Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

I dette arbeidet beskrives en intracellulær kalsiumfluorescensanalyse med høy gjennomstrømning for 384-brønnplater for å skjerme små molekylbiblioteker på rekombinante G-proteinkoblede reseptorer (GPCR). Målet, kininreseptoren fra storfefeberflåtten, Rhipicephalus microplus, uttrykkes i CHO-K1-celler. Denne analysen identifiserer agonister og antagonister som bruker de samme cellene i en "dual-addisjon" -analyse.

Abstract

G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) representerer den største superfamilien av reseptorer og er målene for mange humane legemidler. High-throughput screening (HTS) av tilfeldige småmolekylbiblioteker mot GPCR brukes av farmasøytisk industri for målspesifikk legemiddeloppdagelse. I denne studien ble en HTS ansatt for å identifisere nye småmolekylære ligander av virvelløse spesifikke neuropeptid GPCRs som prober for fysiologiske studier av vektorer av dødelige humane og veterinære patogener.

Den virvelløse spesifikke kininreseptoren ble valgt som et mål fordi den regulerer mange viktige fysiologiske prosesser hos virvelløse dyr, inkludert diurese, fôring og fordøyelse. Videre er farmakologien til mange virvelløse GPCR-er dårlig karakterisert eller ikke karakterisert i det hele tatt; Derfor gir differensiell farmakologi av disse gruppene av reseptorer med hensyn til de relaterte GPCR-ene i andre metazoer, spesielt mennesker, kunnskap til struktur-aktivitetsforholdene til GPCR som en superfamilie. En HTS-analyse ble utviklet for celler i 384-brønnplater for påvisning av ligander av kininreseptoren fra storfefeberflåtten, eller sørlig storfeflått, Rhipicephalus microplus. Tick kinin-reseptoren ble stabilt uttrykt i CHO-K1-celler.

Kininreseptoren, når den aktiveres av endogene kininneuropeptider eller andre småmolekylære agonister, utløser Ca2+ frigjøring fra kalsiumlagre i cytoplasma. Denne kalsiumfluorescensanalysen kombinert med en "dual-addisjon" -tilnærming kan oppdage funksjonelle agonist- og antagonist "hit" -molekyler i samme analyseplate. Hver analyse ble utført ved hjelp av stoffplater som bærer en rekke 320 tilfeldige små molekyler. En pålitelig Z-faktor på 0,7 ble oppnådd, og tre agonist- og to antagonisttreffmolekyler ble identifisert når HTS var ved en 2 μM endelig konsentrasjon. Kalsiumfluorescensanalysen som er rapportert her, kan tilpasses for å skjerme andre GPCR-er som aktiverer Ca2+ -signalkaskaden.

Introduction

G-proteinkoblede reseptorer (GPCR), som er tilstede fra gjær til mennesker, representerer den største superfamilien av reseptorer i mange organismer1. De spiller kritiske roller i å regulere nesten alle biologiske prosesser hos dyr. Det er 50-200 GPCR-er i genomet til leddyr, noe som betyr at de representerer den største membranreseptor-superfamilien2. De er klassifisert i seks hovedklasser, A-F, basert på deres sekvenslikhet og funksjoner3. GPCR transduserer forskjellige ekstracellulære signaler, for eksempel hormoner, neuropeptider, biogene aminer, glutamat, proton, lipoglykoproteiner og fotoner4. GPCRs kobles til heterotrimer G-proteiner (Gα, Gβ og Gγ) for å overføre nedstrøms signaler. GPCR koblet til Gαs- eller Gαi/o-proteiner øker eller reduserer henholdsvis de intracellulære 3', 5'-sykliske adenosinmonofosfatnivåene (cAMP) ved å aktivere eller hemme adenylylsyklase. GPCR koblet til Gαq / 11 induserer kalsiumfrigivelse fra endoplasmatiske retikulumkalsiumlagre ved å aktivere fosfolipase C (PLC) -inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) -banen. GPCRs koblet til Gα12/13 aktiverer RhoGTPase nukleotidutvekslingsfaktorer 5,6. GPCR er målet for mer enn 50% av humane legemidler og et akaricid, amitraz4. Som GPCRs transduserer så forskjellige signaler, er de lovende mål for å utvikle nye plantevernmidler som forstyrrer hvirvelløse spesifikke fysiologiske funksjoner.

Målet med HTS er å identifisere treffmolekyler som kan modulere reseptorfunksjoner. HTS innebærer analyseutvikling, miniatyrisering og automatisering7. Leddyr neuropeptid GPCR er involvert i de fleste fysiologiske funksjoner, som utvikling, smelting og ecdysis, utskillelse, energimobilisering og reproduksjon4. De fleste neuropeptid GPCRs av leddyr og metazoer signaliserer gjennom kalsiumsignalkaskaden 2,6,8,9,10, slik som i myoinhibitorisk peptid og SIFamidreseptorer av blacklegged tick Ixodes scapularis; deres ligander er antagonistiske i hindgut motilitetsanalyser, med SIF som fremkaller sammentrekning og MIP hemmer det11,12. En NPY-lignende reseptor av gulfebermyggen, Aedes aegypti, regulerer kvinnelig vert som søker13. Sammenlignet med andre alternative kalsiummobiliseringsanalyser som aequorin kalsiumbioluminescensanalyse14, er kalsiumfluorescensanalysen enkel å utføre, krever ikke transfeksjon av andre rekombinante kalsiumdetekterende proteiner, og er kostnadseffektiv. Kalsiumfluorescensanalysen gir et langvarig signal sammenlignet med det raske kinetiske signalet oppnådd i aequorin kalsiumbioluminescensanalysen14,15.

I eksemplet her ble kininreseptoren fra storfefeberflåtten, Rhipicephalus microplus, rekombinant uttrykt i CHO-K1-cellelinjen og brukt til kalsiumfluorescensanalysen. Det er bare ett kininreseptorgen som finnes i R. microplus; reseptoren signaliserer gjennom en Gq-proteinavhengig signalvei og utløser utstrømningen av Ca2+ fra kalsiumlagre inn i det intracellulære rommet16. Denne prosessen kan detekteres og kvantifiseres av en fluorofor, som fremkaller et fluorescenssignal ved binding av kalsiumioner (figur 1).

Kininreseptoren er en virvelløse spesifikk GPCR, som tilhører klasse A Rhodopsin-lignende reseptorer. Kinin er et gammelt signalnevropeptid som er tilstede i Mollusca, Crustacea, Insecta og Acari 4,17,18. Coleopterans (biller) mangler kinin signalsystemet; i myggen Aedes aegypti er det bare en kininreseptor som binder tre aedeskininer, mens Drosophila melanogaster har en kininreseptor med drosokinin som en unik ligand 19,20,21. Det er ingen homologe kininer eller kininreseptorer hos vertebrater. Selv om den eksakte funksjonen til kinin er ukjent i flått, viser kininreseptoren RNAi-stille kvinner av R. microplus betydelig redusert reproduktiv kondisjon22. Kininer er pleotropiske peptider i insekter. I Drosophila melanogaster er de involvert i både sentrale og perifere nervereguleringssystemer23, pre-ecdysis24, fôring 25, metabolisme 26 og søvnaktivitetsmønstre26,27, samt larvebevegelse 28. Kinins regulerer hindgut sammentrekning, diurese og fôring i mygg A. aegypti 29,30,31. Kininpeptidene har et konservert C-terminalt pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, som er den minste nødvendige sekvensen for biologisk aktivitet32. Leddyrspesifisiteten, den lille størrelsen på den endogene liganden, som gjør dem mottagelige for småmolekylær interferens, og de pleiotropiske funksjonene i insekter, gjør kininreseptoren til et lovende mål for skadedyrsbekjempelse4.

Analysen "dual-addition" (figur 2) gjør det mulig å identifisere agonister eller antagonister i samme HTS-analyse15. Den er tilpasset fra en "dual-addisjon" analyse som ofte brukes i farmasøytisk industri for narkotikaforskning33. Kort sagt, den første tilsetningen av legemidler i celleplaten tillater identifisering av potensielle agonister i det kjemiske biblioteket når et høyere fluorescenssignal oppdages sammenlignet med anvendelsen av løsningsmiddelkontrollen. Etter 5 minutters inkubasjon med disse små molekylene påføres en kjent agonist (kininpeptid) på alle brønnene. De brønnene som tilfeldig mottok en antagonist fra legemiddelplaten, viser et lavere fluorescenssignal ved agonisttilsetning sammenlignet med kontrollbrønnene som mottok løsningsmidlet i det første tillegget. Denne analysen tillater deretter identifisering av potensielle agonister og antagonister med de samme cellene. I et standard HTS-prosjekt vil disse treffmolekylene bli ytterligere validert gjennom dose-respons-analyser og ved ytterligere biologiske aktivitetsanalyser, som ikke er vist her.

