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Biochemistry

पुनः संयोजक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक "दोहरी-अतिरिक्त" कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

इस काम में, पुनः संयोजक जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) पर छोटे अणु पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए 384-वेल प्लेटों के लिए एक उच्च-थ्रूपुट, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख का वर्णन किया गया है। लक्ष्य, मवेशी बुखार टिक, रिपिसेफेलस माइक्रोप्लस से किनिन रिसेप्टर, सीएचओ-के 1 कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। यह परख एक "दोहरे-जोड़" परख में एक ही कोशिकाओं का उपयोग करके एगोनिस्ट और विरोधी की पहचान करती है।

Abstract

जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) रिसेप्टर्स के सबसे बड़े सुपरफैमिली का प्रतिनिधित्व करते हैं और कई मानव दवाओं के लक्ष्य हैं। जीपीसीआर के खिलाफ यादृच्छिक छोटे अणु पुस्तकालयों की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) का उपयोग दवा उद्योग द्वारा लक्ष्य-विशिष्ट दवा की खोज के लिए किया जाता है। इस अध्ययन में, घातक मानव और पशु चिकित्सा रोगजनकों के वैक्टर के शारीरिक अध्ययन के लिए जांच के रूप में अकशेरुकी-विशिष्ट न्यूरोपैप्टाइड जीपीसीआर के नए छोटे-अणु लिगेंड की पहचान करने के लिए एक एचटीएस को नियोजित किया गया था।

अकशेरुकी-विशिष्ट किनिन रिसेप्टर को एक लक्ष्य के रूप में चुना गया था क्योंकि यह अकशेरुकी जीवों में कई महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है, जिसमें ड्यूरेसिस, फीडिंग और पाचन शामिल हैं। इसके अलावा, कई अकशेरुकी जीपीसीआर के फार्माकोलॉजी को खराब विशेषता है या बिल्कुल भी विशेषता नहीं है; इसलिए, अन्य मेटाज़ोन्स, विशेष रूप से मनुष्यों में संबंधित जीपीसीआर के संबंध में रिसेप्टर्स के इन समूहों के अंतर फार्माकोलॉजी, सुपरफैमिली के रूप में जीपीसीआर की संरचना-गतिविधि संबंधों में ज्ञान जोड़ते हैं। मवेशी बुखार टिक, या दक्षिणी मवेशी टिक, रिपिसेफलस माइक्रोप्लस से किनिन रिसेप्टर के लिगेंड की खोज के लिए 384-वेल प्लेटों में कोशिकाओं के लिए एक एचटीएस परख विकसित की गई थी। टिक किनिन रिसेप्टर को सीएचओ-के 1 कोशिकाओं में स्थिर रूप से व्यक्त किया गया था।

किनिन रिसेप्टर, जब अंतर्जात किनिन न्यूरोपैप्टाइड्स या अन्य छोटे अणु एगोनिस्ट द्वारा सक्रिय होता है, तो कैल्शियम स्टोर से साइटोप्लाज्म में सीए2 + रिलीज को ट्रिगर करता है। यह कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख "दोहरे-अतिरिक्त" दृष्टिकोण के साथ संयुक्त एक ही परख प्लेट में कार्यात्मक एगोनिस्ट और विरोधी "हिट" अणुओं का पता लगा सकता है। प्रत्येक परख 320 यादृच्छिक छोटे अणुओं की एक सरणी ले जाने वाली दवा प्लेटों का उपयोग करके आयोजित की गई थी। 0.7 का एक विश्वसनीय जेड 'कारक प्राप्त किया गया था, और तीन एगोनिस्ट और दो विरोधी हिट अणुओं की पहचान की गई थी जब एचटीएस 2 μM अंतिम एकाग्रता पर था। यहां रिपोर्ट किए गए कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख को अन्य जीपीसीआर को स्क्रीन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो सीए2 + सिग्नलिंग कैस्केड को सक्रिय करते हैं।

Introduction

जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर), जो खमीर से मनुष्यों में मौजूद हैं,कई जीवों में रिसेप्टर्स के सबसे बड़े सुपरफैमिली का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे जानवरों में लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। आर्थ्रोपोड्स के जीनोम में 50-200 जीपीसीआर हैं, जिसका अर्थ है कि वे सबसे बड़े झिल्ली रिसेप्टर सुपरफैमिली2 का प्रतिनिधित्व करते हैं। उन्हें उनकी अनुक्रम समानता और कार्यों के आधार पर छह प्रमुख वर्गों, ए-एफ में वर्गीकृत कियागया है। जीपीसीआर विभिन्न बाह्य संकेतों को ट्रांसड्यूस करते हैं, जैसे हार्मोन, न्यूरोपैप्टाइड्स, बायोजेनिक एमाइन, ग्लूटामेट, प्रोटॉन, लिपोग्लिकोप्रोटीन और फोटॉन4। जीपीसीआर डाउनस्ट्रीम संकेतों को प्रसारित करने के लिए हेटेरोट्रीमर जी प्रोटीन (जी, जी, और जी) से जुड़ते हैं। जीपीआर को जीओ एस या जीआई / ओ प्रोटीनके साथ युग्मित किया जाता है, क्रमशः इंट्रासेल्युलर 3', 5'-चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएएमपी) के स्तर को एडेनिल साइक्लेज को सक्रिय या बाधित करके। जी.पी.सी.आर. के साथ युग्मित जीपीसीआर फॉस्फोलिपेज़ सी (पीएलसी)-इनोसिटोल-1,4,5-ट्राइफॉस्फेट (आईपी3) मार्ग को सक्रिय करके एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम कैल्शियम स्टोर से कैल्शियम रिलीज को प्रेरित करते हैं। जी.पी.सी.आर.12/13 के साथ युग्मित जी.पी.सी.आर. 3.6. जीपीसीआर 50% से अधिक मानव दवाओं और एक एक्रिसाइड, एमिट्राज़4 का लक्ष्य है। चूंकि जीपीसीआर इस तरह के विविध संकेतों को ट्रांसड्यूस करते हैं, वे नए कीटनाशकों को विकसित करने के लिए आशाजनक लक्ष्य हैं जो अकशेरुकी-विशिष्ट शारीरिक कार्यों को बाधित करते हैं।

एचटीएस का लक्ष्य हिट अणुओं की पहचान करना है जो रिसेप्टर कार्यों को संशोधित कर सकते हैं। एचटीएस में परख विकास, लघुकरण और स्वचालनशामिल हैं। आर्थ्रोपोड न्यूरोपैप्टाइड जीपीसीआर अधिकांश शारीरिक कार्यों में शामिल हैं, जैसे कि विकास, मोलिंग और एकडिसिस, उत्सर्जन, ऊर्जा जुटाना और प्रजनन4। आर्थ्रोपोड्स और मेटाज़ोन्स के अधिकांश न्यूरोपैप्टाइड जीपीसीआर कैल्शियम सिग्नलिंग कैस्केड 2,6,8,9,10 के माध्यम से संकेत देते हैं, जैसे कि ब्लैकलेग्ड टिक इक्सोड्स स्कैपुलारिस के मायोइनहिबिटरी पेप्टाइड और एसआईएफैमाइड रिसेप्टर्स; उनके लिगेंड हिंडगट गतिशीलता परख में विरोधी हैं, एसआईएफ संकुचन को प्राप्त करता है और एमआईपी इसे11,12 को रोकता है। पीले बुखार के मच्छर का एक एनपीवाई जैसा रिसेप्टर, एडीज एजिप्टी,13 की मांग करने वाली महिला मेजबान को नियंत्रित करता है। अन्य वैकल्पिक कैल्शियम मोबिलाइजेशन परख जैसे कि एकोरिन कैल्शियम बायोलुमिनेसेंस परख14 की तुलना में, कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख प्रदर्शन करना आसान है, अन्य पुनः संयोजक कैल्शियम का पता लगाने वाले प्रोटीन के अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है, और लागत प्रभावी है। कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख एक्वारिन कैल्शियम बायोल्यूमिनेसेंस परख14,15 में प्राप्त तेज गतिज संकेत की तुलना में एक लंबे समय तक संकेत पैदा करता है।

यहां उदाहरण में, मवेशी बुखार टिक, रिपिसेफेलस माइक्रोप्लस से किनिन रिसेप्टर, को सीएचओ-के 1 सेल लाइन में पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया गया था और कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख के लिए उपयोग किया गया था। माइक्रोप्लस में केवल एक किनिन रिसेप्टर जीन पाया जाता है; रिसेप्टर एक जीक्यू प्रोटीन-निर्भर सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से संकेत देता है और कैल्शियम स्टोर से इंट्रासेल्युलर स्पेस16 में सीए2 + के प्रवाह को ट्रिगर करता है। इस प्रक्रिया को फ्लोरोफोरे द्वारा पता लगाया और परिमाणित किया जा सकता है, जो कैल्शियम आयनों को बांधते समय एक प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करता है (चित्रा 1)।

किनिन रिसेप्टर एक अकशेरुकी-विशिष्ट जीपीसीआर है, जो क्लास ए रोडोप्सिन जैसे रिसेप्टर्स से संबंधित है। किनिन एक प्राचीन सिग्नलिंग न्यूरोपैप्टाइड है जो मोलस्का, क्रस्टेसिया, इंसेक्टा और अकारी 4,17,18 में मौजूद है। कोलोप्टेरान (बीटल) में किनिन सिग्नलिंग सिस्टम की कमी होती है; मच्छर एडीज एजिप्टी में, केवल एक किनिन रिसेप्टर होता है जो तीन एडीस्किनिन को बांधता है, जबकि ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में एक अद्वितीय लिगैंड19,20,21 के रूप में ड्रोसोकिनिन के साथ एक किनिन रिसेप्टर होता है। कशेरुक में कोई समरूप किनिन या किनिन रिसेप्टर्स नहीं हैं। यद्यपि टिक्स में किनिन का सटीक कार्य अज्ञात है, लेकिन आर माइक्रोप्लस की किनिन रिसेप्टर आरएनएआई-साइलेंस्ड महिलाएं प्रजनन फिटनेस22 में काफी कमी दिखाती हैं। कीड़े में किनिन प्लियोट्रोपिक पेप्टाइड्स हैं। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, वे केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका नियामक प्रणालियों23, प्री-एकडिसिस24, फीडिंग25, चयापचय 26, और नींद गतिविधि पैटर्न26,27, साथ ही लार्वा लोकोमोशन 28 दोनों में शामिल हैं। किनिन मच्छर ए एजिप्टी 29,30,31 में हिंडगट संकुचन, मूत्र और भोजन को नियंत्रित करते हैं। किनिन पेप्टाइड्स में एक संरक्षित सी-टर्मिनल पेंटापेप्टाइड पीएचई-एक्स 1-एक्स 2-टीआरपी-ग्लाइ-एनएच2 है, जो जैविक गतिविधि32 के लिए न्यूनतम आवश्यक अनुक्रम है। आर्थ्रोपोड विशिष्टता, अंतर्जात लिगैंड का छोटा आकार, जो उन्हें छोटे-अणु हस्तक्षेप के लिए उत्तरदायी बनाता है, और कीड़ों में प्लेयोट्रोपिक कार्य किनिन रिसेप्टर कोकीट नियंत्रण के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बनाते हैं।

"दोहरी-जोड़" परख (चित्रा 2) एक ही एचटीएस परख15 में एगोनिस्ट या विरोधी की पहचान की अनुमति देता है। यह एक "दोहरे-अतिरिक्त" परख से अनुकूलित है जो आमतौर पर दवा उद्योग में दवा की खोज के लिए उपयोग कियाजाता है। संक्षेप में, सेल प्लेट में दवाओं का पहला जोड़ रासायनिक पुस्तकालय में संभावित एगोनिस्ट की पहचान की अनुमति देता है जब विलायक नियंत्रण के आवेदन की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति संकेत का पता चलता है। इन छोटे अणुओं के साथ इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद, एक ज्ञात एगोनिस्ट (किनिन पेप्टाइड) सभी कुओं पर लागू होता है। वे कुएं जिन्हें यादृच्छिक रूप से दवा प्लेट से एक विरोधी प्राप्त हुआ, वे नियंत्रण कुओं की तुलना में एगोनिस्ट जोड़ पर कम प्रतिदीप्ति संकेत प्रदर्शित करते हैं जो पहले जोड़ में विलायक प्राप्त करते हैं। यह परख तब एक ही कोशिकाओं के साथ संभावित एगोनिस्ट और विरोधी की पहचान की अनुमति देती है। एक मानक एचटीएस परियोजना में, इन हिट अणुओं को खुराक-प्रतिक्रिया परख और अतिरिक्त जैविक गतिविधि परख के माध्यम से आगे मान्य किया जाएगा, जो यहां नहीं दिखाए गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: कैल्शियम प्रतिदीप्ति परख तंत्र का चित्रण। जीक्यू प्रोटीन इंट्रासेल्युलर कैल्शियम सिग्नलिंग मार्ग को ट्रिगर करता है। किनिन रिसेप्टर (जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर) को सीएचओ-के 1 कोशिकाओं में पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया गया था। जब एगोनिस्ट लिगैंड रिसेप्टर को बांधता है, तो किनिन रिसेप्टर से जुड़ा जीक्यू प्रोटीन पीएलसी को सक्रिय करता है, जो पीआईपी2 अणु के आईपी3 और डीएजी में रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है। आईपी3 तब एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम की सतह पर आईपी3आर को बांधता है, जिससे साइटोप्लाज्म में सीए2 + की रिहाई होती है, जहां सीए2 + आयन फ्लोरोफोर से बंधते हैं और प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करते हैं। प्रतिदीप्ति संकेत 490 एनएम पर उत्तेजना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है और 514 एनएम पर पता लगाया जा सकता है। संक्षेप: जीपीसीआर = जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर; पीएलसी = फॉस्फोलिपेज़ सी; पीआईपी2 = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 4,5-बिस्फॉस्फेट; आईपी3 = इनोसिटोल ट्राइसफॉस्फेट; डीएजी = डायसिलेग्लिसरॉल; आईपी3आर = आईपी3 रिसेप्टर। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: सीएचओ-के 1 कोशिकाओं में व्यक्त जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर पर छोटे अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए वर्कफ़्लो। (A) पुनः संयोजक सीएचओ-के 1 कोशिकाओं को स्थिर रूप से किनिन रिसेप्टर को व्यक्त करने वाली 384-वेल प्लेट (10,000 कोशिकाओं / कुएं) में तरल हैंडलिंग सिस्टम (25 μL / वेल) का उपयोग करके जोड़ा गया और12-16 घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफाइड CO 2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट किया गया। ) फ्लोरोसेंट डाई (25 μL / वेल) युक्त परख बफर को तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके सेल प्लेट में जोड़ा गया था। प्लेट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट किया गया था और आरटी पर अगले 30 मिनट के लिए समतुल्य किया गया था। (डी) 384-वेल लाइब्रेरी प्लेट और खाली विलायक (सभी 0.5 μL / वेल पर) से दवा समाधान एक तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके सेलुलर परख प्लेट में जोड़े गए थे। (ई) सेलुलर कैल्शियम फ्लोरेसेंस प्रतिक्रियाओं को दवा समाधानों के अतिरिक्त के तुरंत बाद प्लेट रीडर के साथ मापा गया था; औसत प्रतिदीप्ति संकेतों से अधिक प्राप्त करने वाले यौगिकों को एगोनिस्ट हिट (एस) के रूप में चुना गया था। चरण जी के दौरान पेप्टाइड एगोनिस्ट को जोड़ने के बाद जीपीसीआर (नीचे आइकन) को अवरुद्ध करने वाले विरोधी हिट सामने आए थे। (एफ) एक ही परख प्लेट में, स्क्रीनिंग यौगिकों के साथ कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के 5 मिनट के बाद, टिक किनिन रिसेप्टर के एक अंतर्जात एगोनिस्ट पेप्टाइड रिमी-के -1 (क्यूएफएसपीडब्ल्यूजीमाइड) को प्रत्येक कुएं (1 μM) में जोड़ा गया था। (जी) एगोनिस्ट पेप्टाइड जोड़ के बाद सेलुलर फ्लोरेसेंस प्रतिक्रियाओं को तुरंत प्लेट रीडर द्वारा मापा गया था। प्रतिदीप्ति संकेत को बाधित करने वाले यौगिक (ओं) को विरोधी हिट (ओं) के रूप में चुना गया था। संक्षेप: जीपीसीआर = जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर; आरटी = कमरे का तापमान; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. सेल रखरखाव

नोट: एक सीएचओ-के 1 सेल लाइन जो आर माइक्रोप्लस से किनिन रिसेप्टर को स्थिर रूप से व्यक्त करती है, जिसका नाम बीएमएलके3 है, होम्स एट अल.16 द्वारा विकसित किया गया था। सेल लाइन के विकास का विवरण कहीं और प्रस्तुत कियागया है 14. निम्नलिखित सभी चरणों को द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है।

  1. लक्ष्य रिसेप्टर की अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए चयनात्मक मीडिया (एफ -12 के माध्यम जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] और 800 μg / mL G418 सल्फेट होता है) में पुनः संयोजक सेल लाइन विकसित करें। -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 2 एमएल क्रायोवियल में फ्रीजिंग माध्यम (90% एफबीएस और 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ]) के 1 एमएल में रिसेप्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को स्थिर रूप से स्टोर करें।
    नोट: जमे हुए कोशिकाओं के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, उन्हें तरल नाइट्रोजन में स्टोर करें।
  2. सेल संस्कृति से पहले सभी मीडिया को पूर्वप्रावर्तन करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 13 एमएल प्रीवार्ड सेलेक्टिव मीडियम (एफ -12 के माध्यम जिसमें 10% एफबीएस और 800 μg / mL G418 सल्फेट होता है) को टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें, और इसे जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें। जमे हुए BMLK3 कोशिकाओं (~ 1.5 × 10 6 कोशिकाओं) की एक शीशीको 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं। पिघली हुई कोशिकाओं को टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में बनाए रखें जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न हो।
  3. जब कोशिकाएं 90% कंफ्लुएंसी (1-2 दिन) तक पहुंच जाती हैं, तो डलबेको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) को छोड़कर सभी मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें, जिसे कमरे के तापमान पर रखा जाता है। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, टी -75 फ्लास्क से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें, फ्लास्क को धीरे से घुमाकर 10 एमएल डीपीबीएस के साथ 5 सेकंड के लिए कोशिकाओं को धोएं, और फिर डीपीबीएस को सीरोलॉजिकल पिपेट से हटा दें।
    नोट: 90% कंफ्लुएंसी पर सीएचओ-के 1 कोशिकाओं की एक छवि लू एट अल.14 में दिखाई गई है।
  4. टी -75 फ्लास्क से कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल जोड़कर अलग करें, और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, चयनात्मक माध्यम के 8 एमएल जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और उसी सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ धीरे से 2x-3x जारी करें।
  5. चरण 1.4 से सेल निलंबन के 2 एमएल (~ 1 × 106 कोशिकाएं) को एक नए टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें 10 एमएल गर्म चयनात्मक माध्यम होता है। इनक्यूबेटर में 1-2 दिनों के लिए कोशिकाओं को विकसित करें जब तक कि वे 90% स्थिरता तक नहीं पहुंच जाते।
  6. अगले चरणों के बाद परख के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें, या परख में कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले चरण 1.4-1.5 को एक या दो बार दोहराएं।
    नोट: तीन से चार मार्गों से अधिक न हों, क्योंकि कुछ सेल लाइनों के साथ परख संकेत आगे के मार्गों के साथ कमजोर हो सकता है।

2. कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख

  1. सेल प्लेट को कोट करें।
    1. 384-वेल प्लेटों में सभी पाइपिंग चरणों के लिए बायोसेफ्टी कैबिनेट के अंदर रखी गई तरल हैंडलिंग प्रणाली का उपयोग करें। 384-वेल प्लेट्स31 (पूरक तालिका एस 1) में पाइपिंग के लिए कस्टम प्रोग्राम बनाएं। बाँझ 384-अच्छी प्लेटों को पहले से कोट करें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्रत्येक प्लेट में 0.05 मिलीग्राम / एमएल पर पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) के जलीय घोल के 10 μL / कुएं लोड करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. प्लेट को जल्दी से उल्टा करके प्लेट को खाली करें और धीरे से इसे बाँझ पेपर तौलिए पर सोखने दें। फिर, प्रत्येक कुएं को 10 μL पानी से धो लें, प्लेट को खाली करें, और प्लेट को ढक्कन के बिना रात भर जैव सुरक्षा कैबिनेट में सूखने के लिए छोड़ दें। ढक्कन के साथ प्लेट बंद करें, और रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: लेपित प्लेटों को 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. दिन 1
    1. दवा प्लेट (90% डीपीबीएस + 10% डीएमएसओ में 100 μM, HTS के लिए कुएं में अंतिम एकाग्रता 2 μM) -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत करें, और इसे कमरे के तापमान पर रखें।
      नोट: दवा प्लेट का लेआउट: प्रत्येक 384-वेल प्लेट (24 कॉलम x 16 पंक्तियां) में विभिन्न पुस्तकालय यौगिकों के साथ 320 कुएं और खाली विलायक (10% डीएमएसओ युक्त डीपीबीएस) के साथ 64 कुएं होते हैं, जो चार कॉलम में व्यवस्थित होते हैं, प्रत्येक तरफ दो कॉलम होते हैं। प्लेट लेआउट के लिए पूरक तालिका S2 देखें।
    2. जब कोशिकाएं टी -75 फ्लास्क में ~ 70% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंचती हैं, तो टी -75 फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग कर देती हैं जैसा कि नीचे वर्णित है। डीपीबीएस (कमरे के तापमान) को छोड़कर सभी मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीवार्म करें।
      1. खर्च किए गए माध्यम को निकालें, डीपीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोएं, और फिर डीपीबीएस को हटा दें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 2 एमएल का उपयोग करके टी -75 फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करें, 8 एमएल चयनात्मक माध्यम जोड़ें, और सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें ताकि 3 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज किया जा सके।
      2. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और सेल पेलेट को 1% एफबीएस और 400 μg / mL G418 सल्फेट युक्त F-12K माध्यम के 10 एमएल में पुन: निलंबित करें। सेल गिनती का निर्धारण करते समय जैव सुरक्षा कैबिनेट में निलंबन रखें।
    3. आगे कमजोर पड़ने के लिए निलंबन के सेल घनत्व का निर्धारण करें: सेल सस्पेंशन के 20 μL को 0.4% ट्रिपैन नीले रंग के 20 μL में मिलाएं, और फिर सेल घनत्व के लिए सेल काउंटर द्वारा पढ़े जाने वाले सेल काउंटिंग कक्ष में मिश्रण के 20 μL लोड करें।
    4. सेल निलंबन को एक ही माध्यम (एफ -12 के माध्यम जिसमें 1% एफबीएस और 400 μg / mL G418 सल्फेट होता है) में 4 × 10 5 कोशिकाओं / mL के घनत्व पर कम से कम15 mL की अंतिम मात्रा में पतला करें।
    5. पीडीएल-लेपित 384-वेल प्लेट में कोशिकाओं को बीज दें। उपरोक्त सेल निलंबन के 15 एमएल (4 × 105 सेल / एमएल) को 150 एमएल ऑटो-फ्रेंडली अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें। दो चरणों में तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके प्लेट के 384 कुओं में से प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन (~ 10,000 कोशिकाओं / कुएं) के 25 μL वितरित करें। तरल हैंडलर सिर पर 384/12.5 μL कम-अवधारण युक्तियों को लोड करें, जलाशय से 12.5 μL (गति 5.2 μL / s) को एस्पिरेट करें, और प्रत्येक कुएं में वितरित करें (गति: 3.1 μL / s)।
    6. 25 μL प्रति अच्छी तरह से पहुंचने के लिए पिछले चरण 2.2.5 के रूप में पाइपिंग को दोहराएं। फिर, प्लेट को रात भर (14-16 घंटे) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
      नोट: चूंकि इस विशिष्ट सिर के लिए अधिकतम पिपेटिंग वॉल्यूम 12.5 μL है, इसलिए 25 μL के लिए पिपेटिंग दो चरणों में की जाती है।
  3. दिन 2
    1. अगली सुबह, माइक्रोस्कोप के तहत कवर सेल प्लेट की जांच करें; यदि स्थिर नहीं है, तो तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि कोशिकाएं 90% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाती हैं।
    2. फ्लोरोसेंट डाई का स्टॉक समाधान तैयार करें: डीएमएसओ के 100 μL में लियोफिलाइज्ड फ्लोरोसेंट डाई को पुन: निलंबित करें, और स्टॉक समाधान पर प्रत्यक्ष प्रकाश से बचें। फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब लपेटें।
      नोट: बार-बार ठंड और पिघलने से बचने के लिए स्टॉक को प्रत्येक प्लेट परख के लिए 15 μL एलिकोट में विभाजित किया जा सकता है; एलिकोट को 1 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. बायोसेफ्टी कैबिनेट में, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटी 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में लोडिंग डाई (1x) तैयार करें, फ्लोरोसेंट डाई स्टॉक समाधान के 15 μL (चरण 2.3.2 से) और शेष पूर्वनिर्मित किट घटकों (37 डिग्री सेल्सियस): 1x HHBS का 13.5 एमएल (20 mM HEPES के साथ हांक का बफर) और 1.5 mL अभिकर्मक B (डाई एफ्लक्स अवरोधक)।
      नोट: इस चरण के दौरान कमरे की रोशनी चालू है।
    4. ट्यूब को बंद करें और ट्यूब को धीरे से कई (आमतौर पर 3-5x) बार मोड़कर अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: कमरे के तापमान पर रखें, और 30 मिनट के भीतर लोडिंग डाई मिश्रण का उपयोग करें।
    5. जब कोशिकाएं 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो प्लेट को जल्दी से उलटकर और बाँझ पेपर तौलिए पर धीरे से सोखते हुए 384-वेल परख प्लेट से खर्च किए गए माध्यम को हटा दें; प्लेट से सभी तरल को हटाने के लिए इस आंदोलन को 2x-3x दोहराएं। गीले तौलिए को फेंक दें।
    6. कमरे में अधिकांश कृत्रिम प्रत्यक्ष रोशनी बंद करें (दृश्यमान कार्य स्थितियों की अनुमति देने के लिए एक नरम, मंद डेस्क लैंप छोड़ना) और परख के अंत तक सभी चरणों के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में (लगभग 1.5 घंटे के लिए)।
    7. चरण 2.3.3 से 15 एमएल लोडिंग डाई (1x) को 150 एमएल ऑटो-फ्रेंडली जलाशय में रखें।
      1. प्लेट के प्रत्येक कुएं में 12.5 μL वितरित करके 384/12.5 μL कम-प्रतिधारण युक्तियों के साथ तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके जलाशय से लोडिंग डाई (1x) के 25 μL को प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें (आकांक्षा और वितरण गति: 3.8 μL / s)।
    8. प्लेट के प्रत्येक कुएं में 25 μL की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए 2.3.7.1 में पाइपिंग चरण को दोहराएं। परिवेश प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को कवर और लपेटें।
    9. सीओ2 ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कवर सेल प्लेट को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, इसे इनक्यूबेटर से हटा दें, और इसे प्लेट रीडर के अंदर या बेंच पर कमरे के तापमान पर बराबर करें, प्लेट को कवर करें और 30 मिनट के लिए पन्नी के साथ लपेटें। कोशिकाएं तब उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए तैयार होती हैं।
    10. रासायनिक तैयारी: दवा प्लेट को चरण 2.2.1 से 1,200 × ग्राम पर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए प्लेट सेंट्रीफ्यूज में घुमाएं।
      1. रिमी-के -1 (क्यूएफएसपीडब्ल्यूगाइड) (10 μM) का 10x एगोनिस्ट पेप्टाइड समाधान तैयार करें, जिसमें 0.1% डीएमएसओ युक्त 1x HHBS के 10 mL में लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड के 100 नैनोल्स को पुन: निलंबित किया जाए, और समाधान को 150 एमएल ऑटो-फ्रेंडली जलाशय में स्थानांतरित किया जाए।
    11. पृष्ठभूमि संकेत को मापें: प्लेट रीडर में पूरे एचटीएस परख के लिए, प्रोटोकॉल के तहत, अंत-बिंदु प्रतिदीप्ति मोड चुनें।
      नोट: फ्लोरोसेंट सिग्नल को प्लेट के नीचे से 495 एनएम / 525 एनएम के उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर पढ़ा जाता है।
      1. प्लेट रीडर में सेल प्लेट डालें। इंस्ट्रूमेंट पैनल में, लाभ समायोजित करें का चयन करें, प्लेट पर एक यादृच्छिक कुएं का चयन करें, इसे अधिकतम मापने योग्य प्रतिदीप्ति मूल्य के 5% -10% के रूप में असाइन करें, और समायोजित (पढ़ने) ऊंचाई का चयन करें।
      2. सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (आरएफयू) में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत के लिए पूरी प्लेट को पढ़ने के लिए प्रारंभ माप पर क्लिक करें।
    12. "दोहरी जोड़" परख
      1. 384/12.5 μL युक्तियों के साथ तरल हैंडलिंग सिस्टम का उपयोग करके, दवा प्लेट के प्रत्येक कुएं में दवा समाधान को मिलाने के लिए, दवा समाधान के 3x ऊपर और नीचे 10 μL (10% DMSO युक्त DPBS में) (पाइपिंग गति: 5.2 μL / s), और दवा प्लेट के प्रत्येक कुएं से "एस्पिरेटेड" 1.5 μL (आकांक्षा गति: 1.0 μL)।
      2. 0.2% डीएमएसओ में 2 μM की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए सेल परख प्लेट (पाइपिंग गति: 1 μL / s) में यौगिकों का "डिस्पेंसर" 0.5 μL।
      3. स्क्रीनिंग यौगिकों को जोड़ने के बाद परख प्लेट को तुरंत प्लेट रीडर में रखें। एक ही प्लेट को आगे और पीछे दोनों पढ़ने की दिशाओं में पढ़ें। इन रीडआउट को प्राप्त करने के लिए, "वेल 1-384" और तुरंत "384-1" से पढ़ने के लिए एक प्रोग्राम को परिभाषित करें।
        नोट: दोनों दिशाओं में रीडआउट में कुल 2 मिनट लगते हैं। यह रीडआउट डिज़ाइन प्रत्येक दिशा में प्लेट रीडिंग के दौरान होने वाली सिग्नल ताकत में कमी की भरपाई करने के लिए है। रीडआउट विश्लेषण के लिए चरण 3.1 देखें।
      4. युक्तियों में शेष 1 μL दवा समाधान का निपटान करें, युक्तियों को ~ 50 mL डीपीबीएस (वितरण गति: 1.0 μL / s) युक्त 150 एमएल अपशिष्ट जलाशय में डुबोकर।
      5. रोशनी बंद होने के साथ बायोसेफ्टी कैबिनेट में कमरे के तापमान पर कोशिकाओं के साथ स्क्रीनिंग यौगिकों को कुल 5 मिनट (प्लेट रीडिंग के 2 मिनट शामिल) के लिए इनक्यूबेट करें। तरल हैंडलिंग सिस्टम (वितरण गति: 3.1 μL/s) का उपयोग करके परख प्लेट में जलाशय (आकांक्षा गति: 3.1 μL/s) से एगोनिस्ट पेप्टाइड, रिमी-के-1 (QFSPWGamide) के 3 μL जोड़ें।
      6. एगोनिस्ट पेप्टाइड के अतिरिक्त के तुरंत बाद प्लेट को प्लेट रीडर में रखें। चरण 2.3.12.3 में एक ही प्रोग्राम का उपयोग करके प्लेट को आगे और पीछे दोनों दिशाओं में पढ़ें

3. डेटा विश्लेषण

  1. कंप्यूटर पर स्थापित प्लेट रीडर से जुड़े विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, पहले यौगिक जोड़ के बाद दोनों रीडिंग के लिए सेलुलर फ्लोरेसेंस प्रतिक्रियाओं (आरएफयू में) की गणना करें (पहले पढ़ें; आरएफयूपहले [पूरक तालिका एस 2]) और एगोनिस्ट जोड़ चरणों के बाद (दूसरा पठन = आरएफयूचींटी [पूरक तालिका एस 2])। प्रत्येक पठन क्रमशः चरण 2.3.12.3 और चरण 2.3.12.6 से आगे और रिवर्स प्लेट रीडिंग द्वारा प्राप्त दो मानों (नहीं दिखाए गए) के औसत से प्राप्त किया जाता है।
    नोट: आरएफयूपहले, आरएफयूचींटी संभावित एगोनिस्ट हिट (चरण 2.3.12.3 में पढ़ें) और संभावित विरोधी हिट (चरण 2.3.12.6 में पढ़ें) की सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों को संदर्भित करता है।
  2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर से डेटा के सभी तीन सेट, आरएफयूबीजी, आरएफयूएगो और आरएफयूएंट को तीन अलग-अलग स्प्रेडशीट में निर्यात करें। प्रत्येक स्प्रेडशीट में केवल दो कॉलम होंगे: अच्छी तरह से स्थिति और कच्चे आरएफयू (फाइलें यहां नहीं दिखाई गई हैं)।
    नोट: RFUbg चरण 2.3.11.2 में पढ़ी गई पृष्ठभूमि के RFU को संदर्भित करता है।
  3. तीन स्प्रेडशीट से डेटा को स्वरूपित करें, और उपरोक्त डेटा को एक सीएसवी फ़ाइल में व्यवस्थित करें ( पूरक तालिका एस 2 में उदाहरण देखें)। क्रमशः आरएफयूएगो और आरएफयूचींटी से पढ़े गए पृष्ठभूमि संकेत को घटाएं ( पूरक तालिका एस 2 में जी और एच कॉलम)।
  4. डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण (तालिका 1) और भंडारण के लिए सीएसवी फ़ाइल को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध "ऑनलाइन एचटीएस डेटा प्लेटफ़ॉर्म" ( सामग्री की तालिका देखें) में आयात करें।
  5. समीकरण (1) का उपयोग करके प्रत्येक प्लेट परख के गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मैन्युअल रूप से जेड-फैक्टर की गणना करें:
    समीकरण (1):
    Equation 1(1)
    नोट: μसी- और μसी + एक ही कुओं के रीडिंग के औसत आरएफयू का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो विलायक (रिक्त विलायक, एन = 64; पूरक तालिका एस 2 में नीले रंग में संख्या) को जोड़ने के बाद पहले जोड़ में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं और एगोनिस्ट (रिक्त विलायक + एगोनिस्ट, एन = 64; मैजेंटा में संख्या) को जोड़ने के बाद सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। क्रमशः। इसके अतिरिक्त, σसी- और σसी + उनके संबंधित मानक विचलन (एसडी) का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  6. मैन्युअल रूप से "ऑनलाइन एचटीएस डेटा प्लेटफॉर्म" पर गर्मी मानचित्रों से हिट अणुओं का चयन करें, और समीकरण (2) और समीकरण (3) का उपयोग करके एगोनिस्ट हिट और विरोधी हिट के लिए सामान्यीकृत प्रतिशत सक्रियण (एनपीए) और निरोधात्मक गतिविधि (आईओ) की गणना करें:
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

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Representative Results

एक उदाहरण के रूप में इस एचटीएस परख को प्रदर्शित करने के लिए 320 यादृच्छिक छोटे अणुओं से बनी एक इन-हाउस ड्रग प्लेट (एसएसी 2-34-6170) का उपयोग किया गया था। एचटीएस में 0.7 (तालिका 1) के जेड कारक के साथ उत्कृष्ट परख गुणवत्ता थी। यह जेड कारक परीक्षण किए गए यौगिकों से स्वतंत्र परख गुणवत्ता कोदर्शाता है। 0.5 या उससे अधिक का जेड-फैक्टर सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण के आरएफयू के बीच एक अच्छी परख संकेत गतिशील सीमा को इंगित करता है। 0.5 से कम जेड 'कारक वाले परखों में एक उप-मानक सिग्नल गतिशील सीमा होती है, आमतौर पर हिट चयन के लिए सूचनात्मक नहीं होती है, और इसलिए, छोड़ दी जाती है। सकारात्मक नियंत्रणों (64 सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का औसत आरएफयू,μ सी + = 130,139) से प्रतिक्रिया (सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों, आरएफयू में मापा जाता है) नकारात्मक नियंत्रणों की तुलना में औसतन 19 गुना अधिक थी (64 नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रियाओं का औसत आरएफयू, μसी- = 6,675)। यहां "एगोनिस्ट हिट्स" का चयन करने के लिए कटऑफ फ्लोरेसेंस को >50% के सामान्यीकृत प्रतिशत सक्रियण (एनपीए) अधिकतम अनुपात पर सेट किया गया था। "विरोधी हिट" का चयन करने के लिए कटऑफ फ्लोरेसेंस को >50% की एक देखी गई निरोधात्मक गतिविधि (आईओ) पर सेट किया गया था। तीन एगोनिस्ट हिट अणुओं और दो विरोधी हिट्स का चयन किया गया था: एसएसीसी -0090237 (एनपीए = 153%), एसएसीसी -0036982 (एनपीए = 118%), और एसएसीसी -0006532 (एनपीए = 152%) एगोनिस्ट के रूप में, और एसएसीसी -0103392 (आईओ = 53%) और एसएसीसी -0041280 (आईओ = 56%) को सहायक के रूप में दिखाया गया है। एगोनिस्ट (हरी पंक्तियों) और विरोधी (नारंगी पंक्तियों) के लिए एनपीए और आईओ की गणना के उदाहरण क्रमशः पूरक तालिका एस 2 में दिखाए गए हैं।

यौगिक जोड़ μs1 σs μग- σग- Z का मान
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
एगोनिस्ट पेप्टाइड जोड़ μs σs μc+ σc+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

तालिका 1: एचटीएस परख में पूरी प्लेट से सामान्यीकृत सेल प्रतिक्रियाओं का सारांश। सीडीडी वॉल्ट विश्लेषण से माध्य (μ) और मानक विचलन (σ) प्राप्त किए जाते हैं। संक्षेप: एचटीएस = उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयां; 1एस (नमूने) = 320 परीक्षण किए गए यौगिक; μएस = 320 कुओं से सेलुलर प्रतिक्रियाओं (आरएफयू) का औसत मूल्य; μसी- = नकारात्मक नियंत्रण से आरएफयू का औसत मूल्य; μसी + = सकारात्मक नियंत्रण से आरएफयू का औसत मूल्य; σएस = 320 कुओं से सेलुलर प्रतिक्रियाओं (आरएफयू) का मानक विचलन; σसी- = नकारात्मक नियंत्रण से आरएफयू का मानक विचलन; σसी + = सकारात्मक नियंत्रण से आरएफयू का मानक विचलन।

पूरक तालिका एस 1: स्वचालित पाइपिंग चरणों के लिए तरल हैंडलिंग सिस्टम के कस्टम प्रोग्राम। इस तालिका को जिओंग एट अल.31 से संशोधित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: प्रतिनिधि परिणामों का कच्चा डेटा। हरे रंग में हाइलाइट की गई पंक्तियां एगोनिस्ट हिट का प्रतिनिधित्व करती हैं, और नारंगी में हाइलाइट की गई पंक्तियां विरोधी हिट का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचटीएस का लक्ष्य छोटे अणुओं की भारी संख्या की स्क्रीनिंग के माध्यम से हिट अणुओं की पहचान करना है। इसलिए, इस उदाहरण के परिणाम केवल एक पारंपरिक एचटीएस प्रयोग के एक छोटे से हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, पहचाने गए हिट अणुओं को डाउनस्ट्रीम परख में मान्य करने की आवश्यकता होती है जैसे कि एक ही पुनः संयोजक सेल लाइन पर खुराक-निर्भर परख और केवल खाली वेक्टर को ले जाने वाली सीएचओ-के 1 सेल लाइन पर, जिसे छोटे अणुओं को बचाने के लिए एक साथ किया जा सकता है। साइटोटॉक्सिसिटी परख यह प्रदर्शित करने में मदद करेगी कि दूसरे जोड़ में प्रतिक्रिया की कमी सेल मृत्यु दर के कारण नहीं है। विट्रो में पृथक ऊतकों में गतिविधि को मान्य करने के लिए, या जीवित आर्थ्रोपोड्स में छोटे अणुओं को लागू करके या खिलाकर अन्य बायोएसे किए जाने चाहिए। टिक किनिन रिसेप्टर के छोटे अणु लिगैंड पहचान की पूरी पाइपलाइन पिछले प्रकाशन31 में पाई जा सकती है। इस पाइपलाइन के माध्यम से, टिक किनिन रिसेप्टर के कुल 36 विरोधी हिट की पहचान की गई थी। इन विरोधी में से तीन को आगे एक ऊतक संकुचन-निषेध परख में परीक्षण किया गया था और मच्छर हिंडगट पर एंटी-मायोट्रोपिक गतिविधि दिखाई गई थी, जहां ऑर्थोलॉगस मच्छर किनिन रिसेप्टर्स31 व्यक्त किए जाते हैं।

एचटीएस करने से पहले प्रत्येक जीपीसीआर-व्यक्त सेल लाइन को उपयुक्त प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए मान्य किया जाना चाहिए। इन स्थितियों में सेल घनत्व (10,000 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से), स्क्रीन किए गए यौगिकों की एकाग्रता (2 μM), परख में अंतिम DMSO एकाग्रता (0.2%), दूसरे जोड़ के लिए उपयोग किए जाने वाले एगोनिस्ट लिगैंड की एकाग्रता (1 μM), पिपेटिंग गति और गहराई, और एगोनिस्ट पेप्टाइड (5 मिनट) को जोड़ने के बाद पढ़ने का समय शामिल है। तरल हैंडलिंग सिस्टम की गहराई और गति को समायोजित करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यदि कोशिकाएं अनुयायी हैं तो वितरण चरण कोशिकाओं को परेशान नहीं करते हैं। एचटीएस शुरू करने से पहले इन शर्तों का सत्यापन समस्या निवारण में सहायता करेगा यदि परख की गुणवत्ता खराब है। इष्टतम परिस्थितियों में कोशिकाओं का होना महत्वपूर्ण है: कोशिकाओं को 90% -100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचना चाहिए, लेकिन एचटीएस के लिए उपयोग किए जाने पर सेल प्लेट में अतिप्रवाह नहीं होना चाहिए। यदि कुछ कुओं में पृष्ठभूमि संकेत असामान्य रूप से कम या उच्च हैं, तो स्पष्ट रूप से कम या उच्च सेल घनत्व के लिए माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करने के बाद, डेटा का विश्लेषण करते समय आउटलायर्स को मैन्युअल रूप से हटा दिया जाना चाहिए। एचटीएस के लिए कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख को अनुकूलित करने से पहले, सकारात्मक पेप्टाइड के गतिज वक्र को जाना जाना चाहिए, क्योंकि एगोनिस्ट पेप्टाइड के लिए कोशिकाओं की गतिज प्रतिक्रिया 1-2 मिनट तक चलना चाहिए ताकि इसे एचटीएस परख में अनुकूलित किया जा सके और पूरी प्लेट को पढ़ने के लिए पर्याप्त समय तक चले। लंबे समय तक संकेत प्राप्त करने के लिए, एगोनिस्ट पेप्टाइड की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता लागू की जानी चाहिए, या एक उच्च सेल घनत्व का परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि कुछ रिसेप्टर कोशिकाओं की गतिज प्रतिक्रिया बहुत कम है (1 मिनट से कम समय तक रहती है), तो अंतिम बिंदु रीडआउट में तेज गति से पढ़ने या एचटीएस के लिए प्लेट के केवल एक हिस्से का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। निश्चित रूप से, रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर के संबंध में पुनः संयोजक सेल लाइन की गुणवत्ता सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। विभिन्न क्लोनल सेल लाइनें अलग-अलग होंगी, क्योंकि प्लास्मिड का सम्मिलन जीनोम में यादृच्छिक है, और यह निश्चित रूप से रिसेप्टर अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकता है। ट्रांसक्रिप्टेड पूल के प्रारंभिक कैल्शियम फ्लोरेसेंस टेस्ट को शामिल करना और क्लोनल सेल लाइनों का चयन करने की प्रक्रिया के दौरान आदर्श होगा।

कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख की सीमा यह है कि यह रिसेप्टर के लिगैंड के प्रत्यक्ष बंधन के बजाय माध्यमिक दूतों की गतिविधि को मापता है। यद्यपि लक्ष्य रिसेप्टर को व्यक्त नहीं करने वाली कोशिकाओं पर हिट अणुओं की स्क्रीनिंग करके ऑफ-टारगेट एगोनिस्ट हिट को बाहर करना संभव है, लेकिन इस परख का उपयोग करके ऑफ-टारगेट विरोधी हिट अणुओं को पूरी तरह से बाहर करना असंभव है क्योंकि यह संभव है कि कुछ अणु जीपीसीआर सिग्नलिंग के डाउनस्ट्रीम सेलुलर कैल्शियम रिलीज मार्गों को रोक सकते हैं। इसलिए, जीव स्तर पर सत्यापन के लिए या तो लिगैंड बाइंडिंग परख या बायोसेसे का उपयोग करके आगे सत्यापन की आवश्यकता होती है, जैसे कि एक ज्ञात एगोनिस्ट के साथ टिक ऊतक परख में, जैसा कि पहले मच्छरों के साथ कियागया था।

जीपीसीआर सक्रियण का पता लगाने वाले अधिकांश कार्यात्मक परख मुख्य रूप से दो प्रमुख सिग्नलिंग मार्गों में इंट्रासेल्युलर घटनाओं को मापते हैं: जी प्रोटीन-निर्भर और जी प्रोटीन-स्वतंत्र मार्ग। जी प्रोटीन-निर्भर परख सीए2 +, इनोसिटोल ट्राइफॉस्फेट (आईपी3), या सीएमपी सांद्रता को मापते हैं, जबकि जी प्रोटीन-स्वतंत्र परख मुख्य रूप से रिसेप्टर तस्करी या β-अरेस्टिन भर्ती7 का पता लगाते हैं। विभिन्न परख रीडआउट के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हैं, जैसे कि सीए2 + -संवेदनशील रंजक (फ्लोरेसेंस परख), फोटोप्रोटीन जैसे कि एकोरिन (सीए2 + बायोलुमिनेसेंस एसेस)14, टैग किए गए फ्लोरेसेंस प्रोटीन, फ्लोरेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (फ्रेट)-आधारित परख, बायोल्यूमिनेसेंस रेजोनेंस एनर्जी ट्रांसफर (बीआरईटी) -आधारित परख, या लेबल-मुक्त ऑप्टिकल बायोसेंसर-आधारित सेलुलर परख। झांग और ज़ी35 द्वारा इन परखों और संबंधित उपलब्ध रीडआउट प्रौद्योगिकियों की विस्तार से समीक्षा की गई थी। कुछ परख किसी भी जीपीसीआर पर लागू होते हैं, और कुछ कुछ जीपीसीआर के लिए विशिष्ट होते हैं (उदाहरण के लिए, जीक्यू-युग्मित रिसेप्टर्स के लिए सीए2 + परख, जीआई / ओ- या जीएस-युग्मित रिसेप्टर्स के लिए सीएमपी)। हालांकि, पुनः संयोजक कोशिकाओं में रिसेप्टर के साथ कुछ जी प्रोटीन को सह-व्यक्त करके, सिग्नलिंग मार्ग को बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, जीक्यू 15/16 प्रोटीन को पीएलसी-आईपी 3-सीए2 + सिग्नलिंग डिटेक्शन 7,36 के लिए गैर-जीक्यू-युग्मित रिसेप्टर्स के साथ सह-व्यक्त किया जा सकता है। एक आणविक घटना को मापने वाले परखों के विपरीत, उच्च-सामग्री विश्लेषण परख हैं, जो लिगैंड विशिष्टता37 में सुधार के लिए भारी मात्रा में जैविक डेटा एकत्र करते हैं। इस प्रकार की परख भीप्रदर्शन करने के लिए अधिक जटिल और महंगी है।

अकशेरुकी अनुसंधान में, सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले कार्यात्मक परख दूसरे दूतों की सांद्रता में उतार-चढ़ाव का विश्लेषण करके जीपीसीआर सक्रियण का पता लगाते हैं, जैसे कि सीए2 + या सीएमपी। स्तनधारियों और अकशेरुकी जीवों के बीच सिग्नलिंग मार्गों में अंतर के कारण, उपर्युक्त अधिकांश अन्य रीडआउट प्रौद्योगिकियों को अभी तक अकशेरुकी जीपीसीआर अध्ययनों के लिए व्यापक रूप से नहीं अपनाया गया है। हालांकि, जी-प्रोटीन जानवरों के साम्राज्य में अपेक्षाकृत संरक्षित हैं। हाल ही में, लिसमोंट एट अल .38 ने प्रदर्शित किया कि रिसेप्टर पुनः संयोजक कोशिकाओं में सह-व्यक्त होने पर कुछ मानव बीआरईटी-आधारित जी-प्रोटीन बायोसेंसर को कीट जीपीसीआर के सक्रियण का पता लगाने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है। विशिष्ट जीपीसीआर के साथ विभिन्न जी प्रोटीन-आधारित बायोसेंसर (जीएस, जीआई / ओ, जीक्यू / 11, या जी12/13) में से प्रत्येक को सह-व्यक्त करके, जी प्रोटीन-युग्मन तंत्र को स्पष्ट किया जा सकता है। लिसमोंट एट अल.38 द्वारा किए गए अध्ययन में, Schgr-CRF-DH खुराक पर निर्भर रूप से Gi/o और Gq/11 बायोसेंसर को सक्रिय करसकता है और G s और G12/13 बायोसेंसर को सक्रिय नहीं करता है।

कुल मिलाकर, यहां वर्णित "दोहरे-जोड़" दृष्टिकोण के साथ संयोजन में 384-वेल प्लेट में किए गए कैल्शियम फ्लोरेसेंस परख अपेक्षाकृत कम समय में दसियों हजार अणुओं की स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। डाउनस्ट्रीम सत्यापन और अनुप्रयोगों के लिए हिट अणुओं की खोज के लिए यह एक अपेक्षाकृत समय और लागत कुशल दृष्टिकोण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को यूएसडीए-निफा-एएफआरआई पशु स्वास्थ्य और कल्याण पुरस्कार (पुरस्कार संख्या 2022-67015-36336, पीवीपी [परियोजना निदेशक]) और टेक्सास ए एंड एम एग्रीलाइफ रिसर्च कीट वेक्टर रोग अनुदान कार्यक्रम (एफवाई'22-23) से पीवीपी को प्रतिस्पर्धी धन से समर्थित किया गया था। पूरक तालिका एस 2 में टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय और टेक्सास ए एंड एम एग्रीलाइफ रिसर्च में डॉ जेम्स सैचेटिनी की प्रयोगशाला से प्राप्त एक इन-हाउस, यादृच्छिक, छोटे-अणु पुस्तकालय से डेटा शामिल है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

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References

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जैव रसायन अंक 190
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