Isolatie van gentherapievectoren van de volgende generatie door middel van engineering, barcoding en screening van adeno-geassocieerde virus (AAV) capsid-varianten

Summary

AAV-peptideweergavebibliotheek generatie en daaropvolgende validatie door de barcodering van kandidaten met nieuwe eigenschappen voor het maken van AAV's van de volgende generatie.

Abstract

Genafgiftevectoren afgeleid van Adeno-geassocieerd virus (AAV) zijn een van de meest veelbelovende hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, wat blijkt uit bemoedigende klinische gegevens en de goedkeuring van verschillende AAV-gentherapieën. Twee belangrijke redenen voor het succes van AAV-vectoren zijn (i) de voorafgaande isolatie van verschillende natuurlijk voorkomende virale serotypen met verschillende eigenschappen, en (ii) de daaropvolgende vestiging van krachtige technologieën voor hun moleculaire engineering en herbestemming in hoge doorvoer. Het potentieel van deze technieken wordt verder vergroot door recent geïmplementeerde strategieën voor het barcoderen van geselecteerde AAV-capsiden op DNA- en RNA-niveau, waardoor hun uitgebreide en parallelle in vivo stratificatie in alle belangrijke organen en celtypen in een enkel dier mogelijk wordt. Hier presenteren we een basispijplijn die deze reeks complementaire wegen omvat, met behulp van AAV-peptideweergave om het gevarieerde arsenaal aan beschikbare capsid-engineeringtechnologieën te vertegenwoordigen. Dienovereenkomstig beschrijven we eerst de cruciale stappen voor het genereren van een AAV-peptideweergavebibliotheek voor de in vivo selectie van kandidaten met gewenste eigenschappen, gevolgd door een demonstratie van hoe de meest interessante capside-varianten voor secundaire in vivo screening kunnen worden gebarcodeerd. Vervolgens illustreren we de methodologie voor het maken van bibliotheken voor next-generation sequencing (NGS), inclusief barcodeversterking en adapterligatie, voordat we afsluiten met een overzicht van de meest kritieke stappen tijdens NGS-gegevensanalyse. Omdat de hier gerapporteerde protocollen veelzijdig en aanpasbaar zijn, kunnen onderzoekers ze gemakkelijk gebruiken om de optimale AAV-capside-varianten in hun favoriete ziektemodel en voor gentherapietoepassingen te verrijken.

Introduction

Genoverdrachtstherapie is de introductie van genetisch materiaal in cellen om het cellulaire genetische materiaal te repareren, te vervangen of te veranderen om ziekten te voorkomen, behandelen, genezen of verbeteren. Genoverdracht, zowel in vivo als ex vivo, is afhankelijk van verschillende toedieningssystemen, niet-viraal en viraal. Virussen zijn op natuurlijke wijze geëvolueerd om hun doelcellen efficiënt te transduceren en kunnen worden gebruikt als leveringsvectoren. Onder de verschillende soorten virale vectoren die bij gentherapie worden gebruikt, worden adeno-geassocieerde virussen in toenemende mate gebruikt, vanwege hun gebrek aan pathogeniciteit, veiligheid, lage immunogeniciteit en vooral hun vermogen om langdurige, niet-integrerende expressie te ondersteunen ^1,2,3. AAV-gentherapie heeft het afgelopen decennium aanzienlijke resultaten opgeleverd; drie therapieën zijn goedgekeurd door het Europees Geneesmiddelenbureau en de Amerikaanse Food and Drug Administration voor gebruik bij mensen ^3,4. Verschillende klinische onderzoeken zijn ook aan de gang om een verscheidenheid aan ziekten te behandelen, zoals hemofilie, spier-, hart- en neurologische aandoeningen, zoals elders besproken³. Ondanks tientallen jaren van vooruitgang heeft het gebied van gentherapie de afgelopen jaren een reeks tegenslagen ervaren⁴, vooral sterfgevallen in klinische onderzoeken⁵ die in de wacht zijn gezet vanwege dosisbeperkende toxiciteiten, met name voor weefsels die enorm zijn, zoals spieren, of moeilijk te bereiken, zoals hersenen⁶.

De AAV-vectoren die momenteel in klinische onderzoeken worden gebruikt, behoren tot de natuurlijke serotypen, op enkele uitzonderingen^{na 1}. AAV-engineering biedt de mogelijkheid om vectoren te ontwikkelen met superieure orgaan- of celspecificiteit en efficiëntie. In de afgelopen twee decennia zijn verschillende benaderingen met succes toegepast, zoals peptideweergave, loop-swap, capsid DNA-schuifelen, foutgevoelige PCR en gericht ontwerp, om individuele AAV-varianten of bibliotheken daarvan met verschillende eigenschappen te genereren⁷. Deze worden vervolgens onderworpen aan meerdere rondes van gerichte evolutie om de varianten erin te selecteren met de gewenste eigenschappen, zoals elders besproken ^1,3. Van alle capsid-evolutiestrategieën zijn peptide-display AAV-bibliotheken het meest gebruikt, vanwege enkele unieke eigenschappen: ze zijn relatief eenvoudig te genereren en ze kunnen een hoge diversiteit en high-throughput sequencing bereiken, waardoor ze hun evolutie kunnen volgen.

De eerste succesvolle peptide insertie AAV-bibliotheken werden bijna 20 jaar geleden beschreven. In een van de eerste construeerden Perabo et ^al.8 een bibliotheek van gemodificeerde AAV2-capsiden, waarin een pool van willekeurig gegenereerde oligonucleotiden in een plasmide werd ingebracht op een positie die overeenkomt met aminozuur 587 van het VP1 capside-eiwit, in de drievoudige as die uit de capside steekt. Met behulp van adenovirus co-infectie werd de AAV-bibliotheek ontwikkeld door meerdere selectierondes en de uiteindelijke re-targeted varianten bleken in staat te zijn om cellijnen refractair te transduceren naar de ouderlijke AAV2⁸. Kort daarna introduceerden Müller et ^al.9 het tweestappensysteem voor bibliotheekproductie, een aanzienlijke verbetering van het protocol. Aanvankelijk wordt de plasmidebibliotheek, samen met een adenoviraal helperplasmide, gebruikt om een AAV-bibliotheek te produceren die chimere capsiden bevat. Deze AAV-shuttlebibliotheek wordt gebruikt om cellen met een lage multipliciteit van infectie (MOI) te infecteren, met als doel één viraal genoom per cel te introduceren. Co-infectie met adenovirus zorgt voor de productie van AAV's met een bijpassend genoom en capsid⁹. Ongeveer een decennium later gebruikte Dalkara¹⁰ in vivo gerichte evolutie om de 7m8-variant te creëren. Deze variant heeft een 10 aminozuurinbrenging (LALGETTRPA), waarvan er drie fungeren als linkers, en richt zich efficiënt op het buitenste netvlies na intravitreale injectie¹⁰. Deze engineered capsid is een uitzonderlijk succesverhaal, omdat het een van de weinige engineered capsids is die tot nu toe de kliniek heeft bereikt¹¹.

Het veld beleefde een tweede boost met de introductie van next-generation sequencing (NGS) technieken. Twee publicaties van Adachi et al.12 in 2014 en van Marsic et ^al.13 in 2015, toonden de kracht van NGS om de distributie van AAV-capsidbibliotheken met streepjescode met hoge nauwkeurigheid te volgen. Een paar jaar later werd de NGS van barcodegebieden aangepast aan het peptide-insertiegebied om de capside-evolutie te volgen. Körbelin et ^al.14 voerden een NGS-geleide screening uit om een pulmonaal gerichte AAV2-gebaseerde capsid te identificeren. De NGS-analyse hielp bij het berekenen van drie beoordelingsscores: de verrijkingsscore tussen selectierondes, de algemene specificiteitsscore om weefselspecificiteit te bepalen en ten slotte de gecombineerde score¹⁴. Het Gradinaru-lab¹⁵ publiceerde in hetzelfde jaar het op Cre-recombination gebaseerde AAV-gerichte evolutie (CREATE) -systeem, dat een celtypespecifieke selectie mogelijk maakt. In dit systeem draagt de capsid-bibliotheek een Cre-inverteerbare schakelaar, omdat het polyA-signaal wordt geflankeerd door twee loxP-sites. De AAV-bibliotheek wordt vervolgens geïnjecteerd in Cre-muizen, waar het polyA-signaal alleen in Cre + -cellen wordt omgekeerd, waardoor de sjabloon wordt geboden voor het binden van een omgekeerde PCR-primer met de voorwaartse primer in het capsid-gen. Deze zeer specifieke PCR-redding maakte de identificatie van de AAV-PHP mogelijk. B-variant die de bloed-hersenbarrière kan passeren¹⁵. Dit systeem werd verder ontwikkeld tot M-CREATE (Multiplexed-CREATE), waarbij NGS en synthetische bibliotheekgeneratie werden geïntegreerd in de pijplijn¹⁶.

Een verbeterde RNA-gebaseerde versie van dit systeem uit het Maguire-lab¹⁷, iTransduce, maakt selectie op DNA-niveau mogelijk van capsiden die functioneel cellen transduceren en hun genomen tot expressie brengen. Het virale genoom van de peptideweergavebibliotheek bestaat uit een Cre-gen onder controle van een alomtegenwoordige promotor en het capside-gen onder controle van de p41-promotor. De bibliotheek wordt geïnjecteerd bij muizen die een loxP-STOP-loxP-cassette hebben stroomopwaarts van tdTomato. Cellen getransduceerd met AAV-varianten die het virale genoom tot expressie brengen en dus Cre tdTomato tot expressie brengen en, in combinatie met celmarkers, kunnen worden gesorteerd en geselecteerd¹⁷. Evenzo plaatsten Nonnenmacher et al.18 en Tabebordbar et ^al.19 de capsid-genenbibliotheek onder controle van weefselspecifieke promotors. Na injectie in verschillende diermodellen werd viraal RNA gebruikt om de capsid-varianten te isoleren.

Een alternatieve benadering is om barcoding te gebruiken om capsid-bibliotheken te taggen. Het Björklund lab²⁰ gebruikte deze benadering voor barcode peptide insertion capsid libraries en ontwikkelde de barcoded rational AAV vector evolution (BRAVE). In één plasmide wordt de Rep2Cap-cassette gekloond naast een inverted terminal repeats (ITR)-geflankeerd, geel fluorescerend eiwit (YFP)-expresserend, barcode-gelabeld transgen. Met behulp van loxP-sites tussen het einde van de dop en het begin van de streepjescode, genereert een in vitro Cre-recombinatie een fragment dat klein genoeg is voor NGS, waardoor de associatie van peptide-insertie met de unieke streepjescode (look-up table, LUT) mogelijk wordt. AAV-productie wordt uitgevoerd met behulp van de plasmidebibliotheek en de barcodes uitgedrukt in het mRNA worden gescreend na in vivo toepassing, opnieuw met NGS²⁰. Wanneer de capsid-bibliotheken varianten van het hele capsid-gen bevatten (d.w.z. geschudde bibliotheken), moet long-read sequencing worden gebruikt. Verschillende groepen hebben barcodes gebruikt om deze diverse bibliotheken te taggen, waardoor NGS een hogere leesdiepte heeft. Het Kay lab²¹ tagde zeer diverse capsid shuffled bibliotheken met barcodes stroomafwaarts van het cap polyA signaal. In een eerste stap werd een plasmidebibliotheek met streepjescode gegenereerd en de geschudde capsid-genenbibliotheek werd erin gekloond. Vervolgens werd een combinatie van MiSeq (short read, hogere leesdiepte) en PacBio (long read, lagere leesdiepte) NGS en Sanger sequencing gebruikt om hun LUT²¹ te genereren. In 2019 hebben Ogden en collega's van het Church-lab²² de AAV2-capsid-geschiktheid voor meerdere functies afgebakend met behulp van bibliotheken met mutaties, inserties en deleties op één punt in elke positie, wat uiteindelijk machinegestuurd ontwerp mogelijk maakte. Voor de generatie van de bibliotheek werden kleinere fragmenten van het capsid-gen gesynthetiseerd, getagd met een barcode, de volgende generatie gesequenced en vervolgens gekloond in het volledige capsid-gen. De NGS-gegevens werden gebruikt om een LUT te genereren. De bibliotheek werd vervolgens gescreend met alleen de barcodes en short read sequencing, wat op zijn beurt een hogere leesdiepte²² mogelijk maakt.

Bibliotheken met streepjescodes zijn voornamelijk gebruikt om een pool van bekende, natuurlijke en technische varianten te screenen na verschillende selectierondes van capsid-bibliotheken of onafhankelijk van een capsid-evolutiestudie. Het voordeel van dergelijke bibliotheken is de mogelijkheid om meerdere capsiden te screenen, terwijl het aantal dieren wordt verminderd en de variatie tussen dieren wordt geminimaliseerd. De eerste studies die deze technologie introduceerden in het AAV-veld werden bijna tien jaar geleden gepubliceerd. Het Nakai-lab 12 tagde 191 dubbele alaninemutanten met aminozuren 356 tot 736 op de VP1 van AAV9 met een paar 12-nucleotide barcodes. Met behulp van NGS werd de bibliotheek in vivo gescreend op galactosebinding en andere eigenschappen¹². Marsic en collega's bakenden de biodistributie van AAV-varianten af met behulp van ook een dubbele barcorded analyse 1 jaar later¹³. Een meer recente studie bij niet-menselijke primaten vergeleek de biodistributie in het centrale zenuwstelsel van 29 capsiden met behulp van verschillende toedieningsroutes²³. Ons lab heeft onlangs AAV-bibliotheekschermen met streepjescode gepubliceerd van 183 varianten die natuurlijke en technische AAV's bevatten. Deze screenings op DNA- en RNA-niveau leidden tot de identificatie van een zeer myotrope AAV-variant²⁴ bij muizen en andere met een hoge celtypespecificiteit in het muizenbrein²⁵.

Hier beschrijven we de methodologie die in dit werk wordt gebruikt en breiden we deze uit met screening van AAV-peptideweergavebibliotheken. Dit omvat het genereren van AAV2-peptideweergavebibliotheken, een digitale druppel-PCR (dd-PCR) -methode voor kwantificering en ten slotte een NGS-pijplijn om de AAV-varianten te analyseren, deels gebaseerd op het werk van Weinmann en collega's²⁴. Ten slotte wordt een beschrijving gegeven van het genereren van AAV-bibliotheken met streepjescode en de NGS-pijplijn die in dezelfde publicatie wordt gebruikt.

Protocol

1. AAV2 willekeurige 7-mer peptide display bibliotheek voorbereiding

OPMERKING: Voor de voorbereiding van een AAV2 random peptide display library, synthetiseer de gedegenereerde oligonucleotiden als enkelstrengs DNA, zet het om in dubbelstrengs DNA, verteert, ligaat naar het acceptor plasmide en elektroporaat.

1. Ontwerp van gedegenereerde oligonucleotiden
   1. Ordenschik de gedegenereerde oligonucleotiden en vermijd codon bias. In het oligonucleotide 5' CAGTCGGCCAG AG W GGC (X01)⁷ GCCCAGGCGGCTGACGAG 3' komt X01 overeen met 20 codons, die elk coderen voor een van de 20 aminozuren. De W kan A of T zijn, waardoor de codons AGA of AGT worden geproduceerd, die coderen voor de aminozuren arginine (R) of serine (S).
   2. Bestel de versterkingsprimer: 5' CTCGTCAGCCGCCTGG 3' (zie figuur 1 voor details). Hierdoor ontstaat de volgende eiwitinzet: R/S G_{X 7}. De theoretische diversiteit wordt als volgt berekend: 1 x 2 x 20⁷ = 2,56 x 10⁹ unieke varianten.
      OPMERKING: Opgemerkt moet worden dat deze diversiteit kan worden beperkt door de transformatie-efficiëntie.
2. Tweede-strengs synthese
   1. Resuspensie van beide oligonucleotiden (gedegenereerde oligonucleotiden en amplificatieprimer) tot een eindconcentratie van 100 μM met TE-buffer.
      1. Stel voor de PCR-reactie een 50 μL-reactie in met 1 μL van elke primer, 10 μL van de buffer, 1,5 μL DMSO, 0,5 μL dNTPs (10 mM), 0,5 μL Hi-fidelity Hot Start Polymerase II en 35,5 μL nucleasevrij water.
      2. Breng de reactie over op een thermocycler en voer een pre-incubatiestap uit gedurende 10 s bij 98 °C, gevolgd door drie cycli van 10 s bij 98 °C, 30 s bij 59 °C en 10 s bij 72 °C, vervolgens 5 minuten bij 72 °C en een laatste koelstap.
   2. Zuiver de reactie met behulp van een nucleotideverwijderingskit en elueer in 100 μL nucleasevrij water.
   3. Bevestig de efficiëntie van de tweedestrengssynthese door analyse op een bioanalysator (zie figuur 2). Analyseer de grootte en zuiverheid van de dubbelstrengs insert door 1 μL van de reactie op een microfluïdische chip uit een DNA 1000-reagentiakit te laden volgens de instructies van de fabrikant. Deze kit is geoptimaliseerd om de grootte en concentratie van dubbelstrengs DNA-fragmenten van 25-1.000 bps te meten.
3. Vertering van insert en plasmidevector
   1. Ververs 85 μL van de gezuiverde insert met 10 μL 10x buffer en 5 μL BglI-enzym in een laatste reactievolume van 100 μL (zie figuur 1 voor details). Incubeer 's nachts bij 37 °C. Zuiver met behulp van een nucleotideverwijderingskit, elueer in 50 μL nucleasevrij water en kwantificeer met behulp van het type "Oligo DNA" in een spectrofotometer.
   2. Verteer 10 μg van een replicatie-competent AAV-plasmide (pRep2Cap2_)²⁶ (ITR-geflankeerd viraal genoom) met 20 μL 10x buffer en 10 μL SfiI-enzym in een laatste reactievolume van 200 μL (zie figuur 1 voor details). Incubeer 's nachts bij 50 °C. Zuiver de vector op een 1% agarose-gel met behulp van de gelextractiekit gevolgd door een extra zuiveringsstap met behulp van een DNA-zuiveringskit. Kwantificeer de concentratie in een spectrofotometer.
4. Ligatie van insert naar vector
   1. Ligate 955 ng plasmidevector met 45 ng insert met 2 μL buffer en 2 μL ligase in een ligatiereactie van 20 μL. Incubeer 's nachts bij 16 °C, gevolgd door 10 minuten bij 70 °C om de ligase te inactiveren.
5. Transformatie, complexiteitsberekening en voorbereiding van de plasmidebibliotheek
   1. Zuiver de reactie met een DNA-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Elueer de reactie in ongeveer 80% van het startvolume nucleasevrij water en sla het op ijs op voor latere transformatie.
   2. Transformeer elektrocompetente cellen: ontdooi één injectieflacon met elektrocompetente cellen op ijs gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 1-2 μL van de gezuiverde ligatiereactie toe aan 30 μL (één injectieflacon) elektrocompetente cellen en meng door zachtjes te tikken. Pipetteer vervolgens het cel/DNA-mengsel voorzichtig tot een voorgekoelde elektroporatiecuvet met een opening van 1 mm zonder luchtbellen in te brengen.
   3. Elektroporaat met de volgende instellingen: 1800 V, 600 Ω en 10 μF. Voeg binnen 10 s na de elektroporatiepuls 970 μL voorverwarmde herstelmedia (voorzien van de elektrocompetente cellen) toe aan de cuvette en meng door pipetteren. Breng ten slotte de cellen over naar een microcentrifugebuis en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C bij 250 tpm. Om een gewenste diversiteit te bereiken, voert u 10-100 reacties uit en bundelt u na incubatie alle reacties in één buis.
   4. Bereken de diversiteit door 10 μL van de gepoolde transformaties 10-, 100- of 1.000-voudig in PBS te verdunnen en 100 μL te verspreiden over voedingsagarplaten die het juiste antibioticum bevatten (75 mg / ml ampicilline). Incubeer de agarplaten een nacht bij 37 °C en tel vervolgens de kolonies op de agarplaten.
   5. Bereken de theoretische diversiteit als volgt:
      Theoretische maximale diversiteit = 10 x verdunningsfactor x aantal kolonies x aantal elektroporatiereacties.
      OPMERKING: Om de kwaliteit van de bibliotheek te bevestigen, sequentieert u ten minste 20 kolonies door Sanger-sequencing. De meeste klonen moeten een insert bevatten en ze moeten allemaal uniek zijn.
   6. Ent 400-1.000 ml LB-medium met het juiste antibioticum met de rest van de gepoolde transformaties en incubeer 's nachts bij 37 °C, 180 tpm.
6. Voorbereiding van plasmidebibliotheek
   1. Bereid van de nachtkweek een glycerolbouillon (meng gelijke volumes bacteriecultuur en 50% glyceroloplossing in nucleasevrij water en vries in bij -80 °C) en zuiver de plasmidebibliotheek met behulp van een plasmide maxi-kit.
7. Productie van AAV virale bibliotheek
   1. Bereid de virale bibliotheek voor zoals eerder beschreven²⁷. Transfecteer de plasmidebibliotheek (pRep2Cap2_PI, peptide-insert) samen met een adeno-helperplasmide naar HEK293T-cellen met behulp van een transfectiereagens zoals polyethylenimine (PEI).
   2. Verzamel de cellen na 3 dagen en onderwerp ze aan drie cycli van bevriezen-dooi. Zuiver het virale lysaat met behulp van cesiumchloride gradiënt ultracentrifugatie, gevolgd door bufferuitwisseling naar PBS, en concentreer ten slotte de virale deeltjes.
8. AAV-vectortitratie met dd-PCR
   1. Verdun 2 μL van de AAV-vectorvoorraad serieel in 198 μL nucleasevrij water tot een 1:10⁶ eindverdunning. Meng elke keer grondig met een pipet van 200 μL. Voeg één besturingselement zonder sjabloon (NTC) toe als negatief besturingselement.
      OPMERKING: Aanvullende lagere of hogere verdunningen kunnen worden getest (1:10;^5-1:10;⁷).
   2. Bereid een 20x primer-probe mix. Voeg 3,6 μL van elk van de 100 μM primers (vooruit en achteruit, Rep2 en ITR), 1 μL elk van de 100 μM dd-PCR probes (Rep2 en ITR) en 3,6 μL nucleasevrij water toe aan een 1,5 ml centrifugebuis.
      OPMERKING: De AAV-bibliotheek wordt gemeten met behulp van een transgen-gerichte primer-probe set (Rep2) gedetecteerd met een FAM-gelabelde probe, en een ITR-gerichte primer-probe set gedetecteerd met een HEX-gelabelde probe.
   3. Bereid een PCR-reactie van 22 μl voor door toevoeging van 5,5 μl monster, 1,1 μl 20x primer-probe-mix, 11 μl dd-PCR-supermix voor sondes (geen dUTP) en 4,4 μl nucleasevrij water. Dit levert concentraties op van respectievelijk 900 nM en 250 nM voor de primers en de sonde.
   4. Genereer de druppels met behulp van een druppelgenerator, breng de reactie over op een plaat met 96 putten, plaats de plaat in een thermocycler en voer een denaturatiestap uit gedurende 10 minuten bij 94 °C, gevolgd door 40 cycli van 30 s bij 94 °C en 1 min bij 58 °C. Verwarm vervolgens het polymerase gedurende 10 minuten bij 98 °C en voeg een laatste koelstap toe. Lees de reacties in een druppellezer en ga verder met de analyse²⁸.
   5. Open het opgeslagen dd-PCR-plaatbestand met behulp van de analysesoftware. Gebruik het drempelgereedschap op het tabblad 1D-amplitude (fluorescentieamplitude versus gebeurtenisnummer) om de negatieve en positieve druppels voor elk kanaal te scheiden, met de NTC als leidraad, en exporteer de gegevens naar een csv-bestand.
   6. Om de vectorconcentratie te berekenen, berekent u eerst de correctiefactor CF met behulp van de formule:
      
      CF bepaalt het aandeel druppels positief voor het transgen [Positieven] dat positief is voor zowel transgen als ITR [Ch1+ Ch2⁺], om de detectie van functionele vectordeeltjes te garanderen. De uiteindelijke vectorconcentratie c kan nu worden berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      
      DF is de verdunningsfactor (1:10;^5-1:10;⁷ zoals eerder bepaald). De kopieën per 20 μL/putreactie komen overeen met 5 μL van het verdunde monster. De factor 1.000 corrigeert de schaal naar VG/ml (viraal genoom/ml). Een voorbeeldig titratieresultaat is te zien in tabel 1 en figuur 3.
9. Analyse van de AAV virale bibliotheek door NGS
   1. Versterking van het 96-nucleotide peptide insertiefragment door een 20 μL PCR-reactie op te zetten met behulp van een proeflezende polymerasekit (2x; zie figuur 4). Voeg 1 μL AAV-bouillon met 1 x 10⁸ vg, 0,5 μL van elk van 100 μM primer (NGS_forward en NGS_reverse) en 10 μL van het enzymmengsel toe aan de reactie. Stel het uiteindelijke volume in op 20 μL met nucleasevrij water.
   2. Breng de reactie over op een thermocycler en voer een denaturatiestap uit gedurende 3 minuten bij 98 °C, gevolgd door 30-35 cycli van 10 s bij 98 °C, 10 s bij 59 °C en 20 s bij 72 °C, gevolgd door 5 minuten bij 72 °C en een laatste koelstap.
   3. Zuiver de monsters met behulp van een PCR-zuiveringskit. Kwantificeer de concentratie in een spectrofotometer en voer een agarose-gel van 3% uit om de zuiverheid en fragmentgrootte te controleren.
   4. Verwerk de PCR-fragmenten met behulp van het bibliotheeksysteem voor monsters met een lage complexiteit volgens de instructies van de fabrikant voor de voorbereiding van een NGS-bibliotheek. Voer de eindreparatiereactie uit met 30 ng PCR-fragment, gevolgd door adapterligatie en PCR-versterking gedurende 10 cycli. Gebruik de PCR-zuiveringskit voor de zuivering van de reacties.
   5. Verwerk de eindproducten op een Bioanalyzer om de grootte en zuiverheid te controleren, met behulp van een DNA-reagentiakit volgens de instructies van de fabrikant.
   6. Kwantificeer de amplicons met behulp van een fluorometer en pool ze. Kwantificeer de uiteindelijke gepoolde NGS-bibliotheek opnieuw op een fluorometer (volgens de instructies van de fabrikant) en controleer de kwaliteit op een Bioanalyzer.
   7. Sequentieer de NGS-bibliotheken in een single-end (SE) modus, met behulp van een 75-cyclus high output kit, met een leeslengte van 84 en een index 1 van 8.
      OPMERKING: Sequencing van de voorbeelden in dit artikel werd uitgevoerd in de GeneCore-faciliteit van EMBL Heidelberg (http://www.genecore.embl.de/).
   8. Analyseer de NGS-sequencinggegevens met Python 3 en biopython. De bestanden zijn te vinden op https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022 (alternatief op https://doi.org/10.5281/zenodo.7032215). De NGS-analyse bestaat uit twee stappen.
      1. Zoek in de eerste stap in de sequentiebestanden naar sequenties die aan bepaalde criteria voldoen (aanwezigheid van herkenningssequenties die de invoegplaats flankeren) (zie figuur 4, stap 1.9.8.5.). Dit wordt gedaan met behulp van een script (Script #1) en een configuratiebestand dat de benodigde informatie biedt. Zodra de juiste volgorde is geïdentificeerd, extraheert en slaat het programma de reeks op in het uitvoerbestand, een txt-bestand met dezelfde naam als het sequencingbestand.
      2. De tweede stap is de analyse van de uitvoerbestanden. De sequenties in de bibliotheek beginnen met een van de zes nucleotiden (AGWggc, W =A/T) in de negen aminozuurinzetstukken. Op basis van deze startvolgorde wordt het peptide vertaald. Dit genereert de uitvoerbestanden die de peptidevarianten (PV's) bevatten.
      3. Bereid twee mappen voor: Script en Gegevens. Kopieer naar de map Data de gzip-gecomprimeerde bestanden die het resultaat zijn van de sequencing. Kopieer naar de map Script de volgende bestanden, Python-bestand: Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py; Python-bestand: Script #2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py; Configuratiebestand: Barcode_Script_JoVE.conf; en LUT-bestand (Look-up table): Zuordnung.txt.
      4. Voordat u de scripts uitvoert, bewerkt u de volgende bestanden in de map Script. Open het bestand "Zuordnung.txt" en voeg in twee door tabs gescheiden kolommen de namen van de gzip-bestanden (kolom 1) en de gewenste eindnaam (kolom 2; door tabs gescheiden waarden) toe.
         OPMERKING: Voorbeeld txt-bestanden zijn te vinden in de GitHub-map "PV_analysis_script". De bestanden in de GitHub-map zijn voorbereid voor de analyse van drie voorbeeldgegevens uit de bovenstaande bibliotheek: xaa.txt.gz, xab.txt.gz en xac.txt.gz. De uitvoerbestanden zijn ook aanwezig.
      5. Wijzig de volgende variabelen in het configuratiebestand "Barcode_Script_JoVE.conf":
         my_dir = "~/Data/"
         filename_sample_file = "~/Script/Zuordnung.txt"
         De sequentiespecifieke variabelen: BCV_size = 27, BCV_links = TCCAGGGCCAG, BCV_rechts = GCCCAGG, BCV_loc = 30, BCV_marge = 8, BCV_{left_revcomp} = GCCGCCTGGGC, BCV_{right_revcomp} = CTGGCCC en BCV_{loc_revcomp} = 41 (zie figuur 4 voor details).
      6. Gebruik de volgende opdracht om de detectie en extractie van de variantvolgorde aan te roepen:
         >python3 ~/Script#1_DetectionExtraction_JoVE_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
         OPMERKING: De uitvoer zijn txt-bestanden met de geëxtraheerde DNA-sequenties en hun aantal reads. De koptekst van dit bestand bevat statistische gegevens (d.w.z. het totale aantal leesbewerkingen en de geëxtraheerde leesbewerkingen). Deze gegevens worden overgebracht naar de volgende bestanden. Deze txt-gegevens zijn de invoerbestanden voor Script #2, waarin de DNA-sequenties worden vertaald, gerangschikt en geanalyseerd.
      7. Voer PV-extractie en -analyse uit met de volgende opdracht:
         >python3 ~/Script#2_PV_extraction_and_ranking_Py3.py ~/Barcode_Script_JoVE.conf
      8. Analyseer de tekstuitvoerbestanden van Script #2. De uitvoerbestanden van Script #2 worden genoemd met behulp van de tweede kolom van de LUT in "Zuordnung.txt" met extensies op basis van het type analyse.
         OPMERKING: Zorg ervoor dat de drie uitvoerbestanden statistische gegevens bevatten in de eerste rijen ("# van geldige PV-reads", "# van Ongeldige PV-reads" en "# van unieke PV-reads"), een eerste kolom met de index van elke DNA-sequentie van de input txt-bestanden (uitvoer van Script #1), en de volgende kolommen: (1) "... analyzed_all.csv": "Sample:" (DNA-sequentie), "#" (aantal reads), "Frw or Rev" (forward of reverse read) en "PVs" (vertaalde peptidesequentie). De ongeldige reeksen hebben "NA" en "niet geldig" in de laatste twee kolommen. (2) "... analyzed_validSeq.csv": hetzelfde als het vorige bestand, gefilterd op geldige reeksen. (3) "... analyzed_PV.csv": "PV's" (vertaalde peptidevolgorde), "#" (aantal reads) en "count" (de frw- en rev-tellingen in de vorige bestanden worden samengevoegd en de telling krijgt 1 of 2).
      9. Visualiseer de uitvoerbestanden met behulp van beschikbare software op basis van de behoeften van de gebruiker.

2. AAV2 willekeurige 7-mer peptide display bibliotheek selectie

1. Gebruik de AAV-bibliotheek na kwantificering en kwaliteitscontrole (sectie 1) voor gerichte evolutie in een model naar keuze om iteratief te selecteren op kandidaten met gewenste eigenschappen (zie figuur 5)^16,18,21.
   OPMERKING: Deze kandidaten worden vervolgens gebruikt voor het genereren van een bibliotheek met streepjescodes, zoals hieronder beschreven in sectie 3.

3. Barcoded AAV capsid bibliotheek voorbereiding en analyse

OPMERKING: Na de identificatie van een reeks potentieel specifieke en efficiënte AAV-capsiden in het peptidescherm, controleert u de functionaliteit van de geïdentificeerde peptidesequenties en vergelijkt u deze met een reeks veelgebruikte of goed beschreven referentie-AAV-capsidvarianten. Om dit te doen, wordt de capsid-reeks ingevoegd in een Rep / Cap-helperconstructie zonder ITR's.

1. Productie van AAV-bibliotheek met streepjescode
   1. Voer recombinante AAV-productie uit voor elke capsid-variant met behulp van het drie-plasmidesysteem, zoals eerder beschreven²⁴.
      OPMERKING: Om de verschillende capside-varianten te onderscheiden, herbergt de ITR-geflankeerde reporter transgene plasmide een unieke barcode van 15 nucleotiden lang. De barcode bevindt zich op de 3' UTR (onvertaald gebied) tussen het enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) en het polyA signaal (zie figuur 6A). EYFP-expressie wordt aangedreven door een sterke alomtegenwoordige cytomegalovirus (CMV) promotor die voldoende niveaus van RNA-transcripten biedt.
   2. Ontwerp barcodes van 15 nucleotiden in lengte met homopolymeren van minder dan drie nucleotiden, GC-gehalte van <65%²⁹ en een Hammingafstand groter dan vier nucleotiden²⁴.
   3. Produceer elke capside afzonderlijk in combinatie met een transgeen plasmide met een unieke barcode. Op deze manier wordt elke capsid-variant getagd met een afzonderlijke streepjescode die zijn specifieke tracking mogelijk maakt (zie figuur 6B).
2. AAV-vectortitratie met dd-PCR
   1. Voer de AAV-titratie uit zoals eerder beschreven in paragraaf 1.8, door het Rep2-primerpaar te vervangen door het YFP-primerpaar.
   2. Kwantificeer de individuele AAV-producties en pool gelijke hoeveelheden van elke productie om de uiteindelijke bibliotheek met streepjescodes te genereren.
   3. Kwantificeer de uiteindelijke bibliotheek opnieuw om de uiteindelijke concentratie en kwaliteit te controleren (zie figuur 7).
3. Barcoded AAV bibliotheek in vivo applicatie
   1. Pas de AAV-bibliotheek met streepjescode systemisch toe op het modelsysteem van keuze (bijvoorbeeld systemisch bij muizen²⁴).
   2. Verzamel ON- en OFF-target weefsels (d.w.z. lever, long, hart, middenrif, gladde spieren, twaalfvingerige darm, pancreas, dikke darm, biceps, eierstokken, maag, binnenoor, nier, abdominale aorta, thoracale aorta, hersenen, bruin en wit vet en milt) of celtypen op basis van het experiment. Vries ze in bij -80 °C, extraheer het DNA/RNA en pas NGS-kwantificeringsanalyse toe, zoals beschreven in de volgende sectie.
4. DNA/RNA extractie
   1. Extraheer het DNA en RNA uit de weefsels van belang met behulp van de DNA / RNA Mini Kit.
   2. Plaats een klein stukje van het weefsel van belang (1 mm³, ongeveer 5 mg) in een reactiebuis van 2 ml.
   3. Voeg 350 μL lysisbuffer gemengd met β-mercaptoethanol (1%) en 5 mm stalen kralen toe aan het weefsel (behandel monsters met β-mercaptoethanol onder een zuurkast).
   4. Homogeniseer het weefsel in een weefselLyser gedurende 45 s bij 40 Hz.
   5. Voeg 10 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 55 °C tijdens het schudden bij 400 tpm.
   6. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, verzamel het supernatant en ga verder met het protocol van de fabrikant van de DNA / RNA-kit.
   7. Splits de wasstap in twee stappen met 350 μL wasbuffer in elke stap. Tussen deze wasstappen door verteert u het overgebleven DNA op de kolom met RNase-vrije DNase I. Voeg 80 μL van de DNase I-oplossing, bereid volgens de instructies van de fabrikant, toe aan de kolom en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   8. Elueer RNA/DNA uit de kolom met nucleasevrij water. Bewaar het geïsoleerde RNA bij -80 °C en het gDNA bij -20 °C.
5. cDNA synthese
   1. Onderwerp de RNA-monsters aan een nieuwe ronde DNase I-behandeling van 15-30 minuten (voor volledige verwijdering van besmettend DNA uit de RNA-monsters) vóór de omgekeerde transcriptiereactie. Voeg 1 μL van de DNase I-oplossing, 4 μL buffer (meegeleverd met de kit) en nucleasevrij water toe tot een eindvolume van 40 μL tot 212 ng RNA. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en inactiveer gedurende 10 minuten bij 70 °C.
   2. Synthetiseer cDNA met behulp van 150 ng RNA met behulp van een kit volgens de instructies van de fabrikant. Neem controles op zonder de reverse transcriptase, om ervoor te zorgen dat er geen besmet viraal DNA uit het monster komt. Het cDNA wordt bewaard bij -20 °C.
      OPMERKING: De hoeveelheid invoer-RNA voor optimale omgekeerde transcriptie kan variëren afhankelijk van het weefseltype en de verwachte transductie-efficiëntie in het betreffende weefsel.
6. Analyse van de virale AAV-bibliotheek (in-vivo) door NGS
   1. Om tegen lage kosten een hoge sequencingdiepte te bereiken, voert u NGS uit via Illumina-sequencing zoals eerder beschreven (paragraaf 1.9). Versterk de streepjescodevolgorde en ligate vervolgens de sequencingadapters naar het amplicon.
   2. Vanwege de korte leeslengte en de ligatie van de sequencingadapters aan beide zijden van het amplicon, controleert u bij het ontwerpen of het amplicon voldoende klein is om de aanwezigheid van de barcodesequentie in de gelezen NGS te garanderen. Voor de sequencing van de barcodes in de virale genomen en de virale transcripten is het PCR-amplicon ontworpen om 113 bp lang te zijn (zie figuur 8).
   3. Versterk het gebied met streepjescode met de primers BC-seq vooruit en BC-seq achteruit. Bereid de volgende PCR-reactie voor: 0,5 μL Hi-fidelity DNA-polymerase, 10 μL 5x buffer, 0,25 μL van elke 100 μM primer (BC-seq fw/BC-seq rv) en 1 μl 10 mM dNTPs. Gebruik 25 ng van het cDNA of DNA/reactie als sjabloon en pas het uiteindelijke volume aan tot 50 μL met nucleasevrij water.
   4. Bereid de PCR master-mix onder een schone PCR-kap om besmetting te voorkomen. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: 30 s bij 98 °C, gevolgd door 40 cycli bij 98 °C gedurende 10 s en 72 °C gedurende 20 s, en een laatste stap van 5 minuten bij 72 °C.
   5. Neem PCR-controles op om de afwezigheid van besmettend DNA in de PCR-mastermix te bevestigen. Neem voor de cDNA-monsters de controles op zonder reverse transcriptase. Voeg ten slotte een voorbeeld toe aan de AAV-invoerbibliotheek. Deze informatie wordt gebruikt om het Normalization_Variant.txt bestand te genereren dat in de analyse wordt gebruikt.
   6. Controleer de grootte van het PCR-fragment van elk monster door gel-elektroforese vóór PCR-zuivering. Dit laatste wordt bereikt door gebruik te maken van in de handel verkrijgbare magnetische kralen of op kolommen gebaseerde DNA-zuiveringssystemen (zie tabel met materialen).
   7. Bereid de NGS-bibliotheek met behulp van het bibliotheeksysteem voor op monsters met een lage complexiteit volgens de instructies van de fabrikant, zoals eerder beschreven in rubriek 1.9.
   8. Bepaal de DNA-concentratie via de dsDNA HS Kit en analyseer de kwaliteit van de bibliotheek zoals eerder beschreven (paragraaf 1.9.6), gevolgd door pooling. Kwantificeer de gepoolde bibliotheek op een fluorometer en beoordeel de kwaliteit op een Bioanalyzer.
   9. Voer NGS-sequencing uit zoals besproken in paragraaf 1.9.7.
   10. Kwantificeer met qPCR het kopienummer van het transgen (virale genomen) en het huishoudgen om de verdeling van de gepoolde bibliotheek tussen weefsels of organen op het DNA te beoordelen.
   11. Stel als volgt een qPCR-reactie van 30 μL in om het aantal kopieën van EYFP (transgen) en GAPDH (glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase, huishoudgen) te bepalen:
       1. Bereid een primer/probe-mix van 60x voor EYFP (1,5 μM YFP_fw, 1,5 μM YFP_rv en 0,6 μM YFP_probe; zie Tabel met materialen). Gebruik GAPDH primer/probe mix (zie Tabel van Materialen) om het kopienummer van het huishoudstergen te bepalen. Zet de reactie op ijs.
       2. Bereid een PCR-mastermix voor (15 μL, zie Materiaaltabel) en voeg 60x primer/probe-mix (0,5 μL) toe voor alle monsters en standaarden (om kopienummers voor de normen te berekenen, gebruikt u de volgende link: http://cels.uri.edu/gsc/cndna.html). Zet de reactie op ijs.
       3. Breng 15,5 μL van het hoofdmengsel over in een plaat met 96 putten en voeg 14,5 μL monster (75 ng totale DNA-concentratie) of standaard toe aan de betreffende put. Sluit de 96-putplaat af met folie, vortex en spin kort.
       4. Breng 10 μL van elk monster in tweevoud over in een plaat met 384 putten. Sluit de plaat af met folie en draai op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
       5. Incubeer het reactiemengsel in een thermocycler met een begintemperatuur van 50 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door een eerste activeringsstap van 10 minuten bij 95 °C. Voer 40 cycli van denaturatie uit bij 95 °C gedurende 15 s en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 1 min²⁴.
       6. Om het aantal diploïde genomen (dg) te verkrijgen, gebruikt u het GAPDH-kopienummer en deelt u door twee. Neem vervolgens de waarde van het EYFP-kopienummer en deel door het aantal dg, wat resulteert in vectorgenomen per diploïde genoom (vg / dg). Gebruik deze waarde om het Normalization_Organ.txt bestand voor de bioinformatische analyse te genereren.
   12. Voer de analyse uit van de NGS-sequencinggegevens zoals Weinmann et al.²⁴, met behulp van aangepaste code in Python3 (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). De workflow omvat de detectie van barcodesequenties geleid door flankerende sequenties, hun lengte en locatie (Script # 1_BarcodeDetection.py), evenals analyse van barcodeverrijking en distributie over de set weefsels (Script # 2_BarcodeAnalysis.py).
       1. Detecteer streepjescodes en wijs ze toe aan AAV-varianten. Plaats de sequencinggegevens als gearchiveerde fastq-bestanden in één map (bijvoorbeeld "Data_to_analyze"). Het sequencinggegevensbestand voor de invoerbibliotheek is opgenomen in deze map en wordt alleen gebruikt om de capsid-verhoudingen in de invoerbibliotheek te berekenen.
       2. Voordat u het script uitvoert, maakt u twee door tabs gescheiden tekstbestanden: het bestand capsid-varianten (zie voorbeeldbestand "Varianten.txt") met de streepjescodesequenties die zijn toegewezen aan AAV-capsidvariantnamen, en het contaminatiebestand (zie "Contaminaties.txt") met streepjescodesequenties die afkomstig zijn van mogelijke verontreiniging (andere streepjescodes die beschikbaar zijn in het laboratorium, wat bijdraagt aan besmetting).
       3. Bewerk ten slotte het configuratiebestand "Barcode_Script.conf" om de volgende informatie op te nemen: pad naar map met sequencinggegevens (bijv. "Data_to_analyze"), volgorde van flankerende gebieden van de streepjescodes, hun positie en venstergrootte voor barcodedetectie (vergelijkbaar met 1.9.8.5, zie Figuur 8).
       4. Gebruik de volgende opdracht om streepjescodedetectie aan te roepen met de meegeleverde paden naar Script#1_BarcodeDetection.py- en configuratiebestanden:
          >python3 ~/Script#1_BarcodeDetection.py ~/Barcode_Script.conf
          OPMERKING: De uitvoer van Script #1_BarcodeDetection.py-uitvoering bestaat uit tekstbestanden met het aantal gelezen waarden per capsid-variant, evenals het totale aantal leesbewerkingen dat is hersteld van de onbewerkte gegevens.
       5. Evalueer de verdeling van AAV-capsiden met streepjescode over weefsels of organen door Script # 2_BarcodeAnalysis.py uit te voeren samen met de volgende txt-bestanden:
          1. Wijs in het bestand "Zuordnung.txt" de naam toe aan elk txt-bestand dat is verkregen uit de barcodedetectierun aan een weefsel- / orgaannaam: namen van txt-bestanden in de eerste kolom en overeenkomstige weefsel- / orgaannamen in door tabs gescheiden toewijzing.
             OPMERKING: Controleer bijvoorbeeld de map "Voorbeeld" (https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022). Van belang is dat de weefsel- / orgaannaam tekens kan bevatten die cDNA- of gDNA-meting en biologisch replicatienummer (M1, M2, enz.) definiëren.
          2. Maak een tekstbestand "organen.txt" met de lijst met namen voor ON- en OFF-doelorganen, die overeenkomen met de namen in het toewijzingsbestand "Zuordnung.txt" (zie map "Voorbeeld": https://github.com/grimmlabs/AAV_GrimmLab_JoVE2022).
          3. Maak "Normalization_Organ.txt" en "Normalization_Variant.txt" door tabs gescheiden tekstbestanden met genormaliseerde waarden voor alle capsid-varianten en alle organen / weefsels. Schrijf in de eerste kolom van het bestand "Normalization_Organ.txt" de namen die voor elk orgaan zijn gegeven (zoals in het toewijzingsbestand "Zuordnung.txt") en in de tweede kolom de normalisatiewaarden voor de overeenkomstige weefsels, gegenereerd in paragraaf 3.6.11.
          4. Vul de eerste kolom van het bestand "Normalization_Variant.txt" met de lijst met capsid-namen en de tweede kolom met de genormaliseerde waarden van de gelezen tellingen voor elke capsid in de gepoolde bibliotheek (normalisatie kan worden berekend op basis van het txt-uitvoerbestand voor de invoerbibliotheek die voortvloeit uit het eerste script).
          5. Bewerk het configuratiebestand door de volledige paden naar alle hierboven genoemde extra bestanden op te geven. Voer Script#2_BarcodeAnalysis.py uit als:
             >python3 /Script#2_BarcodeAnalysis.py ~/Barcode_Script.conf
             OPMERKING: Het barcode-analysescript voert verschillende bestanden uit: tekstbestanden met relatieve concentratie (RC) -waarden van capsid-verdeling binnen verschillende weefsels op basis van meerdere normalisatiestappen die eerder zijn beschreven, en het spreadsheetbestand dat tekstbestandsgegevens combineert tot samengevoegde matrixgegevens. Deze laatste kan worden gebruikt voor clusteranalyse en visualisatie.
          6. Visualiseer de gegevens en voer clusteranalyse van de matrixgegevens uit om capside-eigenschappen te onderscheiden en hun overeenkomsten te evalueren op basis van RC-profielen over weefsels. Gebruik het aanvullende script PCA_heatmap_plot. R geplaatst in de repository:
             >Rscript --vanille ~/PCA. R ~/relatieve concentratie.xls
             OPMERKING: Het script neemt relatieveconcentratie.xls bestanden als invoer en genereert twee plots van hiërarchische cluster heatmap en principal component analysis (PCA).
          7. Als u plots (assen van heatmap, hoofdcomponenten van PCA) of png-parameters (kleur, grootte, labeling) wilt wijzigen, opent u het R-script en volgt u de instructies in de secties met opmerkingen.

Representative Results

Genereren van een AAV2 peptide display library. Als eerste stap naar de selectie van technische AAV's wordt het genereren van een plasmidebibliotheek beschreven. De peptide insert wordt geproduceerd met behulp van gedegenereerde primers. Het verminderen van de combinatie van codons in die van 64 tot 20 heeft de voordelen van het elimineren van stopcodons en het vergemakkelijken van NGS-analyse, door de bibliotheekdiversiteit op het DNA te verminderen, maar niet op het eiwitniveau. De oligonucleotide-insert wordt gekocht als enkelstrengs DNA (figuur 1), dat met behulp van een PCR-reactie wordt omgezet in dubbelstrengs DNA. De kwaliteit van deze reactie wordt gecontroleerd in een Bioanalyzer. Zoals te zien is in figuur 2, produceerden drie cycli een sterkere band, vergeleken met 10 of 30 cycli. De insert wordt vervolgens verteerd met BglI om drie-nucleotide overhangen te genereren. Het nucleotide naast de overhangvolgorde van de dubbelstrengs insert kan een A of een T zijn (W is de ambiguïteitscode voor A of T), die zich op de derde positie bevindt van een codon dat codeert voor arginine (R) of serine (S). De vector (pRep2Cap2_) heeft een frameshiftmutatie in de peptide-insertieplaats die de productie van de capsid voorkomt bij afwezigheid van een insert, vanwege de creatie van een stopcodon kort na de insertieplaats. SfiI-vertering van dit plasmide genereert drie-nucleotide-overhangen die overeenkomen met de overhangen die worden gegenereerd in de peptide-coderende oligonucleotide-insert. Ligatie moet onder optimale omstandigheden worden uitgevoerd om de complexiteit van de plasmidebibliotheek te maximaliseren. Hiertoe werd voor de transformatie elektroporatie uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare bacteriën met een hoge efficiëntie.

De diversiteit van de plasmidebibliotheek wordt berekend op basis van het aantal kolonies, dat meestal ongeveer 1 x 10⁸ is voor dit type bibliotheek. Het totale aantal kolonies komt overeen met de maximale potentiële diversiteit van de bibliotheek bij de NGS-analyse, zoals verderop wordt besproken. De plasmidebibliotheek wordt vervolgens gebruikt om de AAV-bibliotheek te genereren, die hier niet in detail wordt beschreven, maar elders²⁷.

De kwantificering van deze bibliotheek werd uitgevoerd met dd-PCR. Doorgaans worden twee regio's gekwantificeerd, het AAV2-rep-gen in het virale genoom en de ITR (zie figuur 3 en tabel 1). Zoals te zien is in tabel 1, is 99,2% van de druppels die positief zijn voor het virale genoom ook positief voor ITR (Ch1 + Ch2 ⁺), wat een kwaliteitscontrole is voor de AAV-bibliotheek en suggereert dat de AAV-capsiden volledige virale genomen bevatten. Om een concentratie in vg/ml te verkrijgen, wordt de verhouding tussen dubbelpositieve druppels en positieven berekend en gebruikt om het juiste aantal kopieën te verkrijgen vóór amplificatie door de verdunningsfactor.

De kwaliteit van de AAV-bibliotheek wordt vervolgens beoordeeld door NGS-analyse, te beginnen met een PCR met behulp van geschikte primers. Vervolgens wordt het PCR-product verwerkt met behulp van een in de handel verkrijgbare kit, die indexbevattende adapters aan het PCR-product toevoegt. De NGS-producten worden gesequenced en de bestanden worden geanalyseerd met behulp van Python. Er worden drie voorbeeldgegevens uit een AAV2-peptideweergavebibliotheek verstrekt. Elke sequentie in het Script #1-invoerbestand (lijst met sequenties van alle PCR-kopieën van het versterkte DNA-segment in het monster) wordt bio-informaticatisch gezocht naar de BCV-linker- en BCV-rechtersequenties, of_de BCV-left_comp- en BCV-right_comp sequenties. Als een van beide combinaties wordt geïdentificeerd, wordt de ingesloten reeks geëxtraheerd en toegevoegd aan het uitvoerbestand (zie figuur 4). De uitvoer van beide scripts biedt statistische gegevens over de voorbereiding van de NGS-bibliotheek. In alle drie de sets vertegenwoordigden de geëxtraheerde reads, gebaseerd op handtekeningsequenties die specifiek zijn voor de bibliotheek, ongeveer 94% van de totale reads, wat een goede kwaliteit suggereert. De uitvoer van Script #2 biedt verdere statistische gegevens en de vertaling van de geëxtraheerde DNA-sequentie levert aanvullende kwaliteitscontrolegegevens op. De "# van Invalid PV reads" (d.w.z. sequenties die de zes nucleotiden missen die worden gebruikt om de in-silico translatie te initiëren en residuen RG of SG te coderen) is minder dan 1% van de herstelde reads, wat een goede sequencingkwaliteit bevestigt. De outputs van het tweede script (d.w.z. de vertaling en rangschikking van de geëxtraheerde DNA-sequenties) bieden aanvullende informatie, zoals het aantal reads per peptidevariant of het aantal DNA-sequenties dat aanleiding geeft tot elke peptidevariant. Van de bestanden bevatten de bestanden die eindigen op "analyzed_PVs" alleen geldige DNA-reads en de analyse wordt uitgevoerd op het niveau van de peptidesequentie. Van de geldige lezingen is meer dan 99% uniek, wat suggereert dat de bibliotheek in balans is en de interne diversiteit hoog is.

Selectie van een AAV2 peptide display library. Deze bibliotheek kan vervolgens worden gebruikt voor in vivo of in vitro selectie. Dit is niet opgenomen in dit protocol, maar een overzicht is weergegeven in figuur 5. Kortom, voor in vivo selectie worden de weefsels 1 week na systemische injectie van 1 x 10¹² vg/muis verzameld en wordt DNA geïsoleerd. Een reddings-PCR op een groter fragment van het cap-gen wordt uitgevoerd en het product wordt gekloond in de plasmidevector met behulp van verschillende restrictieplaatsen, maar een vergelijkbaar protocol als wat hier wordt beschreven, en ronde-1 AAV-bibliotheken worden voorbereid. Voor de NGS-analyse wordt de PCR uitgevoerd op het geïsoleerde DNA of de AAV-bibliotheken. Na selectie neemt het percentage unieke pv's in de bibliotheek meestal af afhankelijk van de selectiedruk. Afhankelijk van het project kan de selectie worden afgerond zodra voldoende dominante PV's door NGS zijn geïdentificeerd.

Selectie en analyse van bibliotheken met streepjescode. De gegevens van een AAV-bibliotheek met streepjescode bestaande uit 82 capsiden zijn eerder beschreven²⁴. De dd-PCR-kwantificering van de AAV-deeltjes (zie figuur 7 en tabel 1) laat zien dat 94% van de capsiden die positief zijn voor het transgen ook een ITR bevatten, wat wijst op een compleet genoom. Dit is lager dan de hierboven beschreven wild-type bibliotheek, maar suggereert nog steeds een goede kwaliteit voor recombinante AAV's, aangezien ze meestal minder efficiënt verpakken. Na injectie van de gepoolde bibliotheek bij dieren worden de weefsels verzameld en worden DNA en RNA geïsoleerd. PCR voor NGS en NGS-bibliotheekvoorbereiding en -sequencing worden vervolgens uitgevoerd zoals hierboven beschreven en eerder²⁴. Om vg/dg te berekenen, wordt de qPCR uitgevoerd en in de verstrekte voorbeeldgegevens variëren de waarden van 0,1-4. Zoals typisch is voor systemische AAV-toediening, heeft de lever meer dan 10 vg / dg.

Als onderdeel van de analysepijplijn worden normalisatiestappen op verschillende niveaus uitgevoerd. In de gegroepeerde invoerbibliotheek zijn de capsid-varianten meestal niet gelijk vertegenwoordigd. Daarom wordt de NGS-analyse van de invoerbibliotheek gebruikt om een normalisatiebestand te genereren, dat de abundantie van elke capsid-variant in het uiteindelijke weefsel / orgaan corrigeert op basis van de overvloed van deze capsid-variant in de invoerbibliotheek. De biodistributie van de gepoolde bibliotheekleden door NGS wordt uitgevoerd op DNA- en RNA-niveau. Deze normalisatie voor de invoerbibliotheek levert het quotiënt (P*_αβ) van verhouding binnen het weefsel/orgaan (P_αβ) op tot de verhouding in de invoerbibliotheek (L_a). Deze berekeningen zijn te vinden in het bestand "variant_comparison.txt". Dit quotiënt wordt vervolgens vermenigvuldigd met de vg/dg-waarden uit het bestand "Normalization_organ.txt" om de waarde Β αβ te verkrijgen, en de verhoudingen van Β_αβ-waarden worden berekend voor een enkel weefsel of voor alle. Het aandeel van de Β αβ-waarde voor elke variant binnen één weefsel (V_αβ) weerspiegelt de verspreiding van deze variant in dit weefsel ("organ_comparison.txt"). Daarentegen duidt het aandeel van de Β αβ-waarde voor elke variant in alle weefsels (T_αβ) op de verspreiding van deze variant in het hele lichaam ("relatieve concetaties.xls"). Deze twee verhoudingen weerspiegelen de intra- en inter-tissue biodistributie van elke variant. Al deze bestanden kunnen worden gebruikt voor verschillende visualisaties van capsid-efficiëntie en specificiteit²⁴. Als voorbeeld, met behulp van de laatste tabel (te vinden in "relatieveconcetraties.xls"), wordt de belangrijkste componentanalyse en hiërarchische clustering weergegeven in figuur 9.

De normalisatie van de gepoolde bibliotheek van de NGS-sequencing laat zien dat elke capsid een gemiddeld aandeel van 0,012 heeft, wat ook overeenkomt met het theoretische aandeel van elk van de 82 capsiden en een goed uitgebalanceerde gepoolde bibliotheek van 0,012 (1/82) suggereert. Het bestand "relatieve concentratie.xls" gegenereerd door de bioinformatische pijplijn weerspiegelt de inter-weefsel capsid biodistributie, zoals geïllustreerd in figuur 9. De heatmap toont relatieve concentratiewaarden op een log2-schaal voor elke capside van de gepoolde bibliotheek hiërarchisch geclusterd volgens het weefselbiodistributieprofiel. De belangrijkste componentanalyse maakt het mogelijk om clusters van AAV-capsidvarianten met vergelijkbare biodistributie-eigenschappen te onderscheiden en benadrukt ook de afgelegen capsiden met unieke patronen van interweefselbiodistributie. De twee belangrijkste takken van de heatmaphiërarchie weerspiegelen het verschil in de transductie-efficiëntie van capsid-varianten. De linkertak met de meerderheid van de capsid-varianten omvat alle capsiden, die een hoge waarde van relatieve concentratie over de meeste weefsels vertonen. Afgezien van opvallend hoge leverspecificiteit, vertoonden drie andere capsiden (Var60, Var13 en Var63) specificiteit in het diafragma (Di), skeletspieren (SM), biceps (BlC) en in de hersenen (B). De rechtertak van de hiërarchische clustering omvat de capside-varianten met een algehele lagere transductie-efficiëntie, die wordt uitgesproken in de twaalfvingerige darm (Du) en pancreas (P). De PCA voor de oorspronkelijke subgroep vormt het cluster van capsidvarianten met hoge leverspecificiteit (Var 64, 78, 65, 55, 56) en schetst de Var60 capsid met uitstekend spiertropisme.

Figuur 1: Overzicht van de kloonstrategie voor de AAV2 random 7-mer peptide display library.
Het oligonucleotide met de willekeurige 7-mer peptide-insertiesequentie wordt geflankeerd door sequenties die de BglI-verteringsplaats en een bindingsplaats voor de amplificatiereactie bevatten. De vector pRep2Cap2_bevat SfiI-sites. De overhangen gegenereerd door de BglI- en SflI-vertering zijn complementair. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Bioanalyzer kwaliteitscontrole van oligonucleotide tweedestrengs synthese.
De tweedestrengssynthese van gedegenereerde oligonucleotiden wordt bevestigd door analyse op een bioanalysator. PCR-reacties met drie, 10 en 30 cycli van versterking worden vergeleken, waaruit blijkt dat de meest efficiënte de drie cycli van versterking zijn. (A) Bioanalyzergegevens weergegeven als gelbeeld. (B-D) Uitgezette fragmentlengtes (in bp, x-as) versus fluorescentie-eenheden (FU, y-as), vergeleken met standaardpieken, zichtbaar bij 15 en 1500 bp. Rode pijlen duiden op dubbelstrengs oligonucleotiden. Merk op dat de hoogste FU-waarde, die de hoogste DNA-concentratie vertegenwoordigt, van dubbelstrengs oligonucleotiden wordt waargenomen na drie cycli van amplificatie (rode pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Titratie van een AAV2 peptide display library met behulp van dd-PCR.
(A) Detectie van rep2-positieve druppels in kanaal 1 (FAM, Kanaal 1) voor een niet-template watercontrole en een 1:10⁶ verdund virusmonster. (B) Detectie van ITR-positieve druppels in kanaal 2 (HEX, kanaal 2). (C) Detectie van druppels die positief zijn voor zowel rep2 als ITR (oranje gemarkeerd). Paarse lijnen geven drempels aan voor de detectie van positieve versus negatieve druppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Overzicht van het DNA-fragment dat wordt gebruikt voor NGS en instellingen voor de python-analyse.
De NGS PCR versterkt een 96-nucleotidegebied. Het PCR-fragment wordt gebruikt om de NGS-bibliotheek te genereren. Voor de bioinformatische analyse moeten herkenningssequenties rechts en links van de insertieplaats worden gegeven voor beide strengen, evenals de afstand tot het begin van het DNA-fragment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Iteratieve selectie van AAV-bibliotheken in vivo.
Muizen worden geïnjecteerd met de AAV-bibliotheek. Target ON- en OFF-weefsels worden 1 week later verzameld en onderworpen aan NGS en analyse. Het ON-target weefsel wordt gebruikt om het capsid-gen te redden, dat wordt gekloond in de moedervector. De geselecteerde AAV-bibliotheek wordt geproduceerd en gebruikt om de bovengenoemde selectiecyclus te herhalen. Deze figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Overzicht van het genereren van de AAV-bibliotheek met streepjescode.
(A) Grafische weergave van een zelfcomplementair AAV-genoom met een CMV-promotorgestuurd eyfp-transgen geflankeerd door ITR's. De 3' UTR bevat een 15 nucleotide-lange barcode (BC) gelegen op de 3' UTR tussen de eyfp en het boviene groeihormoon (BGH) polyadenyleringssignaal. De BC maakt capsid tracing op DNA- en mRNA-niveau mogelijk. (B) Tijdens de productie van AAV wordt een uniek genoom met streepjescode verpakt door een enkele variant van het cap-gen, waardoor capsid-identificatie wordt vergemakkelijkt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Titratie van een AAV-bibliotheek met streepjescode met dd-PCR.
(A) Detectie van YFP-positieve druppels in kanaal 1 (FAM, Kanaal 1) voor een niet-template watercontrole en een 1:10⁶ verdund vectormonster. (B) Detectie van ITR-positieve druppels in kanaal 2 (HEX, kanaal 2). (C) Detectie van druppels die positief zijn voor zowel rep2 als ITR (oranje gemarkeerd). Paarse lijnen geven drempels aan voor de detectie van positieve versus negatieve druppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Overzicht van het DNA-fragment dat wordt gebruikt voor NGS en instellingen voor de Python-analyse.
De NGS PCR versterkt een 113-nucleotidegebied. Voor de bioinformatische analyse moeten herkenningssequenties rechts en links van de barcode worden gegeven voor beide strengen, evenals de afstand tot het begin van het DNA-fragment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Principal component analysis (PCA) en hierarchical cluster analysis.
(A) PCA van relatieve concentratiewaarden voor 82 capsiden over alle weefsels maakt het mogelijk om clusters van capsidvarianten met vergelijkbare eigenschappen en varianten met unieke transductiepatronen te definiëren. (B) Om het dichtbevolkte cluster beter te scheiden, werden de records van afgelegen unieke varianten uitgesloten van de matrix en werd de PCA-analyse herhaald. (C) Hiërarchische clusteranalyse maakt het mogelijk om varianttransductieprofielen over weefsels visueel te evalueren als een heatmapplot (Li = lever, Lu = long, FatB = bruin vet, H = hart, Di = diafragma, SM = gladde spieren, Du = twaalfvingerige darm, P = pancreas, C = colon, BIC = biceps, O = eierstokken, St = maag, I = binnenoor, K = nier, Aa = abdominale aorta, At = thoracale aorta, B = hersenen, FatW = wit vet, en S = milt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Monster	Doel	Kopieën/20 μL goed	Positieven	Ch1+ Ch2+	CF	kopieën gecorrigeerd	DF	VG/ml
H2O	Rep2	28	2	0	0	0	1.00E + 06	5.60E + 09
AAV2lib	Rep2	90600	16396	16266	0.99	89882	1.00E + 06	1,80E+13
H2O	YFP	4	3	2	0.67	3	1.00E + 06	8.00E+08
BCAAVlib	YFP	34680	13229	12452	0.94	32643	1.00E + 06	6,53E+12

Tabel 1: Titratieresultaten van een AAV2-peptideweergavebibliotheek ("AAV2lib") en de EYFP-vectorbibliotheek met streepjescode ("BCAAVlib").

Discussion

In dit protocol worden de stappen beschreven die nodig zijn voor peptideweergave AAV capsid engineering en voor barcoded AAV-bibliotheekscreening, evenals voor bioinformatische analyse van bibliotheeksamenstelling en capsid-prestaties. Dit protocol richt zich op de stappen die de bioinformatische analyse van dit soort bibliotheken vergemakkelijken, omdat de meeste virologielaboratoria achterblijven in programmeervaardigheden om hun vaardigheid in moleculaire biologietechnieken te evenaren. Beide soorten bibliotheken zijn uitgebreid beschreven in de literatuur, zoals beschreven in de inleiding, en kunnen relatief gemakkelijk worden gereproduceerd.

Als eerste stap wordt het ontwerp van een peptideweergavebibliotheek op positie 588 in variabel gebied VIII van AAV2 geschetst. Dit ontwerp (AAV2_Peptide(ii) in eerdere publicatie 26) en de beschreven kloonmethode kunnen gemakkelijk worden aangepast aan andere serotypen op basis van de informatie in een recente publicatie²⁶. Een cruciale stap in de kloonpijplijn is de ligatie-/transformatie-efficiëntie (met behulp van de ~1 x 10⁸ kolonies cut-off). Het wordt aanbevolen om één ligatiereactie toe te voegen met alleen vector. Dit helpt bij het identificeren van het percentage bacteriekolonies met insert, dat hoger moet zijn dan 80%. Een lager dan verwachte efficiëntie, dat wil zeggen een aantal bacteriekolonies (het berekenen van het percentage met insert) lager dan de theoretische diversiteit van de oligonucleotide-inserts, zou een negatieve invloed hebben op varianten met een lage abundantie. Verschillende verbeteringen omvatten langere verteringstijden en opruimstappen voor de vector- of ligatiereactie, met behulp van commerciële kits.

De volgende stap is de kwaliteitscontrole van de variantbibliotheek met behulp van NGS van een PCR-fragment dat de oligonucleotide-insertieplaats omvat. De NGS wordt uitgevoerd met behulp van een Illumina-sequencingsysteem. Er zijn verschillende alternatieven, waarbij PCR-producten direct kunnen worden ingediend zonder voorafgaande voorbereiding van de NGS-bibliotheek. Dit is meer geschikt voor kleinschalige experimenten of wanneer een hoge leesdiepte niet vereist is. Het hier gerapporteerde protocol omvat NGS-bibliotheekvoorbereiding, inclusief de toevoeging van adapters met Illumina-indexen aan de PCR-producten, met behulp van een in de handel verkrijgbare kit. Een veel voorkomende beperking met betrekking tot NGS is dat deze PCR-fragmenten een lage diversiteit hebben, omdat de sequenties die de high-diversity insertieplaats flankeren identiek zijn in alle varianten, wat op zijn beurt de sequencing-efficiëntie vermindert. Om dit aan te pakken, voegt deze kit een willekeurig aantal van twee tot acht willekeurige nucleotiden toe tussen het PCR-fragment en de adapter. Als alternatief moet het monster worden geprikt met PhiX. De gedetailleerde Python-pijplijn wordt beschreven om AAV2-peptideweergavebibliotheken te analyseren. Als sjabloon worden voorbeeldbestanden geleverd die zijn geëxtraheerd uit het originele NGS-bestand van de AAV2-peptideweergavebibliotheek. Dit kan worden aangepast aan andere serotypen met de gegeven instructies. De uitvoerbestanden van deze analyse kunnen worden gebruikt in downstream-analyse, zoals de vergelijking van plasmide en AAV-bibliotheek 30, aminozuursamenstelling in elke positie³⁰, berekening van de verrijkingsscore tussen bibliotheken na selectierondes 14, of het genereren van sequentielogo's of grafieken¹⁹. Wat de invoerbibliotheek betreft, is de aanwezigheid van een hoog percentage unieke varianten gewenst. Sommige varianten produceren echter niet zo goed als andere, wat kan leiden tot scheve verdelingen na productie. Een lage variantdiversiteit, of met andere woorden de aanwezigheid van dominante varianten, kan worden toegeschreven aan een lage oligonucleotide-insertkwaliteit of een hoog aantal tweedestrengssynthesecycli (stap 1.2). Bovendien kan de aminozuursamenstelling worden beïnvloed door de productie. Elk aminozuur moet een frequentie van 5,00% hebben. Als de verdeling sterk afwijkt van deze waarde, wordt voorgesteld om dezelfde analyse uit te voeren op de plasmidebibliotheek om mogelijke vooroordelen te identificeren³⁰.

Aangezien de protocollen voor het genereren van AAV-bibliotheken en de daaropvolgende selectierondes in verschillende dier- en in-vitromodellen uitgebreid zijn beschreven in meerdere publicaties en protocollen 27,30,31,32^, wordt hier alleen de analyse van barcodebibliotheken van geselecteerde technische varianten en benchmarks beschreven. Van belang is dat het klonen van de bibliotheek na elke selectieronde kan worden uitgevoerd door PCR-isolatie van het cap-gen, zoals vermeld in de secties protocol en resultaten. Uitgebreide selectierondes en PCR-amplificatie kunnen leiden tot de opbouw van mutaties of stopcodons, die door NGS kunnen worden waargenomen. Als alternatief kunnen verrijkte varianten worden geselecteerd uit de NGS-gegevens en kunnen de oligonucleotiden worden geordend en gekloond zoals beschreven voor het genereren van een peptideweergavebibliotheek^16,18. Tot slot bevat het protocol een korte beschrijving voor de selectie van bibliotheken op DNA-niveau, 1 week na systemische injectie. RNA-gebaseerde selecties zijn strenger, omdat ze ook selecteren op varianten die door infectieuze toegangswegen gaan, hoewel ze technisch uitdagender zijn. Opgemerkt moet worden dat RNA- of transgen-gebaseerde selecties (d.w.z. Cre) een langere in vivo duur van ongeveer 3-4 weken vereisen 15,16,17,18,19,33. Vooral voor DNA-gebaseerde selecties is het van cruciaal belang om de geselecteerde varianten te valideren tegen bekende natuurlijke en gemanipuleerde serotypen op zowel DNA- als RNA-niveau met behulp van een AAV-bibliotheek met streepjescodes.

Het tweede deel van het protocol beschrijft het genereren en screenen van AAV-bibliotheken met streepjescodes met behulp van de eerder ontwikkelde pijplijn²⁴. Elke AAV-capsid in de pool bevat hetzelfde transgen (eyfp onder controle van een CMV-promotor) met een duidelijke barcode tussen eyfp en het polyA-signaal. De barcodes die in deze bibliotheek worden gebruikt, zijn te vinden in de eerdere publicatie²⁴. Het ontwerp was gebaseerd op het basisprincipe van Hamming-afstand (d.w.z. de barcodesequenties moeten voldoende verschillend zijn), zodat sequencingfouten niet leiden tot foutieve barcodetoewijzingen. Zoals beschreven in Lyons et al²⁶, is de kans op twee fouten in reads tussen 25-100 nucleotiden zeer laag. Een Hamming-afstand van 4 betekent dat er twee sequencingfouten nodig zijn om een leescode als de verkeerde streepjescode toe te wijzen. Leesbewerkingen met één fout worden tijdens de analyse genegeerd en in dit geval gecategoriseerd als "leest met onbekende varianten". In een relevante publicatie worden richtlijnen en een Python-script gegeven om barcodes²⁹ te genereren die in de pijplijn kunnen worden gebruikt. Voor de identificatie van nuttige barcodes kan een andere populaire foutcorrigerende code worden gebruikt zoals beschreven in de publicatie van Buschmann en Bystrykh³⁴, namelijk de Levenshtein-afstand. Deze groep levert ook een softwarepakket voor de programmeertaal R³⁵.

Na de AAV-productie kan de gepoolde AAV-bibliotheek met streepjescode worden gebruikt voor biodistributiestudies in verschillende modellen. Deze studie schetst de pijplijn met behulp van de bibliotheek met 82 varianten uit de vorige publicatie²⁴ en biedt voorbeeldgegevens voor de praktijk. Dit protocol kan ook worden aangepast op basis van de behoeften van elke gebruiker. De biodistributieanalyse is gebaseerd op het verzamelen van verschillende ON- en OFF-target weefsels of cellen, de extractie van DNA en RNA daaruit, PCR-amplificatie van het barcodegebied voor NGS-sequencing en de meting van vg/dg op DNA-niveau. Voor het RNA zou het het beste zijn om de verhouding tot het mRNA-kopienummer van een referentiegen te berekenen. Het referentiegen van keuze moet op vergelijkbare wijze tot expressie worden gebracht in verschillende weefsels 36, zoals RPP30 (Ribonuclease P/MRP Subunit P30)³⁷ of Hprt (hypoxanthinefosforibosyltransferase 1)³⁶. Dit is echter moeilijk, dus het kan nodig zijn om meerdere referentiegenen tegelijkertijd te gebruiken om de RNA-gegevens te normaliseren. Om deze reden kan de normalisatie naar dg op DNA-niveau worden voltooid, wat ruwweg correleert met het aantal cellen. Dit wijst ook op het gebruik van qPCR voor deze berekening, zoals eerder beschreven²⁴, hoewel dd-PCR nauwkeuriger is en dus de voorkeur heeft voor toekomstig gebruik, vooral gezien de vooruitgang op dit gebied³⁷. Last but not least, fundamentele moleculaire biologie-optimalisaties zijn uiterst kritisch voor de hier beschreven methodologie. De PCR-reacties moeten worden geoptimaliseerd om te voorkomen dat vooroordelen worden geïntroduceerd in de distributie van de bibliotheken. De dd-PCR-sondes moeten worden ontworpen om intronische gebieden voor DNA en interexonische gebieden voor RNA te omvatten. Goede laboratoriumpraktijken, zoals fysieke compartimentering van de stappen, met name DNA- en AAV-productie van bibliotheekvoorbereiding, en een goede desinfectie zijn van het grootste belang om foutieve amplificatie en bibliotheekbesmettingen te voorkomen.

Met name het gebruik van peptideweergavebibliotheken en vector-DNA / RNA-barcodering om te selecteren op gemanipuleerde capsiden met nieuwe tropismen of andere klinisch relevante eigenschappen vertegenwoordigt slechts twee voorbeelden van gerichte AAV-capsid-evolutietechnologieën. Ze hebben allemaal gemeen dat ze beperkingen hebben en verdere optimalisatie vereisen om hun volledige potentieel te realiseren. Bijvoorbeeld, het louter inbrengen van een peptide laat een groot deel (~ 99%) van de onderliggende capsid-sequentie ongewijzigd, waarvan de eigenschappen, inclusief interactie met neutraliserende anti-AAV-antilichamen, mogelijk verder moeten worden gewijzigd voorafgaand aan menselijke toepassing³⁸. Bovendien is de werkelijke diversiteit van peptideweergave of andere bibliotheken doorgaans lager dan de theoretische, bijvoorbeeld vanwege technische beperkingen tijdens het klonen of bacteriële transformatie³¹. Over het algemeen is er ook een actief debat over de translationele relevantie van gerichte evolutie in dier- of in vitromodellen , bevorderd door toenemend bewijs voor een mogelijke soort- of zelfs stamspecifieke prestatie van synthetische AAV-capsiden³⁸. Niettemin is er grote hoop dat veel of al deze beperkingen zullen worden overwonnen en dat het huidige arsenaal aan technologieën zal worden uitgebreid tot een nog grotere verscheidenheid aan ziektemodellen en nog toegankelijker zal worden voor de meeste onderzoeksgroepen. In dit opzicht is een bijzonder bemoedigende recente ontwikkeling het gebruik van barcode-AAV-bibliotheken zoals die hier worden gerapporteerd om geselecteerde capsiden niet langer alleen op het orgaan, maar nu ook op cellulair niveau te valideren, wat kan worden bereikt met nieuwe technologieën zoals single-cell (sc) RNA-sequencing³⁹. De hier gepresenteerde protocollen zullen de bredere vestiging van AAV-evolutietechnieken vergemakkelijken en zo de ontwikkeling van nieuwe capsiden versnellen die zijn afgestemd op de behoeften van een overvloed aan onderzoeksgroepen en menselijke patiënten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplification primer	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	DNA fragment validation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	DNA fragment validation
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	80204	DNA/RNA extraction
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	5067-1504	NGS Library preparation
Agilent 2100 Bioanalyzer System	Agilent Technologies (Santa Clara, CA, USA)	G2938C	NGS Library preparation
BC-seq fw:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	ATCACTCTCGGCATGGACGAGC	NGS Library preparation
BC-seq rv:	IDT (San Joce, CA, CA, USA)	GGCTGGCAACTAGAAGGCACA	NGS Library preparation
β-Mercaptoethanol	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	44-420-3250ML	DNA/RNA extraction
BglI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0143	Digestion of double-stranded insert
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1851196	dd-PCR cycler
dNTPS	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	N0447S	NGS Library preparation
ddPCR Supermix for probes (no dUTP)	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863024	dd-PCR supermix
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863005	dd-PCR droplet generation oil
DG8 Cartridges for QX100 / QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864008	dd-PCR droplet generation cartridge
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863051	dd-PCR cartridge holder
Droplet Generator DG8 Gasket	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1863009	dd-PCR cover for cartridge
ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	12001925	dd-PCR 96-well plate
E.cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells	Lucigen (Middleton, WI, USA)	60081-1	Electrocompetent cells
Electroporation cuvettes, 1mm	Biozym Scientific (Oldendorf, Germany)	748050	Electroporation
GAPDH primer/probe mix	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Mm00186825_cn	Taqman qPCR primer
Genepulser Xcell	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1652660	Electroporation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems (Waltham, MA, USA)	4368814	cDNA reverse transcription
ITR_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CGGCCTCAGTGAGCGA (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR primer
ITR_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	HEX-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-BHQ1 (https://signagen.com/blog/2019/10/25/qpcr-primer-and-probe-sequences-for-raav-titration/)	dd-PCR probe
Illumina NextSeq 500 system	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	SY-415-1001	NGS Library sequencing
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)*	Roche AG (Basel, Switzerland)	KK2600 07958919001	NGS sample prepration
MagnaBot 96 Magnetic Separation Device	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	V8151	Sample prepration for NGS library
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	ND-2000	Digestion of double-stranded insert
NGS_frw	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	GTT CTG TAT CTA CCA ACC TC	NGS primer
NGS_rev	Sigma-Aldrich (Burlinght, MA, USA)	CGC CTT GTG TGT TGA CAT C	NGS primer
NextSeq 500/550 High Output Kit (75 cycles)	Illumina Inc (San Diego, CA, USA)	FC-404-2005	NGS Library sequencing
Ovation Library System for Low Complexity Samples Kit	NuGEN Technologies, Inc. (San Carlos, CA, USA)	9092-256	NGS Library preparation
PX1 Plate Sealer	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814000	dd-PCR plate sealer
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1814040	dd-PCR sealing foil
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F530S	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences, Inc. (Warrington, PA, USA)	24765-1G	AAV library preparation
ProNex Size-Selective Purification System	Promega GmbH (Madison, WI, USA)	NG2002	Sample prepration for NGS library
Phusion Hot Start II Polymerase	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	F549L	NGS Library preparation
Proteinase K	Roche AG (Basel, Switzerland)	5963117103	DNA/RNA extraction
pRep2Cap2_PIS			ITR-Rep2Cap2-ITR vector. Peptide insertion site within the Cap2 ORF, manufactured/prepared in the lab
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864002	dd-PCR droplet generator
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad (Hercules, CA, USA)	1864003	dd-PCR droplet analysis
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28306	Second-strand synthesis of oligonucleotide insert purification
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28704	Plasmid vector purification
QIAGEN Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	12162	Plasmid library DNA preparation
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen (Venlo, Netherlands)	28104	Sample prepration for NGS library
Qubit fluorometer	Invitrogen (Waltham, MA, USA)	Q32857	NGS Library preparation
Qubit dsDNA HS	Thermo Fischer Scientific (Waltham, MA, USA)	Q32851	NGS Library preparation
QuantiFast PCR Master Mix	Qiagen (Venlo, Netherlands)	1044234	Taqman qPCR
rep_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	AAGTCCTCGGCCCAGATAGAC	dd-PCR primer
rep_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	CAATCACGGCGCACATGT	dd-PCR primer
rep_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-TGATCGTCACCTCCAACA-BHQ1	dd-PCR probe
RNase-free DNase	Qiagen (Venlo, Netherlands)	79254	DNA/RNA extraction
SfiI	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	R0123	Digestion of vector
5 mm, steel Beads	Qiagen (Venlo, Netherlands)	69989	DNA/RNA extraction
TRIMER-oligonucleotides	ELLA Biotech (Munich, Germany)	-	Degenerate oligonucleotide
T4 Ligase	New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)	M0202L	Plasmid library ligation
TissueLyserLT	Qiagen (Venlo, Netherlands)	85600	DNA/RNA extraction
YFP_fw	IDT (San Joce, CA, USA)	GAGCGCACCATCTTCTTCAAG	dd-PCR primer
YFP_rv	IDT (San Joce, CA, USA)	TGTCGCCCTCGAACTTCAC	dd-PCR primer
YFP_probe	IDT (San Joce, CA, USA)	FAM-ACGACGGCAACTACA-BHQ1	dd-PCR probe
Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (Capped)	Zymo research (Irvine, CA, USA)	D4013	Vector and Ligation purification