Figure 1
Figur 1: Illustrasjon av kalsiumfluorescensanalysemekanismen. Gq-proteinet utløser den intracellulære kalsiumsignalveien. Kininreseptoren (G-proteinkoblet reseptor) ble rekombinant uttrykt i CHO-K1-celler. Når agonistliganden binder seg til reseptoren, aktiverer Gq-proteinet assosiert med kininreseptoren PLC, som katalyserer omdannelsen av et PIP2-molekyl til IP3 og DAG. IP 3 binder seg deretter til IP3R på overflaten av endoplasmatisk retikulum, noe som fører til frigjøring av Ca 2+ i cytoplasma, hvor Ca2+ ioner binder seg til fluoroforene og fremkaller et fluorescenssignal. Fluorescenssignalet kan oppnås ved eksitasjon ved 490 nm og detekteres ved 514 nm. Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet reseptor; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositoltrisfosfat; DAG = diacylglycerol; IP 3 R = IP3-reseptor. Laget med BioRender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Arbeidsflyten for høy gjennomstrømningsscreening av små molekyler på en G-proteinkoblet reseptor uttrykt i CHO-K1-celler. (A) Rekombinante CHO-K1-celler som stabilt uttrykker kininreseptoren ble tilsatt platen med 384 brønner (10 000 celler/brønn) ved hjelp av et væskehåndteringssystem (25 μL/brønn) og inkubert i en fuktet CO 2-inkubator i 12-16 timer. (B ) Analysebufferen som inneholder det fluorescerende fargestoffet (25 μL / brønn) ble tilsatt i celleplaten ved hjelp av et væskehåndteringssystem. Platen ble inkubert i 30 minutter ved 37 °C i 30 minutter og likevektet ved RT i ytterligere 30 minutter. (C) Bakgrunnsfluorescenssignalet til cellene i hver brønn ble målt med en plateleser. (D) Legemiddelløsninger fra en bibliotekplate med 384 brønner og blankt løsningsmiddel (alle ved 0,5 μL / brønn) ble tilsatt i den cellulære analyseplaten ved hjelp av et væskehåndteringssystem. (E) Cellulære kalsiumfluorescensresponser ble målt med plateleseren umiddelbart etter tilsetning av legemiddelløsningene; Forbindelse(r) som fremkalte høyere enn gjennomsnittlige fluorescenssignaler ble plukket ut som agonisttreff(er). Antagonisttreff som blokkerer GPCR (ikonet nedenfor) ble avslørt etter tilsetning av peptidagonisten under trinn G. (F) I samme analyseplate, etter 5 minutters inkubasjon av cellene med screeningforbindelser, ble et endogent agonistpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) av flåttkininreseptoren tilsatt hver brønn (1 μM). (G) Cellulære fluorescensresponser etter agonistpeptidtilsetning ble målt av plateleseren umiddelbart. Forbindelse(r) som hemmer fluorescenssignalet ble valgt som antagonisttreff(er). Forkortelser: GPCR = G proteinkoblet reseptor; RT = romtemperatur; RFU = relative fluorescensenheter. Laget med BioRender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell vedlikehold

MERK: EN CHO-K1-cellelinje som stabilt uttrykker kininreseptoren fra R. microplus, kalt BMLK3, ble utviklet av Holmes et al.16. Detaljene om utviklingen av cellelinjen presenteres andre steder14. Alle følgende trinn utføres under sterile forhold i et biosikkerhetsskap i klasse II.

  1. Dyrk den rekombinante cellelinjen i selektive medier (F-12K-medium som inneholder 10% føtalt bovint serum [FBS] og 800 μg / ml G418-sulfat) for å sikre ekspresjonen av målreseptoren. Oppbevar cellene som stabilt uttrykker reseptoren i 1 ml frysemedium (90% FBS og 10% dimetylsulfoksid [DMSO]) i en 2 ml kryovial i en -80 ° C fryser.
    MERK: For langtidslagring av de frosne cellene, oppbevar dem i flytende nitrogen.
  2. Forvarm alle mediene før cellekultur. I et biosikkerhetsskap overfører du 13 ml forvarmet selektivt medium (F-12K-medium inneholdende 10% FBS og 800 μg / ml G418-sulfat) til en T-75-kolbe, og oppbevar den i biosikkerhetsskapet. Tine ett hetteglass med de frosne BMLK 3-cellene (~1,5 × 106 celler) i et 37 °C vannbad i2-3 minutter. Overfør de tinte cellene til T-75-kolben. Oppretthold cellene i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 med mindre annet er spesifisert.
  3. Når cellene når 90% sammenløp (1-2 dager), forvarm alle mediene til 37 ° C bortsett fra Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS), som holdes ved romtemperatur. I et biosikkerhetsskap, fjern det brukte mediet fra T-75-kolben, vask cellene i 5 s med 10 ml DPBS ved å virvle kolben forsiktig, og fjern deretter DPBS med en serologisk pipette.
    MERK: Et bilde av CHO-K1-celler ved 90% sammenløp er vist i Lu et al.14.
  4. Løsne cellene fra T-75-kolben ved å tilsette 2 ml 0,25% trypsin-EDTA, og inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C i inkubatoren. Tilsett deretter 8 ml selektivt medium, og bland godt ved pipettering og slipp forsiktig 2x-3x med samme serologiske pipette.
  5. Overfør 2 ml av cellesuspensjonen (~1 × 106 celler) fra trinn 1.4 til en ny T-75 kolbe inneholdende 10 ml varmt selektivt medium. Vokse cellene i 1-2 dager i inkubatoren til de når 90% sammenheng.
  6. Bruk cellene til analysen etter de neste trinnene, eller gjenta trinn 1,4–1,5 én eller to ganger før du bruker cellene i analysen.
    MERK: Ikke overskrid tre til fire passasjer, da analysesignalet med visse cellelinjer kan bli svakere med ytterligere passasjer.

2. Kalsiumfluorescensanalyse

  1. Belegg celleplaten.
    1. Bruk et væskehåndteringssystem plassert inne i et biosikkerhetsskap for alle pipetteringstrinnene i platene med 384 brønner. Lag tilpassede programmer for pipettering i 384-brønnsplatene31 (tilleggstabell S1). Belegg de sterile platene med 384 brønner på forhånd. I et biosikkerhetsskap, last 10 μL / brønn av en vandig løsning av Poly-D-lysin (PDL) ved 0,05 mg / ml i hver plate, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Tøm platen ved raskt å snu platen og forsiktig blotting den på sterile papirhåndklær. Skyll deretter hver brønn med 10 μL vann, tøm platen og la platen tørke i biosikkerhetsskapet over natten uten lokket. Lukk platen med lokket, og oppbevar ved 4 °C i kjøleskapet.
      MERK: De belagte platene kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
  2. Dag 1
    1. Ta ut medikamentplaten (100 μM i 90% DPBS + 10% DMSO, endelig konsentrasjon i brønnen for HTS vil være 2 μM) lagret i -20 ° C fryseren, og legg den ved romtemperatur.
      MERK: Oppsett av stoffplaten: Hver plate med 384 brønner (24 kolonner x 16 rader) inneholder 320 brønner med forskjellige bibliotekforbindelser og 64 brønner med blankt løsningsmiddel (DPBS som inneholder 10% DMSO), som er arrangert i fire kolonner, med to kolonner på kanten av hver side. Se Tilleggstabell S2 for plateoppsettet.
    2. Når cellene når ~ 70% -90% sammenløp i T-75-kolben, løsner cellene fra T-75-kolben som beskrevet nedenfor. Forvarm alle mediene til 37 °C unntatt DPBS (romtemperatur).
      1. Fjern det brukte mediet, vask cellene med 10 ml DPBS, og fjern deretter DPBS. Løsne cellene fra T-75-kolben ved å bruke 2 ml 0,25% trypsin-EDTA i 3-5 minutter ved 37 ° C i inkubatoren, tilsett 8 ml selektivt medium, og overfør cellesuspensjonen til et 15 ml konisk rør for å sentrifuge ved 1000 × g i 3 minutter.
      2. Kast supernatanten, og resuspend cellepelleten i 10 ml F-12K medium som inneholder 1% FBS og 400 μg / ml G418 sulfat. Hold suspensjonen i biosikkerhetsskapet mens du bestemmer celletallet.
    3. Bestem celletettheten til suspensjonen for ytterligere fortynning: Bland 20 μL cellesuspensjon i 20 μL på 0,4% trypanblå, og last deretter 20 μL av blandingen inn i et celletellingskammer som skal leses av en celleteller for celletetthet.
    4. Fortynn cellesuspensjonen i samme medium (F-12K-medium inneholdende 1% FBS og 400 μg / ml G418-sulfat) til et endelig volum på minst 15 ml ved en tetthet på 4 × 105 celler / ml.
    5. Frø cellene i PDL-belagt 384-brønnplate. Overfør 15 ml av ovennevnte cellesuspensjon (4 × 105 celler/ml) til et 150 ml autovennlig reagensreservoar. Dispenser 25 μL av cellesuspensjonen (~ 10 000 celler / brønn) i hver brønn på de 384 brønnene på platen ved hjelp av et væskehåndteringssystem i to trinn. Last 384/12,5 μL lavretensjonsspisser på væskehåndteringshodet, aspirer 12,5 μL fra reservoaret (hastighet 5,2 μL/s), og dispenser i hver brønn (hastighet: 3,1 μL/s).
    6. Gjenta pipetteringen som i forrige trinn 2.2.5 for å nå 25 μL per brønn. Inkuber deretter platen over natten (14-16 timer) ved 37 °C og 5 % CO2 i den fuktede inkubatoren.
      MERK: Siden det maksimale pipetteringsvolumet er 12,5 μL for dette spesifikke hodet, utføres pipettering for 25 μL i to trinn.
  3. Dag 2
    1. Neste morgen, sjekk den dekkede celleplaten under et mikroskop; Hvis ikke sammenflytende, vent til cellene når 90% sammenløp.
    2. Forbered en stamløsning av fluorescerende fargestoff: Resuspend lyofilisert fluorescerende fargestoff i 100 μL DMSO, og unngå direkte lys på stamløsningen. Pakk røret med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking.
      MERK: Bestanden kan aliquoted i 15 μL aliquots for hver plateanalyse for å unngå gjentatt frysing og tining; aliquotene kan oppbevares ved −80 °C i opptil 1 måned.
    3. I biosikkerhetsskapet med lysene av, klargjør du lastefargestoff (1x) i et 15 ml konisk rør innpakket med aluminiumsfolie, og kombiner 15 μL av fluorescerende fargestoffløsning (fra trinn 2.3.2) og resten av de forvarmede settkomponentene (37 ° C): 13,5 ml 1x HHBS (Hanks buffer med 20 mM HEPES) og 1,5 ml reagens B (fargestoff efflukshemmer).
      MERK: Romlyset er på i løpet av dette trinnet.
    4. Lukk røret og bland godt ved å forsiktig invertere røret flere (vanligvis 3-5x) ganger.
      NOTAT: Oppbevares i romtemperatur, og bruk fargestoffblandingen innen 30 minutter.
    5. Når cellene når 90% sammenheng, fjern det brukte mediet fra analyseplaten med 384 brønner ved raskt å invertere platen og forsiktig blotting på sterile papirhåndklær; Gjenta denne bevegelsen 2x-3x for å fjerne all væsken fra platen. Kast de våte håndklærne.
    6. Slå av de fleste kunstige direkte lys i rommet (la en myk, svak bordlampe være på eller lignende for å tillate synlige arbeidsforhold) og i biosikkerhetsskapet for alle trinnene til slutten av analysen (ca. 1,5 timer).
    7. Plasser 15 ml av fargestoffet (1x) fra trinn 2.3.3 i et 150 ml automatisk vennlig reservoar.
      1. Overfør 25 μL av lastfargestoffet (1x) fra reservoaret til hver brønn ved hjelp av et væskehåndteringssystem med 384/12,5 μL lavretensjonsspisser ved å dispensere 12,5 μL i hver brønn på platen (aspirasjon og påføringshastighet: 3,8 μL / s).
    8. Gjenta pipetteringstrinnet som i 2.3.7.1 for å nå et sluttvolum på 25 μL i hver brønn på platen. Dekk til og pakk platen med aluminiumsfolie for å beskytte den mot omgivelseslys.
    9. Inkuber den tildekkede celleplaten ved 37 °C i CO2 fuktet inkubator i 30 minutter, fjern den fra inkubatoren og balanser den ved romtemperatur inne i plateleseren eller på benken, og hold platen dekket og pakket inn med folie i ytterligere 30 minutter. Cellene er da klare for high-throughput screening (HTS).
    10. Kjemisk preparat: Spinn stoffplaten fra trinn 2.2.1 ved 1,200 × g i en platesentrifuge i 1 min ved romtemperatur.
      1. Klargjør en 10x agonistpeptidløsning av Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) (10 μM) ved å resuspendere 100 nmole lyofilisert peptid i 10 ml 1x HHBS inneholdende 0,1% DMSO, og overfør løsningen til et 150 ml automatisk vennlig reservoar.
    11. Mål bakgrunnssignalet: For hele HTS-analysen i plateleseren, under Protokoller, velg sluttpunktfluorescensmodus.
      MERK: Det fluorescerende signalet leses fra bunnen av platen ved eksitasjons- / utslippsbølgelengder på 495 nm / 525 nm.
      1. Sett celleplaten inn i plateleseren. I instrumentpanelet velger du juster forsterkning, velger en tilfeldig brønn på platen, tilordner den til 5%-10% av den maksimale målbare fluorescensverdien, og velger juster (lese) høyde.
      2. Klikk startmåling for å lese hele platen for bakgrunnsfluorescenssignalet i relative fluorescensenheter (RFU).
    12. "Dual-addisjon" analyse
      1. Bruk væskehåndteringssystemet med 384/12,5 μL spisser, for å blande legemiddeloppløsningen i hver brønn på legemiddelplaten, pipette 3x opp og ned 10 μL av legemiddeloppløsningen (i DPBS som inneholder 10% DMSO) (pipetteringshastighet: 5,2 μL / s), og "aspirere" 1,5 μL fra hver brønn på stoffplaten (aspirasjonshastighet: 1,0 μL / s).
      2. "Dispenser" 0,5 μL av forbindelsene i celleanalyseplaten (pipetteringshastighet: 1 μL / s) for å nå en endelig konsentrasjon på 2 μM i 0,2% DMSO.
      3. Plasser analyseplaten umiddelbart i plateleseren etter tilsetning av screeningforbindelsene. Les den samme platen i både fremover- og bakoverleseretningen. For å få disse avlesningene, definer et program som skal leses fra "brønn 1-384" og umiddelbart fra "384-1".
        MERK: Avlesningen i begge retninger tar totalt 2 min. Denne avlesningsdesignen er for å kompensere for reduksjonen i signalstyrken som oppstår under plateavlesning i hver retning. Se trinn 3.1 for avlesningsanalysene.
      4. Kast de resterende 1 μL legemiddeloppløsningen i spissene ved å senke spissene i et 150 ml avfallsreservoar som inneholder ~50 ml DPBS (påføringshastighet: 1,0 μL/s).
      5. Inkuber screeningforbindelsene med cellene i totalt 5 minutter (inkluderer 2 minutters plateavlesning) ved romtemperatur i biosikkerhetsskapet med lysene av. Tilsett 3 μL agonistpeptidet, Rhimi-K-1 (QFSPWGamid), fra reservoaret (aspirasjonshastighet: 3,1 μL/s) i analyseplaten ved hjelp av væskehåndteringssystemet (påføringshastighet: 3,1 μL/s) med 384/12,5 μL spisser.
      6. Plasser platen i plateleseren umiddelbart etter tilsetning av agonistpeptidet. Les platen i både forover- og bakoverretning ved å bruke samme program som i trinn 2.3.12.3

