Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Abstract

G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder ve çok sayıda insan ilacının hedefidir. GPCR'lere karşı rastgele küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması (HTS), ilaç endüstrisi tarafından hedefe özgü ilaç keşfi için kullanılır. Bu çalışmada, omurgasız-spesifik nöropeptit GPCR'lerin yeni küçük moleküllü ligandlarını, ölümcül insan ve veteriner patojenlerinin vektörlerinin fizyolojik çalışmaları için problar olarak tanımlamak için bir HTS kullanılmıştır.

Omurgasızlara özgü kinin reseptörü hedef olarak seçildi çünkü omurgasızlarda diürez, beslenme ve sindirim dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik süreci düzenliyor. Ayrıca, birçok omurgasız GPCR'nin farmakolojisi zayıf bir şekilde karakterize edilir veya hiç karakterize edilmez; bu nedenle, bu reseptör gruplarının diğer metazoanlardaki, özellikle de insanlardaki ilgili GPCR'lere göre diferansiyel farmakolojisi, GPCR'lerin bir süper aile olarak yapı-aktivite ilişkilerine bilgi katmaktadır. Sığır ateşi kenesinden kinin reseptörünün ligandlarının veya güney sığır kenesi Rhipicephalus microplus'tan keşfedilmesi için 384 kuyucuklu plakalardaki hücreler için bir HTS testi geliştirilmiştir. Kene kinin reseptörü CHO-K1 hücrelerinde kararlı bir şekilde eksprese edildi.

Kinin reseptörü, endojen kinin nöropeptitleri veya diğer küçük molekül agonistleri tarafından aktive edildiğinde, kalsiyum depolarından sitoplazmaya Ca2 + salınımını tetikler. Bu kalsiyum floresan testi, "çift eklemeli" bir yaklaşımla birleştirildiğinde, aynı tahlil plakasındaki fonksiyonel agonist ve antagonist "hit" moleküllerini tespit edebilir. Her tahlil, 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir dizi taşıyan ilaç plakaları kullanılarak gerçekleştirildi. 0.7'lik güvenilir bir Z 'faktörü elde edildi ve HTS 2 μM nihai konsantrasyondayken üç agonist ve iki antagonist isabet molekülü tanımlandı. Burada bildirilen kalsiyum floresan testi, Ca2+ sinyal kaskadını aktive eden diğer GPCR'leri taramak için uyarlanabilir.

Introduction

Mayadan insanlara kadar mevcut olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), birçok organizmada reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder1. Hayvanlarda neredeyse tüm biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynarlar. Eklembacaklıların genomunda 50-200 GPCR vardır, yani en büyük membran reseptörü süper ailesi2'yi temsil ederler. Dizi benzerliklerine ve işlevlerine göre A-F olmak üzere altı ana sınıfa ayrılırlar3. GPCR'ler hormonlar, nöropeptitler, biyojenik aminler, glutamat, proton, lipoglikoproteinler ve fotonlar gibi çeşitli hücre dışı sinyalleri dönüştürür4. GPCR'ler, aşağı akış sinyallerini iletmek için heterotrimer G proteinlerine (Gα, Gβ ve Gγ) bağlanır. Gαs veya Gαi / o proteinlerine bağlı GPCR'ler, sırasıyla adenilil siklazı aktive ederek veya inhibe ederek hücre içi 3', 5'-siklik adenozin monofosfat (cAMP) seviyelerini arttırır veya azaltır. Gαq/11'e bağlı GPCR'ler, fosfolipaz C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfat (IP3) yolunu aktive ederek endoplazmik retikulum kalsiyum depolarından kalsiyum salınımını indükler. Gα12/13'e bağlı GPCR'ler RhoGTPaz nükleotid değişim faktörleri 5,6'yı aktive eder. GPCR'ler, insan ilaçlarının% 50'sinden fazlasının ve bir akarisitin hedefidir, amitraz4. GPCR'ler bu kadar çeşitli sinyalleri dönüştürürken, omurgasızlara özgü fizyolojik fonksiyonları bozan yeni pestisitler geliştirmek için umut verici hedeflerdir.

HTS'nin amacı, reseptör fonksiyonlarını modüle edebilen isabetli molekülleri tanımlamaktır. HTS, tahlil geliştirme, minyatürleştirme ve otomasyon7'yi içerir. Eklembacaklı nöropeptit GPCR'leri, gelişim, erime ve ekdisis, atılım, enerji mobilizasyonu ve üreme gibi çoğu fizyolojik fonksiyonda rol oynar4. Eklembacaklıların ve metazoanların nöropeptit GPCR'lerinin çoğu, siyah bacaklı kene Ixodes scapularis'in miyoinhibitör peptid ve SIFamid reseptörlerinde olduğu gibi, kalsiyum sinyal kaskadın 2,6,8,9,10 yoluyla sinyal verir; ligandları hindgut motilite testlerinde antagonistiktir, SIF kasılmaya neden olur ve MIP bunu inhibe eder11,12. Sarı humma sivrisineğinin NPY benzeri bir reseptörü olan Aedes aegypti,13 arayan kadın konağı düzenler. Aequorin kalsiyum biyolüminesans testi14 gibi diğer alternatif kalsiyum mobilizasyon testleriyle karşılaştırıldığında, kalsiyum floresan testinin gerçekleştirilmesi kolaydır, diğer rekombinant kalsiyum tespit proteinlerinin transfeksiyonunu gerektirmez ve uygun maliyetlidir. Kalsiyum floresan testi, aequorin kalsiyum biyolüminesans testi14,15'te elde edilen hızlı kinetik sinyale kıyasla uzun süreli bir sinyal üretir.

Buradaki örnekte, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücre hattında rekombinant olarak eksprese edildi ve kalsiyum floresan testi için kullanıldı. R. microplus'ta bulunan sadece bir kinin reseptör geni vardır; reseptör, Gq proteinine bağımlı bir sinyal yolundan sinyal verir ve kalsiyum depolarından hücre içi boşluğa16 Ca2 + 'nın efflüksünü tetikler. Bu işlem, kalsiyum iyonlarını bağlarken bir floresan sinyali ortaya çıkaran bir florofor ile tespit edilebilir ve ölçülebilir (Şekil 1).

Kinin reseptörü, A Sınıfı Rodopsin benzeri reseptörlere ait omurgasızlara özgü bir GPCR'dir. Kinin, Mollusca, Crustacea, Insecta ve Acari 4,17,18'de bulunan eski bir sinyal nöropeptitidir. Koleopteranlar (böcekler) kinin sinyal sisteminden yoksundur; Sivrisinek Aedes aegypti'de, üç aedeskinin'i bağlayan sadece bir kinin reseptörü bulunurken, Drosophila melanogaster'in benzersiz bir ligand19,20,21 olarak drosokinin ile bir kinin reseptörü vardır. Omurgalılarda homolog kininler veya kinin reseptörleri yoktur. Kininin kesin işlevi kenelerde bilinmemekle birlikte, R. microplus'ın kinin reseptörü RNAi-susturulmuş dişileri, üreme uygunluğunu önemli ölçüde azalttığını göstermektedir22. Kininler böceklerde pleotropik peptitlerdir. Drosophila melanogaster'da, hem merkezi hem de periferik sinir düzenleyici sistemler 23, ekdisis öncesi 24, beslenme 25, metabolizma 26 ve uyku aktivite paternleri26,27 ve larva lokomotifi 28'de rol oynarlar. Kininler, sivrisinek A. aegypti29,30,31'de hindgut kontraksiyonunu, diürezi ve beslenmeyi düzenler. Kinin peptitleri, biyolojik aktivite için gerekli minimum sekans olan korunmuş bir C-terminal pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2'ye sahiptir32. Eklembacaklı özgüllüğü, endojen ligandın küçük boyutu, onları küçük moleküllü girişime uygun hale getirir ve böceklerdeki pleiotropik fonksiyonlar, kinin reseptörünü haşere kontrolü için umut verici bir hedef haline getirir4.

"Çift eklemeli" tahlil (Şekil 2), aynı HTS tahlili15'teki agonistlerin veya antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. İlaç endüstrisinde ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan "çift eklemeli" bir tahlilden uyarlanmıştır33. Kısacası, ilaçların hücre plakasına ilk eklenmesi, çözücü kontrolünün uygulanmasına kıyasla daha yüksek bir floresan sinyali tespit edildiğinde kimyasal kütüphanedeki potansiyel agonistlerin tanımlanmasına izin verir. Bu küçük moleküllerle 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tüm kuyucuklara bilinen bir agonist (kinin peptidi) uygulanır. İlaç plakasından rastgele bir antagonist alan kuyucuklar, ilk eklemede çözücüyü alan kontrol kuyularına kıyasla agonist ilavesi üzerine daha düşük bir floresan sinyali gösterir. Bu tahlil daha sonra aynı hücrelere sahip potansiyel agonistlerin ve antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. Standart bir HTS projesinde, bu isabet molekülleri, doz-yanıt testleri ve burada gösterilmeyen ek biyolojik aktivite testleri ile daha da doğrulanacaktır.

Figure 1
Şekil 1: Kalsiyum floresan tahlil mekanizmasının gösterimi. Gq proteini hücre içi kalsiyum sinyal yolunu tetikler. Kinin reseptörü (G proteinine bağlı reseptör) CHO-K1 hücrelerinde rekombinant olarak eksprese edildi. Agonist ligand reseptöre bağlandığında, kinin reseptörü ile ilişkili Gq proteini, bir PIP2 molekülünün IP3 ve DAG'ye dönüşümünü katalize eden PLC'yi aktive eder. IP 3 daha sonra endoplazmik retikulumun yüzeyindeki IP3R'ye bağlanır ve Ca 2 + iyonlarının floroforlara bağlandığı ve bir floresan sinyali ortaya çıkardığı sitoplazmaya Ca2 + 'nın salınmasına yol açar. Floresan sinyali, 490 nm'de uyarma ile elde edilebilir ve 514 nm'de tespit edilebilir. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; PLC = fosfolipaz C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat; IP3 = inositol trisfosfat; DAG = diasilgliserol; IP3 R = IP3 reseptörü. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilen G proteinine bağlı bir reseptör üzerindeki küçük moleküllerin yüksek verimli taranması için iş akışı. (A) Kinin reseptörünü kararlı bir şekilde eksprese eden rekombinant CHO-K1 hücreleri, bir sıvı taşıma sistemi (25 μL / kuyu) kullanılarak 384 delikli plakaya (10.000 hücre / kuyu) eklendi ve nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 12-16 saat boyunca inkübe edildi (B ) Floresan boyayı (25 μL/kuyu) içeren tahlil tamponu, sıvı taşıma sistemi kullanılarak hücre plakasına eklenmiştir. Plaka, 30 dakika boyunca 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi ve RT'de 30 dakika daha dengelendi. (C) Her bir kuyucuktaki hücrelerin arka plan floresan sinyali bir plaka okuyucu ile ölçüldü. (D) 384 delikli bir kütüphane plakasından ve boş çözücüden (hepsi 0,5 μL / kuyuda) ilaç çözeltileri, bir sıvı işleme sistemi kullanılarak hücresel tahlil plakasına eklendi. (E) Hücresel kalsiyum floresan yanıtları, ilaç çözeltilerinin eklenmesinden hemen sonra plaka okuyucu ile ölçülmüştür; ortalamadan daha yüksek floresan sinyalleri ortaya çıkaran bileşik (ler) agonist hit (ler) olarak seçildi. GPCR'yi bloke eden antagonist vuruşları (aşağıdaki simge), G adımı sırasında peptid agonistinin eklenmesinden sonra ortaya çıkmıştır. (F) Aynı tahlil plakasında, hücrelerin tarama bileşikleri ile 5 dakikalık inkübasyonundan sonra, kene kinin reseptörünün endojen agonist peptidi Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) her bir oyuğa (1 μM) eklenmiştir. (G) Agonist peptid ilavesinden sonra hücresel floresan yanıtları hemen plaka okuyucu tarafından ölçüldü. Floresan sinyalini inhibe eden bileşik (ler) antagonist hit (ler) olarak seçildi. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; RT = oda sıcaklığı; RFU = bağıl floresan birimleri. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre bakımı

NOT:BMML 3 olarak adlandırılan R. microplus'tan kinin reseptörünü istikrarlı bir şekilde eksprese eden bir cho-K1 hücre hattı, Holmes ve ark.16 tarafından geliştirilmiştir. Hücre hattının gelişiminin ayrıntıları başka bir yerde sunulmuştur14. Aşağıdaki adımların tümü steril koşullar altında sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

  1. Hedef reseptörün ekspresyonunu sağlamak için rekombinant hücre hattını seçici ortamda (% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve 800 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı) büyütün. Reseptörü sabit bir şekilde eksprese eden hücreleri 1 mL donma ortamında (% 90 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit [DMSO]) -80 ° C'lik bir dondurucuda 2 mL'lik bir kriyovyalde saklayın.
    NOT: Dondurulmuş hücrelerin uzun süreli depolanması için, bunları sıvı azotta saklayın.
  2. Hücre kültüründen önce tüm ortamları önceden ısıtın. Bir biyogüvenlik kabininde, 13 mL önceden ısıtılmış seçici ortamı (% 10 FBS ve% 10 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı) bir T-75 şişesine aktarın ve biyogüvenlik kabininde saklayın. Dondurulmuş BMLK 3 hücrelerinin bir şişesini (~ 1.5 × 106 hücre) 37 ° C'lik bir su banyosunda2-3 dakika boyunca çözün. Çözülmüş hücreleri T-75 şişesine aktarın. Aksi belirtilmedikçe, hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun.
  3. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında (1-2 gün), oda sıcaklığında tutulan Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) hariç tüm ortamları 37 ° C'ye ısıtın. Bir biyogüvenlik kabininde, harcanan ortamı T-75 şişesinden çıkarın, şişeyi yavaşça döndürerek hücreleri 10 mL DPBS ile 5 s yıkayın ve ardından DPBS'yi serolojik bir pipetle çıkarın.
    NOT: CHO-K1 hücrelerinin %90 oranında bir görüntüsü Lu ve ark.14'te gösterilmiştir.
  4. 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri T-75 şişesinden ayırın ve inkübatörde 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin. Daha sonra, 8 mL seçici ortam ekleyin ve pipetle pipetleyerek ve aynı serolojik pipetle hafifçe 2x-3x bırakarak iyice karıştırın.
  5. Hücre süspansiyonunun 2 mL'sini (~ 1 × 106 hücre) adım 1.4'ten 10 mL sıcak seçici ortam içeren yeni bir T-75 şişesine aktarın. Hücreleri% 90 akıcıya ulaşana kadar inkübatörde 1-2 gün boyunca büyütün.
  6. Sonraki adımları izleyerek tahlil için hücreleri kullanın veya tahlildeki hücreleri kullanmadan önce 1.4-1.5 arasındaki adımları bir veya iki kez yineleyin.
    NOT: Üç ila dört pasajı geçmeyin, çünkü belirli hücre hatlarına sahip tahlil sinyali daha fazla pasajla zayıflayabilir.

2. Kalsiyum floresan testi

  1. Hücre plakasını kaplayın.
    1. 384 delikli plakalardaki tüm pipetleme adımları için bir biyogüvenlik kabininin içine yerleştirilmiş bir sıvı taşıma sistemi kullanın. 384 delikli plakalara pipetleme için özel programlar oluşturun31 (Ek Tablo S1). Steril 384 kuyucuklu plakaları önceden kaplayın. Bir biyogüvenlik kabininde, her plakaya 0.05 mg / mL'de sulu bir Poli-D-lizin (PDL) çözeltisinin 10 μL / kuyucuğunu yükleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Tabağı hızlı bir şekilde ters çevirerek ve steril kağıt havluların üzerine hafifçe lekeleyerek plakayı boşaltın. Daha sonra, her bir kuyucuğu 10 μL suyla durulayın, plakayı boşaltın ve plakayı kapaksız olarak gece boyunca biyogüvenlik dolabında kurumaya bırakın. Plakayı kapakla kapatın ve buzdolabında 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Kaplanmış plakalar 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
  2. 1. Gün
    1. -20 °C dondurucuda saklanan ilaç plakasını (% 90 DPBS +% 10 DMSO'da 100 μM, HTS için kuyudaki son konsantrasyon 2 μM olacaktır) çıkarın ve oda sıcaklığına yerleştirin.
      NOT: İlaç plakasının düzeni: Her 384 delikli plaka (24 sütun x 16 sıra), farklı kütüphane bileşiklerine sahip 320 kuyu ve her iki tarafın kenarında iki sütun bulunan dört sütun halinde düzenlenmiş boş çözücülü (% 10 DMSO içeren DPBS) 64 kuyu içerir. Plaka düzeni için Ek Tablo S2'ye bakın.
    2. Hücreler T-75 şişesinde ~% 70 -% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri aşağıda açıklandığı gibi T-75 şişesinden ayırın. DPBS (oda sıcaklığı) hariç tüm ortamları 37 °C'ye önceden ısıtın.
      1. Harcanan ortamı çıkarın, hücreleri 10 mL DPBS ile yıkayın ve ardından DPBS'yi çıkarın. İnkübatörde 37 ° C'de 3-5 dakika boyunca 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri T-75 şişesinden ayırın, 8 mL seçici ortam ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj yapın.
      2. Süpernatanı atın ve hücre peletini% 1 FBS ve 400 μg / mL G418 sülfat içeren 10 mL F-12K ortamında yeniden askıya alın. Hücre sayısını belirlerken süspansiyonu biyogüvenlik kabininde tutun.
    3. Daha fazla seyreltme için süspansiyonun hücre yoğunluğunu belirleyin: 20 μL hücre süspansiyonunu% 0.4 tripan mavisinin 20 μL'sine karıştırın ve ardından karışımın 20 μL'sini hücre yoğunluğu için bir hücre sayacı tarafından okunacak bir hücre sayma odasına yükleyin.
    4. Hücre süspansiyonunu aynı ortamda (% 1 FBS ve 400 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı), 4 × 10 5 hücre / mL yoğunlukta en az15 mL'lik bir son hacme kadar seyreltin.
    5. PDL kaplı 384 delikli plakadaki hücreleri tohumlayın. Yukarıdaki hücre süspansiyonunun 15 mL'sini (4 × 105 hücre/mL) 150 mL'lik otomatik uyumlu bir reaktif haznesine aktarın. İki adımda bir sıvı taşıma sistemi kullanarak plakanın 384 kuyusunun her bir kuyucuğuna 25 μL hücre süspansiyonunu (~ 10.000 hücre / kuyu) dağıtın. 384/12,5 μL düşük tutma uçlarını sıvı işleyici kafasına yükleyin, rezervuardan 12,5 μL aspire edin (hız 5,2 μL/s) ve her bir kuyucuğa dağıtın (hız: 3,1 μL/s).
    6. Kuyucuk başına 25 μL'ye ulaşmak için pipetlemeyi önceki adım 2.2.5'te olduğu gibi tekrarlayın. Daha sonra, plakayı gece boyunca (14-16 saat) 37 ° C'de ve% 5 CO2'yi nemlendirilmiş inkübatörde inkübe edin.
      NOT: Bu özel kafa için maksimum pipetleme hacmi 12,5 μL olduğundan, 25 μL için pipetleme iki adımda gerçekleştirilir.
  3. 2. Gün
    1. Ertesi sabah, kapalı hücre plakasını mikroskop altında kontrol edin; Birleşimli değilse, hücreler% 90 akıcılığa ulaşana kadar bekleyin.
    2. Bir floresan boya stok çözeltisi hazırlayın: Liyofilize floresan boyayı 100 μL DMSO'da yeniden askıya alın ve stok çözeltisi üzerinde doğrudan ışıktan kaçının. Fotobeyazlatmayı önlemek için tüpü alüminyum folyo ile sarın.
      NOT: Stok, tekrarlanan donma ve çözülmeyi önlemek için her plaka testi için 15 μL alikotlara ayrılabilir; alikotlar -80 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir.
    3. Işıkları kapalı biyogüvenlik kabininde, floresan boya stok çözeltisinin 15 μL'sini (adım 2.3.2'den itibaren) ve önceden ısıtılmış kit bileşenlerinin geri kalanını (37 ° C) birleştirerek, alüminyum folyo ile sarılmış 15 mL'lik bir konik tüp içinde yükleme boyası (1x) hazırlayın: 13,5 mL 1x HHBS (Hank'in 20 mM HEPES'li tamponu) ve 1,5 mL reaktif B (boya efflux inhibitörü).
      NOT: Bu adımda oda ışığı yanar.
    4. Tüpü kapatın ve tüpü birkaç kez (tipik olarak 3-5x) hafifçe ters çevirerek iyice karıştırın.
      NOT: Oda sıcaklığında tutun ve yükleme boya karışımını 30 dakika içinde kullanın.
    5. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında, plakayı hızlı bir şekilde ters çevirerek ve steril kağıt havluları nazikçe lekeleyerek harcanan ortamı 384 kuyusu test plakasından çıkarın; Tüm sıvıyı plakadan çıkarmak için bu hareketi 2x-3x tekrarlayın. Islak havluları atın.
    6. Odadaki çoğu yapay doğrudan ışığı kapatın (görünür çalışma koşullarına izin vermek için yumuşak, loş bir masa lambasını açık veya benzeri bir şekilde bırakın) ve biyogüvenlik kabininde, tahlilin sonuna kadar (yaklaşık 1,5 saat boyunca) tüm adımlar için.
    7. 2.3.3 adımından itibaren 15 mL'lik yükleme boyasını (1x) 150 mL'lik otomatik uyumlu bir hazneye yerleştirin.
      1. Yükleme boyasının 25 μL'sini (1x) rezervuardan her bir kuyucuğa, plakanın her bir kuyucuğuna 12,5 μL dağıtarak 384/12,5 μL düşük tutma uçlu bir sıvı taşıma sistemi kullanarak her bir kuyucuğa aktarın (aspirasyon ve dağıtım hızı: 3,8 μL/s).
    8. Plakanın her bir kuyucuğunda 25 μL'lik son hacme ulaşmak için pipetleme adımını 2.3.7.1'deki gibi tekrarlayın. Ortam ışığından korumak için plakayı alüminyum folyo ile örtün ve sarın.
    9. Kapalı hücre plakasını CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, inkübatörden çıkarın ve plaka okuyucusunun içinde veya tezgahta oda sıcaklığında dengeleyin, plakayı 30 dakika daha folyo ile örtülü ve sarılmış halde tutun. Hücreler daha sonra yüksek verimli tarama (HTS) için hazırdır.
    10. Kimyasal preparat: İlaç plakasını 2.2.1 adımından 1.200 × g'da bir plaka santrifüjünde oda sıcaklığında 1 dakika boyunca döndürün.
      1. % 0.1 DMSO içeren 10 mL'lik 1x HHBS'de 100 nmol liyofilize peptidi yeniden askıya alarak Rhimi-K-1 (QFSPWGamid) (10 μM) 10x agonist peptid çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 150 mL otomatik dostu bir rezervuara aktarın.
    11. Arka plan sinyalini ölçün: Plaka okuyucudaki HTS testinin tamamı için, Protokoller altında, uç nokta floresan modunu seçin.
      NOT: Floresan sinyali, plakanın altından 495 nm/525 nm uyarım/emisyon dalga boylarında okunur.
      1. Hücre plakasını plaka okuyucuya yerleştirin. Gösterge panelinde, kazancı ayarla'yı seçin, plaka üzerinde rastgele bir kuyu seçin, ölçülebilir maksimum floresan değerinin% 5 -% 10'u olarak atayın ve yüksekliği ayarla (okuma) seçeneğini belirleyin.
      2. Göreceli floresan birimlerindeki (RFU) arka plan floresan sinyalinin tüm plakasını okumak için ölçümü başlat'ı tıklatın.
    12. "Çift eklemeli" tahlil
      1. İlaç çözeltisini ilaç plakasının her bir kuyucuğunda karıştırmak için 384/12,5 μL uçlu sıvı taşıma sistemini kullanarak, ilaç çözeltisinin 3 kat yukarı ve aşağı 10 μL'sini (% 10 DMSO içeren DPBS'de) (pipetleme hızı: 5,2 μL / s) ve ilaç plakasının her bir kuyucuğundan 1,5 μL'yi "aspire edin" (aspirasyon hızı: 1,0 μL / s).
      2. % 0.2 DMSO'da 2 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için bileşiklerin 0.5 μL'sini hücre tahlil plakasına (pipetleme hızı: 1 μL / s) "dağıtın".
      3. Eleme bileşiklerini ekledikten sonra tahlil plakasını hemen plaka okuyucuya yerleştirin. Aynı plakayı hem ileri hem de geri okuma yönlerinde okuyun. Bu okumaları elde etmek için, "kuyu 1-384" ten ve hemen "384-1" den okumak için bir program tanımlayın.
        NOT: Her iki yönde de okuma toplam 2 dakika sürer. Bu okuma tasarımı, her yönde plaka okuma sırasında meydana gelen sinyal gücündeki azalmayı telafi etmek içindir. Okuma analizleri için adım 3.1'e bakın.
      4. Kalan 1 μL ilaç çözeltisini, uçları ~50 mL DPBS içeren 150 mL'lik bir atık rezervuarına daldırarak uçlara atın (dağıtım hızı: 1,0 μL / s).
      5. Eleme bileşiklerini, ışıklar kapalıyken biyogüvenlik kabinindeki oda sıcaklığında toplam 5 dakika (2 dakikalık plaka okumasını içerir) hücrelerle birlikte inkübe edin. 384/12,5 μL uçlu sıvı taşıma sistemini (dağıtım hızı: 3,1 μL/s) kullanarak rezervuardan (aspirasyon hızı: 3,1 μL/s) agonist peptid Rhimi-K-1 (QFSPWGamid)'in 3 μL'sini tahlil plakasına ekleyin.
      6. Agonist peptidin eklenmesinden hemen sonra plakayı plaka okuyucuya yerleştirin. Adım 2.3.12.3'teki ile aynı programı kullanarak plakayı hem ileri hem de geri yönlerde okuyun

3. Veri analizi

  1. Bir bilgisayara yüklenen plaka okuyucu ile ilişkili analiz yazılımını kullanarak, ilk bileşik eklemeden sonra her iki okuma için hücresel floresan yanıtlarını (RFU'da) hesaplayın (İlk okuma; RFUönce [Ek Tablo S2]) ve agonist ekleme adımlarından sonra (İkinci okuma = RFUkarıncası [Ek Tablo S2]). Her okuma, sırasıyla adım 2.3.12.3 ve adım 2.3.12.6'dan ileri ve geri plaka okumaları tarafından elde edilen (gösterilmeyen) iki değerin ortalaması alınarak elde edilir.
    NOT: RFU öncesinde, RFUkarıncası sırasıyla potansiyel agonist isabetlerinin (adım 2.3.12.3'te okunur) ve potansiyel antagonist isabetlerinin (adım 2.3.12.6'da okunur) göreceli floresan birimlerine atıfta bulunur.
  2. Üç veri kümesini, RFUbg, RFU ago ve RFUant'ı analiz yazılımından üç ayrı elektronik tabloya aktarın. Her elektronik tablonun yalnızca iki sütunu olacaktır: iyi konum ve ham RFU (burada gösterilmeyen dosyalar).
    NOT: RFU bg, adım 2.3.11.2'de okunan arka planın RFU'suna başvurur.
  3. Üç e-tablodaki verileri biçimlendirin ve yukarıdaki verileri tek bir csv dosyasında düzenleyin (Ek Tablo S2'deki örneğe bakın). Okunan arka plan sinyalini sırasıyla RFU ago ve RFU antından çıkarın (Ek Tablo S2'deki G ve H sütunları).
  4. Aşağı akış veri analizi (Tablo 1) ve depolama için csv dosyasını ticari olarak temin edilebilen bir "çevrimiçi HTS veri platformuna" (Malzeme Tablosu'na bakın) aktarın.
  5. Denklem (1) kullanarak her plaka testinin kalite kontrolü için Z'-faktörünü manuel olarak hesaplayın:
    denklem (1):
    Equation 1(1)
    NOT: μ c- ve μc+, çözücü eklendikten sonraki ilk eklemede negatif kontroller olarak hizmet eden (boş çözücü, n = 64; Ek Tablo S2'de mavi renkli sayılar) ve agonistin eklenmesinden sonra pozitif kontroller olarak hizmet eden (boş çözücü + agonist, n = 64; macentadaki sayılar) aynı kuyucukların okumalarının ortalama RFU'larını temsil eder. sırasıyla. Ek olarak, c- ve σ c+ σ karşılık gelen standart sapmalarını (SD'ler) temsil eder.
  6. "Çevrimiçi HTS veri platformundaki" ısı haritalarından isabet moleküllerini manuel olarak seçin ve denklem (2) ve denklem (3) kullanarak agonist isabetleri ve antagonist isabetleri için normalleştirilmiş yüzde aktivasyonunu (NPA) ve inhibitör aktivitesini (Io) hesaplayın:
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu HTS tahlilini örnek olarak göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir kurum içi ilaç plakası (SAC2-34-6170) kullanılmıştır. HTS, 0.7 Z' faktörü ile mükemmel tahlil kalitesine sahipti (Tablo 1). Bu Z' faktörü, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesini yansıtır34. 0,5 veya daha yüksek bir Z′ faktörü, pozitif kontrollerin RFU'ları ile negatif kontroller arasında iyi bir tahlil sinyali dinamik aralığı olduğunu gösterir. Z' faktörü 0,5'ten düşük olan tahliller optimal olmayan bir sinyal dinamik aralığına sahiptir, genellikle isabet seçimi için bilgilendirici değildir ve bu nedenle atılır. Pozitif kontrollerden gelen yanıt (göreceli floresan birimleri, RFU cinsinden ölçülür) (64 pozitif kontrol yanıtının ortalama RFU'su, μ c+ = 130.139), negatif kontrollerden ortalama 19 kat daha yüksekti (64 negatif kontrol yanıtının ortalama RFU'su, μc- = 6.675). Burada "agonist isabetleri" seçmek için kesme floresansı,% >50'lik normalleştirilmiş yüzde aktivasyon (NPA) maksimum oranına ayarlandı. "Antagonist vuruşları" seçmek için kesme floresansı,% >50'lik gözlemlenen bir inhibitör aktiviteye (Io) ayarlandı. Üç agonist isabet molekülü ve iki antagonist isabeti seçildi: SACC-0090237 (NPA =% 153), SACC-0036982 (NPA =% 118) ve SACC-0006532 (NPA =% 152) ve SACC-0103392 (I o =% 53) ve SACC-0041280 (I o =% 56) antagonistler olarak (ham veriler Ek Tablo S2'de gösterilmiştir). Agonistler (yeşil satırlar) ve antagonistler (turuncu satırlar) için NPA ve Io hesaplamalarına örnekler Ek Tablo S2'de gösterilmiştir.

Bileşik ekleme μS1 σs μc- σc- Z' değeri
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Agonist peptid ilavesi μs σs μc+ σc+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tablo 1: HTS tahlilinde tüm plakadan normalleştirilmiş hücre yanıtlarının özeti. Ortalama (μ) ve standart sapma (σ) CDD kasa analizinden elde edilir. Kısaltmalar: HTS = yüksek verimli tarama; RFU'lar = bağıl floresan birimleri; 1s (numuneler) = 320 test edilmiş bileşik; μs = 320 kuyudan gelen hücresel yanıtların (RFU'lar) ortalama değeri; μc- = negatif kontrollerden RFU'ların ortalama değeri; μc+ = pozitif kontrollerden RFU'ların ortalama değeri; σs = 320 kuyudan hücresel yanıtların (RFU'lar) standart sapması; σc- = RFU'ların negatif kontrollerden standart sapması; σc+ = RFU'ların pozitif kontrollerden standart sapması.

Ek Tablo S1: Otomatik pipetleme adımları için sıvı taşıma sisteminin özel programları. Bu tablo Xiong ve ark.31'den değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Temsili sonuçların ham verileri. Yeşil renkle vurgulanan satırlar agonist isabetlerini, turuncu renkle vurgulanan satırlar ise antagonist isabetlerini temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HTS'nin amacı, çok sayıda küçük molekülü tarayarak isabetli molekülleri tanımlamaktır. Bu nedenle, bu örnekten elde edilen sonuçlar geleneksel bir HTS deneyinin yalnızca küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Ayrıca, tanımlanan isabet moleküllerinin, aynı rekombinant hücre hattında ve sadece boş vektörü taşıyan bir CHO-K1 hücre hattında doza bağımlı bir tahlil gibi aşağı akış tahlillerinde doğrulanması gerekir; bu, küçük molekülleri kurtarmak için aynı anda gerçekleştirilebilir. Sitotoksisite testleri, ikinci ilavedeki yanıt eksikliğinin hücre mortalitesine bağlı olmadığını göstermeye yardımcı olacaktır. İzole dokulardaki aktiviteyi in vitro olarak doğrulamak için veya küçük molekülleri canlı eklembacaklılara uygulayarak veya besleyerek diğer biyotahliller yapılmalıdır. Kene kinin reseptörünün küçük moleküllü ligand tanımlamasının tam boru hattı, önceki bir yayında bulunabilir31. Bu boru hattı sayesinde, kene kinin reseptörünün toplam 36 antagonist vuruşu tanımlandı. Bu antagonistlerden üçü bir doku kasılma-inhibisyon testinde daha fazla test edildi ve ortolog sivrisinek kinin reseptörlerinin eksprese edildiği sivrisinek hindgutunda anti-miyotropik aktivite gösterdi31.

Her GPCR eksprese eden hücre hattı, HTS yapılmadan önce uygun deneysel koşullar için doğrulanmalıdır. Bu koşullar arasında hücre yoğunluğu (kuyu başına 10.000 hücre), taranan bileşiklerin konsantrasyonu (2 μM), tahlildeki son DMSO konsantrasyonu (% 0.2), ikinci ekleme için kullanılan agonist ligandın konsantrasyonu (1 μM), pipetleme hızı ve derinliği ve agonist peptidin eklenmesinden sonraki okuma süresi (5 dakika) bulunur. Hücreler yapışmışsa, dağıtım adımlarının hücreleri rahatsız etmemesini sağlamak için sıvı taşıma sisteminin derinliğini ve hızını ayarlamak çok önemlidir. HTS'ye başlamadan önce bu koşulların doğrulanması, tahlil kalitesinin düşük olması durumunda sorun gidermeye yardımcı olacaktır. Hücrelerin optimal koşullarda olması önemlidir: hücreler% 90 -% 100 akıcılığa ulaşmalı, ancak HTS için kullanıldığında hücre plakasında aşırı akıcı olmamalıdır. Bazı kuyucuklardaki arka plan sinyalleri anormal derecede düşük veya yüksekse, mikroskop altında açıkça düşük veya yüksek hücre yoğunluğu için onaylandıktan sonra, verileri analiz ederken aykırı değerler manuel olarak çıkarılmalıdır. Kalsiyum floresan tahlilini HTS'ye uyarlamadan önce, pozitif peptidin kinetik eğrisi bilinmelidir, çünkü hücrelerin agonist peptide kinetik tepkisi, bir HTS testine adapte edilmesi ve tüm plakayı okuyacak kadar uzun sürmesi için 1-2 dakika sürmelidir. Uzun süreli sinyali elde etmek için, agonist peptidin nispeten yüksek bir konsantrasyonu uygulanmalı veya daha yüksek bir hücre yoğunluğu test edilmelidir. Belirli reseptör hücrelerinin kinetik tepkisi çok kısaysa (1 dakikadan az sürerse), son nokta okumasında daha hızlı bir hızda okunması veya HTS için plakanın yalnızca bir kısmının kullanılması önerilir. Kuşkusuz, rekombinant hücre hattının reseptör ekspresyon seviyesine göre kalitesi başarı için çok önemlidir. Plazmidin yerleştirilmesi genomda rastgele olduğu için farklı klonal hücre çizgileri muhtemelen değişecektir ve bu kesinlikle reseptör ekspresyonunu etkileyebilir. Transfekte havuzun erken bir kalsiyum floresan testini ve klonal hücre hatlarını seçme işlemi sırasında dahil etmek ideal olacaktır.

Kalsiyum floresan testinin sınırlaması, ligandın reseptöre doğrudan bağlanması yerine ikincil habercilerin aktivitesini ölçmesidir. Hedef reseptörünü ifade etmeyen hücrelerdeki isabet moleküllerini tarayarak hedef dışı agonist isabetlerini dışlamak mümkün olsa da, bu tahlili kullanarak hedef dışı antagonist isabet moleküllerini tamamen dışlamak imkansızdır, çünkü bazı moleküllerin GPCR sinyalinin aşağısındaki hücresel kalsiyum salınım yollarını inhibe etmesi mümkündür. Bu nedenle, daha önce sivrisineklerle yapıldığı gibi, bilinen bir agoniste sahip bir kene dokusu testinde olduğu gibi, organizma düzeyinde doğrulama için bir ligand bağlama testi veya bir biyotahlil kullanılarak daha fazla doğrulama gereklidir31.

GPCR aktivasyonunu tespit eden çoğu fonksiyonel tahlil, öncelikle iki ana sinyal yolundaki hücre içi olayları ölçer: G proteinine bağımlı ve G proteininden bağımsız yollar. G proteinine bağımlı analizler Ca2+, inositol trifosfat (IP3) veya cAMP konsantrasyonlarını ölçerken, G proteininden bağımsız analizler öncelikle reseptör kaçakçılığını veya β tutuklama işe alımını tespiteder 7. Farklı tahliller, Ca 2 + duyarlı boyalar (floresan testleri), aequorins (Ca2 + biyolüminesans testleri) 14 gibi fotoproteinler, etiketli floresan proteinleri, floresan rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı testler, biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı testler veya etiketsiz optik biyosensör tabanlı hücresel testler gibi okumalar için farklı teknolojiler kullanır. Bu testler ve ilgili mevcut okuma teknolojileri, Zhang ve Xie35 tarafından ayrıntılı olarak gözden geçirildi. Bazı tahliller herhangi bir GPCR'ye uygulanabilir ve bazıları belirli GPCR'lere özgüdür (örneğin, G q-kuplajlı reseptörler için Ca2+ testi, Gi / o- veya Gs- kuplajlı reseptörler için cAMP). Bununla birlikte, bazı G proteinlerini rekombinant hücrelerdeki reseptör ile birlikte eksprese ederek, sinyal yolu değiştirilebilir. Örneğin, Gq15/16 proteinleri, PLC-IP 3-Ca2+ sinyal tespiti 7,36 için Gq-bağlı olmayan reseptörlerle birlikte eksprese edilebilir. Tek bir moleküler olayı ölçen tahlillerin aksine, ligand özgüllüğünü iyileştirmek için büyük miktarda biyolojik veri toplayan yüksek içerikli analiz tahlilleri vardır37. Bu tür bir tahlil aynı zamanda7 yapmak için daha karmaşık ve pahalıdır.

Omurgasız araştırmalarında, en yaygın kullanılan fonksiyonel testler, Ca2 + veya cAMP gibi ikinci habercilerin konsantrasyonlarındaki dalgalanmaları analiz ederek GPCR aktivasyonunu tespit eder. Memeliler ve omurgasızlar arasındaki sinyal yollarındaki farklılıklar nedeniyle, yukarıda belirtilen diğer okuma teknolojilerinin çoğu, omurgasız GPCR çalışmaları için henüz geniş çapta benimsenmemiştir. Bununla birlikte, G-proteinleri hayvan krallığında nispeten korunmaktadır. Son zamanlarda, Lismont ve ark.38 , bazı insan BRET bazlı G-protein biyosensörlerinin, reseptör rekombinant hücrelerinde birlikte eksprese edildiğinde bir böcek GPCR'sinin aktivasyonunu tespit etmek için uyarlanabileceğini göstermiştir. Farklı G proteini bazlı biyosensörlerin (Gs, Gi / o, Gq / 11 veya G12/13) her birini spesifik GPCR'lerle birlikte ifade ederek, G proteini bağlanma mekanizması açıklığa kavuşturulabilir. Lismont ve ark.38 tarafından yapılan çalışmada, Schgr-CRF-DH, GI / O ve Gq / 11 biyosensörlerini doza bağımlı olarak aktive edebilir ve Gs ve G12/13 biyosensörlerini aktive etmemiştir.

Genel olarak, burada açıklanan "çift eklemeli" yaklaşımla birlikte 384 delikli bir plakada gerçekleştirilen kalsiyum floresan testi, nispeten kısa sürede on binlerce molekülün taranmasına izin verir. Bu, aşağı akış doğrulamaları ve uygulamaları için isabet moleküllerini keşfetmek için nispeten zaman ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, USDA-NIFA-AFRI Hayvan Sağlığı ve Refahı Ödülü (Ödül numarası 2022-67015-36336, PVP [Proje Direktörü]) ve Texas A&M AgriLife Araştırma Böcek Vektör Hastalıkları Hibe Programı'ndan (FY'22-23) P.V.P.'ye kadar rekabetçi fonlardan desteklenmiştir. Ek Tablo S2 , Dr. James Sacchettini'nin Texas A & M Üniversitesi ve Texas A & M AgriLife Research'teki laboratuvarından elde edilen şirket içi, rastgele, küçük moleküllü bir kütüphaneden elde edilen verileri içerir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
  2. Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
  4. Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
  5. Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
  6. Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
  7. Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. Leifert, W. , Humana Press. Totowa, NJ. (2009).
  8. Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
  9. Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
  10. Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
  11. Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
  12. Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
  13. Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
  14. Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
  15. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
  16. Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
  17. Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
  18. Dircksen, H. Chapter 32 - Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). Kastin, A. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 209-221 (2013).
  19. Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
  20. Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
  21. Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
  22. Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
  23. Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
  24. Kim, Y. -J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
  25. Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
  26. Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
  27. Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
  28. Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
  29. Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
  30. Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
  31. Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
  32. Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
  33. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
  34. Zhang, J. -H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  35. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
  36. Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
  37. Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
  38. Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).

Tags

Biyokimya Sayı 190
Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio,… More

Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors. J. Vis. Exp. (190), e64505, doi:10.3791/64505 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter