Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Et "dual-addition" calciumfluorescensassay til high-throughput screening af rekombinante G-proteinkoblede receptorer

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

I dette arbejde beskrives et højt gennemløb, intracellulært calciumfluorescensassay for 384-brøndplader til screening af små molekylebiblioteker på rekombinante G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er). Målet, kininreceptoren fra kvægfeberflåten, Rhipicephalus microplus, udtrykkes i CHO-K1-celler. Dette assay identificerer agonister og antagonister, der bruger de samme celler i et "dual-addition" assay.

Abstract

G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) repræsenterer den største superfamilie af receptorer og er målene for adskillige humane lægemidler. High-throughput screening (HTS) af tilfældige små molekylebiblioteker mod GPCR'er bruges af medicinalindustrien til målspecifik lægemiddelopdagelse. I denne undersøgelse blev en HTS anvendt til at identificere nye småmolekyleligander af hvirvelløse dyrspecifikke neuropeptid-GPCR'er som sonder til fysiologiske undersøgelser af vektorer af dødelige humane og veterinære patogener.

Den hvirvelløse dyrespecifikke kininreceptor blev valgt som mål, fordi den regulerer mange vigtige fysiologiske processer hos hvirvelløse dyr, herunder diurese, fodring og fordøjelse. Desuden er farmakologien hos mange hvirvelløse GPCR'er dårligt karakteriseret eller slet ikke karakteriseret; derfor tilføjer den differentierede farmakologi af disse grupper af receptorer med hensyn til de relaterede GPCR'er i andre metazoer, især mennesker, viden til struktur-aktivitetsforholdet mellem GPCR'er som en superfamilie. Et HTS-assay blev udviklet til celler i 384-brøndplader til opdagelse af ligander af kininreceptoren fra kvægfeberflåten eller den sydlige kvægflåt, Rhipicephalus microplus. Tick kininreceptoren blev stabilt udtrykt i CHO-K1-celler.

Kininreceptoren, når den aktiveres af endogene kininneuropeptider eller andre små molekyleagonister, udløser Ca2+ frigivelse fra calciumbutikker ind i cytoplasmaet. Dette calciumfluorescensassay kombineret med en "dual-addition" tilgang kan detektere funktionelle agonist og antagonist "hit" molekyler i samme analyseplade. Hvert assay blev udført ved hjælp af lægemiddelplader, der bærer en række 320 tilfældige små molekyler. En pålidelig Z'-faktor på 0,7 blev opnået, og tre agonist- og to antagonist-hitmolekyler blev identificeret, når HTS var ved en slutkoncentration på 2 μM. Det calciumfluorescensassay, der rapporteres her, kan tilpasses til at screene andre GPCR'er, der aktiverer Ca2+ signalkaskaden.

Introduction

G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er), som er til stede fra gær til mennesker, repræsenterer den største superfamilie af receptorer i mange organismer1. De spiller afgørende roller i reguleringen af næsten alle biologiske processer hos dyr. Der er 50-200 GPCR'er i leddyrs genom, hvilket betyder, at de repræsenterer den største membranreceptor-superfamilie2. De er klassificeret i seks hovedklasser, A-F, baseret på deres sekvenslighed og funktioner3. GPCR'er transducerer forskellige ekstracellulære signaler, såsom hormoner, neuropeptider, biogene aminer, glutamat, proton, lipoglycoproteiner og fotoner4. GPCR'er kobles til heterotrimer G-proteiner (Gα, Gβ og Gγ) for at transmittere nedstrømssignaler. GPCR'er koblet til Gαs eller Gαi / o-proteiner øger eller reducerer henholdsvis de intracellulære 3', 5'-cykliske adenosinmonophosphatniveauer (cAMP) ved at aktivere eller hæmme adenylylcyclase. GPCR'er koblet til Gαq/11 inducerer calciumfrigivelse fra de endoplasmatiske retikulumcalciumlagre ved at aktivere phospholipase C (PLC)-inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) vejen. GPCR'er koblet til Gα12/13 aktiverer RhoGTPase-nukleotidbyttefaktorer 5,6. GPCR'er er målet for mere end 50% af humane lægemidler og et acaricid, amitraz4. Da GPCR'er transducerer så forskellige signaler, er de lovende mål for udvikling af nye pesticider, der forstyrrer hvirvelløse dyr-specifikke fysiologiske funktioner.

Målet med HTS er at identificere hitmolekyler, der kan modulere receptorfunktioner. HTS involverer analyseudvikling, miniaturisering og automatisering7. Arthropod neuropeptid GPCR'er er involveret i de fleste fysiologiske funktioner, såsom udvikling, smeltning og ecdysis, udskillelse, energimobilisering og reproduktion4. De fleste neuropeptid-GPCR'er af leddyr og metazoer signalerer gennem calciumsignalkaskaden 2,6,8,9,10, såsom i myohæmmende peptid- og SIFamidreceptorer i den sortbenede flåt Ixodes scapularis; deres ligander er antagonistiske i bagtarmmotilitetsanalyser, hvor SIF fremkalder sammentrækning og MIP hæmmer det11,12. En NPY-lignende receptor af gul feber myg, Aedes aegypti, regulerer kvindelig vært søger13. Sammenlignet med andre alternative calciummobiliseringsassays såsom aequorin-calciumbioluminescensanalysen14 er calciumfluorescensanalysen let at udføre, kræver ikke transfektion af andre rekombinante calciumdetekterende proteiner og er omkostningseffektiv. Calciumfluorescensanalysen frembringer et forlænget signal sammenlignet med det hurtige kinetiske signal opnået i aequorincalciumbioluminescensanalysen14,15.

I eksemplet her blev kininreceptoren fra kvægfeberflåten, Rhipicephalus microplus, rekombinant udtrykt i CHO-K1-cellelinjen og anvendt til calciumfluorescensassayet. Der findes kun ét kininreceptorgen i R. microplus; receptoren signalerer gennem en Gq-proteinafhængig signalvej og udløser udstrømningen af Ca2+ fra calciumlagre til det intracellulære rum16. Denne proces kan detekteres og kvantificeres af en fluorofor, som fremkalder et fluorescenssignal ved binding af calciumioner (figur 1).

Kininreceptoren er en hvirvelløse dyr-specifik GPCR, som tilhører klasse A Rhodopsin-lignende receptorer. Kinin er et gammelt signalneuropeptid, der er til stede i Mollusca, Crustacea, Insecta og Acari 4,17,18. Coleopterans (biller) mangler kinin signalsystemet; i myggen Aedes aegypti er der kun en kininreceptor, der binder tre aedeskininer, mens Drosophila melanogaster har en kininreceptor med drosokinin som en unik ligand 19,20,21. Der er ingen homologe kininer eller kininreceptorer hos hvirveldyr. Selvom kinins nøjagtige funktion er ukendt i flåter, viser kininreceptorens RNAi-tavse hunner af R. microplus signifikant reduceret reproduktionsegnethed22. Kininer er pleotropiske peptider i insekter. I Drosophila melanogaster er de involveret i både de centrale og perifere nervereguleringssystemer23, præ-ecdysis24, fodring25, stofskifte 26 og søvnaktivitetsmønstre 26,27 samt larvebevægelse 28. Kinins regulerer hindgut sammentrækning, diurese og fodring i myggen A. aegypti 29,30,31. Kininpeptiderne har et konserveret C-terminalt pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, som er den mindste krævede sekvens for biologisk aktivitet32. Arthropodspecificiteten, den lille størrelse af den endogene ligand, som gør dem modtagelige for småmolekyleinterferens, og de pleiotropiske funktioner i insekter gør kininreceptoren til et lovende mål for skadedyrsbekæmpelse4.

"Dual-addition"-assayet (figur 2) gør det muligt at identificere agonister eller antagonister i samme HTS-assay15. Det er tilpasset fra et "dual-addition" assay, der almindeligvis anvendes i medicinalindustrien til lægemiddelopdagelse33. Kort sagt tillader den første tilsætning af lægemidler i cellepladen identifikation af potentielle agonister i det kemiske bibliotek, når der detekteres et højere fluorescenssignal sammenlignet med anvendelsen af opløsningsmiddelkontrollen. Efter 5 minutters inkubation med disse små molekyler påføres en kendt agonist (kininpeptid) på alle brøndene. De brønde, der tilfældigt modtog en antagonist fra lægemiddelpladen, viser et lavere fluorescenssignal ved agonisttilsætning sammenlignet med kontrolhullerne, der modtog opløsningsmidlet i den første tilsætning. Dette assay tillader derefter identifikation af potentielle agonister og antagonister med de samme celler. I et standard HTS-projekt ville disse hitmolekyler blive yderligere valideret gennem dosis-respons-assays og ved yderligere biologiske aktivitetsassays, som ikke er vist her.

Figure 1
Figur 1: Illustration af calciumfluorescensanalysemekanismen. Gq-proteinet udløser den intracellulære calciumsignalvej. Kininreceptoren (G-proteinkoblet receptor) blev rekombinant udtrykt i CHO-K1-celler. Når agonistenaganden binder til receptoren, aktiverer Gq-proteinet, der er forbundet med kininreceptoren, PLC, som katalyserer omdannelsen af et PIP2-molekyle til IP3 og DAG. IP 3 binder derefter til IP3R på overfladen af det endoplasmatiske retikulum, hvilket fører til frigivelse af Ca 2+ i cytoplasmaet, hvor Ca2+ ioner binder til fluoroforerne og fremkalder et fluorescenssignal. Fluorescenssignalet kan opnås ved excitation ved 490 nm og detekteres ved 514 nm. Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet receptor; PLC = phospholipase C; PIP2 = phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat; IP3 = inositoltrisphosphat; DAG = diacylglycerol; IP3 R = IP3 receptor. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgangen for high-throughput screening af små molekyler på en G-proteinkoblet receptor udtrykt i CHO-K1-celler. (A) Rekombinante CHO-K1-celler, der stabilt udtrykker kininreceptoren, blev tilsat til 384-brøndpladen (10.000 celler / brønd) ved hjælp af et væskehåndteringssystem (25 μL / brønd) og inkuberet i en befugtet CO2 -inkubator i 12-16 timer. (B ) Analysebufferen indeholdende det fluorescerende farvestof (25 μL/hul) blev tilsat cellepladen ved hjælp af et væskehåndteringssystem. Pladen blev inkuberet i 30 minutter ved 37 °C i 30 minutter og ekvilibreret ved RT i yderligere 30 minutter. (C) Baggrundsfluorescenssignalet fra cellerne i hvert hul blev målt med en pladelæser. (D) Lægemiddelopløsninger fra en 384-brønds biblioteksplade og blindopløsningsmiddel (alle ved 0,5 μL / brønd) blev tilsat til den cellulære analyseplade ved hjælp af et væskehåndteringssystem. (E) Cellulære calciumfluorescensresponser blev målt med pladelæseren umiddelbart efter tilsætning af lægemiddelopløsningerne; Forbindelse(r), der fremkaldte fluorescenssignaler, der var højere end gennemsnittet, blev udvalgt som agonisthits. Antagonisthits, der blokerer GPCR (ikonet nedenfor) blev afsløret efter tilsætning af peptidagonisten under trin G. (F) I samme analyseplade blev der efter 5 minutters inkubation af cellerne med screeningsforbindelser tilsat et endogent agonistpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) af flåtkininreceptoren til hvert hul (1 μM). (G) Cellulære fluorescensresponser efter tilsætning af agonistpeptid blev straks målt af pladelæseren. Forbindelse(r), der hæmmer fluorescenssignalet, blev valgt som antagonisthits. Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet receptor; RT = stuetemperatur; RFU = relative fluorescensenheder. Oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vedligeholdelse af celler

BEMÆRK: EN CHO-K1-cellelinje, der stabilt udtrykker kininreceptoren fra R. microplus, kaldet BMLK3, blev udviklet af Holmes et al.16. Detaljerne om cellelinjens udvikling præsenteres andetsteds14. Alle følgende trin udføres under sterile forhold i et klasse II biosikkerhedsskab.

  1. Dyrk den rekombinante cellelinje i selektive medier (F-12K-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum [FBS] og 800 μg / ml G418-sulfat) for at sikre ekspressionen af målreceptoren. Opbevar cellerne, der stabilt udtrykker receptoren, i 1 ml frysemedium (90% FBS og 10% dimethylsulfoxid [DMSO]) i en 2 ml kryovial i en -80 °C fryser.
    BEMÆRK: Ved langtidsopbevaring af de frosne celler opbevares de i flydende nitrogen.
  2. Forvarm alle medier før cellekultur. I et biosikkerhedsskab overføres 13 ml forvarmet selektivt medium (F-12K-medium indeholdende 10% FBS og 800 μg / ml G418-sulfat) til en T-75-kolbe og opbevares i biosikkerhedsskabet. Et hætteglas med de frosne BMLK 3-celler (~1,5 × 106 celler) tøs op i et 37 °C vandbad i2-3 min. Overfør de optøede celler til T-75-kolben. Cellerne opbevares i en befugtet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2, medmindre andet er angivet.
  3. Når cellerne når 90% sammenløb (1-2 dage), forvarmes alle medier til 37 °C undtagen Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS), som holdes ved stuetemperatur. I et biosikkerhedsskab fjernes det brugte medium fra T-75-kolben, cellerne vaskes i 5 s med 10 ml DPBS ved at hvirvle kolben forsigtigt og derefter fjernes DPBS med en serologisk pipette.
    BEMÆRK: Et billede af CHO-K1-celler ved 90% sammenløb er vist i Lu et al.14.
  4. Cellerne løsnes fra T-75-kolben ved tilsætning af 2 ml 0,25% trypsin-EDTA, og inkuberes i 3-5 minutter ved 37 °C i inkubatoren. Derefter tilsættes 8 ml selektivt medium, og blandes godt ved pipettering og frigivelse forsigtigt 2x-3x med den samme serologiske pipette.
  5. 2 ml af cellesuspensionen (~1 × 106 celler) overføres fra trin 1.4 til en ny T-75-kolbe indeholdende 10 ml varmt, selektivt medium. Vok cellerne i 1-2 dage i inkubatoren, indtil de når 90% sammenløb.
  6. Brug cellerne til analysen ved at følge de næste trin, eller gentag trin 1.4-1.5 en eller to gange, før du bruger cellerne i assayet.
    BEMÆRK: Overskrid ikke tre til fire passager, da analysesignalet med visse cellelinjer kan blive svagere med yderligere passager.

2. Calciumfluorescensanalyse

  1. Overtræk cellepladen.
    1. Brug et væskehåndteringssystem placeret inde i et biosikkerhedsskab til alle pipetteringstrin i pladerne med 384 brønde. Opret brugerdefinerede programmer til pipettering i 384-brøndpladerne31 (supplerende tabel S1). Overtræk de sterile 384-brøndplader på forhånd. I et biosikkerhedsskab fyldes 10 μL/hul af en vandig opløsning af Poly-D-lysin (PDL) ved 0,05 mg/ml i hver plade, og der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Tøm pladen ved hurtigt at vende pladen og forsigtigt tørre den på sterile køkkenrulle. Skyl derefter hver brønd med 10 μL vand, tøm pladen, og lad pladen tørre i biosikkerhedsskabet natten over uden låg. Luk pladen med låget, og opbevar den ved 4 °C i køleskabet.
      BEMÆRK: De coatede plader kan opbevares ved 4 °C i op til 6 måneder.
  2. Dag 1
    1. Tag lægemiddelpladen ud (100 μM i 90% DPBS + 10% DMSO, den endelige koncentration i brønden for HTS vil være 2 μM), der opbevares i -20 °C fryseren, og læg den ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Lægemiddelpladens layout: Hver 384-brøndplade (24 kolonner x 16 rækker) indeholder 320 brønde med forskellige biblioteksforbindelser og 64 brønde med blindopløsningsmiddel (DPBS indeholdende 10% DMSO), som er arrangeret i fire kolonner med to kolonner på kanten af hver side. Se supplerende tabel S2 for pladelayout.
    2. Når cellerne når ~70%-90% sammenløbet i T-75-kolben, løsnes cellerne fra T-75-kolben som beskrevet nedenfor. Forvarm alle medier til 37 °C undtagen DPBS (stuetemperatur).
      1. Fjern det brugte medium, vask cellerne med 10 ml DPBS, og fjern derefter DPBS. Cellerne løsnes fra T-75-kolben ved hjælp af 2 ml 0,25% trypsin-EDTA i 3-5 minutter ved 37 °C i inkubatoren, tilsættes 8 ml selektivt medium, og cellesuspensionen overføres til et 15 ml konisk rør for at centrifugere ved 1.000 × g i 3 minutter.
      2. Supernatanten kasseres, og cellepelletsen resuspenderes i 10 ml F-12K-medium indeholdende 1% FBS og 400 μg/ml G418-sulfat. Opbevar suspensionen i biosikkerhedsskabet, mens celletallet bestemmes.
    3. Bestem suspensionens celletæthed for yderligere fortynding: Bland 20 μL cellesuspension i 20 μL 0,4% trypanblåt, og læg derefter 20 μL af blandingen i et celletællekammer, der skal læses af en celletæller for celletæthed.
    4. Cellesuspensionen fortyndes i samme medium (F-12K-medium indeholdende 1% FBS og 400 μg/ml G418-sulfat) til et slutvolumen på mindst 15 ml ved en densitet på 4 × 105 celler/ml.
    5. Frø cellerne i den PDL-belagte 384-brøndplade. Overfør 15 ml af ovennævnte cellesuspension (4 × 105 celler/ml) til et 150 ml autovenligt reagensreservoir. Fordel 25 μL af cellesuspensionen (~ 10.000 celler / brønd) i hvert hul i pladens 384 brønde ved hjælp af et væskehåndteringssystem i to trin. Hæld 384/12,5 μL spidser med lav retentions på væskehåndteringshovedet, aspirer 12,5 μL fra beholderen (hastighed 5,2 μL/s), og hæld dem ud i hvert hul (hastighed: 3,1 μL/s).
    6. Ompipetten gentages som i foregående trin 2.2.5 for at nå op på 25 μL pr. hul. Derefter inkuberes pladen natten over (14-16 timer) ved 37 °C og 5% CO2 i den befugtede inkubator.
      BEMÆRK: Da det maksimale pipetteringsvolumen er 12,5 μL for dette specifikke løftehøjde, udføres pipettering for 25 μL i to trin.
  3. Dag 2
    1. Næste morgen skal du kontrollere den overdækkede celleplade under et mikroskop; Hvis det ikke flyder sammen, skal du vente, indtil cellerne når 90% sammenløb.
    2. Forbered en stamopløsning af fluorescerende farvestof: Resuspender frysetørret fluorescerende farvestof i 100 μL DMSO, og undgå direkte lys på stamopløsningen. Pak røret ind med aluminiumsfolie for at forhindre fotoblegning.
      BEMÆRK: Lageret kan aliquoteres i 15 μL alikvoter for hver pladeanalyse for at undgå gentagen frysning og optøning; alikvoterne kan opbevares ved -80 °C i op til 1 måned.
    3. I biosikkerhedskabinettet med lyset slukket skal du forberede ilægning af farvestof (1x) i et 15 ml konisk rør indpakket med aluminiumsfolie, der kombinerer 15 μL af stamopløsningen af fluorescerende farvestof (fra trin 2.3.2) og resten af de forvarmede kitkomponenter (37 °C): 13,5 ml 1x HHBS (Hanks buffer med 20 mM HEPES) og 1,5 ml reagens B (farvestofeffluxhæmmer).
      BEMÆRK: Rumlyset er tændt under dette trin.
    4. Luk røret og bland godt ved forsigtigt at vende røret flere (typisk 3-5x) gange.
      BEMÆRK: Opbevares ved stuetemperatur, og brug farveblandingen inden for 30 minutter.
    5. Når cellerne når 90% sammenløb, skal du fjerne det brugte medium fra 384-brøndens analyseplade ved hurtigt at vende pladen og forsigtigt blotte på sterile papirhåndklæder; Gentag denne bevægelse 2x-3x for at fjerne al væsken fra pladen. Kassér de våde håndklæder.
    6. Sluk for de fleste kunstige direkte lys i rummet (lad en blød, svag bordlampe være tændt eller lignende for at tillade synlige arbejdsforhold) og i biosikkerhedsskabet i alle trin indtil slutningen af analysen (ca. 1,5 time).
    7. 15 ml af påfyldningsfarvestoffet (1x) fra trin 2.3.3 anbringes i et 150 ml autovenligt reservoir.
      1. Overfør 25 μL af påfyldningsfarvestoffet (1x) fra beholderen til hvert hul ved hjælp af et væskehåndteringssystem med 384/12,5 μL spidser med lav retentionsspids ved at dispensere 12,5 μL i hvert hul på pladen (aspirations- og dispenseringshastighed: 3,8 μL/s).
    8. Omrøringstrinnet gentages som i punkt 2.3.7.1 for at opnå et slutvolumen på 25 μL i hvert hul på pladen. Dæk og pakk pladen med aluminiumsfolie for at beskytte den mod omgivende lys.
    9. Den tildækkede celleplade inkuberes ved 37 °C i den CO2 befugtede inkubator i 30 min, fjernes fra inkubatoren, og den afbalanceres ved stuetemperatur inde i pladelæseren eller på bænken, idet pladen holdes dækket og indpakket med folie i yderligere 30 minutter. Cellerne er derefter klar til high-throughput screening (HTS).
    10. Kemisk præparation: Drej lægemiddelpladen fra trin 2.2.1 ved 1.200 × g i en pladecentrifuge i 1 min ved stuetemperatur.
      1. Forbered en 10x agonistpeptidopløsning af Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) (10 μM) ved at resuspendere 100 nmol frysetørret peptid i 10 ml 1x HHBS indeholdende 0,1% DMSO, og overfør opløsningen til et 150 ml autovenligt reservoir.
    11. Mål baggrundssignalet: For hele HTS-analysen i pladelæseren skal du under Protokoller vælge slutpunktsfluorescenstilstand.
      BEMÆRK: Det fluorescerende signal aflæses fra bunden af pladen ved excitations-/emissionsbølgelængder på 495 nm/525 nm.
      1. Indsæt cellepladen i pladelæseren. I instrumentpanelet skal du vælge justeringsforstærkning, vælge en tilfældig brønd på pladen, tildele den som 5% -10% af den maksimale målbare fluorescensværdi og vælge justere (læse) højde.
      2. Klik på start måling for at læse hele pladen for baggrundsfluorescenssignalet i relative fluorescensenheder (RFU).
    12. Analyse af "dobbelt tilføjelse"
      1. Brug væskehåndteringssystemet med 384/12,5 μL spidser til at blande lægemiddelopløsningen i hvert hul på lægemiddelpladen, pipette 3x op og ned 10 μL af lægemiddelopløsningen (i DPBS indeholdende 10% DMSO) (pipetteringshastighed: 5,2 μL / s) og "aspirere" 1,5 μL fra hvert hul på lægemiddelpladen (aspirationshastighed: 1,0 μL / s).
      2. "Dispenser" 0,5 μL af forbindelserne i celleanalysepladen (pipetteringshastighed: 1 μL / s) for at nå en slutkoncentration på 2 μM i 0,2% DMSO.
      3. Anbring analysepladen straks i pladelæseren efter tilsætning af screeningsforbindelserne. Læs den samme plade i både fremadgående og baglæns læseretning. For at få disse udlæsninger skal du definere et program, der skal læses fra "brønd 1-384" og straks fra "384-1".
        BEMÆRK: Udlæsningen i begge retninger tager 2 minutter i alt. Dette udlæsningsdesign skal kompensere for faldet i signalstyrken, der opstår under pladeaflæsning i hver retning. Se trin 3.1 for udlæsningsanalyserne.
      4. Bortskaf de resterende 1 μL lægemiddelopløsning i spidserne ved at nedsænke spidserne i et 150 ml affaldsreservoir indeholdende ~ 50 ml DPBS (dispenseringshastighed: 1,0 μL / s).
      5. Inkuber screeningsforbindelserne med cellerne i alt 5 minutter (inklusive de 2 minutters pladeaflæsning) ved stuetemperatur i biosikkerhedsskabet med lyset slukket. Der tilsættes 3 μL agonistpeptid, Rhimi-K-1 (QFSPWGamid), fra reservoiret (aspirationshastighed: 3,1 μL/s) til analysepladen ved hjælp af væskehåndteringssystemet (dispenseringshastighed: 3,1 μL/s) med 384/12,5 μL spidser.
      6. Pladen anbringes i pladelæseren umiddelbart efter tilsætning af agonistkantitet. Pladen aflæses både fremad og bagud ved hjælp af samme program som i trin 2.3.12.3

3. Analyse af data

  1. Brug analysesoftwaren, der er knyttet til pladelæseren, der er installeret på en computer, til at beregne de cellulære fluorescensresponser (i RFU) for begge aflæsninger efter den første sammensatte tilsætning (Første læsning; RFUsiden [Supplerende tabel S2]) og efter agonisttilføjelsestrinnene (Anden læsning = RFUant [Supplerende tabel S2]). Hver aflæsning opnås ved at beregne gennemsnittet af de to værdier, der opnås (ikke vist) ved for- og bakpladeaflæsningerne fra henholdsvis trin 2.3.12.3 og trin 2.3.12.6.
    BEMÆRK: RFU siden henviser RFUant til henholdsvis de relative fluorescensenheder for de potentielle agonisthits (læs i trin 2.3.12.3) og de potentielle antagonisthits (læs i trin 2.3.12.6).
  2. Eksporter alle tre datasæt, RFU bg, RFU ago og RFUant, fra analysesoftwaren til tre separate regneark. Hvert regneark har kun to kolonner: brøndposition og rå RFU (filer, der ikke vises her).
    BEMÆRK: RFU bg henviser til RFU'en for baggrunden læst i trin 2.3.11.2.
  3. Formatér dataene fra de tre regneark, og organiser ovenstående data i én csv-fil (se eksemplet i supplerende tabel S2). Træk baggrundssignalet læst fra henholdsvis RFU siden og RFU ant (G og H kolonner i supplerende tabel S2).
  4. Importer csv-filen til en kommercielt tilgængelig "online HTS-dataplatform" (se materialetabellen) til downstream-dataanalyse (tabel 1) og lagring.
  5. Z'-faktoren beregnes manuelt til kvalitetskontrol af hvert pladeassay ved hjælp af ligning (1):
    Ligning (1):
    Equation 1(1)
    BEMÆRK: μ c- og μc+ repræsenterer de gennemsnitlige RFU'er for aflæsninger af de samme huller, der tjener som negative kontroller i den første tilsætning efter tilsætning af opløsningsmidlet (blindopløsningsmiddel, n = 64; tal i blåt i supplerende tabel S2) og tjener som positive kontroller efter tilsætning af agonisten (blindopløsningsmiddel + agonist, n = 64; tal i magenta) henholdsvis. Derudover repræsenterer σ c- og σc+ deres tilsvarende standardafvigelser (SD'er).
  6. Vælg manuelt hitmolekylerne fra varmekortene på "online HTS-dataplatformen", og beregn den normaliserede procentaktivering (NPA) og hæmmende aktivitet (Io) for agonisthits og antagonisthits ved hjælp af ligning (2) og ligning (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En intern lægemiddelplade (SAC2-34-6170) sammensat af 320 tilfældige små molekyler blev brugt til at demonstrere dette HTS-assay som et eksempel. HTS havde fremragende analysekvalitet med en Z'-faktor på 0,7 (tabel 1). Denne Z'-faktor afspejler analysekvaliteten uafhængig af de testede forbindelser34. En Z′-faktor på 0,5 eller højere angiver et godt dynamisk område for analysesignaler mellem RFU'erne for de positive kontroller og de negative kontroller. Assays med en Z'-faktor mindre end 0,5 har et suboptimalt signaldynamisk område, er normalt ikke informative til hitvalg og kasseres derfor. Responsen (målt i relative fluorescensenheder, RFU) fra positive kontroller (gennemsnitlig RFU på 64 positive kontrolresponser, μc+ = 130.139) var i gennemsnit 19 gange højere end responsen for de negative kontroller (gennemsnitlig RFU på 64 negative kontrolresponser, μc- = 6.675). Afskæringsfluorescensen for valg af "agonisthits" her blev sat til et normaliseret procentaktivering (NPA) max-forhold på >50%. Afskæringsfluorescensen til udvælgelse af "antagonisthits" blev indstillet til en observeret hæmmende aktivitet (Io) på >50%. Tre agonisthitmolekyler og to antagonisthits blev udvalgt: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%) og SACC-0006532 (NPA = 152%) som agonister og SACC-0103392 (I o = 53%) og SACC-0041280 (I o = 56%) som antagonister (rådataene er vist i supplerende tabel S2). Eksempler på beregninger af NPA og Io for henholdsvis agonister (grønne rækker) og antagonister (orange rækker) er vist i supplerende tabel S2.

Sammensat tilsætning μs1 σs μc- σc- Z' værdi
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Tilsætning af agonistpeptid μs σs μC+ σC+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tabel 1: Oversigt over de normaliserede celleresponser fra hele pladen i HTS-assayet. Middelværdien (μ) og standardafvigelsen (σ) opnås fra CDD-boksanalysen. Forkortelser: HTS = high-throughput screening; RFU'er = relative fluorescensenheder; 1s (prøver) = 320 testede forbindelser; μs = gennemsnitsværdien af cellulære responser (RFU'er) fra 320 brønde; μc- = gennemsnitsværdien af RFU'er fra negative kontroller μc+ = gennemsnitsværdien af RFU'er fra positive kontroller σs = standardafvigelse af cellulære responser (RFU'er) fra 320 brønde; σc- = RFU'ers standardafvigelse fra negative kontroller σc+ = RFU'ers standardafvigelse fra positive kontroller.

Supplerende tabel S1: Brugerdefinerede programmer i væskehåndteringssystemet til de automatiske pipetteringstrin. Denne tabel blev ændret fra Xiong et al.31. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S2: De rå data for de repræsentative resultater. De rækker, der er fremhævet med grønt, repræsenterer agonisthits, og rækkerne fremhævet med orange repræsenterer antagonisthits. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med HTS er at identificere hitmolekyler gennem screening af et massivt antal små molekyler. Derfor repræsenterer resultaterne fra dette eksempel kun en lille del af et konventionelt HTS-eksperiment. Desuden skal de identificerede hitmolekyler valideres i downstream-assays, såsom et dosisafhængigt assay på den samme rekombinante cellelinje og på en CHO-K1-cellelinje, der kun bærer den tomme vektor, som kan udføres samtidigt for at redde små molekyler. Cytotoksicitetsanalyser vil hjælpe med at demonstrere, at manglende respons i den anden tilsætning ikke skyldes celledødelighed. Andre bioassays bør udføres for at validere aktiviteten i de isolerede væv in vitro eller ved at anvende eller fodre levende leddyr med de små molekyler. Den komplette pipeline af småmolekyleligandidentifikation af tick kinin-receptoren findes i en tidligere publikation31. Gennem denne pipeline blev i alt 36 antagonisthits af tick kinin-receptoren identificeret. Tre af disse antagonister blev yderligere testet i et vævskontraktionshæmningsassay og viste antimyotrop aktivitet på myggens bagtarm, hvor ortologe myggekininreceptorer udtrykkes31.

Hver GPCR-ekspressiv cellelinje skal valideres for egnede eksperimentelle betingelser, før HTS udføres. Disse betingelser inkluderer celletætheden (10.000 celler pr. Brønd), koncentrationen af de screenede forbindelser (2 μM), den endelige DMSO-koncentration (0,2%) i analysen, koncentrationen af agonistliganden, der anvendes til den anden tilsætning (1 μM), pipetteringshastigheden og -dybden og aflæsningstiden efter tilsætningen af agonistpeptidet (5 min). Det er afgørende at justere dybden og hastigheden af væskehåndteringssystemet for at sikre, at dispenseringstrinnene ikke forstyrrer cellerne, hvis cellerne klæber. Valideringen af disse betingelser, før du går i gang med HTS, vil hjælpe med fejlfinding, hvis analysekvaliteten er dårlig. Det er vigtigt at have cellerne under optimale forhold: cellerne skal nå 90% -100% sammenløb, men ikke være overflydende i cellepladen, når de bruges til HTS. Hvis baggrundssignalerne i visse brønde er unormalt lave eller høje, efter at de under mikroskopet er bekræftet for åbenlyst lav eller høj celletæthed, skal outliers fjernes manuelt, når dataene analyseres. Før calciumfluorescensanalysen tilpasses HTS, skal det positive peptids kinetiske kurve være kendt, da cellernes kinetiske respons på agonistpeptidet skal vare i 1-2 minutter, for at det kan tilpasses til et HTS-assay og vare længe nok til at læse hele pladen. For at opnå det langvarige signal skal der påføres en relativt høj koncentration af agonistpeptidet, eller en højere celletæthed skal testes. Hvis det kinetiske respons af visse receptorceller er for kort (varer mindre end 1 min), anbefales det at læse hurtigere i slutpunktsaflæsningen eller kun bruge en del af pladen til HTS. Kvaliteten af den rekombinante cellelinje med hensyn til niveauet af receptorekspression er bestemt afgørende for succes. Forskellige klonale cellelinjer vil sandsynligvis variere, da indsættelsen af plasmidet er tilfældig i genomet, og dette kan helt sikkert påvirke receptorekspression. Det ville være ideelt at inkorporere en tidlig calciumfluorescenstest af den transfekterede pool og under processen med at vælge klonale cellelinjer.

Begrænsningen af calciumfluorescensanalysen er, at den måler aktiviteten af de sekundære budbringere i stedet for den direkte binding af liganden til receptoren. Selvom det er muligt at udelukke off-target agonist hits ved at screene hitmolekylerne på cellerne, der ikke udtrykker målreceptoren, er det umuligt fuldstændigt at udelukke off-target antagonist hit molekyler ved hjælp af dette assay, fordi det er muligt, at nogle molekyler kan hæmme de cellulære calciumfrigivelsesveje nedstrøms for GPCR-signaleringen. Derfor er der behov for yderligere validering ved anvendelse af enten et ligandbindingsassay eller et bioassay til validering på organismeniveau, såsom i et flåtvævsassay med en kendt agonist, som tidligere gjort med myg31.

De fleste funktionelle assays, der detekterer GPCR-aktivering, måler primært intracellulære hændelser i to hovedsignalveje: G-proteinafhængige og G-proteinuafhængige veje. G-proteinafhængige assays måler Ca2+, inositoltrifosfat (IP3) eller cAMP-koncentrationer, mens G-proteinuafhængige assays primært detekterer receptorhandel eller rekruttering β-arrestin7. Forskellige assays anvender forskellige teknologier til udlæsninger, såsom Ca 2+-følsomme farvestoffer (fluorescensassays), fotoproteiner såsom aequoriner (Ca2+ bioluminescensassays)14, mærkede fluorescensproteiner, fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)-baserede assays, bioluminescensresonansenergioverførsel (BRET)-baserede assays eller etiketfri optiske biosensorbaserede cellulære assays. Disse analyser og de tilsvarende tilgængelige udlæsningsteknologier blev gennemgået i detaljer af Zhang og Xie35. Nogle assays gælder for alle GPCR'er, og nogle er specifikke for visse GPCR'er (f.eks. Ca2+-analysen for Gq-koblede receptorer, cAMP for Gi/o- eller Gs-koblede receptorer). Ved promiskuøst at co-udtrykke visse G-proteiner med receptoren i de rekombinante celler kan signalvejen imidlertid ændres. For eksempel kan Gq15/16-proteiner udtrykkes sammen med ikke-Gq-koblede receptorer til PLC-IP3-Ca 2+ signaldetektion 7,36. I modsætning til analyserne, der måler en enkelt molekylær begivenhed, er der analyser med højt indhold, der indsamler en massiv mængde biologiske data for at forbedre ligandspecificiteten37. Denne type analyse er også mere kompleks og dyr at udføre7.

I hvirvelløse undersøgelser registrerer de mest anvendte funktionelle assays GPCR-aktivering ved at analysere udsvingene i koncentrationerne af anden budbringere, såsom Ca2+ eller cAMP. På grund af forskellene i signalvejene mellem pattedyr og hvirvelløse dyr er de fleste af de andre ovennævnte udlæsningsteknologier endnu ikke blevet bredt anvendt til GPCR-undersøgelser af hvirvelløse dyr. G-proteiner er dog relativt konserverede i hele dyreriget. For nylig viste Lismont et al.38, at nogle humane BRET-baserede G-proteinbiosensorer også kan tilpasses til at detektere aktiveringen af et insekt-GPCR, når de udtrykkes sammen i receptorrekombinante celler. Ved at co-udtrykke hver af de forskellige G-proteinbaserede biosensorer (Gs, Gi/o, G q/11 eller G12/13) med specifikke GPCR'er kan G-proteinkoblingsmekanismen belyses. I undersøgelsen af Lismont et al.38 kunne Schgr-CRF-DH dosisafhængig aktivere Gi / o og G q / 11 biosensorer og aktiveredeikke G s og G12/13 biosensorerne.

Samlet set tillader calciumfluorescensanalysen udført i en 384-brøndplade i kombination med den her beskrevne "dual-addition" -tilgang screening af titusinder af molekyler på relativt kort tid. Dette er en relativt tids- og omkostningseffektiv tilgang til at opdage hitmolekyler til downstream-valideringer og applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Award number 2022-67015-36336, PVP [Project Director]) og fra konkurrencedygtige midler fra Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) til P.V.P. A.W.E.S.O.M.E. fakultetsgruppen ved College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, anerkendes for hjælp til redigering af manuskriptet. Supplerende tabel S2 indeholder data fra et internt, tilfældigt, lille molekylebibliotek hentet fra Dr. James Saccettinis laboratorium ved Texas A &M University og Texas A &M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).

Tags

Biokemi nr. 190
Et "dual-addition" calciumfluorescensassay til high-throughput screening af rekombinante G-proteinkoblede receptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio,… More

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (190), e64505, doi:10.3791/64505 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter