Summary
במאמר זה נתאר את השיטה לביסוס מודל של תרבית תאים משולשת של מחסום הדם-מוח המבוסס על תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח האנושי, אסטרוציטים ופריציטים. מודל רב-תאי זה מתאים למחקרים על תפקוד לקוי של יחידות נוירו-וסקולריות במהלך שבץ איסכמי במבחנה או לסינון מועמדים לתרופות.
Abstract
שבץ איסכמי הוא גורם מרכזי למוות ולנכות ברחבי העולם עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. הנוירופתולוגיה של שבץ איסכמי מאופיינת על ידי הפרעה באספקת הדם למוח המובילה למוות תאי ותפקוד קוגניטיבי. במהלך ואחרי שבץ איסכמי, תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח (BBB) מקל על התקדמות הפציעה ותורם להחלמה לקויה של המטופל. המודלים הנוכחיים של BBB כוללים בעיקר מונוקולטורות אנדותל ותרביות כפולות עם אסטרוציטים או פריציטים.
מודלים כאלה חסרים את היכולת לחקות באופן מלא מיקרו-סביבה מוחית דינמית, החיונית לתקשורת בין תאים. בנוסף, מודלים נפוצים של BBB מכילים לעתים קרובות תאי אנדותל אנושיים מונצחים או תרביות תאים שמקורן בבעלי חיים (מכרסם, חזיר או בקר) המציבות מגבלות תרגום. מאמר זה מתאר מודל BBB חדשני המבוסס על הכנסה טובה המכיל רק תאים אנושיים ראשוניים (תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח, אסטרוציטים ופריסיטים של כלי דם במוח) המאפשרים לחקור פגיעה מוחית איסכמית במבחנה.
ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD) על שלמות המחסום הוערכו על ידי חדירות פסיבית, מדידות התנגדות חשמלית טרנסאנדותליאלית (TEER) והדמיה ישירה של תאים היפוקסיים. הפרוטוקול המוצג מציע יתרון מובהק בחיקוי הסביבה הבין-תאית של ה-BBB in vivo, ומשמש כמודל BBB מציאותי יותר במבחנה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות במסגרת פגיעה מוחית איסכמית.
Introduction
שבץ מוחי הוא אחד הגורמים המובילים למוות ולנכות ארוכת טווח ברחבי העולם1. שכיחות השבץ עולה במהירות עם הגיל, ומכפילה את עצמה כל 10 שנים לאחר גיל 552. שבץ איסכמי מתרחש כתוצאה מהפרעה בזרימת הדם במוח עקב אירועים טרומבוטיים ותסחיפיים, המקיפים יותר מ -80% מכלל מקרי השבץ3. גם כיום, קיימות אפשרויות טיפול מעטות יחסית למזעור מוות של רקמות בעקבות שבץ איסכמי. הטיפולים שכן קיימים הם תלויי זמן וכתוצאה מכך לא תמיד מובילים לתוצאות קליניות טובות. לכן, מחקר על מנגנונים תאיים מורכבים של שבץ איסכמי המשפיעים על התאוששות לאחר שבץ הוא נחוץ בדחיפות.
ה-BBB הוא ממשק דינמי להחלפת מולקולות בין הדם לפרנכימה של המוח. מבחינה מבנית, ה-BBB מורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המחוברים ביניהם על ידי קומפלקסים צומתיים המוקפים בקרום מרתף, פריציטים ואנדפיטים אסטרוציטיים4. פריסיטים ואסטרוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על שלמות BBB באמצעות הפרשת גורמים שונים הדרושים להיווצרות צמתים חזקים והדוקים 5,6. התמוטטות ה- BBB היא אחד מסימני ההיכר של שבץ איסכמי. תגובה דלקתית חריפה ועקה חמצונית הקשורה לאיסכמיה מוחית גורמת לשיבוש של קומפלקסים של חלבונים בצמתים הדוקים ולהצלבה לא מווסתת בין אסטרוציטים, פריציטים ותאי אנדותל, מה שמוביל לחדירות מוגברת של מומסים פרא-תאיים ברחבי BBB7. תפקוד לקוי של BBB מקדם עוד יותר את היווצרות בצקת המוח ומגביר את הסיכון לטרנספורמציה דימומית8. בהתחשב בכל האמור לעיל, יש עניין רב בהבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ברמת BBB במהלך ואחרי שבץ איסכמי.
למרות שמודלים רבים של BBB במבחנה פותחו בעשורים האחרונים ומשמשים במגוון מחקרים, אף אחד מהם לא יכול לשכפל באופן מלא בתנאי in vivo 9. בעוד שחלק מהמודלים מבוססים על מונולרים של תאי אנדותל שגודלו בתרבית על תמיכות חדירות היטב לבדן או בשילוב עם פריסיטים או אסטרוציטים, רק מחקרים עדכניים יותר הציגו עיצובים של מודלים של תרביות תאים משולשות. כמעט כל המודלים הקיימים של BBB בתרבית משולשת משלבים תאי אנדותל ראשוניים במוח יחד עם אסטרוציטים ופריסיטים שבודדו ממיני בעלי חיים או תאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים10,11,12,13.
מתוך הכרה בצורך לשחזר טוב יותר את ה-BBB במבחנה האנושית, הקמנו תרבית תאים משולשת במבחנה מודל BBB המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMEC), אסטרוציטים אנושיים ראשוניים (HA) ופריסיטים וסקולריים ראשוניים במוח האנושי (HBVP). דגם BBB תלת-תרבותי זה ממוקם על צלחת 6 בארות, תוספות קרום פוליאסטר בגודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. תוספות טובות אלה מספקות סביבה אופטימלית לחיבור תאים ומאפשרות גישה נוחה הן לתאים אפיקליים (דם) והן לתאים בזולטרליים (מוח) לדגימה בינונית או ליישום מורכב. התכונות של מודל BBB מוצע זה של תרבית תאים משולשת מוערכות על ידי מדידת TEER ושטף על-תאי לאחר OGD המחקה שבץ איסכמי במבחנה, עם מחסור בחמצן (<1% O2) וחומרים מזינים (על ידי שימוש במדיום נטול גלוקוז) המושג באמצעות תא לח ואטום. בנוסף, תנאים דמויי איסכמיה המושרים במודל זה מאומתים במדויק על ידי הדמיה ישירה של תאים היפוקסיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל התאים, החומרים, הציוד והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הגדרת מודל BBB של תרבית תאים משולשת
- זריעת פריציטים
- טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. לאחר ההגעה למפגש, שאפו את מדיום הפריסיטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח חמה של דולבקו (DPBS). שאפו את ה- DPBS ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו-1 מ"ל של DPBS.
הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ- P7. - לדגום את הבקבוקון במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 . מבט תחת מיקרוסקופ כדי לוודא אם התאים מנותקים מהבקבוקון. הוסיפו 5 מ"ל של סרום פריציטים חם (המכיל 2% סרום בקר עוברי [FBS]) והעבירו את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- צנטריפוגה של מתלה התא במשך 3 דקות ב 200 × גרם, המאפשר לתאים ליצור גלולה בתחתית הצינור. שאפו את המדיום מהצינור, כדי להבטיח שכדור התא יישאר שלם.
- להשעות את כדור התא במדיום פריציטים; חשב את כמות המדיום בהתאם למפגש התאים ולמספר התוספות הדרושות. קח 10 μL של התאים המחודשים, הנח אותם לתוך שקופית ספירת תאים, וספור את מספר התאים.
- לקבוע את צפיפות התאים ואת זרע 300,000 תאים / להכניס 1 מ"ל של מדיום pericyte על הצד abluminal של מוסיף היטב (פורמט 6-טוב).
הערה: בעת זריעת HBVP על החלק התחתון של התוספות, חשוב מאוד להפוך תחילה את הצלחות המוכנסות היטב במהופך. בזמן שהצלחת מונחת שטוחה על משטח, הסר את החלק התחתון כדי לחשוף את הצד האבלומי של הבאר. לאחר הוספת תרחיף תאי פריציט על הצד האבומי, כסו את התוספות היטב עם הלוח ההפוך כדי למנוע אידוי. שמור את כל הצלחות הפוכות באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- טפחו HBVP בבקבוקי תרבית T75 עם משטח פעיל להידבקות תאים בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. לאחר ההגעה למפגש, שאפו את מדיום הפריסיטים הישן ושטפו את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח חמה של דולבקו (DPBS). שאפו את ה- DPBS ונתקו את התאים מהבקבוקון באמצעות שילוב של 4 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA חמה ו-1 מ"ל של DPBS.
- זריעת אסטרוציטים
- טפחו HA בצלוחיות T75 בתוך חממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להגעה למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום אסטרוציטים (המכיל גם 2% FBS) במקום מדיום פריציטים.
הערה: הימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ- P9. - קבע את צפיפות התאים ואת זרע 300,000 תאים / באר על החלק התחתון של תרבית הרקמה 6-בארות לוחות. מכסים את הצלחת כדי למנוע אידוי ושומרים את כל הצלחות באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- טפחו HA בצלוחיות T75 בתוך חממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להגעה למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום אסטרוציטים (המכיל גם 2% FBS) במקום מדיום פריציטים.
- זריעת תאי אנדותל
- טפחו HBMEC במנות תרבית רקמה בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום קלאסי שלם (המכיל 10% FBS) במקום מדיום פריציטים.
הערה: יש להימנע משימוש בקטעים מאוחרים יותר מ-P12. - הוציאו את תרבית הרקמה צלחות 6-באר המכילות אסטרוציטים ואת הבאר-תוספות (בפורמט 6-well) המכילות פריסיטים מהאינקובטור 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. שאפו את מדיום האסטרוציטים מתרביית הרקמה צלחות 6 בארות. הוסף 1 מ"ל של בינוני פריציטים ו 1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים לכל באר.
- שאפו את מדיום הפריציטים מהבאר והכניסו אותם לתרבית הרקמה צלחות 6 בארות המכילות את האסטרוציטים שנזרעו. זרע HBMEC בצפיפות של 300,000 תאים/באר ב-2 מ"ל של מדיום קלאסי שלם על הצד האפי של אותה באר.
הערה: יש לזרוע את תאי האנדותל בצד האפיקלי של הבאר ביום המחרת לאחר זריעת הפריציטים בצד האבמינלי של הבאר ואסטרוציטים על צלחות תרבית רקמה 6 בארות. התאים צריכים להישמר בתרבית משולשת במשך 6 ימים כדי לגרום לתכונות דמויות BBB. יש להחליף את מדיום תרבית התאים בשני התאים המוכנסים היטב 24 שעות לפני הניסויים.
- טפחו HBMEC במנות תרבית רקמה בתוך אינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למפגש. בצע את השלבים לעיל 1.1.1-1.1.4 באמצעות מדיום קלאסי שלם (המכיל 10% FBS) במקום מדיום פריציטים.
2. אינדוקציה של מחסור חמצן-גלוקוז
- לשטוף את התאים 3x עם DPBS. עבור תרביות תאים משולשות הנתונות ל-OGD, יש להוסיף מדיום נטול גלוקוז (ללא L-גלוטמין ופנול אדום) הן לתאים האפיקליים והן לתאים הבזולטרליים. החלף את מדיום התרבית במדיום טרי בתרביות תאי בקרה נורמוקסיות. בקרת תרביות משולשות בחממה 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: שינויים בינוניים לפני השראת OGD או מיד לאחר OGD עשויים ליצור לחץ מכני שישפיע עוד יותר על המונדלרים של תאי האנדותל. לפיכך, השלבים עם תחליף בינוני כלולים עבור תרביות תא בקרה נורמוקסיות. - הניחו צלחת פטרי המכילה 20 מ"ל מים סטריליים בתא האינקובטור של היפוקסיה כדי לספק לחות מספקת של התרביות. פתח את התא על ידי שחרור מהדק הטבעת. סדרו את תרביות התאים על המדפים. אטמו את החדר על ידי אבטחת מהדק הטבעת.
- פתח את יציאות הכניסה והיציאה של החדר. חברו את הצינורות המגיעים מראש מד הזרימה לתא. חברו את הצינורות המגיעים מתחתית מד הזרימה למיכל הגז המכיל את תערובת הגז של 95% N 2/5% CO2 באמצעות מסנן אוויר.
- פתח את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבובו נגד כיוון השעון כדי לאפשר זרימת גז מינימלית. פתח באיטיות את שסתום ווסת הלחץ על ידי סיבוב בכיוון השעון.
- יש לשטוף את התא עם תערובת הגזים בקצב זרימה של 20 ליטר/דקה למשך 5 דקות. נתקו את התא ממקור הגז וסגרו היטב את שני מלחציי הפלסטיק הלבנים.
- כבה את שסתום בקרת זרימת המיכל על ידי סיבוב בכיוון השעון. סגור את שסתום וסת הלחץ על ידי סיבוב נגד כיוון השעון.
- מניחים את תא היפוקסיה באינקובטור קונבנציונלי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
הערה: להוספת תקופת חמצון חוזרת לאחר מכן, שטפו את התאים פי 3 עם DPBS, הוסיפו מדיום טרי בכל התרביות המשולשות, ושמרו למשך 24 שעות נוספות באינקובטור 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. על פי הוראות היצרן, ריכוז החמצן שנותר בתא הוא 0% לאחר לא פחות מ-4 דקות של טיהור עם תערובת גזים אנאירובית ב-20 ליטר לדקה.
3. מדידות TEER
- הכנס את מכשיר ה- TEER המעוקר לארון הביו-בטיחותי וחבר את האלקטרודות לוולטוהמטר האפיתליאלי. לעקר את האלקטרודות ב 30 מ"ל של 70% איזופרופיל אלכוהול פתרון למשך מינימום של 30 דקות.
- הפעל את מכשיר ה- TEER והגדר את הפונקציה לאוהם.
- הסר את האלקטרודות מתמיסת 70% איזופרופיל אלכוהול והנח אותן ב-20 מ"ל של DPBS למשך 30 דקות לפחות עד שהקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER תקרא 0 אוהם.
- הכנס את החלק הארוך של האלקטרודה דרך אחד משלושת הפתחים במתלה הבאר של פקד הבאר הריקה, והנמיך אותו עד שהוא נוגע בתחתית הבאר. ודא כי הפתח הקצר מונח מעל התרבות apical בתחתית הבאר.
הערה: בקרת הבאר הריקה מורכבת מ-2 מ"ל של מדיום קלאסי שלם בתא האפיקלי ושילוב של 1 מ"ל של מדיום פריציטים ו-1 מ"ל של מדיום אסטרוציטים בתא הבזולטרלי. ודא שהאלקטרודות מוחזקות בזווית של 90° לבאר תוך כדי ביצוע מדידת ה- TEER. שימוש בממוצע של שתיים או שלוש קריאות המתקבלות באותה באר (לכל פתיחה) יכול לעזור להקטין את השונות. - המתן עד לביטול ערכי הקריאה הדיגיטלית במכשיר TEER לפני הקלטת הערך. החזירו את האלקטרודות ל-DPBS כדי לשטוף אותן בין המדידות. המשך לאסוף את כל מדידות ה- TEER עבור שני פקדים ריקים נוספים שהוכנסו היטב.
- אסוף את מדידות ה- TEER של לוחות הדגימה באמצעות שלבים 3.4-3.5 שנלקחו עבור מדידות הבקרה. לאחר ביצוע כל המדידות, החזירו את האלקטרודה לתמיסת 70% איזופרופיל אלכוהול למשך 30 דקות. נתקו את האלקטרודות ממכשיר ה-TEER ואפשרו להן להתייבש באוויר.
- חישוב ערכי TEER. השתמש במשוואה (1) כדי להחסיר את ערך ה-ohm הממוצע של פקד ההוספה הריקה מערך ה-ohm של הדגימה, ולאחר מכן הכפל ערך התנגדות זה באזור של תוספת הממברנה (ס"מ 2) כדי לתת את ערך ה- TEER המדווח ב- Ω∙cm2.
(1)
(1)4. הערכת החדירות הפרה-תאית BBB
הערה: בצע את כל השלבים הכוללים FITC-dextran בארון בטיחות ביולוגית של תרבית תאים כאשר האורות כבויים. כסו את תמיסות FITC-dextran ברדיד אלומיניום כדי למזער את ההלבנת הפוטו.
- הכינו תמיסות המכילות FITC-dextrans של 20 ו-70 kDa (0.1 מ"ג/מ"ל) באמצעות מדיום צמיחת תאי אנדותל ללא אדום פנול ואפשרו לערבב על שייקר פלטפורמת נדנדה למשך שעה אחת. סנן את הפתרונות באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
- שאפו את המדיום מהתא הבזולטרלי והחליפו אותו ב-2 מ"ל של מדיום צמיחת תאי אנדותל ללא אדום פנול במודל BBB של תרבית תאים משולשת. שטפו את התאים בתא האפיקלי פעמיים עם תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS).
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת FITC-dextran בתא האפיקלי וכסה את הצלחת ברדיד אלומיניום. הכניסו את הצלחת לחממה של 5% CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
- קח 100 μL של בינוני מן התאים basolateral ולהעביר אותו לתוך צלחת שחורה 96 באר. מדוד את הפלואורסצנציה באמצעות קורא microplate כאשר אורכי הגל של העירור והפליטה מוגדרים ל-480 ננומטר ו-530 ננומטר, בהתאמה.
5. זיהוי היפוקסיה בתאים חיים
- זרעים של 200 μL של HBMEC, HA ו-HBVP במרכז כלים מצופים פולי-די-ליזין, תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ בצפיפות של 150,000 תאים/צלחת. לפני זריעת HBMEC, מצפים את תחתית הכלים עם גורם ההצמדה. אפשרו לתאים להתחבר למשטח הזכוכית על ידי השארתם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2 .
הערה: חשוב למקם צלחות עם תאים ראשוניים אנושיים בו זמנית עם מודל BBB משולש שהוכנס היטב בתא היפוקסיה עבור OGD. - לאחר ההגעה למפגש, יש להשליך את מדיום התרבית ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום נטול גלוקוז שחומם מראש (עבור OGD) או מדיום רגיל (עבור בקרות) המכיל 2 μL של 1 mM Hoechst 33342 (ריכוז סופי 0.2 μM) ו- 0.5 μL של 5 mM פתרון מלאי של מגיב היפוקסיה ירוקה Image-iT הפניה (ריכוז סופי 1 μM). לאחר טיפול OGD, יש להחליף את המדיום במדיום מותאם להדמיה בכל המנות.
- בצע הדמיה פלואורסצנטית של תאים חיים באמצעות מסנן GFP וחממה מיקרוסקופית קונפוקלית בשלב העליון כפי שתואר קודםלכן 14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לבחון את ההשפעות של אסטרוציטים ופריסיטים על תפקוד המחסום של HBMEC, בנינו את מודל ה-BBB של תרבית תאים משולשת על תוספות תרביות תאים (איור 1A) יחד עם מונוקולטורה של HBMEC ושני מודלים של תרביות משותפות כפולות כבקרות (איור 1B). בקרות כפולות של תרבית משותפת כללו תרבית משותפת ללא מגע של HBMEC עם HA ותרבית משותפת של מגע של HBMEC עם HBVP. לאחר 6 ימים בתרבות משותפת, כל המערכות הניסיוניות היו נתונות ל- OGD במשך 4 שעות. שלמות המחסום של המונולייר האנדותל בתצורות BBB שצוינו הוערכה על-ידי קביעת TEER לפני ואחרי OGD, כמו גם לאחר 24 שעות של חמצון מחדש (איור 1C). במשך 4 שעות, ה- OGD גרם לירידה משמעותית בערכי TEER רק במונוקולטורה של HBMEC ובמודל התרבות המשותפת עם HBMEC ו- HBVP. רמות נמוכות אלה הגיעו לרמות הבסיסיות לאחר 24 שעות של חמצון מחדש. שום השפעה של OGD על מודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HA הצביעה על התפקיד המגן של אסטרוציטים מפני תנאים איסכמיים במבחנה.
אף על פי שלא היה הבדל ב- TEER הבסיסי בין מודלים של תרבית משותפת כפולה של HBMEC / HBVP, ערכי ה- TEER במודל התרבות המשותפת המשולשת היו גבוהים משמעותית מאלה שבבקרות התרבות המשותפת הכפולה או בקרת המונוקולטורה מיד לאחר OGD, מה שמרמז על כך ששילוב של HA ו- HBVP במודל ה- BBB המשולש ממלא תפקיד קריטי בשמירה על שלמות תפקודית ה- BBB בתנאים פתולוגיים (איור 1C ). חקרנו גם את החדירות של מסה מולקולרית קטנה (20 kDa) וגדולה (70 kDa) FITC-dextrans על פני האנדותל מונולייר במודל התרבית המשולשת שפותח. החדירות העל-תאית של מונו-שכבות אנדותל למסה מולקולרית של 20 kDa FITC-dextran עלתה באופן דרסטי במונוקולטורה של HBMEC ובמידה פחותה במודל התרבית המשותפת עם HBMEC ו-HBVP בהשוואה לבקרות נורמוקסיקליות (איור 1D). יתר על כן, רמות חדירות FITC-dextran של 20 kDa היו הנמוכות ביותר במודל BBB המשולש מבין כל הדגמים בתנאים נורמוקסיים ו- OGD. לא נצפו שינויים בשטף של 70 kDa FITC-dextran על פני מונו-שכבות אנדותל באף אחד מהמודלים (איור 1E). נתונים אלה מצביעים על כך שנזק איסכמי-היפוקסי לא היה כה חמור כדי לגרום לשינויים בחדירות הפארא-תאית למולקולות גדולות כגון חלבוני פלזמה.
איור 1: ההשפעות של מחסור בחמצן-גלוקוז על עמידות חשמלית טרנס-אנדותל וחדירות אנדותל במודלים של BBB חד-ערכי, קו-תרבית ומשולשת בבני אדם. (A) ציר זמן סכמטי לקביעת מודל BBB של תרבית תאים ראשונית משולשת. (B) ייצוגים סכמטיים של התצורות עבור מודלי BBB מבוססי תאים ראשוניים אנושיים סטטיים במבחנה . מודל מונוקולטורה מכיל HBMEC שנזרע בצד האפיקלי של הממברנה הנקבובית המוכנסת היטב. תרבית משותפת ללא מגע מכילה HBMEC שנזרע על פני השטח העליונים של התמיכה המוכנסת היטב ו- HA נזרע בתחתית באר התרבית. מודל של תרבית משותפת למגע כולל HBVP שנזרע על המשטח התחתון של תמיכת ההחדרה היטב עם HBMEC על המשטח העליון. עבור מודל התרבית המשולשת, HBMEC נזרע על המשטח העליון של התמיכה כאשר HBVP נזרע על המשטח התחתון ו- HA נזרע בתחתית בארות התרבית. (C) שינויים ב- TEER מנוטרים מיד לפני OGD, לאחר 4 שעות של OGD, ולאחר 24 שעות של חמצון. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n = 5-6). P < 0.0001 בהשוואה למודלים של מונו ותרבות משותפת (ANOVA דו-כיוונית). (D) חדירות פארא-תאית ל-20 kDa FITC-dextran על פני מונו-שכבות אנדותל נמדדה לאחר 4 שעות של OGD. (E) חדירות פארא-תאית ל-70 kDa FITC-dextran על פני מונו-שכבות אנדותל נמדדה לאחר 4 שעות של OGD. נתונים המיוצגים כממוצע ± SD (n = 5-6). *P < 0.05. P < 0.0001 (ANOVA דו-כיווני). קיצורים: OGD = מחסור בחמצן-גלוקוז; TEER = התנגדות חשמלית טרנסאנדותלית; HBMEC = תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האדם; HA = אסטרוציטים אנושיים; HBVP = פריציטים וסקולריים במוח האנושי; FITC-dextran = דקסטרן מצומד לפלואורסצין איזותיוציאנט; ארב. יחידות = יחידות שרירותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כדי לאמת פגיעה היפוקסית הנגרמת על ידי OGD, HBMEC, HA ו- HBVP תורבתו בבארות של צלחות תחתית זכוכית 35 מ"מ והוטענו בריאגנט היפוקסיה, שהאות הפלואורסצנטי שלו עלה עם רמות חמצן מופחתות. כל הסוגים האנושיים העיקריים שנחשפו ל-OGD הפגינו פלואורסצנטיות ירוקה חזקה, מה שמוכיח שהתאים החיים המצולמים היו היפוקסיים (איור 2). לאחר שהערכנו את ההשפעות של סוגי תאים פריווסקולריים שונים (אסטרוציטים ופריציטים), או את שילובם במודל BBB על תכונות המחסום בעקבות פרוטוקול OGD, הגענו למסקנה שהמודל המשולש עדיף על מודלים אחרים של BBB שנבדקו.
איור 2: צביעה חיה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח אנושי היפוקסי, אסטרוציטים אנושיים ופריסיטים של כלי דם במוח האנושי לאחר 4 שעות של מחסור בחמצן-גלוקוז. חשיפות ל-OGD בוצעו על כל התאים הראשוניים (HBMEC, HA ו-HBVP) באמצעות מגיב היפוקסיה ומדיום נטול גלוקוז במשך 4 שעות. מוצגות תוצאות מארבעה ניסויים בלתי תלויים. תרבויות צולמו בהגדלה של פי 20. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: OGD = מחסור בחמצן-גלוקוז; HBMEC = תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האדם; HA = אסטרוציטים אנושיים; HBVP = פריציטים וסקולריים במוח האנושי; DAPI = 4',6-diamidino-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה להקמת מודל BBB אמין של תרבית תאי אנדותל-פריציטים-אסטרוציטים לחקר תפקוד לקוי של BBB בהגדרה של שבץ איסכמי במבחנה. בהתחשב בכך pericytes הם השכנים הקרובים ביותר של תאי אנדותל in vivo, HBVP מצופים על החלק התחתון של מוסיף היטב מודלזה 16. למרות שתצורה זו חסרה את התקשורת הישירה בין תא לתא בין אסטרוציטים לתאי אנדותל, סידור זה מאפשר תקשורת עקיפה בין תא לתא בין סוגי תאים באמצעות גורמים מסיסים מופרשים. נוכחותם של אסטרוציטים ופריסיטים במערכת זו משפרת מאוד את שלמות HBMEC, ומגבילה את החדירות הפרה-תאית של המונולאייר לעוקבים בגודל קטן. בנוסף, לאסטרוציטים ולפריציטים יש השפעה מגנה על HBMEC בתנאי OGD.
בפרוטוקול שפותח, ביצענו אופטימיזציה של יחס התאים (1:1:1) ותערובת בינונית של תרבית עבור התא הבזולטרלי. דגם ה-BBB המשולש הציג ערכי TEER גבוהים כמעט פי 2.5 (239 ± 9 Ω·ס"מ 2) מאשר מונוקולטורת HBMEC בקרה (112 ± 11 Ω·cm2) לאחר 6 ימים של תרבות משותפת, הזמן הדרוש להיווצרות מונולייר HBMEC תקין17,18. ערכי ה- TEER שהושגו במודל משולש זה דומים לאלה שבמודל המשולש האחר שתואר קודם לכן, שבו HA היו במגע עם HBMEC ו- HBVP נזרעו בתחתית בארות הצלחת19. במודל התרבית המשולשת של התאים הראשוניים האנושיים האחרים עם אותה תצורת תאים וזמן חשיפה ל-OGD, ערכי ה-TEER הבסיסיים היו נמוכים משמעותית מאלו שבעבודה זו ולא הגיעו לרמות הסטנדרטיות (100 Ω·ס"מ2)20. השימוש בלוחות 6-well-insert היטב עם תאים גדולים יותר אפשר לנו להפחית את תדירות השינוי הבינוני כדי למנוע את ההפרעה של חילופי חומרים בין אוכלוסיות התאים.
ניסויי OGD בוצעו באמצעות תא אינקובטור היפוקסיה אטום המכיל תערובת גזים אנאירובית (95% חנקן ו-5% פחמן דו חמצני). אחד היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הוא שניתן להתאים בקלות את חומרת הפגיעה האיסכמית לצרכים ספציפיים על ידי שינוי אורך תקופת ה- OGD. לאחר הערכת חדירות ה- TEER והדקסטרן, 4 שעות של OGD לא פגעו בשלמות ה- BBB במודל המשולש שנבנה. לכן, כדי לחקור שבץ איסכמי במבחנה, יש ליישם חשיפה ארוכה יותר ל- OGD כדי לגרום לפירוק BBB. הדמיית תאים חיים, המופיעה בפרוטוקול, מאפשרת ניטור בזמן אמת של סוגי תאים שונים ואימות של פגיעה ב-OGD, המהווה יתרון במחקרים רבים.
בפרוטוקול זה, 0.4 מיקרומטר פוליאסטר מוסיף היטב נבחרו כבסיס למודל BBB משולש זה. קרום פוליאסטר נחשב לסוג ההכנסה הטוב ביותר להדמיית תאים ביישומי הדמיה פלואורסצנטית, המספק הזדמנות מצוינת לדמיין שינויים של חלבוני צומת הדוקים ומובילים במידת הצורך. בעוד שקוטר הנקבוביות הקטנות שנבחר יוצר חדירות נמוכה למולקולות הידרופיליות קטנות על פני מונולרים אנדותליים, הוא גם מגביל את היישום הפוטנציאלי של מודל BBB המשולש הנוכחי עבור מבחני נדידה טרנסאנדותליים, שבהם נדרשים 3 מיקרומטר או 8 מיקרומטר גודל נקבוביות.
לבסוף, מגבלה נוספת של מודל זה יכולה להיות קשורה להיעדר לחץ גזירה, אשר הוכח לקדם את היווצרותם של צמתים הדוקים במערכות BBB דינמיות משולשות במבחנה 21. לסיכום, מודל BBB של תרבית משולשת חזקה ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית, המורכב מתאים אנושיים ראשוניים, מייצג כלי רב ערך לבדיקת תרופות ולחקר תפקוד לקוי של BBB הקשור לשבץ איסכמי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים חשפו כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ו- DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N.
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y.
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