3. Analyse av data

  1. Bruk analyseprogramvaren knyttet til plateleseren som er installert på en datamaskin, beregne de cellulære fluorescensresponsene (i RFU) for begge avlesningene etter den første sammensatte tilsetningen (Første lesning; RFUsiden [Tilleggstabell S2]) og etter agonist-addisjonstrinnene (Andre lesning = RFU-maur [Tilleggstabell S2]). Hver avlesning oppnås ved å beregne et gjennomsnitt av de to verdiene som oppnås (ikke vist) ved forover- og bakoverplateavlesningene fra henholdsvis trinn 2.3.12.3 og trinn 2.3.12.6.
    MERK: RFU siden, RFUmaur refererer til de relative fluorescensenhetene til de potensielle agonisttreffene (les i trinn 2.3.12.3) og de potensielle antagonisttreffene (les i trinn 2.3.12.6).
  2. Eksporter alle tre datasettene, RFU bg, RFU ago og RFUant, fra analyseprogramvaren til tre separate regneark. Hvert regneark vil bare ha to kolonner: brønnposisjon og rå RFU (filer som ikke vises her).
    MERK: RFU bg refererer til RFU av bakgrunnen lest i trinn 2.3.11.2.
  3. Formater dataene fra de tre regnearkene, og organiser dataene ovenfor i én csv-fil (se eksemplet i tilleggstabell S2). Trekk bakgrunnssignalet som er lest fra henholdsvis RFU siden og RFU-mauren (G- og H-kolonner i tilleggstabell S2).
  4. Importer csv-filen til en kommersielt tilgjengelig "online HTS-dataplattform" (se materialtabellen) for nedstrøms dataanalyse (tabell 1) og lagring.
  5. Beregn manuelt Z'-faktoren for kvalitetskontroll av hver plateanalyse ved hjelp av ligning (1):
    ligning (1):
    Equation 1(1)
    MERK: μc- og μc+ representerer gjennomsnittlige RFUer for avlesninger av de samme brønnene, som fungerer som negative kontroller i første tilsetning etter tilsetning av løsningsmidlet (blankt løsningsmiddel, n = 64; tall i blått i tilleggstabell S2) og fungerer som positive kontroller etter tilsetning av agonisten (blank løsningsmiddel + agonist, n = 64; tall i magenta), henholdsvis. I tillegg representerer σ c- og σc+ deres tilsvarende standardavvik (SDer).
  6. Velg treffmolekylene manuelt fra varmekartene på "online HTS-dataplattform", og beregn normalisert prosentaktivering (NPA) og hemmende aktivitet (Io) for agonisttreff og antagonisttreff ved hjelp av ligning (2) og ligning (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En intern stoffplate (SAC2-34-6170) sammensatt av 320 tilfeldige små molekyler ble brukt til å demonstrere denne HTS-analysen som et eksempel. HTS hadde utmerket analysekvalitet med en Z-faktor på 0,7 (tabell 1). Denne Z-faktoren gjenspeiler analysekvaliteten uavhengig av de testede forbindelsene34. En Z′-faktor på 0,5 eller høyere indikerer et godt dynamisk område for analysesignal mellom RFU-ene til de positive kontrollene og de negative kontrollene. Analyser med en Z-faktor mindre enn 0,5 har et suboptimalt signaldynamisk område, er vanligvis ikke informative for treffvalg, og blir derfor kassert. Responsen (målt i relative fluorescensenheter, RFU) fra positive kontroller (gjennomsnittlig RFU på 64 positive kontrollresponser, μc+ = 130 139) var i gjennomsnitt 19 ganger høyere enn for de negative kontrollene (gjennomsnittlig RFU på 64 negative kontrollsvar,μ c- = 6 675). Avskjæringsfluorescensen for å velge "agonisttreff" her ble satt til et normalisert prosentaktiveringsforhold (NPA) på >50%. Cutoff fluorescens for å velge "antagonist treff" ble satt til en observert hemmende aktivitet (Io) på >50%. Tre agonisttreffmolekyler og to antagonisttreff ble valgt: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%) og SACC-0006532 (NPA = 152%) som agonister, og SACC-0103392 (I o = 53%) og SACC-0041280 (I o = 56%) som antagonister (rådataene er vist i tilleggstabell S2). Eksempler på beregninger av henholdsvis NPA og Io for agonister (grønne rader) og antagonister (oransje rader) er vist i tilleggstabell S2.

Sammensatt tillegg μs1 σs μc- σc- Z' verdi
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Agonist peptid addisjon μs σs μC+ σC+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tabell 1: Sammendrag av normaliserte celleresponser fra hele platen i HTS-analysen. Gjennomsnittet (μ) og standardavviket (σ) er hentet fra CDD-hvelvanalysen. Forkortelser: HTS = high-throughput screening; RFU = relative fluorescensenheter; 1s (prøver) = 320 testede forbindelser; μs = gjennomsnittsverdi av cellulære responser (RFUer) fra 320 brønner; μc- = gjennomsnittsverdi av RFUer fra negative kontroller; μc + = gjennomsnittsverdi av RFUer fra positive kontroller; σs = standardavvik for cellulære responser (RFUer) fra 320 brønner; σc- = RFUers standardavvik fra negative kontroller; σc+ = standardavvik for RFUer fra positive kontroller.

Tilleggstabell S1: Tilpassede programmer for væskehåndteringssystemet for de automatiske pipetteringstrinnene. Denne tabellen er endret fra Xiong et al.31. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S2: Rådata for de representative resultatene. Radene som er uthevet i grønt, representerer agonisttreffene, og radene som er uthevet i oransje, representerer antagonisttreffene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med HTS er å identifisere treffmolekyler gjennom screening av et stort antall små molekyler. Derfor representerer resultatene fra dette eksemplet bare en liten del av et konvensjonelt HTS-eksperiment. Videre må de identifiserte treffmolekylene valideres i nedstrømsanalyser, for eksempel en doseavhengig analyse på samme rekombinante cellelinje og på en CHO-K1-cellelinje som bare bærer den tomme vektoren, som kan utføres samtidig for å redde små molekyler. Cytotoksisitetsanalyser vil bidra til å demonstrere at mangel på respons i det andre tillegget ikke skyldes celledødelighet. Andre bioassays bør utføres for å validere aktivitet i det isolerte vevet in vitro, eller ved å påføre eller mate de små molekylene til levende leddyr. Den komplette rørledningen av småmolekylær ligandidentifikasjon av flåttkininreseptoren finnes i en tidligere publikasjon31. Gjennom denne rørledningen ble totalt 36 antagonisttreff av tick kinin-reseptoren identifisert. Tre av disse antagonistene ble videre testet i en vevskontraksjonsinhiberingsanalyse og viste antimyotropisk aktivitet på mygghindgut, hvor ortologe myggkininreseptorer uttrykkes31.

Hver GPCR-uttrykkende cellelinje bør valideres for egnede eksperimentelle forhold før HTS utføres. Disse forholdene inkluderer celletettheten (10 000 celler per brønn), konsentrasjonen av de screenede forbindelsene (2 μM), den endelige DMSO-konsentrasjonen (0,2%) i analysen, konsentrasjonen av agonistliganden som brukes til den andre tilsetningen (1 μM), pipetteringshastigheten og dybden, og lesetiden etter tilsetningen av agonistpeptidet (5 min). Det er viktig å justere dybden og hastigheten på væskehåndteringssystemet for å sikre at dispenseringstrinnene ikke forstyrrer cellene hvis cellene holder seg. Valideringen av disse tilstandene før du begynner på HTS, vil hjelpe til med feilsøking hvis analysekvaliteten er dårlig. Det er viktig å ha cellene under optimale forhold: cellene skal nå 90% -100% sammenløp, men ikke være overkonfluent i celleplaten når de brukes til HTS. Hvis bakgrunnssignalene i visse brønner er unormalt lave eller høye, etter å ha bekreftet under mikroskopet for åpenbart lav eller høy celletetthet, bør uteliggerne fjernes manuelt når dataene analyseres. Før kalsiumfluorescensanalysen tilpasses HTS, må den kinetiske kurven til det positive peptidet være kjent, da cellens kinetiske respons til agonistpeptidet skal vare i 1-2 minutter for at den skal tilpasses til en HTS-analyse og vare lenge nok til å lese hele platen. For å oppnå det forlengede signalet, bør en relativt høy konsentrasjon av agonistpeptidet påføres, eller en høyere celletetthet bør testes. Hvis den kinetiske responsen til de enkelte reseptorcellene er for kort (varer mindre enn 1 min), anbefales det å lese med raskere hastighet i endepunktavlesningen eller bare bruke en del av platen til HTS. Kvaliteten på den rekombinante cellelinjen med hensyn til nivået av reseptoruttrykk er avgjørende for suksess. Ulike klonale cellelinjer vil sannsynligvis variere, da innsettingen av plasmidet er tilfeldig i genomet, og dette kan sikkert påvirke reseptoruttrykket. Det ville være ideelt å innlemme en tidlig kalsiumfluorescenstest av det transfiserte bassenget og under prosessen med å velge klonale cellelinjer.

Begrensningen av kalsiumfluorescensanalysen er at den måler aktiviteten til de sekundære budbringerne i stedet for den direkte bindingen av liganden til reseptoren. Selv om det er mulig å ekskludere off-target agonist treff ved screening av treffmolekylene på cellene som ikke uttrykker målreseptoren, er det umulig å helt utelukke off-target antagonist hit molekyler ved hjelp av denne analysen fordi det er mulig at noen molekyler kan hemme de cellulære kalsiumfrigivelsesveiene nedstrøms for GPCR-signaleringen. Derfor er det nødvendig med ytterligere validering ved bruk av enten en ligandbindingsanalyse eller et bioassay for validering på organismenivå, for eksempel i en flåttvevsanalyse med en kjent agonist, som tidligere gjort med mygg31.

De fleste funksjonelle analyser som oppdager GPCR-aktivering, måler primært intracellulære hendelser i to hovedsignalveier: G-proteinavhengige og G-proteinuavhengige veier. G-proteinavhengige analyser måler Ca2+, inositoltrifosfat (IP3) eller cAMP-konsentrasjoner, mens G-proteinuavhengige analyser primært påviser reseptorhandel eller rekruttering β-arrestin7. Ulike analyser benytter forskjellige teknologier for avlesninger, for eksempel Ca 2+-sensitive fargestoffer (fluorescensanalyser), fotoproteiner som aequoriner (Ca2+ bioluminescensanalyser)14, merkede fluorescensproteiner, fluorescensresonansenergioverføring (FRET)-baserte analyser, bioluminescensresonansenergioverføring (BRET)-baserte analyser eller etikettfrie optiske biosensorbaserte celleanalyser. Disse analysene og de tilsvarende tilgjengelige avlesningsteknologiene ble gjennomgått i detalj av Zhang og Xie35. Noen analyser gjelder for alle GPCR-er, og noen er spesifikke for visse GPCR-er (f.eks. Ca2+-analysen for Gq-koblede reseptorer, cAMP for G/o- eller Gs-koblede reseptorer). Men ved promiskuøst å uttrykke visse G-proteiner med reseptoren i de rekombinante cellene, kan signalveien endres. For eksempel kan Gq15/16-proteiner uttrykkes sammen med ikke-Gq-koblede reseptorer for PLC-IP3-Ca 2+ signaldeteksjon 7,36. I motsetning til analysene som måler en enkelt molekylær hendelse, er det analyseanalyser med høyt innhold, som samler en massiv mengde biologiske data for å forbedre ligandspesifisiteten37. Denne typen analyser er også mer komplekse og dyre å utføre7.

I virvelløse undersøkelser oppdager de mest brukte funksjonelle analysene GPCR-aktivering ved å analysere svingningene i konsentrasjonene av andre budbringere, for eksempel Ca2+ eller cAMP. På grunn av forskjellene i signalveiene mellom pattedyr og virvelløse dyr, har de fleste av de andre ovennevnte avlesningsteknologiene ennå ikke blitt bredt vedtatt for virvelløse GPCR-studier. G-proteiner er imidlertid relativt konservert over hele dyreriket. Nylig viste Lismont et al.38 at noen humane BRET-baserte G-proteinbiosensorer også kan tilpasses for å oppdage aktiveringen av et insekt GPCR når det uttrykkes i reseptorrekombinante celler. Ved å kouttrykke hver av de forskjellige G-proteinbaserte biosensorene (Gs, Gi / o, G q / 11 eller G12/13) med spesifikke GPCRs, kan G-proteinkoblingsmekanismen belyses. I studien av Lismont et al.38 kunne Schgr-CRF-DH doseavhengig aktivere Gi/o og G q/11 biosensorene og aktiverte ikke biosensorene Gs og G12/13.

Samlet sett utfører kalsiumfluorescensanalysen i en 384-brønnplate i kombinasjon med "dual-addisjon" -tilnærmingen beskrevet her, screening av titusenvis av molekyler på relativt kort tid. Dette er en relativt tids- og kostnadseffektiv tilnærming for å oppdage treffmolekyler for nedstrøms valideringer og applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Prisnummer 2022-67015-36336, PVP [Prosjektdirektør]) og fra konkurransedyktige midler fra Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) til P.V.P. A.W.E.S.O.M.E. fakultetsgruppen ved College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, er anerkjent for hjelp til å redigere manuskriptet. Supplerende tabell S2 inneholder data fra et internt, tilfeldig, lite molekylbibliotek hentet fra Dr. James Sacchettinis laboratorium ved Texas A&M University og Texas A&M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).

Tags

Biokjemi utgave 190
En "dual-addisjon" kalsiumfluorescensanalyse for høy gjennomstrømningsscreening av rekombinante G-proteinkoblede reseptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio,… More

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (190), e64505, doi:10.3791/64505 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter