Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

I detta arbete beskrivs en intracellulär kalciumfluorescensanalys med hög genomströmning för 384-brunnsplattor för att screena små molekylbibliotek på rekombinanta G-proteinkopplade receptorer (GPCR). Målet, kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen, Rhipicephalus microplus, uttrycks i CHO-K1-celler. Denna analys identifierar agonister och antagonister som använder samma celler i en "dual-addition" -analys.

Abstract

G-proteinkopplade receptorer (GPCR) representerar den största superfamiljen av receptorer och är målen för många mänskliga läkemedel. High-throughput screening (HTS) av slumpmässiga småmolekylbibliotek mot GPCR används av läkemedelsindustrin för målspecifik läkemedelsupptäckt. I denna studie användes en HTS för att identifiera nya småmolekylära ligander av ryggradslösa djurspecifika neuropeptid-GPCR som sonder för fysiologiska studier av vektorer av dödliga mänskliga och veterinära patogener.

Den ryggradslösa djurspecifika kininreceptorn valdes som mål eftersom den reglerar många viktiga fysiologiska processer hos ryggradslösa djur, inklusive diurese, utfodring och matsmältning. Dessutom är farmakologin hos många ryggradslösa djur-GPCR dåligt karakteriserad eller inte karakteriserad alls; Därför tillför differentialfarmakologin hos dessa grupper av receptorer med avseende på de relaterade GPCR: erna i andra metazoer, särskilt människor, kunskap om struktur-aktivitetsförhållandena mellan GPCR som en superfamilj. En HTS-analys utvecklades för celler i 384-brunnsplattor för upptäckt av ligander av kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen eller södra boskapsfästingen, Rhipicephalus microplus. Fästingkininreceptorn uttrycktes stabilt i CHO-K1-celler.

Kininreceptorn, när den aktiveras av endogena kininneuropeptider eller andra småmolekylagonister, utlöser Ca2+ frisättning från kalciumförråd till cytoplasman. Denna kalciumfluorescensanalys i kombination med en "dual-addition" -metod kan detektera funktionell agonist och antagonist "hit" -molekyler i samma analysplatta. Varje analys utfördes med användning av läkemedelsplattor som bär en rad 320 slumpmässiga små molekyler. En tillförlitlig Z-faktor på 0,7 erhölls och tre agonister och två antagonistträffmolekyler identifierades när HTS var vid en slutlig koncentration på 2 μM. Kalciumfluorescensanalysen som rapporteras här kan anpassas för att screena andra GPCR som aktiverar Ca2+ signalkaskaden.

Introduction

G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som finns från jäst till människor, representerar den största superfamiljen av receptorer i många organismer1. De spelar kritiska roller för att reglera nästan alla biologiska processer hos djur. Det finns 50-200 GPCR i genomet hos leddjur, vilket innebär att de representerar den största membranreceptoröverfamiljen2. De klassificeras i sex huvudklasser, A-F, baserat på deras sekvenslikhet och funktioner3. GPCR transducerar olika extracellulära signaler, såsom hormoner, neuropeptider, biogena aminer, glutamat, proton, lipoglykoproteiner och fotoner4. GPCR kopplas till heterotrimer-G-proteiner (Gα, Gβ och Gγ) för att överföra nedströmssignaler. GPCR kopplade till Gαs eller Gαi / o-proteiner ökar respektive minskar de intracellulära 3', 5'-cykliska adenosinmonofosfatnivåerna (cAMP) genom att aktivera eller hämma adenylylcyklas. GPCR kopplade till Gαq / 11 inducerar kalciumfrisättning från endoplasmatiska retikulumkalciumförråden genom att aktivera fosfolipas C (PLC) -inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) vägen. GPCR kopplade till Gα12/13 aktiverar RhoGTPase nukleotidutbytesfaktorer 5,6. GPCR är målet för mer än 50% av humana droger och en akaricid, amitraz4. Eftersom GPCR omvandlar så olika signaler är de lovande mål för att utveckla nya bekämpningsmedel som stör ryggradslösa djurspecifika fysiologiska funktioner.

Målet med HTS är att identifiera träffmolekyler som kan modulera receptorfunktioner. HTS involverar analysutveckling, miniatyrisering och automatisering7. Leddjur neuropeptid GPCR är involverade i de flesta fysiologiska funktioner, såsom utveckling, smältning och ecdysis, utsöndring, energimobilisering och reproduktion4. De flesta neuropeptid-GPCR: erna hos leddjur och metazoer signalerar genom kalciumsignalkaskaden 2,6,8,9,10, såsom i myoinhibitoripeptid och SIFamidreceptorer i den svarta fästingen Ixodes scapularis; deras ligander är antagonistiska i bakgutmotilitetsanalyser, med SIF som framkallar sammandragning och MIP hämmar den11,12. En NPY-liknande receptor för gula febern myggan, Aedes aegypti, reglerar kvinnlig värd som söker13. Jämfört med andra alternativa kalciummobiliseringsanalyser, såsom aequorinkalciumbioluminescensanalys14, är kalciumfluorescensanalysen lätt att utföra, kräver inte transfektion av andra rekombinanta kalciumdetekterande proteiner och är kostnadseffektiv. Kalciumfluorescensanalysen ger en långvarig signal jämfört med den snabba kinetiska signalen som erhålls i aequorinkalciumbioluminescensanalysen14,15.

I exemplet här uttrycktes kininreceptorn från nötkreatursfeberfästingen, Rhipicephalus microplus, rekombinant i CHO-K1-cellinjen och användes för kalciumfluorescensanalysen. Det finns bara en kininreceptorgen som finns i R. microplus; receptorn signalerar genom en Gq-proteinberoende signalväg och utlöser efflux av Ca2+ från kalciumförråd till det intracellulära utrymmet16. Denna process kan detekteras och kvantifieras med en fluorofor, som framkallar en fluorescenssignal vid bindning av kalciumjoner (figur 1).

Kininreceptorn är en ryggradslös djurspecifik GPCR, som tillhör de klass A Rhodopsin-liknande receptorerna. Kinin är en gammal signalerande neuropeptid som finns i Mollusca, Crustacea, Insecta och Acari 4,17,18. Coleopterans (skalbaggar) saknar kininsignalsystemet; i myggan Aedes aegypti finns det bara en kininreceptor som binder tre aedeskininer, medan Drosophila melanogaster har en kininreceptor med drosokinin som en unik ligand 19,20,21. Det finns inga homologa kininer eller kininreceptorer hos ryggradsdjur. Även om kinins exakta funktion är okänd hos fästingar, visar kininreceptorn RNAi-tystade honor av R. microplus signifikant minskad reproduktiv kondition22. Kininer är pleotropa peptider i insekter. I Drosophila melanogaster är de involverade i både centrala och perifera nervsystemet 23, pre-ecdysis 24, matning25, metabolism 26 och sömnaktivitetsmönster26,27, samt larvrörelse 28. Kininer reglerar bakgutkontraktion, diurese och utfodring i myggan A. aegypti 29,30,31. Kininpeptiderna har en konserverad C-terminal pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, vilket är den minsta erforderliga sekvensen för biologisk aktivitet32. Leddjursspecificiteten, den lilla storleken på den endogena liganden, vilket gör dem mottagliga för småmolekylära störningar och de pleiotropa funktionerna hos insekter gör kininreceptorn till ett lovande mål för skadedjursbekämpning4.

Analysen "dual-addition" (figur 2) möjliggör identifiering av agonister eller antagonister i samma HTS-analys15. Den är anpassad från en "dual-addition" -analys som vanligtvis används inom läkemedelsindustrin för läkemedelsupptäckt33. I korthet möjliggör den första tillsatsen av läkemedel i cellplattan identifiering av potentiella agonister i det kemiska biblioteket när en högre fluorescenssignal detekteras jämfört med appliceringen av lösningsmedelskontrollen. Efter 5 minuters inkubation med dessa små molekyler appliceras en känd agonist (kininpeptid) på alla brunnar. De brunnar som slumpmässigt fick en antagonist från läkemedelsplattan visar en lägre fluorescenssignal vid agonisttillsats jämfört med kontrollbrunnarna som fick lösningsmedlet i den första tillsatsen. Denna analys möjliggör sedan identifiering av potentiella agonister och antagonister med samma celler. I ett standard HTS-projekt skulle dessa träffmolekyler valideras ytterligare genom dos-responsanalyser och genom ytterligare biologiska aktivitetsanalyser, som inte visas här.

Figure 1
Figur 1: Illustration av kalciumfluorescensanalysmekanismen. Gq-proteinet utlöser den intracellulära kalciumsignalvägen. Kininreceptorn (G-proteinkopplad receptor) uttrycktes rekombinant i CHO-K1-celler. När agonistliganden binder till receptorn aktiverar Gq-proteinet associerat med kininreceptorn PLC, vilket katalyserar omvandlingen av en PIP2-molekyl till IP3 och DAG. IP 3 binder sedan till IP3R på ytan av endoplasmatisk retikulum, vilket leder till frisättning av Ca 2+ i cytoplasman, där Ca2+ joner binder till fluoroforerna och framkallar en fluorescenssignal. Fluorescenssignalen kan erhållas genom excitation vid 490 nm och detekteras vid 514 nm. Förkortningar: GPCR = G proteinkopplad receptor; PLC = fosfolipas C; PIP2 = fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositoltrisfosfat; DAG = diacylglycerol; IP 3 R = IP3-receptor. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Arbetsflödet för screening med hög genomströmning av små molekyler på en G-proteinkopplad receptor uttryckt i CHO-K1-celler. (A) Rekombinanta CHO-K1-celler som stabilt uttrycker kininreceptorn tillsattes till 384-brunnsplattan (10 000 celler/brunn) med hjälp av ett vätskehanteringssystem (25 μl/brunn) och inkuberades i en fuktad CO2-inkubator i12-16 timmar. (B ) Analysbufferten som innehåller det fluorescerande färgämnet (25 μl/brunn) tillsattes i cellplattan med hjälp av ett vätskehanteringssystem. Plattan inkuberades i 30 min vid 37 °C i 30 min och jämnades vid RT i ytterligare 30 min. (D) Läkemedelslösningar från en biblioteksplatta med 384 brunnar och blankt lösningsmedel (alla vid 0,5 μl/brunn) tillsattes i den cellulära analysplattan med hjälp av ett vätskehanteringssystem. (E) Cellulära kalciumfluorescenssvar mättes med plattläsaren omedelbart efter tillsats av läkemedelslösningarna; föreningar som framkallade högre fluorescenssignaler än genomsnittet valdes ut som agonistträff(ar). Antagonistträffar som blockerar GPCR (ikonen nedan) avslöjades efter tillsatsen av peptidagonisten under steg G. (F) I samma analysplatta, efter 5 minuters inkubation av cellerna med screeningföreningar, tillsattes en endogen agonistpeptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) av fästingkininreceptorn till varje brunn (1 μM). (G) Cellulära fluorescenssvar efter tillsats av agonistpeptiden mättes omedelbart av plattläsaren. Förening (er) som hämmar fluorescenssignalen valdes som antagonistträff(ar). Förkortningar: GPCR = G proteinkopplad receptor; RT = rumstemperatur; RFU = relativa fluorescensenheter. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell underhåll

OBS: En CHO-K1-cellinje som stabilt uttrycker kininreceptorn från R. microplus, med namnet BMLK3, utvecklades av Holmes et al.16. Detaljerna om utvecklingen av cellinjen presenteras någon annanstans14. Alla följande steg utförs under sterila förhållanden i ett klass II biosäkerhetsskåp.

  1. Odla den rekombinanta cellinjen i selektiva medier (F-12K-medium innehållande 10% fetalt bovint serum [FBS] och 800 μg / ml G418-sulfat) för att säkerställa uttrycket av målreceptorn. Förvara cellerna stabilt som uttrycker receptorn i 1 ml frysmedium (90% FBS och 10% dimetylsulfoxid [DMSO]) i en 2 ml kryovial i en −80 ° C frys.
    OBS: För långvarig lagring av de frysta cellerna, förvara dem i flytande kväve.
  2. Förvärm alla medier före cellodling. I ett biosäkerhetsskåp, överför 13 ml förvärmt selektivt medium (F-12K-medium innehållande 10% FBS och 800 μg / ml G418-sulfat) till en T-75-kolv och förvara den i biosäkerhetsskåpet. Tina en injektionsflaska med de frysta BMLK 3-cellerna (~ 1,5 × 106 celler) i ett 37 ° C vattenbad i2-3 minuter. Överför de tinade cellerna till T-75-kolven. Håll cellerna i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 om inget annat anges.
  3. När cellerna når 90% sammanflöde (1-2 dagar), förvärm alla medier till 37 ° C utom Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS), som hålls vid rumstemperatur. Ta bort det förbrukade mediet från T-75-kolven i ett biosäkerhetsskåp, tvätta cellerna i 5 s med 10 ml DPBS genom att virvla kolven försiktigt och ta sedan bort DPBS med en serologisk pipett.
    OBS: En bild av CHO-K1-celler vid 90% sammanflöde visas i Lu et al.14.
  4. Lossa cellerna från T-75-kolven genom att tillsätta 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA och inkubera i 3–5 minuter vid 37 °C i inkubatorn. Tillsätt sedan 8 ml selektivt medium och blanda väl genom att pipettera och släppa försiktigt 2x-3x med samma serologiska pipett.
  5. Överför 2 ml av cellsuspensionen (~1 × 106 celler) från steg 1.4 till en ny T-75-kolv som innehåller 10 ml varmt selektivt medium. Växa cellerna i 1-2 dagar i inkubatorn tills de når 90% sammanflöde.
  6. Använd cellerna för analysen enligt nästa steg, eller upprepa steg 1.4-1.5 en eller två gånger innan du använder cellerna i analysen.
    OBS: Överskrid inte tre till fyra passager, eftersom analyssignalen med vissa cellinjer kan bli svagare med ytterligare passager.

2. Analys av kalciumfluorescens

  1. Täck cellplattan.
    1. Använd ett vätskehanteringssystem placerat i ett biosäkerhetsskåp för alla pipetteringssteg i 384-brunnsplattorna. Skapa anpassade program för pipettering i 384-brunnsplattorna31 (Kompletterande tabell S1). Täck de sterila 384-brunnsplattorna i förväg. Ladda 10 μl/brunn av en vattenlösning av poly-D-lysin (PDL) i varje platta i ett biosäkerhetsskåp och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    2. Töm plattan genom att snabbt vända på plattan och försiktigt blotta den på sterila pappershanddukar. Skölj sedan varje brunn med 10 μl vatten, töm plattan och låt plattan torka i biosäkerhetsskåpet över natten utan lock. Stäng plattan med locket och förvara vid 4 °C i kylskåp.
      OBS: De belagda plattorna kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
  2. Dag 1
    1. Ta ut läkemedelsplattan (100 μM i 90% DPBS + 10% DMSO, slutkoncentrationen i brunnen för HTS kommer att vara 2 μM) lagrad i −20 ° C frysen och placera den vid rumstemperatur.
      OBS: Layout av läkemedelsplattan: Varje 384-brunnsplatta (24 kolumner x 16 rader) innehåller 320 brunnar med olika biblioteksföreningar och 64 brunnar med tomt lösningsmedel (DPBS innehållande 10% DMSO), som är ordnade i fyra kolumner, med två kolumner på kanten av varje sida. Se Kompletterande tabell S2 för plattans layout.
    2. När cellerna når ~ 70% -90% sammanflöde i T-75-kolven, lossa cellerna från T-75-kolven enligt beskrivningen nedan. Förvärm alla medier till 37 °C utom DPBS (rumstemperatur).
      1. Ta bort det förbrukade mediet, tvätta cellerna med 10 ml DPBS och ta sedan bort DPBS. Lossa cellerna från T-75-kolven med 2 ml 0,25 % trypsin-EDTA i 3–5 minuter vid 37 °C i inkubatorn, tillsätt 8 ml selektivt medium och överför cellsuspensionen till ett 15 ml koniskt rör för centrifugering vid 1 000 × g i 3 minuter.
      2. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml F-12K-medium innehållande 1% FBS och 400 μg / ml G418-sulfat. Håll suspensionen i biosäkerhetsskåpet medan du bestämmer cellantalet.
    3. Bestäm suspensionens celldensitet för ytterligare utspädning: Blanda 20 μl cellsuspension i 20 μl 0,4 % trypanblått och ladda sedan 20 μl av blandningen i en cellräkningskammare som ska läsas av en cellräknare för celltäthet.
    4. Späd cellsuspensionen i samma medium (F-12K-medium innehållande 1% FBS och 400 μg/ml G418-sulfat) till en slutlig volym på minst 15 ml vid en densitet av 4 × 105 celler/ml.
    5. Frö cellerna i den PDL-belagda 384-brunnsplattan. Överför 15 ml av ovanstående cellsuspension (4 × 105 celler/ml) till en 150 ml autovänlig reagensbehållare. Fördela 25 μL av cellsuspensionen (~10 000 celler/brunn) i varje brunn i plattans 384 brunnar med hjälp av ett vätskehanteringssystem i två steg. Ladda 384/12,5 μL spetsar med låg retention på vätskehanterarhuvudet, aspirera 12,5 μL från behållaren (hastighet 5,2 μL/s) och fördela i varje brunn (hastighet: 3,1 μL/s).
    6. Upprepa pipetteringen som i föregående steg 2.2.5 för att nå 25 μl per brunn. Inkubera sedan plattan över natten (14-16 h) vid 37 ° C och 5%CO2 i den fuktade inkubatorn.
      OBS: Eftersom den maximala pipetteringsvolymen är 12,5 μL för detta specifika huvud, utförs pipettering för 25 μL i två steg.
  3. Dag 2
    1. Nästa morgon, kontrollera den täckta cellplattan under ett mikroskop; Om inte sammanflytande, vänta tills cellerna når 90% sammanflöde.
    2. Bered en stamlösning av fluorescerande färgämne: Återsuspendera frystorkat fluorescerande färgämne i 100 μl DMSO och undvik direkt ljus på stamlösningen. Vik in röret med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning.
      OBS: Buljongen kan alikvoteras i 15 μL alikvoter för varje plattanalys för att undvika upprepad frysning och upptining. Alikvoterna kan förvaras vid −80 °C i upp till 1 månad.
    3. I biosäkerhetsskåpet med släckta lampor, förbered lastfärg (1x) i ett 15 ml koniskt rör lindat med aluminiumfolie, som kombinerar 15 μL av den fluorescerande färgämnesstamlösningen (från steg 2.3.2) och resten av de förvärmda kitkomponenterna (37 ° C): 13,5 ml 1x HHBS (Hanks buffert med 20 mM HEPES) och 1,5 ml reagens B (färgämneseffluxhämmare).
      OBS: Rumslampan lyser under detta steg.
    4. Stäng röret och blanda väl genom att försiktigt invertera röret flera (vanligtvis 3-5x) gånger.
      OBS: Förvaras i rumstemperatur och använd laddningsfärgblandningen inom 30 minuter.
    5. När cellerna når 90% sammanflöde, ta bort det förbrukade mediet från 384-brunnsanalysplattan genom att snabbt invertera plattan och försiktigt blotta på sterila pappershanddukar; Upprepa denna rörelse 2x-3x för att ta bort all vätska från plattan. Kassera de våta handdukarna.
    6. Stäng av de flesta konstgjorda direktljus i rummet (lämna en mjuk, svag skrivbordslampa på eller liknande för att möjliggöra synliga arbetsförhållanden) och i biosäkerhetsskåpet för alla steg fram till slutet av analysen (ungefär i 1,5 timmar).
    7. Placera 15 ml av lastfärgen (1x) från steg 2.3.3 i en 150 ml autovänlig behållare.
      1. Överför 25 μL av lastfärgen (1x) från behållaren till varje brunn med hjälp av ett vätskehanteringssystem med 384/12,5 μL spetsar med låg retention genom att dosera 12,5 μL i varje brunn på plattan (aspiration och doseringshastighet: 3,8 μL/s).
    8. Upprepa pipettsteget enligt 2.3.7.1 för att nå en slutlig volym på 25 μl i varje brunn på plattan. Täck och linda in plattan med aluminiumfolie för att skydda den från omgivande ljus.
    9. Inkubera den täckta cellplattan vid 37 °C iden fuktiga kovässade inkubatorn i 30 minuter, ta bort den från inkubatorn och balansera den vid rumstemperatur inuti plattläsaren eller på bänken, håll plattan täckt och lindad med folie i ytterligare 30 minuter. Cellerna är sedan redo för high-throughput screening (HTS).
    10. Kemisk beredning: Snurra läkemedelsplattan från steg 2.2.1 vid 1 200 × g i en plattcentrifug i 1 min vid rumstemperatur.
      1. Bered en 10x agonistpeptidlösning av Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) (10 μM) genom att återsuspendera 100 nmol frystorkad peptid i 10 ml 1x HHBS innehållande 0,1% DMSO och överför lösningen till en 150 ml autovänlig behållare.
    11. Mät bakgrundssignalen: För hela HTS-analysen i plattläsaren, under Protokoll, välj slutpunktsfluorescensläge.
      OBS: Den fluorescerande signalen läses från botten av plattan vid excitations-/emissionsvåglängder på 495 nm/525 nm.
      1. Sätt i cellplattan i plattläsaren. På instrumentpanelen väljer du justera förstärkning, välj en slumpmässig brunn på plattan, tilldela den som 5% -10% av det maximala mätbara fluorescensvärdet och välj justera (läs) höjd.
      2. Klicka på startmätningen för att läsa av hela plattan för bakgrundsfluorescenssignalen i relativa fluorescensenheter (RFU).
    12. "Dual-addition" -analys
      1. Använd vätskehanteringssystemet med 384/12,5 μL spetsar, för att blanda läkemedelslösningen i varje brunn på läkemedelsplattan, pipettera 3x upp och ner 10 μL av läkemedelslösningen (i DPBS innehållande 10% DMSO) (pipetteringshastighet: 5,2 μL / s) och "aspirera" 1,5 μL från varje brunn i läkemedelsplattan (aspirationshastighet: 1,0 μL / s).
      2. "Dispensera" 0,5 μL av föreningarna i cellanalysplattan (pipetteringshastighet: 1 μL/s) för att nå en slutlig koncentration på 2 μM i 0,2 % DMSO.
      3. Placera analysplattan omedelbart i plattläsaren efter tillsats av screeningföreningarna. Läs samma platta i både framåt- och bakåtläsningsanvisningarna. För att få dessa avläsningar, definiera ett program att läsa från "brunn 1-384" och omedelbart från "384-1".
        OBS: Avläsningen i båda riktningarna tar totalt 2 minuter. Denna avläsningsdesign är att kompensera för minskningen av signalstyrkan som uppstår under plattläsning i varje riktning. Se steg 3.1 för avläsningsanalyserna.
      4. Kassera de återstående 1 μl läkemedelslösningen i spetsarna genom att nedsänka spetsarna i en 150 ml avfallsbehållare innehållande ~ 50 ml DPBS (doseringshastighet: 1,0 μL / s).
      5. Inkubera screeningföreningarna med cellerna i totalt 5 minuter (inkluderar 2 minuters plattavläsning) vid rumstemperatur i biosäkerhetsskåpet med lamporna släckta. Tillsätt 3 μL av agonistpeptiden, Rhimi-K-1 (QFSPWGamid), från behållaren (aspirationshastighet: 3,1 μL/s) i analysplattan med hjälp av vätskehanteringssystemet (doseringshastighet: 3,1 μL/s) med 384/12,5 μL spetsar.
      6. Placera plattan i plattläsaren omedelbart efter tillsatsen av agonistpeptiden. Läs plattan i både framåt- och bakåtriktning med samma program som i steg 2.3.12.3

3. Analys av data

  1. Med hjälp av analysprogramvaran som är associerad med plattläsaren installerad på en dator, beräkna cellulära fluorescenssvar (i RFU) för båda avläsningarna efter den första sammansatta tillsatsen (Första läsningen; RFUsedan [Kompletterande tabell S2]) och efter agonisttilläggsstegen (Andra läsningen = RFU-myra [Kompletterande tabell S2]). Varje avläsning erhålls genom medelvärde av de två värden som erhållits (visas inte) av avläsningarna framåt och bakåt från steg 2.3.12.3 respektive steg 2.3.12.6.
    OBS: RFU sedan, RFUant hänvisar till de relativa fluorescensenheterna för de potentiella agonistträffarna (läs i steg 2.3.12.3) respektive de potentiella antagonistträffarna (läs i steg 2.3.12.6).
  2. Exportera alla tre uppsättningar data, RFU bg, RFU ago och RFU ant, från analysprogramvaran till tre separata kalkylblad. Varje kalkylblad har bara två kolumner: brunnsposition och rå RFU (filer som inte visas här).
    OBS: RFU bg hänvisar till RFU för bakgrunden som läses i steg 2.3.11.2.
  3. Formatera data från de tre kalkylbladen och ordna ovanstående data i en csv-fil (se exemplet i kompletterande tabell S2). Subtrahera bakgrundssignalen som lästs från RFU ago respektive RFUant (G- och H-kolumnerna i kompletterande tabell S2).
  4. Importera csv-filen till en kommersiellt tillgänglig "HTS-dataplattform online" (se materialförteckningen) för nedströms dataanalys (tabell 1) och lagring.
  5. Beräkna Z-faktorn manuellt för kvalitetskontrollen av varje plattanalys med hjälp av ekvation (1):
    Ekvation (1):
    Equation 1(1)
    OBS: μ c- och μc+ representerar de genomsnittliga RFU: erna för avläsningar av samma brunnar, som fungerar som negativa kontroller vid den första tillsatsen efter tillsats av lösningsmedlet (tomt lösningsmedel, n = 64; siffror i blått i kompletterande tabell S2) och fungerar som positiva kontroller efter tillsats av agonisten (blankt lösningsmedel + agonist, n = 64; siffror i magenta), respektive. Dessutom representerar σ c- och σc+ motsvarande standardavvikelser (SD).
  6. Välj träffmolekylerna manuellt från värmekartorna på "online HTS-dataplattformen" och beräkna normaliserad procentaktivering (NPA) och hämmande aktivitet (Io) för agonistträffar och antagonistträffar med ekvation (2) och ekvation (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En intern läkemedelsplatta (SAC2-34-6170) bestående av 320 slumpmässiga små molekyler användes för att demonstrera denna HTS-analys som ett exempel. HTS hade utmärkt analyskvalitet med en Z-faktor på 0,7 (tabell 1). Denna Z-faktor återspeglar analyskvaliteten oberoende av de testade föreningarna34. En Z′-faktor på 0,5 eller högre indikerar ett bra dynamiskt analyssignalområde mellan de positiva kontrollernas RFU:er och de negativa kontrollerna. Analyser med en Z-faktor mindre än 0,5 har ett suboptimalt signaldynamiskt omfång, är vanligtvis inte informativa för träffval och kasseras därför. Responsen (mätt i relativa fluorescensenheter, RFU) från positiva kontroller (genomsnittlig RFU på 64 positiva kontrollsvar, μc+ = 130 139) var i genomsnitt 19 gånger högre än för de negativa kontrollerna (genomsnittlig RFU på 64 negativa kontrollsvar,μ c- = 6 675). Cutoff-fluorescensen för att välja "agonistträffar" här var inställd på ett normaliserat procentaktiveringsförhållande (NPA) på >50%. Cutoff-fluorescensen för att välja "antagonistträffar" var inställd på en observerad hämmande aktivitet (Io) på >50%. Tre agonistträffmolekyler och två antagonistträffar valdes: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%) och SACC-0006532 (NPA = 152%) som agonister och SACC-0103392 (I o = 53%) och SACC-0041280 (I o = 56%) som antagonister (rådata visas i kompletterande tabell S2). Exempel på beräkningar av NPA och Io för agonister (gröna rader) respektive antagonister (orange rader) visas i kompletterande tabell S2.

Sammansatt tillsats μs1 σs μc- σc- Z' värde
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Tillsats av agonistpeptid μs σs μC+ σC+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tabell 1: Sammanfattning av de normaliserade cellsvar från hela plattan i HTS-analysen. Medelvärdet (μ) och standardavvikelsen (σ) erhålls från CDD-valvanalysen. Förkortningar: HTS = screening med hög genomströmning; RFU = relativa fluorescensenheter; 1s (prover) = 320 testade föreningar; μs = medelvärdet av cellulära svar (RFU) från 320 brunnar; μc- = medelvärdet av anbudsenheter från negativa kontroller, μc+ = medelvärdet av RFU från positiva kontroller; σs = standardavvikelse för cellulära svar (RFU) från 320 brunnar; σc- = standardavvikelse för RFU från negativa kontroller; σc+ = standardavvikelse för RFU:er från positiva kontroller.

Kompletterande tabell S1: Anpassade program för vätskehanteringssystemet för de automatiska pipetteringsstegen. Denna tabell ändrades från Xiong et al.31. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell S2: Rådata för de representativa resultaten. Raderna markerade med grönt representerar agonistträffarna och raderna markerade med orange representerar antagonistträffarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Målet med HTS är att identifiera träffmolekyler genom screening av ett stort antal små molekyler. Därför representerar resultaten från det här exemplet bara en liten del av ett konventionellt HTS-experiment. Dessutom måste de identifierade träffmolekylerna valideras i nedströmsanalyser, såsom en dosberoende analys på samma rekombinanta cellinje och på en CHO-K1-cellinje som endast bär den tomma vektorn, som kan utföras samtidigt för att spara små molekyler. Cytotoxicitetsanalyser hjälper till att visa att brist på svar i det andra tillägget inte beror på celldödlighet. Andra bioassays bör utföras för att validera aktiviteten i de isolerade vävnaderna in vitro, eller genom att applicera eller mata de små molekylerna till levande leddjur. Den fullständiga pipelinen för småmolekylär ligandidentifiering av fästingkininreceptorn finns i en tidigare publikation31. Genom denna rörledning identifierades totalt 36 antagonistträffar av fästingkininreceptorn. Tre av dessa antagonister testades vidare i en vävnadskontraktionshämningsanalys och visade anti-myotrop aktivitet på myggbakguten, där ortologa myggkininreceptorer uttrycks31.

Varje GPCR-uttryckande cellinje bör valideras för lämpliga experimentella förhållanden innan HTS utförs. Dessa förhållanden inkluderar celldensiteten (10 000 celler per brunn), koncentrationen av de screenade föreningarna (2 μM), den slutliga DMSO-koncentrationen (0,2%) i analysen, koncentrationen av agonistliganden som används för den andra tillsatsen (1 μM), pipetthastigheten och djupet och lästiden efter tillsatsen av agonistpeptiden (5 min). Det är viktigt att justera djupet och hastigheten på vätskehanteringssystemet för att säkerställa att doseringsstegen inte stör cellerna om cellerna är vidhäftande. Valideringen av dessa villkor innan du påbörjar HTS hjälper till med felsökning om analyskvaliteten är dålig. Det är viktigt att ha cellerna under optimala förhållanden: cellerna ska nå 90%-100% sammanflöde men inte vara överkonfluenta i cellplattan när de används för HTS. Om bakgrundssignalerna i vissa brunnar är onormalt låga eller höga, efter att ha bekräftat under mikroskopet för uppenbarligen låg eller hög celltäthet, bör avvikarna tas bort manuellt vid analys av data. Innan kalciumfluorescensanalysen anpassas till HTS måste den positiva peptidens kinetiska kurva vara känd, eftersom cellernas kinetiska svar på agonistpeptiden bör pågå i 1-2 minuter för att den ska kunna anpassas till en HTS-analys och hålla tillräckligt länge för att läsa hela plattan. För att uppnå den långvariga signalen bör en relativt hög koncentration av agonistpeptiden appliceras, eller en högre celldensitet bör testas. Om det kinetiska svaret hos vissa receptorceller är för kort (varar mindre än 1 min), rekommenderas att läsa med en snabbare hastighet i slutpunktsavläsningen eller endast använda en del av plattan för HTS. Visst är kvaliteten på den rekombinanta cellinjen med avseende på nivån av receptoruttryck avgörande för framgång. Olika klonala cellinjer kommer sannolikt att variera, eftersom införandet av plasmiden är slumpmässigt i genomet, och detta kan säkert påverka receptoruttrycket. Det skulle vara idealiskt att införliva ett tidigt kalciumfluorescenstest av den transfekterade poolen och under processen att välja klonala cellinjer.

Begränsningen av kalciumfluorescensanalysen är att den mäter aktiviteten hos de sekundära budbärarna istället för den direkta bindningen av liganden till receptorn. Även om det är möjligt att utesluta off-target-agonistträffarna genom att screena träffmolekylerna på cellerna som inte uttrycker målreceptorn, är det omöjligt att helt utesluta träffmolekylerna utanför målet med hjälp av denna analys eftersom det är möjligt att vissa molekyler kan hämma de cellulära kalciumfrisättningsvägarna nedströms GPCR-signaleringen. Därför behövs ytterligare validering med hjälp av antingen en ligandbindningsanalys eller en bioassay för validering på organismnivå, till exempel i en fästingvävnadsanalys med en känd agonist, som tidigare gjorts med myggor31.

De flesta funktionella analyser som detekterar GPCR-aktivering mäter främst intracellulära händelser i två stora signalvägar: G-proteinberoende och G-proteinoberoende vägar. G-proteinberoende analyser mäter Ca2+, inositoltrifosfat (IP3) eller cAMP-koncentrationer, medan G-proteinoberoende analyser detekterar främst receptorhandel eller β-arrestinrekrytering7. Olika analyser använder olika tekniker för avläsningar, såsom Ca 2+-känsliga färgämnen (fluorescensanalyser), fotoproteiner såsom aequoriner (Ca2+ bioluminescensanalyser)14, märkta fluorescensproteiner, fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-baserade analyser, bioluminescensresonansenergiöverföring (BRET)-baserade analyser eller etikettfria optiska biosensorbaserade cellulära analyser. Dessa analyser och motsvarande tillgängliga avläsningstekniker granskades i detalj av Zhang och Xie35. Vissa analyser är tillämpliga på alla GPCR, och vissa är specifika för vissa GPCR (t.ex. Ca2+ -analysen för Gq-kopplade receptorer, cAMP för Gi / o- eller Gs-kopplade receptorer). Men genom att promiskuöst samuttrycka vissa G-proteiner med receptorn i de rekombinanta cellerna kan signalvägen ändras. Till exempel kan Gq15/16-proteiner samuttryckas med icke-Gq-kopplade receptorer för PLC-IP 3-Ca 2+ signaldetektering 7,36. Till skillnad från analyserna som mäter en enda molekylär händelse finns det analysanalyser med högt innehåll som samlar in en enorm mängd biologiska data för att förbättra ligandspecificiteten37. Denna typ av analys är också mer komplex och dyr att utföra7.

I ryggradslös forskning upptäcker de mest använda funktionella analyserna GPCR-aktivering genom att analysera fluktuationerna i koncentrationerna av andra budbärare, såsom Ca2+ eller cAMP. På grund av skillnaderna i signalvägarna mellan däggdjur och ryggradslösa djur har de flesta av de andra ovannämnda avläsningsteknikerna ännu inte antagits i stor utsträckning för GPCR-studier av ryggradslösa djur. G-proteiner är dock relativt bevarade över hela djurriket. Nyligen visade Lismont et al.38 att vissa humana BRET-baserade G-proteinbiosensorer också kan anpassas för att detektera aktiveringen av en insekt GPCR när den uttrycks tillsammans i receptorrekombinanta celler. Genom att samuttrycka var och en av de olika G-proteinbaserade biosensorerna (Gs, Gi / o, G q / 11 eller G12/13) med specifika GPCR: er kan G-proteinkopplingsmekanismen belysas. I studien av Lismont et al.38 kunde Schgr-CRF-DH dosberoende aktivera Gi/o och G q/11 biosensorer och aktiverade inte Gs och G12/13 biosensorer.

Sammantaget möjliggör kalciumfluorescensanalysen som utförs i en 384-brunnsplatta i kombination med "dual-addition" -metoden som beskrivs här screening av tiotusentals molekyler på relativt kort tid. Detta är ett relativt tids- och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att upptäcka träffmolekyler för nedströms valideringar och applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (prisnummer 2022-67015-36336, PVP [projektledare]) och från konkurrenskraftiga medel från Texas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program (FY'22-23) till P.V.P. A.W.E.S.O.M.E.-fakultetsgruppen vid College of Agriculture and Life Sciences, TAMU, är erkänd för hjälp med att redigera manuskriptet. Kompletterande tabell S2 innehåller data från ett internt, slumpmässigt, småmolekylärt bibliotek som erhållits från Dr. James Sacchettinis laboratorium vid Texas A&M University och Texas A&M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).

Tags

Biokemi utgåva 190
En "dual-addition" kalciumfluorescensanalys för screening med hög genomströmning av rekombinanta G-proteinkopplade receptorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio,… More

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (190), e64505, doi:10.3791/64505 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter