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Biochemistry

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Abstract

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan la superfamilia más grande de receptores y son el objetivo de numerosos medicamentos humanos. La industria farmacéutica utiliza el cribado de alto rendimiento (HTS) de bibliotecas aleatorias de moléculas pequeñas contra GPCR para el descubrimiento de fármacos específicos del objetivo. En este estudio, se empleó un HTS para identificar nuevos ligandos de moléculas pequeñas de GPCR de neuropéptidos específicos de invertebrados como sondas para estudios fisiológicos de vectores de patógenos humanos y veterinarios mortales.

El receptor de quinina específico de invertebrados se eligió como objetivo porque regula muchos procesos fisiológicos importantes en los invertebrados, incluida la diuresis, la alimentación y la digestión. Además, la farmacología de muchos GPCR de invertebrados está mal caracterizada o no está caracterizada en absoluto; por lo tanto, la farmacología diferencial de estos grupos de receptores con respecto a los GPCR relacionados en otros metazoos, especialmente humanos, agrega conocimiento a las relaciones estructura-actividad de GPCR como una superfamilia. Se desarrolló un ensayo HTS para células en placas de 384 pocillos para el descubrimiento de ligandos del receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, o garrapata del ganado del sur, Rhipicephalus microplus. El receptor de quinina de garrapata se expresó de manera estable en las células CHO-K1.

El receptor de quinina, cuando es activado por neuropéptidos de quinina endógenos u otros agonistas de moléculas pequeñas, desencadena la liberación de Ca2+ de las reservas de calcio en el citoplasma. Este ensayo de fluorescencia de calcio combinado con un enfoque de "doble adición" puede detectar moléculas "golpeadas" agonistas funcionales y antagonistas en la misma placa de ensayo. Cada ensayo se realizó utilizando placas de fármacos que transportaban una matriz de 320 moléculas pequeñas aleatorias. Se obtuvo un factor Z' fiable de 0,7, y se identificaron tres moléculas agonistas y dos antagonistas cuando el HTS estaba en una concentración final de 2 μM. El ensayo de fluorescencia de calcio reportado aquí se puede adaptar para detectar otros GPCR que activan la cascada de señalización Ca2+ .

Introduction

Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que están presentes desde la levadura hasta los humanos, representan la mayor superfamilia de receptores en muchos organismos1. Desempeñan un papel crítico en la regulación de casi todos los procesos biológicos en los animales. Hay 50-200 GPCR en el genoma de los artrópodos, lo que significa que representan la superfamilia de receptores de membrana más grande2. Se clasifican en seis clases principales, A-F, en función de su similitud de secuencia y funciones3. Los GPCR transducen diversas señales extracelulares, como las de hormonas, neuropéptidos, aminas biogénicas, glutamato, protones, lipoglicoproteínas y fotones4. Los GPCR se acoplan a las proteínas G heterotrímero (Gα, Gβ y Gγ) para transmitir señales aguas abajo. Los GPCR acoplados a las proteínas Gαs o Gαi/o aumentan o disminuyen, respectivamente, los niveles intracelulares de 3', 5' -monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) mediante la activación o inhibición de la adenilil ciclasa. Los GPCR acoplados a Gαq/11 inducen la liberación de calcio de las reservas de calcio del retículo endoplásmico mediante la activación de la vía de la fosfolipasa C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfato (IP3). Los GPCR acoplados a Gα12/13 activan los factores de intercambio de nucleótidos RhoGTPasa 5,6. Los GPCR son el objetivo de más del 50% de los medicamentos humanos y un acaricida, amitraz4. A medida que los GPCR transducen señales tan diversas, son objetivos prometedores para desarrollar nuevos pesticidas que interrumpen las funciones fisiológicas específicas de los invertebrados.

El objetivo de HTS es identificar moléculas de impacto que puedan modular las funciones del receptor. HTS implica el desarrollo de ensayos, miniaturización y automatización7. Los GPCR del neuropéptido artrópodo están involucrados en la mayoría de las funciones fisiológicas, como el desarrollo, la muda y la ecdisis, la excreción, la movilización de energía y la reproducción4. La mayoría de los GPCR neuropeptídicos de artrópodos y metazoos señalan a través de la cascada de señalización de calcio 2,6,8,9,10, como en el péptido mioinhibitorio y los receptores SIFamida de la garrapata de patas negras Ixodes scapularis; sus ligandos son antagónicos en los ensayos de motilidad del intestino posterior, con SIF provocando contracción y MIP inhibiéndola11,12. Un receptor similar al NPY del mosquito de la fiebre amarilla, Aedes aegypti, regula la búsqueda de huéspedes femeninos13. En comparación con otros ensayos alternativos de movilización de calcio, como el ensayo de bioluminiscencia cálcica aequorina14, el ensayo de fluorescencia de calcio es fácil de realizar, no requiere la transfección de otras proteínas detectoras de calcio recombinantes y es rentable. El ensayo de fluorescencia de calcio produce una señal prolongada en comparación con la señal cinética rápida obtenida en el ensayo de bioluminiscencia cálcica aequorina14,15.

En el ejemplo aquí, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresó recombinantemente en la línea celular CHO-K1 y se utilizó para el ensayo de fluorescencia de calcio. Solo hay un gen receptor de cinina que se encuentra en R. microplus; el receptor señala a través de una vía de señalización dependiente de la proteína Gq y desencadena el flujo de Ca2+ de las reservas de calcio al espacio intracelular16. Este proceso puede ser detectado y cuantificado por un fluoróforo, que provoca una señal de fluorescencia al unir iones de calcio (Figura 1).

El receptor de quinina es un GPCR específico de invertebrados, que pertenece a los receptores similares a la rodopsina de clase A. La quinina es un antiguo neuropéptido de señalización que está presente en moluscos, crustáceos, insectas y acari 4,17,18. Los coleópteros (escarabajos) carecen del sistema de señalización de cininas; en el mosquito Aedes aegypti, solo hay un receptor de quinina que se une a tres aedeskininas, mientras que Drosophila melanogaster tiene un receptor de cinina con drosokinina como ligando único 19,20,21. No hay cininas homólogas o receptores de cinina en vertebrados. Aunque la función exacta de la cinina es desconocida en las garrapatas, las hembras silenciadas por ARNi del receptor de cinina de R. microplus muestran una aptitud reproductiva significativamente reducida22. Las cininas son péptidos pleotrópicos en insectos. En Drosophila melanogaster, están involucrados en los sistemas reguladores nerviosos central y periférico 23, pre-ecdisis24, alimentación 25, metabolismo 26 y patrones de actividad del sueño26,27, así como locomoción larvaria 28. Las cininas regulan la contracción del intestino posterior, la diuresis y la alimentación en el mosquito A. aegypti 29,30,31. Los péptidos de cinina tienen un pentapéptido C-terminal conservado Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, que es la secuencia mínima requerida para la actividad biológica32. La especificidad de los artrópodos, el pequeño tamaño del ligando endógeno, que los hace susceptibles a la interferencia de moléculas pequeñas, y las funciones pleiotrópicas en los insectos hacen del receptor de cinina un objetivo prometedor para el control de plagas4.

El ensayo de "doble adición" (Figura 2) permite la identificación de agonistas o antagonistas en el mismo ensayo HTS15. Está adaptado de un ensayo de "doble adición" que se utiliza comúnmente en la industria farmacéutica para el descubrimiento de fármacos33. En resumen, la primera adición de fármacos en la placa celular permite la identificación de posibles agonistas en la biblioteca química cuando se detecta una señal de fluorescencia más alta en comparación con la aplicación del control de disolvente. Después de 5 minutos de incubación con estas moléculas pequeñas, se aplica un agonista conocido (péptido de cinina) a todos los pocillos. Aquellos pocillos que recibieron al azar un antagonista de la placa de fármaco muestran una señal de fluorescencia más baja tras la adición de agonistas en comparación con los pocillos de control que recibieron el solvente en la primera adición. Este ensayo permite la identificación de posibles agonistas y antagonistas con las mismas células. En un proyecto estándar de HTS, estas moléculas de éxito se validarían aún más a través de ensayos de dosis-respuesta y mediante ensayos de actividad biológica adicionales, que no se muestran aquí.

Figure 1
Figura 1: Ilustración del mecanismo de ensayo de fluorescencia de calcio. La proteína Gq desencadena la vía de señalización de calcio intracelular. El receptor de cinina (receptor acoplado a proteína G) se expresó recombinantemente en células CHO-K1. Cuando el ligando agonista se une al receptor, la proteína Gq asociada con el receptor de quinina activa PLC, que cataliza la conversión de una molécula PIP2 en IP3 y DAG. IP 3 luego se une al IP3R en la superficie del retículo endoplásmico, lo que lleva a la liberación de Ca 2+ en el citoplasma, donde los iones de Ca2+ se unen a los fluoróforos y provocan una señal de fluorescencia. La señal de fluorescencia puede obtenerse por excitación a 490 nm y detectarse a 514 nm. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado a proteína G; PLC = fosfolipasa C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato; IP3 = trifosfato de inositol; DAG = diacilglicerol; IP3 R = receptor IP3. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: El flujo de trabajo para el cribado de alto rendimiento de moléculas pequeñas en un receptor acoplado a proteína G expresado en células CHO-K1. (A) Las células CHO-K1 recombinantes que expresan de manera estable el receptor de cinina se agregaron a la placa de 384 pocillos (10,000 células / pocillo) utilizando un sistema de manejo de líquidos (25 μL / pocillo) y se incubaron en una incubadora humidificada de CO2 durante12-16 h. (B ) El tampón de ensayo que contenía el colorante fluorescente (25 μL/pocillo) se añadió a la placa celular utilizando un sistema de manipulación de líquidos. La placa se incubó durante 30 min a 37 °C durante 30 min y se equilibró a RT durante otros 30 min. (C) La señal de fluorescencia de fondo de las células en cada pocillo se midió con un lector de placas. (D) Se agregaron soluciones farmacológicas de una placa de biblioteca de 384 pocillos y disolvente en blanco (todo a 0,5 μL/pocillo) a la placa de ensayo celular utilizando un sistema de manejo de líquidos. (E) Las respuestas de fluorescencia de calcio celular se midieron con el lector de placas inmediatamente después de la adición de las soluciones farmacológicas; Los compuestos que provocan señales de fluorescencia superiores a la media se seleccionaron como agonistas acertados. Los golpes antagonistas que bloquean el GPCR (icono a continuación) se revelaron después de la adición del agonista peptídico durante el paso G. (F) En la misma placa de ensayo, después de 5 minutos de incubación de las células con compuestos de cribado, se añadió un péptido agonista endógeno Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) del receptor de quinina de garrapata a cada pocillo (1 μM). (G) Las respuestas de fluorescencia celular después de la adición del péptido agonista fueron medidas por el lector de placas inmediatamente. Los compuestos que inhiben la señal de fluorescencia se seleccionaron como antagonistas de los hits. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado a proteína G; RT = temperatura ambiente; RFU = unidades de fluorescencia relativa. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocol

1. Mantenimiento celular

NOTA: UNA LÍNEA CELULAR CHO-K1 que expresa de manera estable el receptor de cinina de R. microplus, llamada BMLK3, fue desarrollada por Holmes et al.16. Los detalles del desarrollo de la línea celular se presentan en otra parte14. Todos los pasos siguientes se realizan en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de clase II.

  1. Cultivar la línea celular recombinante en medios selectivos (medio F-12K que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS] y 800 μg/ml de sulfato G418) para asegurar la expresión del receptor diana. Almacene las células que expresan de manera estable el receptor en 1 ml de medio de congelación (90% FBS y 10% dimetilsulfóxido [DMSO]) en un criovial de 2 ml en un congelador de -80 ° C.
    NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo de las células congeladas, almacénelas en nitrógeno líquido.
  2. Precaliente todos los medios antes del cultivo celular. En una cabina de bioseguridad, transfiera 13 ml de medio selectivo precalentado (medio F-12K que contenga 10% de FBS y 800 μg/ml de sulfato de G418) a un matraz T-75 y guárdelo en el armario de bioseguridad. Descongele un vial de las3 células BMLK congeladas (~1,5 × 106 células) en un baño maría a 37 °C durante 2-3 min. Transfiera las células descongeladas al matraz T-75. Mantener las células en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2 a menos que se especifique lo contrario.
  3. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia (1-2 días), precaliente todos los medios a 37 °C excepto la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), que se mantiene a temperatura ambiente. En un armario de bioseguridad, retirar el medio gastado del matraz T-75, lavar las células durante 5 s con 10 ml de DPBS agitando suavemente el matraz y, a continuación, retirar el DPBS con una pipeta serológica.
    NOTA: Una imagen de células CHO-K1 con una confluencia del 90% se muestra en Lu et al.14.
  4. Separar las células del matraz T-75 añadiendo 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% e incubar durante 3-5 min a 37 °C en la incubadora. A continuación, añadir 8 mL de medio selectivo, y mezclar bien pipeteando y soltando suavemente 2x-3x con la misma pipeta serológica.
  5. Transfiera 2 ml de la suspensión celular (~1 × 106 células) del paso 1.4 a un nuevo matraz T-75 que contenga 10 ml de medio selectivo caliente. Cultive las células durante 1-2 días en la incubadora hasta que alcancen el 90% de confluencia.
  6. Utilice las células para el ensayo siguiendo los pasos siguientes, o repita los pasos 1.4-1.5 una o dos veces antes de usar las células en el ensayo.
    NOTA: No exceda de tres a cuatro pasajes, ya que la señal de ensayo con ciertas líneas celulares puede debilitarse con pasajes adicionales.

2. Ensayo de fluorescencia de calcio

  1. Cubra la placa celular.
    1. Utilice un sistema de manejo de líquidos colocado dentro de un gabinete de bioseguridad para todos los pasos de pipeteo en las placas de 384 pocillos. Crear programas personalizados para pipetear en las placas de 384 pocillos31 (Tabla suplementaria S1). Cubra las placas estériles de 384 pocillos con anticipación. En un gabinete de bioseguridad, cargar 10 μL/pocillo de una solución acuosa de poli-D-lisina (PDL) a 0,05 mg/ml en cada placa, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Vacíe el plato invirtiendo rápidamente el plato y secándolo suavemente en toallas de papel estériles. Luego, enjuague cada pozo con 10 μL de agua, vacíe el plato y deje que el plato se seque en el gabinete de bioseguridad durante la noche sin la tapa. Cerrar el plato con la tapa y conservar a 4 °C en la nevera.
      NOTA: Las placas recubiertas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 6 meses.
  2. Día 1
    1. Saque la placa del fármaco (100 μM en 90% DPBS + 10% DMSO, la concentración final en el pozo para HTS será de 2 μM) almacenada en el congelador de -20 °C y colóquela a temperatura ambiente.
      NOTA: Diseño de la placa de drogas: Cada placa de 384 pocillos (24 columnas x 16 filas) contiene 320 pocillos con diferentes compuestos de biblioteca y 64 pocillos con solvente en blanco (DPBS que contiene 10% de DMSO), que están dispuestos en cuatro columnas, con dos columnas en el borde de cada lado. Consulte la Tabla suplementaria S2 para el diseño de la placa.
    2. Cuando las células alcancen ~70%-90% de confluencia en el matraz T-75, separe las células del matraz T-75 como se describe a continuación. Precaliente todos los medios a 37 °C excepto el DPBS (temperatura ambiente).
      1. Retire el medio gastado, lave las celdas con 10 ml de DPBS y luego retire el DPBS. Separar las células del matraz T-75 con 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% durante 3-5 min a 37 °C en la incubadora, añadir 8 ml de medio selectivo y transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml para centrifugar a 1.000 × g durante 3 min.
      2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de medio F-12K que contenga 1% de FBS y 400 μg/ml de sulfato de G418. Mantenga la suspensión en el gabinete de bioseguridad mientras determina el recuento de células.
    3. Determine la densidad celular de la suspensión para una dilución adicional: Mezcle 20 μL de suspensión celular en 20 μL de azul de tripano al 0,4% y luego cargue 20 μL de la mezcla en una cámara de conteo celular para que la lea un contador de células para determinar la densidad celular.
    4. Diluir la suspensión celular en el mismo medio (medio F-12K que contiene 1% de FBS y 400 μg/ml de sulfato de G418) hasta un volumen final de al menos 15 ml a una densidad de 4 × 105 células/ml.
    5. Siembra las células en la placa de 384 pocillos recubierta con PDL. Transfiera 15 ml de la suspensión celular anterior (4 × 105 células/ml) a un depósito de reactivo autoadhesivo de 150 ml. Dispense 25 μL de la suspensión celular (~10,000 células/pocillo) en cada pocillo de los 384 pocillos de la placa utilizando un sistema de manejo de líquidos en dos pasos. Cargue 384/12,5 μL puntas de baja retención en el cabezal del manipulador de líquidos, aspire 12,5 μL del depósito (velocidad 5,2 μL/s) y dispense en cada pocillo (velocidad: 3,1 μL/s).
    6. Repita el pipeteo como en el paso anterior 2.2.5 para alcanzar los 25 μL por pocillo. A continuación, incubar la placa durante la noche (14-16 h) a 37 °C y 5% deCO2 en la incubadora humidificada.
      NOTA: Como el volumen máximo de pipeteo es de 12,5 μL para este cabezal específico, el pipeteo de 25 μL se realiza en dos pasos.
  3. Día 2
    1. A la mañana siguiente, revise la placa celular cubierta bajo un microscopio; Si no es confluente, espere hasta que las células alcancen el 90% de confluencia.
    2. Prepare una solución madre de colorante fluorescente: Resuspenda el colorante fluorescente liofilizado en 100 μL de DMSO y evite la luz directa sobre la solución madre. Envuelva el tubo con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
      NOTA: El material puede alicotizarse en alícuotas de 15 μL para cada ensayo en placa para evitar la congelación y descongelación repetidas; las alícuotas pueden almacenarse a −80 °C durante un máximo de 1 mes.
    3. En el gabinete de bioseguridad con las luces apagadas, prepare el tinte de carga (1x) en un tubo cónico de 15 ml envuelto con papel de aluminio, combinando 15 μL de la solución madre de colorante fluorescente (del paso 2.3.2) y el resto de los componentes del kit precalentado (37 °C): 13.5 mL de 1x HHBS (tampón de Hank con 20 mM HEPES) y 1.5 mL de reactivo B (inhibidor del eflujo del colorante).
      NOTA: La luz de la habitación está encendida durante este paso.
    4. Cierre el tubo y mezcle bien invirtiendo suavemente el tubo varias veces (típicamente 3-5x).
      NOTA: Mantener a temperatura ambiente y utilizar la mezcla de colorante de carga dentro de los 30 minutos.
    5. Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, retire el medio gastado de la placa de ensayo de 384 pocillos invirtiendo rápidamente la placa y secando suavemente las toallas de papel estériles; Repita este movimiento 2x-3x para eliminar todo el líquido de la placa. Deseche las toallas húmedas.
    6. Apague la mayoría de las luces directas artificiales en la habitación (dejando una lámpara de escritorio suave y tenue encendida o similar para permitir condiciones de trabajo visibles) y en el gabinete de bioseguridad durante todos los pasos hasta el final del ensayo (aproximadamente durante 1,5 h).
    7. Colocar 15 ml del colorante de carga (1x) del paso 2.3.3 en un depósito autoadhesivo de 150 ml.
      1. Transfiera 25 μL del colorante de carga (1x) del depósito a cada pocillo utilizando un sistema de manejo de líquidos con puntas de baja retención de 384/12.5 μL mediante la dispensación de 12.5 μL en cada pocillo de la placa (velocidad de aspiración y dispensación: 3.8 μL / s).
    8. Repita la etapa de pipeteo como en 2.3.7.1 para alcanzar un volumen final de 25 μL en cada pocillo de la placa. Cubra y envuelva la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz ambiental.
    9. Incubar la placa celular cubierta a 37 °C en la incubadora humidificada deCO2 durante 30 minutos, sacarla de la incubadora y equilibrarla a temperatura ambiente dentro del lector de placas o en el banco, manteniendo la placa cubierta y envuelta con papel de aluminio durante otros 30 minutos. Las células están listas para el cribado de alto rendimiento (HTS).
    10. Preparación química: Girar la placa del fármaco a partir del paso 2.2.1 a 1.200 × g en una centrífuga de placa durante 1 minuto a temperatura ambiente.
      1. Preparar una solución peptídica agonista 10x de Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) (10 μM) resuspendiendo 100 nmoles de péptido liofilizado en 10 ml de 1x HHBS que contiene 0,1% de DMSO, y transferir la solución a un depósito autoamigable de 150 ml.
    11. Mida la señal de fondo: para todo el ensayo HTS en el lector de placas, en Protocolos, elija el modo de fluorescencia de punto final.
      NOTA: La señal fluorescente se lee desde la parte inferior de la placa a longitudes de onda de excitación/emisión de 495 nm/525 nm.
      1. Inserte la placa celular en el lector de placas. En el panel de instrumentos, seleccione ajustar ganancia, seleccione un pozo aleatorio en la placa, asígnelo como 5% -10% del valor máximo de fluorescencia medible y seleccione ajustar (lectura) altura.
      2. Haga clic en iniciar medición para leer toda la placa de la señal de fluorescencia de fondo en unidades de fluorescencia relativa (RFU).
    12. Ensayo de "doble adición"
      1. Utilizando el sistema de manejo de líquidos con puntas de 384/12,5 μL, para mezclar la solución del fármaco en cada pocillo de la placa del fármaco, pipetear 3 veces hacia arriba y hacia abajo 10 μL de la solución del fármaco (en DPBS que contiene 10% de DMSO) (velocidad de pipeteo: 5,2 μL/s), y "aspirar" 1,5 μL desde cada pocillo de la placa del fármaco (velocidad de aspiración: 1,0 μL/s).
      2. "Dispense" 0,5 μL de los compuestos en la placa de ensayo celular (velocidad de pipeteo: 1 μL/s) para alcanzar una concentración final de 2 μM en DMSO al 0,2%.
      3. Coloque la placa de ensayo inmediatamente en el lector de placas después de agregar los compuestos de cribado. Lea la misma placa en las direcciones de lectura hacia adelante y hacia atrás. Para obtener estas lecturas, defina un programa para leer desde "pozo 1-384" e inmediatamente desde "384-1".
        NOTA: La lectura en ambas direcciones tarda 2 minutos en total. Este diseño de lectura es para compensar la disminución de la intensidad de la señal que se produce durante la lectura de la placa en cada dirección. Consulte el paso 3.1 para ver los análisis de lectura.
      4. Deseche el 1 μL restante de solución de fármaco en las puntas sumergiendo las puntas en un depósito de residuos de 150 ml que contenga ~50 ml de DPBS (velocidad de dispensación: 1,0 μL/s).
      5. Incubar los compuestos de cribado con las células durante un total de 5 min (incluye los 2 min de lectura de placas) a temperatura ambiente en el gabinete de bioseguridad con las luces apagadas. Añadir 3 μL del péptido agonista, Rhimi-K-1 (QFSPWGamida), desde el reservorio (velocidad de aspiración: 3,1 μL/s) en la placa de ensayo utilizando el sistema de manipulación de líquidos (velocidad de dispensación: 3,1 μL/s) con puntas de 384/12,5 μL.
      6. Coloque la placa en el lector de placas inmediatamente después de la adición del péptido agonista. Lea la placa tanto en la dirección hacia adelante como hacia atrás utilizando el mismo programa que en el paso 2.3.12.3

3. Análisis de datos

  1. Utilizando el software de análisis asociado con el lector de placas instalado en una computadora, calcule las respuestas de fluorescencia celular (en RFU) para ambas lecturas después de la primera adición de compuesto (Primera lectura; RFUago [Tabla suplementaria S2]) y después de los pasos de adición del agonista (Segunda lectura = RFU ant [Tabla suplementaria S2]). Cada lectura se obtiene promediando los dos valores obtenidos (no mostrados) por las lecturas de la placa delantera e inversa del paso 2.3.12.3 y del paso 2.3.12.6, respectivamente.
    NOTA: RFU ago, RFU ant se refiere a las unidades de fluorescencia relativa de los posibles agonistas (leer en el paso 2.3.12.3) y los posibles impactos antagonistas (leer en el paso 2.3.12.6), respectivamente.
  2. Exporte los tres conjuntos de datos, RFU bg, RFU ago y RFUant, desde el software de análisis en tres hojas de cálculo separadas. Cada hoja de cálculo tendrá solo dos columnas: posición de pozo y RFU sin procesar (archivos que no se muestran aquí).
    NOTA: RFU bg se refiere a la RFU del fondo leído en el paso 2.3.11.2.
  3. Dé formato a los datos de las tres hojas de cálculo y organice los datos anteriores en un archivo csv (consulte el ejemplo en la Tabla complementaria S2). Reste la señal de fondo leída de la RFU ago y la RFU ant, respectivamente (columnas G y H en la Tabla Suplementaria S2).
  4. Importe el archivo csv a una "plataforma de datos HTS en línea" disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) para el análisis de datos posteriores (Tabla 1) y el almacenamiento.
  5. Calcular manualmente el factor Z' para el control de calidad de cada ensayo de placa utilizando la ecuación (1):
    Ecuación (1):
    Equation 1(1)
    NOTA: μ c- y μc+ representan las RFU promedio de las lecturas de los mismos pocillos, que sirven como controles negativos en la primera adición después de agregar el solvente (solvente en blanco, n = 64; números en azul en la Tabla Suplementaria S2) y sirven como controles positivos después de la adición del agonista (solvente en blanco + agonista, n = 64; números en magenta), respectivamente. Además, σ c- y σc+ representan sus correspondientes desviaciones estándar (DE).
  6. Seleccione manualmente las moléculas de impacto de los mapas de calor en la "plataforma de datos HTS en línea" y calcule el porcentaje normalizado de activación (NPA) y la actividad inhibitoria (Io) para los agonistas y los aciertos antagonistas utilizando la ecuación (2) y la ecuación (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

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Representative Results

Se utilizó una placa de fármaco interna (SAC2-34-6170) compuesta por 320 moléculas pequeñas aleatorias para demostrar este ensayo HTS como ejemplo. El HTS tuvo una excelente calidad de ensayo con un factor Z' de 0,7 (Tabla 1). Este factor Z' refleja la calidad del ensayo independientemente de los compuestos probados34. Un factor Z′ de 0,5 o superior indica un buen rango dinámico de señal de ensayo entre las RFU de los controles positivos y negativos. Los ensayos con un factor Z' inferior a 0,5 tienen un rango dinámico de señal subóptimo, generalmente no son informativos para la selección de aciertos y, por lo tanto, se descartan. La respuesta (medida en unidades de fluorescencia relativa, RFU) de los controles positivos (RFU promedio de 64 respuestas de controles positivos, μ c+ = 130,139) fue en promedio 19 veces mayor que la de los controles negativos (RFU promedio de 64 respuestas de controles negativos, μc- = 6,675). La fluorescencia de corte para seleccionar "agonistas aciertos" aquí se estableció en una relación máxima de activación porcentual normalizada (NPA) de >50%. La fluorescencia de corte para seleccionar "aciertos antagonistas" se estableció en una actividad inhibitoria observada (Io) del >50%. Se seleccionaron tres moléculas de impacto agonista y dos impactos antagonistas: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%) y SACC-0006532 (NPA = 152%) como agonistas, y SACC-0103392 (I o = 53%) y SACC-0041280 (I o = 56%) como antagonistas (los datos brutos se muestran en la Tabla Suplementaria S2). En la Tabla Suplementaria S2 se muestran ejemplos de cálculos de NPA e Io para agonistas (filas verdes) y antagonistas (filas naranjas), respectivamente.

Adición de compuestos μs1 σs μc- σc- Valor Z'
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Adición de péptidos agonistas μs σs μc+ σc+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tabla 1: Resumen de las respuestas celulares normalizadas de toda la placa en el ensayo HTS. La media (μ) y la desviación estándar (σ) se obtienen del análisis de bóveda de CDD. Abreviaturas: HTS = cribado de alto rendimiento; RFU = unidades de fluorescencia relativa; 1s (muestras) = 320 compuestos probados; μs = valor promedio de las respuestas celulares (RFU) de 320 pocillos; μc- = valor medio de las unidades de seguridad voluntarias procedentes de controles negativos; μc+ = valor medio de las unidades de uso de combustible procedentes de controles positivos; σs = desviación estándar de las respuestas celulares (RFU) de 320 pocillos; σc- = desviación típica de las unidades de reconocimiento electrónico de los controles negativos; σc+ = desviación estándar de las RFU de los controles positivos.

Tabla suplementaria S1: Programas personalizados del sistema de manejo de líquidos para los pasos automáticos de pipeteo. Esta tabla fue modificada de Xiong et al.31. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S2: Los datos brutos de los resultados representativos. Las filas resaltadas en verde representan los agonistas y las filas resaltadas en naranja representan los aciertos antagonistas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El objetivo de HTS es identificar moléculas de impacto a través de la detección de un número masivo de moléculas pequeñas. Por lo tanto, los resultados de este ejemplo solo representan una pequeña parte de un experimento HTS convencional. Además, las moléculas de éxito identificadas deben validarse en ensayos posteriores, como un ensayo dependiente de la dosis en la misma línea celular recombinante y en una línea celular CHO-K1 que lleve solo el vector vacío, que se puede realizar simultáneamente para salvar moléculas pequeñas. Los ensayos de citotoxicidad ayudarán a demostrar que la falta de respuesta en la segunda adición no se debe a la mortalidad celular. Se deben realizar otros bioensayos para validar la actividad en los tejidos aislados in vitro, o aplicando o alimentando las moléculas pequeñas a artrópodos vivos. La tubería completa de identificación de ligandos de moléculas pequeñas del receptor de quinina de garrapata se puede encontrar en una publicación anterior31. A través de esta tubería, se identificaron un total de 36 impactos antagonistas del receptor de quinina de garrapata. Tres de estos antagonistas fueron probados en un ensayo de inhibición de contracción tisular y mostraron actividad antimiotrópica en el intestino posterior del mosquito, donde se expresan receptores ortólogos de quinina del mosquito31.

Cada línea celular que expresa GPCR debe validarse para condiciones experimentales adecuadas antes de realizar HTS. Estas condiciones incluyen la densidad celular (10.000 células por pocillo), la concentración de los compuestos cribados (2 μM), la concentración final de DMSO (0,2%) en el ensayo, la concentración del ligando agonista utilizado para la segunda adición (1 μM), la velocidad y profundidad de pipeteo y el tiempo de lectura después de la adición del péptido agonista (5 min). Es fundamental ajustar la profundidad y la velocidad del sistema de manejo de líquidos para garantizar que los pasos de dispensación no perturben las celdas si las células son adherentes. La validación de estas condiciones antes de embarcarse en HTS ayudará a solucionar problemas si la calidad del ensayo es deficiente. Es importante tener las células en condiciones óptimas: las células deben alcanzar el 90%-100% de confluencia pero no ser sobreconfluentes en la placa celular cuando se usan para HTS. Si las señales de fondo en ciertos pozos son anormalmente bajas o altas, después de confirmar bajo el microscopio que la densidad celular es obviamente baja o alta, los valores atípicos deben eliminarse manualmente al analizar los datos. Antes de adaptar el ensayo de fluorescencia de calcio a HTS, se debe conocer la curva cinética del péptido positivo, ya que la respuesta cinética de las células al péptido agonista debe durar de 1 a 2 minutos para que se adapte a un ensayo HTS y dure lo suficiente como para leer toda la placa. Para lograr la señal prolongada, se debe aplicar una concentración relativamente alta del péptido agonista, o se debe probar una densidad celular más alta. Si la respuesta cinética de ciertas células receptoras es demasiado corta (dura menos de 1 minuto), se recomienda leer a una velocidad más rápida en la lectura del punto final o usar solo una porción de la placa para HTS. Ciertamente, la calidad de la línea celular recombinante con respecto al nivel de expresión del receptor es crucial para el éxito. Es probable que las diferentes líneas celulares clonales varíen, ya que la inserción del plásmido es aleatoria en el genoma, y esto ciertamente podría influir en la expresión del receptor. Sería ideal incorporar una prueba temprana de fluorescencia de calcio de la piscina transfectada y durante el proceso de selección de líneas celulares clonales.

La limitación del ensayo de fluorescencia de calcio es que mide la actividad de los mensajeros secundarios en lugar de la unión directa del ligando al receptor. Aunque es posible excluir los golpes agonistas fuera del objetivo mediante el cribado de las moléculas de impacto en las células que no expresan el receptor objetivo, es imposible excluir completamente las moléculas de impacto antagonistas fuera del objetivo utilizando este ensayo porque es posible que algunas moléculas puedan inhibir las vías de liberación de calcio celular aguas abajo de la señalización GPCR. Por lo tanto, se necesita una validación adicional utilizando un ensayo de unión de ligando o un bioensayo para la validación a nivel del organismo, como en un ensayo de tejido de garrapatas con un agonista conocido, como se hizo anteriormente con mosquitos31.

La mayoría de los ensayos funcionales que detectan la activación de GPCR miden principalmente eventos intracelulares en dos vías principales de señalización: vías dependientes de la proteína G e independientes de la proteína G. Los ensayos dependientes de proteínas G miden las concentraciones de Ca2+, trifosfato de inositol (IP3) o cAMP, mientras que los ensayos independientes de proteínas G detectan principalmente el tráfico de receptores o el reclutamiento de β arrestina7. Diferentes ensayos utilizan diferentes tecnologías para lecturas, como colorantes sensibles al Ca 2+ (ensayos de fluorescencia), fotoproteínas como las aecuorinas (ensayos de bioluminiscencia de Ca2+)14, proteínas de fluorescencia marcadas, ensayos basados en transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), ensayos basados en transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) o ensayos celulares basados en biosensores ópticos sin etiquetas. Estos ensayos y las correspondientes tecnologías de lectura disponibles fueron revisados en detalle por Zhang y Xie35. Algunos ensayos son aplicables a cualquier GPCR, y algunos son específicos para ciertos GPCR (por ejemplo, el ensayo de Ca2+ para receptores acopladosa G q, cAMP para receptores acoplados a Gi / o Gs). Sin embargo, al coexpresar promiscuamente ciertas proteínas G con el receptor en las células recombinantes, la vía de señalización puede alterarse. Por ejemplo, las proteínas Gq15/16 pueden ser coexpresadas con receptores no acoplados a Gq para la detección de señalización PLC-IP3-Ca 2+ 7,36. En contraste con los ensayos que miden un solo evento molecular, existen ensayos de análisis de alto contenido, que recogen una gran cantidad de datos biológicos para mejorar la especificidad del ligando37. Este tipo de ensayo también es más complejo y costoso de realizar7.

En la investigación de invertebrados, los ensayos funcionales más utilizados detectan la activación de GPCR mediante el análisis de las fluctuaciones en las concentraciones de segundos mensajeros, como Ca2+ o cAMP. Debido a las diferencias en las vías de señalización entre mamíferos e invertebrados, la mayoría de las otras tecnologías de lectura mencionadas anteriormente aún no se han adoptado ampliamente para los estudios GPCR de invertebrados. Sin embargo, las proteínas G están relativamente conservadas en todo el reino animal. Recientemente, Lismont et al.38 demostraron que algunos biosensores humanos de proteína G basados en BRET también pueden adaptarse para detectar la activación de un insecto GPCR cuando se coexpresa en las células recombinantes del receptor. Al coexpresar cada uno de los diferentes biosensores basados en proteínas G (GS, G I / O,G q/11 o G12/13) con GPCR específicos, se puede dilucidar el mecanismo de acoplamiento de proteínas G. En el estudio de Lismont et al.38, el Schgr-CRF-DH podía activar de forma dosis-dependiente los biosensores G i/O y G q/11 y no activaba los biosensores Gs y G12/13.

En general, el ensayo de fluorescencia de calcio realizado en una placa de 384 pocillos en combinación con el enfoque de "doble adición" descrito aquí permite el cribado de decenas de miles de moléculas en un tiempo relativamente corto. Este es un enfoque relativamente eficiente en tiempo y costo para descubrir moléculas de éxito para validaciones y aplicaciones posteriores.

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Disclosures

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Premio de Salud y Bienestar Animal USDA-NIFA-AFRI (número de premio 2022-67015-36336, PVP [Director del proyecto]) y de fondos competitivos del Programa de Subvenciones para Enfermedades de Vectores de Insectos de Investigación de Texas A&M AgriLife (FY'22-23) a P.V.P. El grupo de profesores A.W.E.S.O.M.E. de la Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, TAMU, es reconocido por su ayuda en la edición del manuscrito. La Tabla Suplementaria S2 contiene datos de una biblioteca interna, aleatoria y de moléculas pequeñas obtenida del laboratorio del Dr. James Sacchettini en la Universidad de Texas A&M y Texas A&M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

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References

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Bioquímica Número 190
Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes
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