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Biochemistry

Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

Dans ce travail, un test de fluorescence calcique intracellulaire à haut débit pour des plaques à 384 puits afin de cribler de petites banques de molécules sur des récepteurs couplés aux protéines G recombinantes (RCPG) est décrit. La cible, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, est exprimée dans les cellules CHO-K1. Ce test identifie les agonistes et les antagonistes utilisant les mêmes cellules dans un test de « double addition ».

Abstract

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande superfamille de récepteurs et sont la cible de nombreux médicaments humains. Le criblage à haut débit (HTS) de bibliothèques aléatoires de petites molécules par rapport aux RCPG est utilisé par l’industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments spécifiques à la cible. Dans cette étude, un HTS a été utilisé pour identifier de nouveaux ligands à petites molécules de RCPG neuropeptidiques spécifiques aux invertébrés comme sondes pour des études physiologiques de vecteurs d’agents pathogènes humains et vétérinaires mortels.

Le récepteur kinin spécifique aux invertébrés a été choisi comme cible parce qu’il régule de nombreux processus physiologiques importants chez les invertébrés, y compris la diurèse, l’alimentation et la digestion. De plus, la pharmacologie de nombreux RCPG invertébrés est mal caractérisée ou pas caractérisée du tout; par conséquent, la pharmacologie différentielle de ces groupes de récepteurs par rapport aux RCPG apparentés chez d’autres métazoaires, en particulier chez les humains, ajoute des connaissances aux relations structure-activité des RCPG en tant que superfamille. Un test HTS a été développé pour des cellules dans des plaques de 384 puits pour la découverte de ligands du récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, ou tique du bétail du sud, Rhipicephalus microplus. Le récepteur de la kinine à tiques était exprimé de manière stable dans les cellules CHO-K1.

Le récepteur des kinines, lorsqu’il est activé par des neuropeptides de kinine endogènes ou d’autres agonistes de petites molécules, déclenche la libération de Ca2+ des réserves de calcium dans le cytoplasme. Ce test de fluorescence calcique combiné à une approche de « double addition » peut détecter des molécules « hit » agonistes et antagonistes fonctionnelles dans la même plaque de dosage. Chaque essai a été réalisé à l’aide de plaques médicamenteuses portant un réseau de 320 petites molécules aléatoires. Un facteur Z' fiable de 0,7 a été obtenu, et trois molécules d’agonistes et deux molécules d’antagoniste ont été identifiées lorsque le HTS était à une concentration finale de 2 μM. Le test de fluorescence calcique rapporté ici peut être adapté pour dépister d’autres RCPG qui activent la cascade de signalisation Ca2+ .

Introduction

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui sont présents de la levure à l’homme, représentent la plus grande superfamille de récepteurs dans de nombreux organismes1. Ils jouent un rôle essentiel dans la régulation de presque tous les processus biologiques chez les animaux. Il y a 50 à 200 RCPG dans le génome des arthropodes, ce qui signifie qu’ils représentent la plus grande superfamille de récepteurs membranaires2. Ils sont classés en six classes principales, A-F, en fonction de leur similitude de séquence et de leurs fonctions3. Les RCPG transduisent divers signaux extracellulaires, tels que ceux des hormones, des neuropeptides, des amines biogènes, du glutamate, du proton, des lipoglycoprotéines et des photons4. Les RCPG se couplent aux protéines G hétérotrimères (Gα, Gβ et Gγ) pour transmettre des signaux en aval. Les RCPG couplés aux protéines Gαs ou Gαi/o augmentent ou diminuent, respectivement, les niveaux intracellulaires d’adénosine monophosphate (AMPc) 3', 5'-cyclique en activant ou en inhibant l’adénylylcyclase. Les RCPGs couplés à Gαq/11 induisent la libération de calcium à partir des réserves de calcium du réticulum endoplasmique en activant la voie phospholipase C (PLC)-inositol-1,4,5-triphosphate (IP3). Les RCPGs couplés à Gα12/13 activent les facteurs d’échange nucléotidiquesde la RhoGTPase 5,6. Les RCPG sont la cible de plus de 50% des médicaments humains et d’un acaricide, l’amitraze4. Comme les RCPG transduisent des signaux aussi divers, ils sont des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux pesticides qui perturbent les fonctions physiologiques spécifiques aux invertébrés.

L’objectif de HTS est d’identifier les molécules de frappe qui peuvent moduler les fonctions des récepteurs. HTS implique le développement de tests, la miniaturisation et l’automatisation7. Les RCPG des neuropeptides arthropodes sont impliqués dans la plupart des fonctions physiologiques, telles que le développement, la mue et l’ecdysis, l’excrétion, la mobilisation énergétique et la reproduction4. La plupart des RCPG neuropeptidiques des arthropodes et des métazoaires signalent par la cascade de signalisation calcique 2,6,8,9,10, comme dans le peptide myoinhibiteur et les récepteurs SIFamide de la tique à pattes noires Ixodes scapularis; leurs ligands sont antagonistes dans les essais de motilité de l’intestin postérieur, le SIF provoquant une contraction et la MIP l’inhibant11,12. Un récepteur de type NPY du moustique de la fièvre jaune, Aedes aegypti, régule l’hôte femelle à la recherche13. Comparé à d’autres tests alternatifs de mobilisation du calcium tels que le test de bioluminescence calcique de l’équorine14, le test de fluorescence du calcium est facile à réaliser, ne nécessite pas la transfection d’autres protéines de détection du calcium recombinant et est rentable. Le test de fluorescence calcique produit un signal prolongé par rapport au signal cinétique rapide obtenu dans le test de bioluminescence calcique de l’équorine14,15.

Dans l’exemple ici, le récepteur kinine de la tique de la fièvre bovine, Rhipicephalus microplus, a été exprimé de manière recombinante dans la lignée cellulaire CHO-K1 et utilisé pour le test de fluorescence calcique. Il n’y a qu’un seul gène récepteur de la kinine trouvé dans R. microplus; le récepteur signale par une voie de signalisation dépendante de la protéine Gq et déclenche l’efflux de Ca2+ des réserves de calcium dans l’espace intracellulaire16. Ce processus peut être détecté et quantifié par un fluorophore, qui provoque un signal de fluorescence lors de la liaison des ions calcium (Figure 1).

Le récepteur kinine est un RCPG spécifique aux invertébrés, qui appartient aux récepteurs de type rhodopsine de classe A. La kinine est un ancien neuropeptide de signalisation présent dans Mollusca, Crustacea, Insecta et Acari 4,17,18. Les coléoptères (coléoptères) n’ont pas le système de signalisation des kinines; chez le moustique Aedes aegypti, il n’y a qu’un seul récepteur de kinine qui se lie à trois aedeskinines, tandis que Drosophila melanogaster a un récepteur de kinine avec la drosokinine comme ligandunique 19,20,21. Il n’y a pas de kinines homologues ou de récepteurs de kinines chez les vertébrés. Bien que la fonction exacte de la kinine soit inconnue chez les tiques, les femelles de R. microplus silencieuses de R. microplus soumises au récepteur de la kinine sont réduites de manière significative22. Les kinines sont des peptides pléotropes chez les insectes. Chez Drosophila melanogaster, ils sont impliqués dans les systèmes de régulation nerveux central et périphérique23, la pré-ecdysis 24, l’alimentation25, le métabolisme 26 et les schémas d’activité du sommeil26,27, ainsi que la locomotionlarvaire 28. Les kinines régulent la contraction de l’intestin postérieur, la diurèse et l’alimentation du moustique A. aegypti 29,30,31. Les peptides kinines ont conservé un pentapeptide C-terminal Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, qui est la séquence minimale requise pour l’activité biologique32. La spécificité des arthropodes, la petite taille du ligand endogène, qui les rend sujets à l’interférence des petites molécules, et les fonctions pléiotropiques chez les insectes font du récepteur kinine une cible prometteuse pour la lutte antiparasitaire4.

Le test de « double addition » (Figure 2) permet l’identification d’agonistes ou d’antagonistes dans le même test HTS15. Il est adapté d’un test de « double addition » couramment utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour la découverte de médicaments33. En bref, le premier ajout de médicaments dans la plaque cellulaire permet d’identifier les agonistes potentiels dans la bibliothèque chimique lorsqu’un signal de fluorescence plus élevé est détecté par rapport à l’application du contrôle du solvant. Après 5 min d’incubation avec ces petites molécules, un agoniste connu (peptide kinine) est appliqué sur tous les puits. Les puits qui ont reçu au hasard un antagoniste de la plaque médicamenteuse affichent un signal de fluorescence plus faible lors de l’ajout d’agonistes par rapport aux puits témoins qui ont reçu le solvant lors de la première addition. Ce test permet ensuite d’identifier des agonistes et antagonistes potentiels avec les mêmes cellules. Dans un projet HTS standard, ces molécules frappées seraient validées par des tests dose-réponse et par des tests d’activité biologique supplémentaires, qui ne sont pas présentés ici.

Figure 1
Figure 1 : Illustration du mécanisme d’essai de fluorescence calcique. La protéine Gq déclenche la voie de signalisation intracellulaire du calcium. Le récepteur de la kinine (récepteur couplé à la protéine G) a été exprimé de manière recombinante dans les cellules CHO-K1. Lorsque le ligand agoniste se lie au récepteur, la protéine Gq associée au récepteur kinin active l’API, ce qui catalyse la conversion d’une molécule PIP2 en IP3 et DAG. IP 3 se lie ensuite à l’IP3R à la surface du réticulum endoplasmique, conduisant à la libération de Ca 2+ dans le cytoplasme, où les ions Ca2+ se lient aux fluorophores et provoquent un signal de fluorescence. Le signal de fluorescence peut être obtenu par excitation à 490 nm et détecté à 514 nm. Abréviations : RCPG = récepteur couplé aux protéines G; PLC = phospholipase C; PIP2 = phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3 = inositol trisphosphate; DAG = diacylglycérol; IP3 R = récepteur IP3. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flux de travail pour le criblage à haut débit de petites molécules sur un récepteur couplé à une protéine G exprimé dans des cellules CHO-K1. (A) Des cellules CHO-K1 recombinantes exprimant de manière stable le récepteur kinine ont été ajoutées à la plaque de 384 puits (10 000 cellules/puits) à l’aide d’un système de manipulation de liquide (25 μL/puits) et incubées dans un incubateur de CO2 humidifié pendant 12 à 16 h. (B ) Le tampon d’essai contenant le colorant fluorescent (25 μL/puits) a été ajouté dans la plaque cellulaire à l’aide d’un système de manipulation de liquide. La plaque a été incubée pendant 30 min à 37 °C pendant 30 min et équilibrée à TA pendant 30 minutes supplémentaires. (C) Le signal de fluorescence de fond des cellules de chaque puits a été mesuré à l’aide d’un lecteur de plaques. (D) Des solutions médicamenteuses provenant d’une plaque bibliothèque de 384 puits et d’un solvant à blanc (tous à 0,5 μL/puits) ont été ajoutées dans la plaque d’essai cellulaire à l’aide d’un système de manipulation de liquide. (E) Les réponses cellulaires de fluorescence calcique ont été mesurées avec le lecteur de plaque immédiatement après l’ajout des solutions médicamenteuses; Les composés suscitant des signaux de fluorescence supérieurs à la moyenne ont été choisis comme des coups agonistes. Des hits antagonistes qui bloquent le RCPG (icône ci-dessous) ont été révélés après l’ajout de l’agoniste peptidique à l’étape G. (F) Dans la même plaque d’essai, après 5 minutes d’incubation des cellules avec des composés de criblage, un peptide agoniste endogène Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) du récepteur des tiques kinines a été ajouté à chaque puits (1 μM). (G) Les réponses de fluorescence cellulaire après l’ajout du peptide agoniste ont été mesurées immédiatement par le lecteur de plaques. Le(s) composé(s) inhibant(s) le signal de fluorescence a été sélectionné comme antagoniste(s). Abréviations : RCPG = récepteur couplé aux protéines G; RT = température ambiante; RFU = unités de fluorescence relative. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. Entretien des cellules

REMARQUE : UNE LIGNÉE CELLULAIRE CHO-K1 qui exprime de façon stable le récepteur des kinines de R. microplus, nommée BMLK3, a été développée par Holmes et al.16. Les détails du développement de la lignée cellulaire sont présentés ailleurs14. Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité de classe II.

  1. Cultiver la lignée cellulaire recombinante dans un milieu sélectif (milieu F-12K contenant 10 % de sérum fœtal bovin [FBS] et 800 μg/mL de sulfate G418) pour assurer l’expression du récepteur cible. Entreposer les cellules exprimant de façon stable le récepteur dans 1 mL de milieu de congélation (FBS à 90 % et 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]) dans un cryovial de 2 mL dans un congélateur à -80 °C.
    REMARQUE: Pour le stockage à long terme des cellules congelées, stockez-les dans de l’azote liquide.
  2. Préchauffer tous les milieux avant la culture cellulaire. Dans une enceinte de biosécurité, transférer 13 mL de milieu sélectif préchauffé (milieu F-12K contenant 10 % de FBS et 800 μg/mL de sulfate G418) dans une fiole T-75 et la conserver dans l’enceinte de biosécurité. Décongeler un flacon de3 cellules BMLK congelées (~1,5 × 106 cellules) dans un bain-marie à 37 °C pendant 2-3 min. Transvaser les cellules décongelées dans le ballon T-75. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 , sauf indication contraire.
  3. Lorsque les cellules atteignent 90% de confluence (1-2 jours), préchauffer tout le milieu à 37 ° C, à l’exception de la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco, qui est maintenue à température ambiante. Dans une enceinte de biosécurité, retirer le milieu usé de la fiole T-75, laver les cellules pendant 5 s avec 10 mL de DPBS en remuant doucement la fiole, puis retirer la DPBS à l’aide d’une pipette sérologique.
    REMARQUE: Une image de cellules CHO-K1 à 90% de confluence est montrée dans Lu et al.14.
  4. Détacher les cellules du ballon T-75 en ajoutant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber pendant 3 à 5 minutes à 37 °C dans l’incubateur. Ensuite, ajouter 8 mL de milieu sélectif et bien mélanger en pipetant et en relâchant doucement 2x-3x avec la même pipette sérologique.
  5. Transvaser 2 mL de la suspension cellulaire (~1 × 106 cellules) de l’étape 1.4 dans une nouvelle fiole T-75 contenant 10 mL de milieu sélectif chaud. Cultivez les cellules pendant 1-2 jours dans l’incubateur jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% de confluence.
  6. Utilisez les cellules pour le test en suivant les étapes suivantes, ou répétez les étapes 1.4-1.5 une ou deux fois avant d’utiliser les cellules dans le test.
    REMARQUE: Ne pas dépasser trois à quatre passages, car le signal de dosage avec certaines lignées cellulaires peut s’affaiblir avec d’autres passages.

2. Dosage de fluorescence calcique

  1. Enduire la plaque cellulaire.
    1. Utiliser un système de manipulation des liquides placé à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité pour toutes les étapes de pipetage dans les plaques de 384 puits. Créez des programmes personnalisés pour le pipetage dans les plaques 384 puits31 (tableau supplémentaire S1). Enduisez à l’avance les plaques stériles à 384 puits. Dans une enceinte de biosécurité, charger 10 μL/puits d’une solution aqueuse de Poly-D-lysine (PDL) à 0,05 mg/mL dans chaque plaque et incuber pendant 5 min à température ambiante.
    2. Videz l’assiette en la retournant rapidement et en l’épongeant doucement sur des serviettes en papier stériles. Ensuite, rincez chaque puits avec 10 μL d’eau, videz l’assiette et laissez l’assiette sécher dans l’enceinte de biosécurité pendant la nuit sans couvercle. Fermez la plaque avec le couvercle et conservez à 4 °C au réfrigérateur.
      NOTE: Les plaques revêtues peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 6 mois.
  2. Jour 1
    1. Sortez la plaque de médicament (100 μM dans 90% de DPBS + 10% de DMSO, la concentration finale dans le puits pour HTS sera de 2 μM) stockée dans le congélateur à -20 °C et placez-la à température ambiante.
      NOTE: Disposition de la plaque médicamenteuse: Chaque plaque de 384 puits (24 colonnes x 16 rangées) contient 320 puits avec différents composés de bibliothèque et 64 puits avec solvant blanc (DPBS contenant 10% de DMSO), qui sont disposés en quatre colonnes, avec deux colonnes sur le bord de chaque côté. Voir le tableau supplémentaire S2 pour la disposition des plaques.
    2. Lorsque les cellules atteignent une confluence de ~70 % à 90 % dans le ballon T-75, détacher les cellules du ballon T-75 comme décrit ci-dessous. Préchauffer tout le média à 37 °C à l’exception de la DPBS (température ambiante).
      1. Retirez le milieu usé, lavez les cellules avec 10 ml de DPBS, puis retirez le DPBS. Détacher les cellules du ballon T-75 à l’aide de 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 3 à 5 min à 37 °C dans l’incubateur, ajouter 8 mL de milieu sélectif et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL pour centrifuger à 1 000 × g pendant 3 min.
      2. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 10 mL de milieu F-12K contenant 1 % de FBS et 400 μg/mL de sulfate G418. Gardez la suspension dans l’enceinte de biosécurité tout en déterminant le nombre de cellules.
    3. Déterminer la densité cellulaire de la suspension en vue d’une dilution ultérieure : Mélanger 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu de trypan à 0,4 %, puis charger 20 μL du mélange dans une chambre de comptage de cellules pour être lu par un compteur de cellules pour la densité cellulaire.
    4. Diluer la suspension cellulaire dans le même milieu (milieu F-12K contenant 1 % de FBS et 400 μg/mL de sulfate de G418) jusqu’à obtenir un volume final d’au moins 15 mL à une densité de 4 × 105 cellules/mL.
    5. Ensemencez les cellules dans la plaque de 384 puits recouverte de PDL. Transférer 15 mL de la suspension cellulaire ci-dessus (4 × 105 cellules/mL) dans un réservoir de réactif auto-respectueux de 150 mL. Distribuer 25 μL de la suspension cellulaire (~10 000 cellules/puits) dans chaque puits des 384 puits de la plaque à l’aide d’un système de manipulation des liquides en deux étapes. Charger 384/12,5 μL de pointes à faible rétention sur la tête du manipulateur de liquides, aspirer 12,5 μL du réservoir (vitesse 5,2 μL/s) et distribuer dans chaque puits (vitesse : 3,1 μL/s).
    6. Répéter le pipetage comme à l’étape précédente 2.2.5 pour atteindre 25 μL par puits. Ensuite, incuber la plaque pendant une nuit (14-16 h) à 37 °C et 5% de CO2 dans l’incubateur humidifié.
      REMARQUE: Comme le volume maximal de pipetage est de 12,5 μL pour cette tête spécifique, le pipetage pour 25 μL est effectué en deux étapes.
  3. Jour 2
    1. Le lendemain matin, vérifiez la plaque cellulaire couverte au microscope; Si elles ne sont pas confluentes, attendez que les cellules atteignent 90% de confluence.
    2. Préparez une solution mère de colorant fluorescent : Remettez en suspension le colorant fluorescent lyophilisé dans 100 μL de DMSO et évitez la lumière directe sur la solution mère. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment.
      NOTA : Le stock peut être aliquote en aliquotes de 15 μL pour chaque essai sur plaque afin d’éviter la congélation et la décongélation répétées; les aliquotes peuvent être conservées à −80 °C jusqu’à 1 mois.
    3. Dans l’enceinte de biosécurité avec les lumières éteintes, préparer le colorant de chargement (1x) dans un tube conique de 15 mL enveloppé de papier d’aluminium, en combinant 15 μL de la solution mère de colorant fluorescent (à partir de l’étape 2.3.2) et le reste des composants préchauffés de la trousse (37 °C) : 13,5 mL de 1x HHBS (tampon de Hank avec 20 mM HEPES) et 1,5 mL de réactif B (inhibiteur d’efflux de colorant).
      REMARQUE: La lumière de la pièce est allumée pendant cette étape.
    4. Fermez le tube et mélangez bien en le retournant doucement plusieurs fois (généralement 3 à 5 fois).
      NOTE: Conserver à température ambiante et utiliser le mélange de colorant de chargement dans les 30 minutes.
    5. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, retirer le milieu usé de la plaque d’essai à 384 puits en retournant rapidement la plaque et en épongeant doucement sur du papier absorbant stérile; Répétez ce mouvement 2x-3x pour retirer tout le liquide de la plaque. Jetez les serviettes mouillées.
    6. Éteignez la plupart des lumières directes artificielles dans la pièce (en laissant une lampe de bureau douce et faible allumée ou similaire pour permettre des conditions de travail visibles) et dans l’armoire de biosécurité pour toutes les étapes jusqu’à la fin du test (environ pendant 1,5 h).
    7. Placer 15 mL du colorant de chargement (1x) de l’étape 2.3.3 dans un réservoir auto-friendly de 150 mL.
      1. Transférer 25 μL du colorant de chargement (1x) du réservoir dans chaque puits à l’aide d’un système de manutention de liquide avec 384/12,5 μL de pointes de faible rétention en distribuant 12,5 μL dans chaque puits de la plaque (vitesse d’aspiration et de distribution : 3,8 μL/s).
    8. Répéter l’étape de pipetage comme au point 2.3.7.1 pour atteindre un volume final de 25 μL dans chaque puits de la plaque. Couvrez et enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière ambiante.
    9. Incuber la plaque cellulaire couverte à 37 °C dans l’incubateur humidifié au CO2 pendant 30 min, la retirer de l’incubateur et l’équilibrer à température ambiante à l’intérieur du lecteur de plaques ou sur le banc, en gardant la plaque couverte et enveloppée de papier d’aluminium pendant encore 30 min. Les cellules sont alors prêtes pour le criblage à haut débit (HTS).
    10. Préparation chimique: Faire tourner la plaque de médicament de l’étape 2.2.1 à 1 200 × g dans une centrifugeuse à plaques pendant 1 min à température ambiante.
      1. Préparer une solution peptidique agoniste 10x de Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) (10 μM) en remettant en suspension 100 nmoles de peptide lyophilisé dans 10 mL de 1x HHBS contenant 0,1% de DMSO, et transférer la solution dans un réservoir auto-friendly de 150 mL.
    11. Mesurer le signal de fond : Pour l’ensemble du test HTS dans le lecteur de plaques, sous Protocoles, choisissez le mode de fluorescence du point final.
      NOTE: Le signal fluorescent est lu à partir du bas de la plaque à des longueurs d’onde d’excitation/émission de 495 nm/525 nm.
      1. Insérez la plaque cellulaire dans le lecteur de plaque. Dans le tableau de bord, sélectionnez ajuster le gain, sélectionnez un puits aléatoire sur la plaque, attribuez-le à 5 % à 10 % de la valeur de fluorescence maximale mesurable et sélectionnez ajuster la hauteur (lecture).
      2. Cliquez sur Démarrer la mesure pour lire la plaque entière pour le signal de fluorescence de fond en unités de fluorescence relative (RFU).
    12. Essai de « double addition »
      1. À l’aide du système de manipulation des liquides avec des pointes de 384/12,5 μL, pour mélanger la solution médicamenteuse dans chaque puits de la plaque médicamenteuse, pipeter 3x de haut en bas de 10 μL de la solution médicamenteuse (dans DPBS contenant 10% de DMSO) (vitesse de pipetage: 5,2 μL / s) et « aspirer » 1,5 μL de chaque puits de la plaque médicamenteuse (vitesse d’aspiration: 1,0 μL / s).
      2. « Distribuer » 0,5 μL des composés dans la plaque d’essai cellulaire (vitesse de pipetage : 1 μL/s) pour atteindre une concentration finale de 2 μM dans du DMSO à 0,2 %.
      3. Placez immédiatement la plaque de dosage dans le lecteur de plaque après avoir ajouté les composés de criblage. Lisez la même plaque dans les directions de lecture avant et arrière. Pour obtenir ces lectures, définissez un programme à lire à partir de « puits 1-384 » et immédiatement à partir de « 384-1 ».
        REMARQUE: La lecture dans les deux sens prend 2 min au total. Cette conception de lecture vise à compenser la diminution de l’intensité du signal qui se produit pendant la lecture de la plaque dans chaque direction. Voir l’étape 3.1 pour les analyses de lecture.
      4. Éliminer le reste de 1 μL de solution médicamenteuse dans les embouts en immergeant les embouts dans un réservoir de déchets de 150 mL contenant ~50 mL de DPBS (vitesse de distribution : 1,0 μL/s).
      5. Incuber les composés de criblage avec les cellules pendant un total de 5 minutes (y compris les 2 minutes de lecture sur plaque) à température ambiante dans l’enceinte de biosécurité avec les lumières éteintes. Ajouter 3 μL du peptide agoniste, Rhimi-K-1 (QFSPWGamide), du réservoir (vitesse d’aspiration : 3,1 μL/s) dans la plaque d’essai à l’aide du système de manipulation du liquide (vitesse de distribution : 3,1 μL/s) avec des pointes de 384/12,5 μL.
      6. Placez la plaque dans le lecteur de plaque immédiatement après l’ajout du peptide agoniste. Lire la plaque dans les directions avant et arrière en utilisant le même programme qu’à l’étape 2.3.12.3

3. Analyse des données

  1. À l’aide du logiciel d’analyse associé au lecteur de plaques installé sur un ordinateur, calculer les réponses de fluorescence cellulaire (en RFU) pour les deux lectures après la première addition de composé (Première lecture; RFUago [Tableau supplémentaire S2]) et après les étapes d’addition agoniste (Deuxième lecture = RFU ant [Tableau supplémentaire S2]). Chaque lecture est obtenue en faisant la moyenne des deux valeurs obtenues (non représentées) par les lectures sur plaque avant et arrière de l’étape 2.3.12.3 et de l’étape 2.3.12.6, respectivement.
    NOTE: Il y a RFU, les fourmis RFU désignent les unités de fluorescence relatives des hits agonistes potentiels (lire à l’étape 2.3.12.3) et des hits antagonistes potentiels (lire à l’étape 2.3.12.6), respectivement.
  2. Exportez les trois ensembles de données, RFU bg, RFUago et RFUant, du logiciel d’analyse vers trois feuilles de calcul distinctes. Chaque feuille de calcul n’aura que deux colonnes: position du puits et RFU brute (fichiers non affichés ici).
    NOTE: RFU bg fait référence à la RFU de l’arrière-plan lu à l’étape 2.3.11.2.
  3. Mettez en forme les données des trois feuilles de calcul et organisez les données ci-dessus dans un fichier csv (voir l’exemple du tableau supplémentaire S2). Soustrayez le signal de fond lu de la RFU ago et de la RFU ant, respectivement (colonnes G et H dans le tableau supplémentaire S2).
  4. Importez le fichier csv dans une « plateforme de données HTS en ligne » disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse des données en aval (tableau 1) et le stockage.
  5. Calculer manuellement le facteur Z' pour le contrôle de la qualité de chaque essai sur plaque à l’aide de l’équation (1) :
    Équation (1):
    Equation 1(1)
    NOTE: μ c- et μc+ représentent les UFR moyennes des lectures des mêmes puits, qui servent de témoins négatifs dans la première addition après l’ajout du solvant (solvant blanc, n = 64; nombres en bleu dans le tableau supplémentaire S2) et servent de témoins positifs après l’ajout de l’agoniste (solvant blanc + agoniste, n = 64; nombres en magenta), respectivement. De plus, σ c- et σc+ représentent leurs écarts-types (ET) correspondants.
  6. Sélectionnez manuellement les molécules d’impact à partir des cartes thermiques sur la « plate-forme de données HTS en ligne » et calculez le pourcentage normalisé d’activation (NPA) et d’activité inhibitrice (Io) pour les hits agonistes et les hits antagonistes à l’aide de l’équation (2) et de l’équation (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

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Representative Results

Une plaque médicamenteuse interne (SAC2-34-6170) composée de 320 petites molécules aléatoires a été utilisée pour démontrer ce test HTS à titre d’exemple. Le HTS avait une excellente qualité de dosage avec un facteur Z' de 0,7 (tableau 1). Ce facteur Z' reflète la qualité du dosage indépendamment des composés testés34. Un facteur Z de 0,5 ou plus indique une bonne plage dynamique du signal de test entre les UFR des témoins positifs et des témoins négatifs. Les tests avec un facteur Z inférieur à 0,5 ont une plage dynamique de signal sous-optimale, ne sont généralement pas informatifs pour la sélection des résultats et sont donc écartés. La réponse (mesurée en unités de fluorescence relative, UFR) des témoins positifs (moyenne des 64 réponses des témoins positifs, μc+ = 130 139) était en moyenne 19 fois plus élevée que celle des témoins négatifs (moyenne des unités de contrôle négatives de 64 réponses des témoins négatifs, μc- = 6 675). La fluorescence de coupure pour la sélection des « coups agonistes » ici a été réglée sur un rapport maximal normalisé d’activation en pourcentage (NPA) de >50 %. La fluorescence de coupure pour la sélection des « coups antagonistes » a été fixée à une activité inhibitrice observée (Io) de >50 %. Trois molécules à succès agonistes et deux résultats antagonistes ont été sélectionnés : SACC-0090237 (NPA = 153 %), SACC-0036982 (NPA = 118 %) et SACC-0006532 (NPA = 152 %) comme agonistes, et SACC-0103392 (I o = 53 %) et SACC-0041280 (I o = 56 %) comme antagonistes (les données brutes sont présentées dans le tableau supplémentaire S2). Des exemples de calculs de NPA et I o pour les agonistes (rangées vertes) et les antagonistes (rangées orange), respectivement, sont présentés dans le tableau supplémentaire S2.

Addition de composés μs1 σs μc- σc- Valeur Z'
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Ajout de peptides agonistes μs σs μC+ σC+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tableau 1 : Résumé des réponses cellulaires normalisées de la plaque entière dans le test HTS. La moyenne (μ) et l’écart-type (σ) sont obtenus à partir de l’analyse de la chambre forte CDD. Abréviations : HTS = criblage à haut débit; UFR = unités de fluorescence relative; 1s (échantillons) = 320 composés testés; μs = valeur moyenne des réponses cellulaires (RFU) de 320 puits; μc- = valeur moyenne des UFR des témoins négatifs; μc+ = valeur moyenne des UFR provenant de témoins positifs; σs = écart-type des réponses cellulaires (RFU) de 320 puits; σc- = écart type des URF par rapport aux témoins négatifs; σc+ = écart type des UFR par rapport aux témoins positifs.

Tableau supplémentaire S1: Programmes personnalisés du système de manipulation des liquides pour les étapes de pipetage automatique. Ce tableau a été modifié à partir de Xiong et al.31. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Données brutes des résultats représentatifs. Les lignes surlignées en vert représentent les coups agonistes et les rangées surlignées en orange représentent les coups antagonistes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’objectif de HTS est d’identifier les molécules frappées en criblant un nombre massif de petites molécules. Par conséquent, les résultats de cet exemple ne représentent qu’une petite partie d’une expérience HTS conventionnelle. De plus, les molécules hit, identifiées, doivent être validées dans des essais en aval tels qu’un dosage dose-dépendant sur la même lignée cellulaire recombinante et sur une lignée cellulaire CHO-K1 ne portant que le vecteur vide, qui peut être réalisé simultanément pour sauver de petites molécules. Les tests de cytotoxicité aideront à démontrer qu’une absence de réponse dans la deuxième addition n’est pas due à la mortalité cellulaire. D’autres essais biologiques doivent être effectués pour valider l’activité dans les tissus isolés in vitro, ou en appliquant ou en alimentant les petites molécules sur des arthropodes vivants. Le pipeline complet d’identification du ligand à petites molécules du récepteur de la kinine à tiques peut être trouvé dans une publication précédente31. Grâce à ce pipeline, un total de 36 impacts antagonistes du récepteur de la kinine à tiques ont été identifiés. Trois de ces antagonistes ont été testés dans un test de contraction-inhibition tissulaire et ont montré une activité anti-myotrope sur l’intestin postérieur du moustique, où les récepteurs orthologues des moustiques kinines sont exprimés31.

Chaque lignée cellulaire exprimant des RCPG doit être validée pour des conditions expérimentales appropriées avant que HTS ne soit effectué. Ces conditions comprennent la densité cellulaire (10 000 cellules par puits), la concentration des composés criblés (2 μM), la concentration finale de DMSO (0,2%) dans le test, la concentration du ligand agoniste utilisé pour la deuxième addition (1 μM), la vitesse et la profondeur de pipetage et le temps de lecture après l’ajout du peptide agoniste (5 min). Il est essentiel d’ajuster la profondeur et la vitesse du système de manipulation des liquides pour s’assurer que les étapes de distribution ne perturbent pas les cellules si elles sont adhérentes. La validation de ces conditions avant de se lancer dans HTS aidera à résoudre les problèmes si la qualité du test est médiocre. Il est important d’avoir les cellules dans des conditions optimales: les cellules doivent atteindre 90%-100% de confluence mais ne pas être trop confluentes dans la plaque cellulaire lorsqu’elles sont utilisées pour HTS. Si les signaux de fond dans certains puits sont anormalement bas ou élevés, après avoir confirmé au microscope la densité cellulaire manifestement faible ou élevée, les valeurs aberrantes doivent être éliminées manuellement lors de l’analyse des données. Avant d’adapter le test de fluorescence calcique au HTS, la courbe cinétique du peptide positif doit être connue, car la réponse cinétique des cellules au peptide agoniste doit durer 1-2 minutes pour qu’il soit adapté en un test HTS et durer assez longtemps pour lire la plaque entière. Pour obtenir le signal prolongé, une concentration relativement élevée du peptide agoniste doit être appliquée, ou une densité cellulaire plus élevée doit être testée. Si la réponse cinétique de certaines cellules réceptrices est trop courte (dure moins de 1 min), il est recommandé de lire à une vitesse plus rapide dans la lecture du point final ou d’utiliser seulement une partie de la plaque pour HTS. Certes, la qualité de la lignée cellulaire recombinante par rapport au niveau d’expression du récepteur est cruciale pour le succès. Différentes lignées cellulaires clonales varieront probablement, car l’insertion du plasmide est aléatoire dans le génome, ce qui pourrait certainement influencer l’expression des récepteurs. Il serait idéal d’incorporer un test de fluorescence calcique précoce du pool transfecté et pendant le processus de sélection des lignées cellulaires clonales.

La limite du test de fluorescence calcique est qu’il mesure l’activité des messagers secondaires au lieu de la liaison directe du ligand au récepteur. Bien qu’il soit possible d’exclure les frappes agonistes hors cible en criblant les molécules de frappe sur les cellules qui n’expriment pas le récepteur cible, il est impossible d’exclure complètement les molécules de frappe antagonistes hors cible à l’aide de ce test, car il est possible que certaines molécules inhibent les voies de libération du calcium cellulaire en aval de la signalisation GPCR. Par conséquent, une validation plus poussée est nécessaire à l’aide d’un test de liaison au ligand ou d’un essai biologique pour la validation au niveau de l’organisme, comme dans un test de tissu de tique avec un agoniste connu, comme cela a été fait précédemment avec les moustiques31.

La plupart des tests fonctionnels qui détectent l’activation des RCPG mesurent principalement les événements intracellulaires dans deux voies de signalisation principales: les voies dépendantes de la protéine G et les voies indépendantes de la protéine G. Les tests dépendants de la protéine G mesurent les concentrations de Ca2+, de triphosphate d’inositol (IP3) ou d’AMPc, tandis que les tests indépendants de la protéine G détectent principalement le trafic des récepteurs ou le recrutement de β-arrestine7. Différents tests utilisent différentes technologies pour les lectures, telles que les colorants sensibles au Ca 2+ (essais de fluorescence), les photoprotéines telles que les aequorines (essais de bioluminescence Ca2+)14, les protéines de fluorescence marquées, les tests basés sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), les tests basés sur le transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) ou les tests cellulaires basés sur des biocapteurs optiques sans marque. Ces tests et les technologies de lecture disponibles correspondantes ont été examinés en détail par Zhang et Xie35. Certains tests sont applicables à tous les RCPG, et d’autres sont spécifiques à certains RCPG (par exemple, le test Ca2+ pour les récepteurs G couplés q, l’AMPc pour les récepteurs Gi/o- ou Gs-couplés). Cependant, en co-exprimant de manière promiscuité certaines protéines G avec le récepteur dans les cellules recombinantes, la voie de signalisation peut être modifiée. Par exemple, les protéines Gq15/16 peuvent être co-exprimées avec des récepteurs non couplés à Gq pour la détection de signalisation PLC-IP3-Ca 2+ 7,36. Contrairement aux tests qui mesurent un seul événement moléculaire, il existe des tests d’analyse à haut contenu, qui collectent une quantité massive de données biologiques pour améliorer la spécificité du ligand37. Ce type de test est également plus complexe et coûteux à réaliser7.

Dans la recherche sur les invertébrés, les tests fonctionnels les plus largement utilisés détectent l’activation des RCPG en analysant les fluctuations des concentrations de seconds messagers, tels que Ca2+ ou AMPc. En raison des différences dans les voies de signalisation entre les mammifères et les invertébrés, la plupart des autres technologies de lecture susmentionnées n’ont pas encore été largement adoptées pour les études sur les RCPG des invertébrés. Cependant, les protéines G sont relativement conservées dans le règne animal. Récemment, Lismont et al.38 ont démontré que certains biocapteurs humains à base de protéines G BRET peuvent également être adaptés pour détecter l’activation d’un RCPG d’insecte lorsqu’il est co-exprimé dans les cellules recombinantes du récepteur. En co-exprimant chacun des différents biocapteurs à base de protéines G (Gs, Gi/o, Gq/11 ou G12/13) avec des RCPG spécifiques, le mécanisme de couplage des protéines G peut être élucidé. Dans l’étude de Lismont et coll.38, le Schgr-CRF-DH pouvait activer de manière dose-dépendante les biocapteurs G i/o et G q/11 et n’activait pas les biocapteurs Gs et G12/13.

Dans l’ensemble, le test de fluorescence calcique réalisé dans une plaque de 384 puits en combinaison avec l’approche de « double addition » décrite ici permet le criblage de dizaines de milliers de molécules dans un temps relativement court. Il s’agit d’une approche relativement rapide et rentable pour découvrir des molécules de hit pour les validations et les applications en aval.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le prix USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (numéro de prix 2022-67015-36336, PVP [Project Director]) et par des fonds compétitifs du Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) à P.V.P. Le groupe de professeurs A.W.E.S.O.M.E. du College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, est reconnu pour son aide dans l’édition du manuscrit. Le tableau supplémentaire S2 contient des données provenant d’une bibliothèque interne aléatoire de petites molécules obtenues du laboratoire du Dr James Sacchettini à la Texas A&M University et de Texas A&M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

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References

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Biochimie numéro 190
Un test de fluorescence calcique « à double addition » pour le criblage à haut débit de récepteurs couplés à la protéine G recombinante
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Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (190), e64505, doi:10.3791/64505 (2022).

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