter119 음성, 계통 음성 및 발현 키트인 세포에 게이팅합니다. Ter119-Lin-Kit+CD55+를 P6 및 P7로 추가로 세분화한 후 P1에서 P5 개체군으로 최종 세분화합니다(그림 2 참조). Ter119 채널은 동일한 샘플에서 적혈구 세포를 분석 할 수있게합니다 (Ter119 / CD71 접근법12 사용). 그러나 별도의 Ter119 채널은 이 프로토콜에 필수적인 것은 아니며 Ter119 항체는 마스터 믹스에서 생략되고 대신 Lin-FITC 칵테일의 일부로 포함될 수 있습니다. Ter119 양성 세포에 대한 배제 단계는 이 게이팅 전략에 표시되지 않습니다. 숫자는 표시된 히스토그램 내에서 각 게이트의 백분율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Epo 자극 후 골수 및 비장 초기 적혈구 전구 세포 분석. 새로 수확한 골수(BM) 또는 비장(SP)의 대표적인 유세포 분석 플롯. Balb/C 마우스를 0.25 U/g 체중의 Epo 또는 동등한 부피의 식염수로 피하 주사하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 생체 내 Epo에 대한 BM 및 비장 전구 세포의 반응. 새로 수확 된 (A) 골수 및 (B) 비장 세포에서 Epo 주사 후 집단 P1에서 P5까지의 절대 세포 수의 변화를 보여주는 요약 통계; *p = 0.02. 도 4에 설명된 바와 같이 실험한다. n = 각 그룹의 마우스 4 마리. 절대 세포 수를 계산하기 위해 BM 또는 비장의 각 집단에서 세포의 빈도 ( 그림 4)에 각 마우스에서 수확 한 BM 또는 비장 세포의 총 수를 곱하고 마우스 무게 (그램)로 나눕니다. 참고로, BM의 초기 CFU-e만이 통계적 유의성(p =0.02)에 도달했으며, 이는 상대적으로 낮은 Epo 용량과 각 그룹의 적은 수의 마우스의 조합일 가능성이 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 검출기 어레이 | 증권 시세 표시기 | 이색성 거울 | 대역통과 필터 | 형광단 검출 |
| 블루 레이저 (488 nm) | A | 685LP | 695/40 | |
| B | 505LP | 530/30 | 린-핏 (+터119-피트) | |
| C | 488/10 | |||
| 바이올렛 레이저 (405 nm) | A | 760LP | 800/80 | |
| B | 630LP | 660/20 | CD150-BV650 | |
| C | 595LP | 605/20 | CD41-BV605 | |
| D | 475LP | 525/20 | ||
| E | 450/50 | CD49f-BV421 | ||
| 적색 레이저 (640 nm) | A | 755LP | 785/50 | cKit-APC-Cy7 |
| B | 700 LP | 720/30 | ||
| C | 675/14 | CD55-AF 647 | ||
| 자외선 레이저 (355 nm) | A | 505LP | 525/20 | |
| B | 420LP | 450/50 | 아빠 | |
| C | 379/28 | Ter119-BUV 395 | ||
| YG 레이저 (561 nm) | A | 755LP | 780/60 | CD71-PE-Cy7 |
| B | 685LP | 710/50 | ||
| C | 635LP | 660/20 | ||
| D | 600LP | 610/20 | ||
| E | 570LP | 580/20 | CD105-PE |
표 1: LSRII 세포분석기의 채널 레이아웃 예. 데이터를 수집하기 위해 LSRII 유동 세포분석기에서 기재된 프로토콜 및 이들의 배열에 사용된 항체의 패널.
| 시약 또는 항체 | 활용하다 | 스톡 컨 시트 (밀리그램 / 밀리리터) | 희석 계수 | 세포 현탁액의 최종 컨큐어(μg/mL) | 클론 |
| CD71 | 체육/사이7 | 0.2 | 2000 | 0.1 | RI7217 |
| 테르-119 | BUV395 | 0.2 | 100 | 2 | 테르-119 |
| CD55 (다프) | AF647 | 0.5 | 50 | 10 | 리코-3 |
| CD105 | 체육 | 0.2 | 50 | 4 | MJ7/18 |
| CD150 (슬램) | BV650 | 0.1 | 50 | 2 | TC15-12F12.2 |
| CD49f | BV421 | 0.025 | 50 | 0.5 | 고H3 |
| CD41 | BV605 | 0.2 | 100 | 2 | MWReg30 |
| CD117 (cKit) | APC / Cy7 | 0.2 | 200 | 1 | 2B8 |
| 린 칵테일 | 증권 시세 표시기 | 0.08 (칵테일의 각 항체에 대해) | 83 | 1 (칵테일의 각 항체에 대해) | |
| 토끼 IgG | 10 | 50 | 200 |
표 2: 항체 마스터믹스 성분. 항체 마스터 믹스의 조성물. Ter119 채널은 동일한 샘플에서 적혈구 세포를 분석 할 수있게합니다 (Ter119 / CD71 접근법12 사용). 그러나 별도의 Ter119 채널은 이 프로토콜에 필수적인 것은 아니며 Ter119 항체는 마스터 믹스에서 생략되고 대신 Lin-FITC 칵테일의 일부로 포함될 수 있습니다.
| 시약 또는 항체 | 활용하다 | 스톡 컨 시트 (밀리그램 / 밀리리터) | 클론 |
| Ly-6G 및 Ly-6C | 증권 시세 표시기 | 0.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | 증권 시세 표시기 | 0.5 | M1/70 |
| CD19 | 증권 시세 표시기 | 0.5 | 1D3 |
| CD4 | 증권 시세 표시기 | 0.5 | 4-5링깃 |
| CD8a | 증권 시세 표시기 | 0.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | 증권 시세 표시기 | 0.5 | BM8 |
표 3: Lin 칵테일 구성 요소. 항체 마스터 믹스의 일부로서 사용된 린 칵테일의 조성물 ( 표 2의 마스터 믹스의 세부사항 참조).
| 시약 또는 항체 | 활용하다 | 스톡 컨 시트 (밀리그램 / 밀리리터) | 희석 계수 | 세포 현탁액의 최종 컨큐어(μg/mL) | 클론 |
| Ly-6G 및 Ly-6C | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | RB6-8C5 |
| CD11b | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | M1/70 |
| CD19 | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | 1D3 |
| CD4 | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | 4-5링깃 |
| CD8a | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | 53-6.7 |
| F4/80 | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | BM8 |
| 테르-119 | 비오 틴 | 0.5 | 200 | 2.5 | 테르-119 |
| 일반 쥐 혈청 | 50 |
표 4: 마그네틱 비드 농축을 위한 항체. 항체는 세포 분류 전에 BM 또는 비장의 Lin- 분획을 풍부하게 하기 위해 사용된다.
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Discussion
BFU-e 및 CFU-e 전구 세포를 고순도의 신선한 조직에서 직접 전향 적으로 분리 할 수있는 능력은 이전에 연구자를 피했습니다. scRNAseq 및 세포 운명 분석 1,27을 사용하여 검증된 당사의 새로운 접근법은 이제 이를 수행할 수 있는 도구를 제공합니다.
분류 프로토콜과 분석 프로토콜을 모두 성공적으로 실행하기 위한 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫째, 저밀도 셀의 손실을 방지하기 위해 셀을 900 x g 로 회전시켜야 합니다. CFU-e 단계의 많은 세포는 손실될 수 있는 크고 저밀도 세포입니다. 둘째, 위아래로 피펫팅할 때 큰 오리피스 팁을 사용하여 세포 응집체를 파괴하고 깨지기 쉬운 P1 및 P2 세포의 손실을 방지해야 합니다. 이 단계는 많은 CFU-e 전구 세포가 적혈구 모세포 섬 대 식세포 (EBI)와 관련이 있고 성공적으로 해리되지 않으면 손실되기 때문에 중요합니다. 셋째, 세포를 염색 전에 EDTA 함유 완충액("SB5")과 함께 배양하여 EBI를 해리하는 데 도움을 줍니다. 넷째, 유세포 분석 데이터 수집 중에 수집 속도는 7,000 이벤트 / s 또는 사용중인 유세포 분석기 기기의 권장 속도를 초과해서는 안됩니다.
P1 및 P2 집단은 각각 골수에서 모든 CFU-e 및 BFU-e 전구 세포를 포함하며 다른 전구 세포 유형1을 포함하지 않습니다. P1 집단은 CD71111의 발현에 기초하여 초기 CFU-e (P1-low) 및 후기 CFU-e (P1-hi)로 더 나뉩니다. 이러한 고순도 유세포 분석 집단은 생체 내 BFU-e 및 CFU-e 전구 집단의 완전한 그림을 제공합니다.
한 가지 단점은 P2 집단이 초기 CFU-e 전구 세포의 작은 부분을 포함한다는 것입니다. 그러나 BM의 모든 BFU-e 세포는 포함하고 다른 세포 유형은 포함하지 않습니다. P1 모집단은 P2에 존재하는 작은 부분을 제외하고 BM의 모든 CFU-e를 포함합니다. P1 및 P2 개체군과 달리 P3에서 P5는 매우 풍부하지만 순수한 조상 개체군은 아닙니다.
이 유세포 분석 도구를 적혈구 생성의 마우스 모델에 적용하면 이제 적혈구 생성에 대한 생리적 및 병리학 적 섭동 동안 세포 및 분자 반응을 결정할 수 있습니다. 도시된 예에서, 마우스에 호르몬 Epo를 주사하였다. 이 접근법은 유전자 변형 마우스, 예를 들어 혈색소 병증의 마우스 모델에서 생체 내에서 변경된 적혈구 전구 세포의 보다 정확한 분자 분석을 위해 사용될 수 있습니다.
데이터 가용성:
그림 4 및 그림 5 의 실험과 관련된 추가 데이터는 요청 시 제공됩니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 R01DK130498, R01DK120639 및 R01HL141402의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
References
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