Summary
この研究では、組換えGタンパク質共役受容体(GPCR)上の低分子ライブラリをスクリーニングするための384ウェルプレートのハイスループット細胞内カルシウム蛍光アッセイについて説明します。標的は、牛熱ダニ由来のキニン受容体である リピケファルス・マイクロプラスが、 CHO-K1細胞で発現している。このアッセイは、1つの「二重付加」アッセイで同じ細胞を使用するアゴニストとアンタゴニストを同定する。
Abstract
Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、受容体の最大のスーパーファミリーであり、多くのヒト薬物の標的となっています。GPCRに対するランダム低分子ライブラリーのハイスループットスクリーニング(HTS)は、製薬業界で標的特異的創薬に使用されています。この研究では、HTSを使用して、無脊椎動物特異的神経ペプチドGPCRの新規低分子リガンドを、致命的なヒトおよび獣医病原体のベクターの生理学的研究のためのプローブとして同定しました。
無脊椎動物特異的キニン受容体は、利尿、摂食、消化など、無脊椎動物の多くの重要な生理学的プロセスを調節するため、標的として選択されました。さらに、多くの無脊椎動物GPCRの薬理学は、十分に特徴付けられていないか、まったく特徴付けられていません。したがって、他の後生動物、特にヒトにおける関連するGPCRに関するこれらの受容体群の鑑別薬理学は、スーパーファミリーとしてのGPCRの構造活性関係に知識を追加します。HTSアッセイは、ウシコレラダニまたはミナミウシマダニ、 Rhipicephalus microplusからのキニン受容体のリガンドの発見のために、384ウェルプレート中の細胞用に開発されました。このダニキニン受容体はCHO-K1細胞で安定に発現していた。
キニン受容体は、内因性キニン神経ペプチドまたは他の小分子アゴニストによって活性化されると、カルシウム貯蔵から細胞質へのCa2+ 放出を引き起こす。「二重付加」アプローチと組み合わせたこのカルシウム蛍光アッセイは、同じアッセイプレート内の機能的アゴニストおよびアンタゴニスト「ヒット」分子を検出することができます。各アッセイは、320個のランダムな小分子のアレイを担持した薬物プレートを用いて実施した。0.7の信頼性の高いZ'因子が得られ、HTSが2μMの最終濃度にあるときに3つのアゴニストヒット分子と2つのアンタゴニストヒット分子が同定されました。ここで報告されるカルシウム蛍光アッセイは、Ca2+ シグナル伝達カスケードを活性化する他のGPCRをスクリーニングするように適合させることができる。
Introduction
酵母からヒトに存在するGタンパク質共役型受容体(GPCR)は、多くの生物において受容体の最大のスーパーファミリーを表しています1。それらは、動物のほぼすべての生物学的プロセスを調節する上で重要な役割を果たします。節足動物のゲノムには50〜200個のGPCRがあり、それらは最大の膜受容体スーパーファミリー2を表しています。それらは、配列の類似性と関数に基づいて、6つの主要なクラス、A〜Fに分類されます3。GPCRは、ホルモン、神経ペプチド、生体アミン、グルタミン酸、プロトン、リポ糖タンパク質、光子など、さまざまな細胞外シグナルを伝達します4。GPCRはヘテロ三量体Gタンパク質(Gα、Gβ、およびGγ)に結合して、下流のシグナルを伝達します。GαsまたはGαi/oタンパク質に結合したGPCRは、アデニリルシクラーゼを活性化または阻害することにより、細胞内の3',5'-サイクリックアデノシン一リン酸(cAMP)レベルをそれぞれ増加または減少させます。Gαq/11に結合したGPCRは、ホスホリパーゼC(PLC)-イノシトール-1,4,5-三リン酸(IP3)経路を活性化することにより、小胞体カルシウム貯蔵部からのカルシウム放出を誘導します。Gα12/13に結合したGPCRは、RhoGTPaseヌクレオチド交換因子5,6を活性化します。GPCRは、ヒトの薬物の50%以上と殺ダニ剤であるアミトラズ4の標的です。GPCRはこのような多様なシグナルを伝達するため、無脊椎動物特有の生理機能を破壊する新規農薬の開発の標的として期待されています。
HTSの目標は、受容体機能を調節できるヒット分子を特定することです。HTSには、アッセイ開発、小型化、自動化が含まれます7。節足動物の神経ペプチドGPCRは、発生、脱皮および異質、排泄、エネルギー動員、生殖など、ほとんどの生理学的機能に関与しています4。節足動物および後生動物の神経ペプチドGPCRのほとんどは、黒脚ダニIxodes scapularisの筋抑制ペプチドおよびSIFamide受容体など、カルシウムシグナル伝達カスケード2,6,8,9,10を介してシグナル伝達する。それらのリガンドは後腸運動アッセイにおいて拮抗的であり、SIFは収縮を誘発し、MIPはそれを阻害する11,12。黄熱病の蚊のNPY様受容体であるネッタイシマカは、13を求める女性の宿主を調節します。エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14などの他の代替カルシウム動員アッセイと比較して、カルシウム蛍光アッセイは実行が容易であり、他の組換えカルシウム検出タンパク質のトランスフェクションを必要とせず、費用効果が高い。カルシウム蛍光アッセイは、エクオリンカルシウム生物発光アッセイ14、15で得られた高速速度論的シグナルと比較して延長シグナルを生成する。
この例では、牛熱ダニ由来のキニン受容体であるリピセファルスマイクロプラスをCHO-K1細胞株で組換え発現させ、カルシウム蛍光アッセイに使用しました。R.マイクロプラスに見られるキニン受容体遺伝子は1つだけです。受容体は、Gqタンパク質依存性シグナル伝達経路を介してシグナルを送り、カルシウム貯蔵から細胞内空間16へのCa2+の流出を引き起こす。このプロセスは、カルシウムイオンと結合すると蛍光シグナルを誘発する蛍光色素によって検出および定量できます(図1)。
キニン受容体は無脊椎動物特異的GPCRであり、クラスAロドプシン様受容体に属する。キニンは、軟体動物、甲殻類、昆虫、およびアカリに存在する古代のシグナル伝達神経ペプチドです4,17,18。鞘翅目(甲虫)はキニンシグナル伝達システムを欠いています。蚊のネッタイシマカでは、3つのエデスキニンに結合するキニン受容体は1つだけですが、ショウジョウバエメラノガスターは、ドロソキニンを固有のリガンドとして持つキニン受容体を1つ持っています19,20,21。脊椎動物には相同なキニンやキニン受容体はありません。キニンの正確な機能はダニでは不明ですが、R. microplusのキニン受容体RNAiサイレンシングされた雌は、生殖適応度が大幅に低下しています22。キニンは昆虫の多面性ペプチドです。ショウジョウバエメラノガスターでは、それらは中枢および末梢神経調節系23、前泄化24、摂食25、代謝26、および睡眠活動パターン26,27、ならびに幼虫の移動28の両方に関与している。キニンは、蚊A.エジプト29,30,31の後腸収縮、利尿、および摂食を調節します。キニンペプチドは、保存されたC末端ペンタペプチドPhe−X1−X2−Trp−Gly−NH2を有し、これは生物学的活性32のために必要最小限の配列である。節足動物の特異性、内因性リガンドのサイズが小さいため、低分子干渉を受けやすいこと、および昆虫の多面的機能により、キニン受容体は害虫駆除の有望な標的となっています4。
「二重付加」アッセイ(図2)は、同じHTSアッセイ15におけるアゴニストまたはアンタゴニストの同定を可能にする。これは、創薬のために製薬業界で一般的に使用されている「二重付加」アッセイから適応されています33。簡単に言えば、細胞プレートへの薬物の最初の添加は、溶媒制御の適用と比較してより高い蛍光シグナルが検出されたときに、化学ライブラリー内の潜在的なアゴニストの同定を可能にする。これらの小分子とのインキュベーションの5分後、既知のアゴニスト(キニンペプチド)をすべてのウェルに適用します。薬物プレートからアンタゴニストを無作為に受けたウェルは、最初の添加で溶媒を受け取ったコントロールウェルと比較して、アゴニスト添加時に低い蛍光シグナルを示します。次いで、このアッセイは、同じ細胞を有する潜在的なアゴニストおよびアンタゴニストの同定を可能にする。標準的なHTSプロジェクトでは、これらのヒット分子は、用量反応アッセイおよび追加の生物学的活性アッセイによってさらに検証されますが、ここには示されていません。
図1:カルシウム蛍光アッセイ機構の説明図。Gqタンパク質は、細胞内カルシウムシグナル伝達経路をトリガーします。キニン受容体(Gタンパク質共役型受容体)をCHO-K1細胞で組換え発現させた。アゴニストリガンドが受容体に結合すると、キニン受容体に関連するGqタンパク質がPLCを活性化し、これがPIP2分子のIP3およびDAGへの変換を触媒する。次に、IP 3は小胞体表面のIP3 Rに結合し、Ca2+が細胞質に放出され、そこでCa2+イオンが蛍光色素に結合して蛍光シグナルを誘発します。蛍光シグナルは、490 nmでの励起によって得られ、514 nmで検出されます。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;PLC = ホスホリパーゼC;PIP2=ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸;IP3 =イノシトール三リン酸;DAG =ジアシルグリセロール;IP3 R = IP3受容体。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CHO-K1細胞で発現するGタンパク質共役型受容体上の低分子のハイスループットスクリーニングのワークフロー。 (A)キニン受容体を安定に発現する組換えCHO-K1細胞を、リキッドハンドリングシステム(25μL/ウェル)を用いて384ウェルプレート(10,000細胞/ウェル)に添加し、加湿したCO2インキュベーターで12〜16時間インキュベートした(B)蛍光色素を含むアッセイバッファー(25 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞プレートに加えました。プレートを37°Cで30分間インキュベートし、RTでさらに30分間平衡化した。 (C)各ウェル内の細胞のバックグラウンド蛍光シグナルをプレートリーダーで測定した。(D)384ウェルライブラリープレートからの薬物溶液とブランク溶媒(すべて0.5 μL/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用して細胞アッセイプレートに加えました。(E)細胞性カルシウム蛍光応答は、薬物溶液の添加直後にプレートリーダーで測定され、平均よりも高い蛍光シグナルを惹起する化合物をアゴニストヒットとして選択した。GPCRをブロックするアンタゴニストヒット(下のアイコン)は、ステップGの間にペプチドアゴニストを添加した後に明らかにされた。(f)同じアッセイプレートにおいて、スクリーニング化合物と共に細胞を5分間インキュベートした後、ダニキニン受容体の内因性アゴニストペプチドRhimi-K-1(QFSPWGamide)を各ウェル(1μM)に添加した。(g)アゴニストペプチド添加後の細胞蛍光応答を直ちにプレートリーダーにより測定した。蛍光シグナルを阻害する化合物をアンタゴニストヒットとして選択した。略語:GPCR = Gタンパク質共役型受容体;RT =室温;RFU = 相対蛍光単位。BioRender.com で作成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. セルメンテナンス
注: R. MICROPLUS由来のキニン受容体を安定に発現するCHO-K1細胞株(BMLK3)は、Holmesらによって開発された16。細胞株の開発の詳細は、他の14箇所に提示されている。以下のすべてのステップは、クラスIIバイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で実行されます。
- 選択培地(10%ウシ胎児血清[FBS]と800 μg/mL G418硫酸を含むF-12K培地)で組換え細胞株を増殖させ、標的受容体の発現を確実にします。受容体を安定に発現する細胞を1 mLの凍結培地(90%FBSおよび10%ジメチルスルホキシド[DMSO])の2 mLクライオバイアルの-80°C冷凍庫に保存します。
注意: 凍結細胞を長期間保存する場合は、液体窒素で保管してください。 - 細胞培養の前にすべての培地を予熱します。バイオセーフティキャビネットで、13 mLの予熱した選択培地(10%FBSと800 μg/mL G418硫酸塩を含むF-12K培地)をT-75フラスコに移し、バイオセーフティキャビネットに保管します。凍結したBMLK 3細胞(~1.5 ×10 6細胞)の1つのバイアルを37°Cの水浴中で2〜3分間解凍します。解凍した細胞をT-75フラスコに移します。細胞を加湿インキュベーター内で、特に指定がない限り37°Cおよび5%CO2に維持する。
- 細胞が90%コンフルエント(1〜2日)に達したら、室温に保たれているダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を除くすべての培地を37°Cに予熱します。バイオセーフティキャビネットで、使用済み培地をT-75フラスコから取り出し、フラスコを穏やかに回転させて10 mLのDPBSで細胞を5秒間洗浄してから、血清学的ピペットでDPBSを除去します。
注:90%コンフルエントでのCHO-K1細胞の画像は、Luら14に示されています。 - 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加えてT-75フラスコから細胞を剥離し、インキュベーター内で37°Cで3〜5分間インキュベートします。次に、8 mLの選択培地を追加し、ピペッティングしてよく混合し、同じ血清学的ピペットで2x〜3xを穏やかに放出します。
- ステップ1.4の細胞懸濁液2 mL(~1 ×10 6 細胞)を、10 mLの温かい選択培地を含む新しいT-75フラスコに移します。細胞が90%のコンフルエントに達するまで、インキュベーター内で1〜2日間細胞を増殖させます。
- 次のステップに続いてアッセイに細胞を使用するか、アッセイで細胞を使用する前にステップ1.4〜1.5を1〜2回繰り返します。
注:特定の細胞株のアッセイシグナルは、さらに継代すると弱くなる可能性があるため、3〜4継代を超えないようにしてください。
2. カルシウム蛍光アッセイ
- セルプレートをコーティングします。
- バイオセーフティキャビネット内に配置されたリキッドハンドリングシステムを使用して、384ウェルプレートのすべてのピペッティングステップを行います。384ウェルプレート31 にピペッティングするためのカスタムプログラムを作成する(補足表S1)。滅菌済みの384ウェルプレートを事前にコーティングします。バイオセーフティキャビネットに、0.05 mg/mLのポリ-D-リジン(PDL)水溶液10 μL/ウェルを各プレートにロードし、室温で5分間インキュベートします。
- プレートをすばやく反転させ、滅菌ペーパータオルでそっと吸い取って、プレートを空にします。次に、各ウェルを10 μLの水で洗い流し、プレートを空にし、蓋なしでバイオセーフティキャビネットでプレートを一晩乾燥させます。プレートを蓋で閉じ、冷蔵庫に4°Cで保存します。
注:コーティングされたプレートは、4°Cで最大6か月間保存できます。
- 1日目
- −20°Cの冷凍庫に保存されている薬剤プレート(90%DPBS+10%DMSOで100μM、HTS用ウェルの最終濃度は2μM)を取り出し、室温に置きます。
注:ドラッグプレートのレイアウト:各384ウェルプレート(24列x 16行)には、異なるライブラリ化合物を含む320ウェルと、ブランク溶媒(10%DMSOを含むDPBS)を含む64ウェルが含まれ、4列に配置され、両側の端に2列あります。プレートレイアウトについては、 補足表S2 を参照してください。 - 細胞がT-75フラスコ内で~70%-90%のコンフルエントに達したら、以下に説明するように細胞をT-75フラスコから剥離します。DPBS(室温)を除くすべてのメディアを37°Cに予熱します。
- 使用済みの培地を取り除き、10 mLのDPBSで細胞を洗浄してから、DPBSを除去します。インキュベーター内で2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを使用して37°Cで3〜5分間T-75フラスコから細胞を剥離し、8 mLの選択培地を加え、細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移して1,000 × g で3分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、1%FBSおよび400 μg/mLのG418硫酸塩を含む10 mLのF-12K培地に細胞ペレットを再懸濁します。懸濁液をバイオセーフティキャビネットに保管し、細胞数を決定します。
- さらに希釈するために懸濁液の細胞密度を決定する:20 μLの細胞懸濁液を20 μLの0.4%トリパンブルーに混合し、次に20 μLの混合物を細胞計数チャンバーにロードして、細胞密度についてセルカウンターで読み取ります。
- 細胞懸濁液を同じ培地(1%FBSおよび400 μg/mL G418硫酸塩を含むF-12K培地)で、4 × 105 細胞/mLの密度で少なくとも15 mLの最終容量に希釈します。
- PDLコーティングされた384ウェルプレートに細胞を播種します。上記の細胞懸濁液15 mL(4 ×10 5 cells/mL)を150 mLの自動投与試薬リザーバーに移します。25 μLの細胞懸濁液(~10,000細胞/ウェル)を、リキッドハンドリングシステムを使用してプレートの384ウェルの各ウェルに2段階で分注します。384/12.5 μLの低保持チップをリキッドハンドラーヘッドにロードし、リザーバーから12.5 μLを吸引し(速度5.2 μL/s)、各ウェルに分注します(速度:3.1 μL/s)。
- 前のステップ2.2.5と同様にピペッティングを繰り返し、ウェルあたり25 μLに到達します。次いで、プレートを加湿インキュベーター内で37°Cおよび5%CO2 で一晩(14〜16時間)インキュベートする。
注:この特定のヘッドの最大ピペッティング容量は12.5 μLであるため、25 μLのピペッティングは2つのステップで実行されます。
- −20°Cの冷凍庫に保存されている薬剤プレート(90%DPBS+10%DMSOで100μM、HTS用ウェルの最終濃度は2μM)を取り出し、室温に置きます。
- 2日目
- 翌朝、覆われたセルプレートを顕微鏡で確認します。コンフルエントでない場合は、細胞が90%コンフルエントに達するまで待ちます。
- 蛍光色素のストック溶液を調製する:凍結乾燥した蛍光色素を100 μLのDMSOに再懸濁し、ストック溶液に直接光が当たらないようにします。光退色を防ぐために、チューブをアルミホイルで包みます。
注:ストックは、凍結と解凍の繰り返しを避けるために、プレートアッセイごとに15 μLのアリコートに分注することができます。アリコートは-80°Cで最大1ヶ月間保存できます。 - 消灯したバイオセーフティキャビネットで、15 μLの蛍光色素ストック溶液(ステップ2.3.2から)と残りの予熱したキットコンポーネント(37°C)を組み合わせて、アルミホイルで包まれた15 mLのコニカルチューブにローディング色素(1x)を準備します:13.5 mLの1x HHBS(20 mM HEPESを含むハンクスバッファー)と1.5 mLの試薬B(色素排出阻害剤)。
注意: この手順では、ルームライトが点灯します。 - チューブを閉じ、チューブを数回(通常は3〜5倍)静かに反転させてよく混ぜます。
注意: 室温で保管し、30分以内にローディング染料混合物を使用してください。 - 細胞が90%コンフルエントに達したら、プレートをすばやく反転させ、滅菌ペーパータオルで穏やかに吸い取り、使用済みの培地を384ウェルアッセイプレートから取り出します。この動きを2x-3x繰り返して、プレートからすべての液体を取り除きます。濡れたタオルは捨ててください。
- 室内のほとんどの人工直接照明(作業条件が見えるように柔らかく薄暗い電気スタンドを点灯または同様のままにする)およびバイオセーフティキャビネット内のすべてのステップをアッセイ終了まで(約1.5時間)オフにします。
- ステップ2.3.3のローディング色素(1x)15 mLを150 mLの自動対応リザーバーに入れます。
- プレートの各ウェルに12.5 μLを分注することにより、384/12.5 μLの低保持チップを備えたリキッドハンドリングシステムを使用して、25 μLのローディング色素(1x)をリザーバーから各ウェルに移します(吸引および分注速度:3.8 μL/s)。
- 2.3.7.1と同様にピペッティングステップを繰り返して、プレートの各ウェルで最終容量25 μLに到達します。プレートをアルミホイルで覆い、周囲光から保護します。
- 蓋をしたセルプレートをCO2 加湿インキュベーター内で37°Cで30分間インキュベートし、インキュベーターから取り出し、プレートリーダー内またはベンチ上で室温で平衡化し、プレートを覆い、さらに30分間ホイルで包みます。その後、細胞はハイスループットスクリーニング(HTS)の準備が整います。
- 化学製剤:ステップ2.2.1の薬剤プレートをプレート遠心分離機で1,200 × g で室温で1分間回転させます。
- 0.1% DMSOを含む1x HHBSの10 mLに100 nmolの凍結乾燥ペプチドを再懸濁することにより、Rhimi-K-1(QFSPWGamide)(10 μM)の10xアゴニストペプチド溶液を調製し、その溶液を150 mLの自動フレンドリーなリザーバーに移します。
- バックグラウンドシグナルの測定:プレートリーダーのHTSアッセイ全体について、 プロトコルで エンドポイント蛍光モードを選択します。
注:蛍光シグナルは、495 nm / 525 nmの励起/発光波長でプレートの下部から読み取られます。- セルプレートをプレートリーダーに挿入します。インストルメントパネルで、[ゲインの調整]を選択し、プレート上のランダムなウェルを選択し、測定可能な最大蛍光値の5%〜10%として割り当て、[高さの調整(読み取り)]を選択します。
- [ 測定開始 ]をクリックして、相対蛍光単位(RFU)のバックグラウンド蛍光シグナルについてプレート全体を読み取ります。
- 「二重付加」アッセイ
- 384/12.5 μLチップのリキッドハンドリングシステムを使用して、ドラッグプレートの各ウェルで薬液を混合するために、10 μLの薬液(10%DMSOを含むDPBS中)を3倍上下にピペットし(ピペッティング速度:5.2 μL/s)、ドラッグプレートの各ウェルから1.5 μLを「吸引」します(吸引速度:1.0 μL/s)。
- 0.5 μLの化合物を細胞アッセイプレート(ピペッティング速度:1 μL/s)に「分注」し、0.2%DMSO中で最終濃度2 μMに到達します。
- スクリーニング化合物を添加した後、すぐにアッセイプレートをプレートリーダーに入れます。同じプレートを順方向と逆方向の両方で読み取ります。これらの読み出しを得るには、「ウェル1−384」から、そして「384−1」から直ちに読み出すプログラムを定義する。
注意: 両方向の読み出しには合計2分かかります。この読み出し設計は、各方向のプレート読み取り中に発生する信号強度の低下を補償するためのものです。読み出し分析については、ステップ 3.1 を参照してください。 - チップ内の残りの1 μLの薬液を、~50 mLのDPBSを含む150 mLの廃棄物リザーバーに浸して廃棄します(分注速度:1.0 μL/s)。
- スクリーニング化合物を細胞と一緒に、ライトをオフにしてバイオセーフティキャビネットで室温で合計5分間(プレート読み取りの2分間を含む)インキュベートします。3 μLのアゴニストペプチドRhimi-K-1(QFSPWGamide)をリザーバー(吸引速度:3.1 μL/s)から3 μLのリキッドハンドリングシステム(分注速度:3.1 μL/s)を使用してアッセイプレートに3 μL加えます。
- アゴニストペプチドを添加した直後にプレートをプレートリーダーに入れる。ステップ2.3.12.3と同じプログラムを使用して、順方向と逆方向の両方でプレートを読み取ります
3.データ分析
- コンピュータにインストールされたプレートリーダーに関連する分析ソフトウェアを使用して、最初の化合物添加後の両方の読み取り値に対する細胞蛍光応答(RFU単位)を計算します(First read;RFU前[補足表S2])およびアゴニスト添加ステップの後(2回目の読み取り=RFUアリ[補足表S2])。各読み取り値は、ステップ2.3.12.3およびステップ2.3.12.6からの順方向および逆方向のプレート読み取り値によって得られた2つの値(図示せず)をそれぞれ平均することによって得られる。
注: RFU前、 RFUアリは、潜在的なアゴニストヒット(ステップ2.3.12.3で読み取られる)および潜在的なアンタゴニストヒット(ステップ2.3.12.6で読み取られる)の相対的な蛍光単位をそれぞれ参照する。 - RFUbg、RFU ago、RFUantの3つのデータセットすべてを分析ソフトウェアから3つの別々のスプレッドシートにエクスポートします。各スプレッドシートには、井戸位置と生のRFU(ここには示されていないファイル)の2つの列のみが含まれます。
注: RFU bg はステップ 2.3.11.2 で読み取られたバックグラウンドの RFU を参照します。 - 3 つのスプレッドシートのデータを書式設定し、上記のデータを 1 つの csv ファイルに整理します (補足表 S2 の例を参照)。RFU前およびRFUアリからそれぞれ読み取られたバックグラウンド信号を引く(補足表S2のG列およびH列)。
- csvファイルを市販の「オンラインHTSデータプラットフォーム」( 材料表を参照)にインポートして、ダウンストリームデータ分析(表1)および保存します。
- 式 (1) を使用して、各プレートアッセイの品質管理のためのZ'係数を手動で計算します。
式 (1):
(1)
注:μc-およびμc+は、同じウェルの読み取り値の平均RFUを表し、溶媒を添加した後の最初の添加でネガティブコントロールとして機能し(ブランク溶媒、n = 64、補足表S2の青色の数字)、アゴニスト(ブランク溶媒+アゴニスト、n = 64、マゼンタの数値)、 それぞれ。さらに、σ c- および σc+ は、対応する標準偏差 (SD) を表します。 - 「オンラインHTSデータプラットフォーム」のヒートマップからヒット分子を手動で選択し、式(2)と式(3)を使用して、アゴニストヒットとアンタゴニストヒットの正規化パーセント活性化(NPA)と阻害活性(IO)を計算します。
(2)
(3)
(1)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
例として、320個のランダムな小分子で構成される社内の薬物プレート(SAC2-34-6170)を使用して、このHTSアッセイを実証しました。HTSは、Z'係数が0.7と優れたアッセイ品質を有していました(表1)。このZ'因子は、試験化合物34とは無関係のアッセイ品質を反映する。0.5以上のZ′係数は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールのRFU間のアッセイシグナルダイナミックレンジが良好であることを示します。Z'係数が0.5未満のアッセイは、シグナルダイナミックレンジが最適ではなく、通常はヒット選択に有益ではないため、破棄されます。陽性対照からの応答(相対蛍光単位、RFUで測定)(64の陽性対照の応答の平均RFU、μc+ = 130,139)は、陰性対照のそれよりも平均19倍高かった(64の陰性対照の応答の平均RFU、μc- = 6,675)。ここで「アゴニストヒット」を選択するためのカットオフ蛍光は、正規化パーセント活性化(NPA)最大比>50%に設定されました。「アンタゴニストヒット」を選択するためのカットオフ蛍光は、観察された阻害活性(Io)が>50%になるように設定した。アゴニストとしてSACC-0090237(NPA=153%)、SACC-0036982(NPA=118%)、SACC-0006532(NPA=152%)、アンタゴニストとしてSACC-0103392(IO=53%)およびSACC-0041280(Io=56%)の3つのアゴニストヒット分子と2つのアンタゴニストヒットを選択した(生データは補足表S2に示す)。 アゴニスト(緑色の行)およびアンタゴニスト(オレンジ色の行)についてのNPAおよびIoの計算の例を、それぞれ補足表S2に示す。
| 化合物添加 | μs1 | σS | μc- | σc- | Z' 値 |
| (n = 320) | (n = 320) | (n = 64) | (n = 64) | ||
| 9,212 | 18,130 | 6,675 | 1,895 | 0.7 | |
| アゴニストペプチド添加 | μ s | σ s | μc+ | σc+ |  |
| 1,22,322 | 15,987 | 1,30,139 | 11,062 |
表1:HTSアッセイにおけるプレート全体からの正規化された細胞応答の要約。 平均(μ)と標準偏差(σ)は、CDDボールト分析から取得されます。略語: HTS = ハイスループットスクリーニング;RFU = 相対蛍光単位; 1秒(サンプル )= 320試験化合物;μs = 320ウェルからの細胞応答(RFU)の平均値。μc- = 陰性対照からのRFUの平均値。μc+ = ポジティブコントロールからのRFUの平均値。σs = 320ウェルからの細胞応答(RFU)の標準偏差。σc- = 陰性対照からのRFUの標準偏差。σc+ = 陽性対照からのRFUの標準偏差。
補足表S1:自動ピペッティングステップ用の液体処理システムのカスタムプログラム。 この表はXiongら31から修正された。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S2:代表結果の生データ。 緑色で強調表示された行はアゴニストヒットを表し、オレンジ色で強調表示された行はアンタゴニストヒットを表します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
HTSの目標は、膨大な数の低分子をスクリーニングすることにより、ヒット分子を特定することです。したがって、この例の結果は、従来のHTS実験のごく一部にすぎません。さらに、同定されたヒット分子は、同じ組換え細胞株および空のベクターのみを保持するCHO-K1細胞株での用量依存アッセイなどのダウンストリームアッセイで検証する必要があり、小分子を保存するために同時に実行できます。細胞毒性アッセイは、2回目の添加における応答の欠如が細胞死亡率によるものではないことを実証するのに役立ちます。他のバイオアッセイは、単離された組織の活性を検証するためにin vitroで、または小分子を生きた節足動物に適用または給餌することによって実行する必要があります。ダニキニン受容体の小分子リガンド同定の完全なパイプラインは、以前の刊行物31に見出すことができる。このパイプラインを通じて、ダニキニン受容体の合計36のアンタゴニストヒットが同定された。これらのアンタゴニストのうち3つは、組織収縮阻害アッセイでさらにテストされ、オーソログ蚊キニン受容体が発現している蚊の後腸で抗筋向性活性を示しました31。
各GPCR発現細胞株は、HTSを実施する前に、適切な実験条件について検証する必要があります。これらの条件には、細胞密度(ウェルあたり10,000細胞)、スクリーニングされた化合物の濃度(2 μM)、アッセイにおける最終DMSO濃度(0.2%)、2回目の添加に使用したアゴニストリガンドの濃度(1 μM)、ピペッティングの速度と深さ、およびアゴニストペプチドの添加後の読み取り時間(5分)が含まれます。液体処理システムの深さと速度を調整して、細胞が接着している場合に分注ステップが細胞を乱さないようにすることが重要です。HTSに着手する前にこれらの条件を検証することは、アッセイの品質が低い場合のトラブルシューティングに役立ちます。細胞を最適な状態に置くことが重要です:細胞は90%-100%のコンフルエントに達する必要がありますが、HTSに使用する場合は細胞プレート内で過剰にコンフルエントであってはなりません。特定のウェルのバックグラウンドシグナルが異常に低いまたは高い場合は、顕微鏡で明らかに低いまたは高い細胞密度を確認した後、データを分析するときに外れ値を手動で除去する必要があります。カルシウム蛍光アッセイをHTSに適応させる前に、アゴニストペプチドに対する細胞の動態応答がHTSアッセイに適合し、プレート全体を読み取るのに十分な長さで持続するために1〜2分間続く必要があるため、陽性ペプチドの速度論曲線を知る必要があります。延長シグナルを達成するには、比較的高濃度のアゴニストペプチドを適用するか、より高い細胞密度を試験する必要があります。特定の受容体細胞の動態応答が短すぎる(持続時間が1分未満)場合は、エンドポイント読み出しでより速い速度で読み取るか、プレートの一部のみをHTSに使用することをお勧めします。確かに、受容体発現のレベルに対する組換え細胞株の質は成功のために重要です。プラスミドの挿入はゲノム内でランダムであるため、クローン細胞株によって異なる可能性が高く、これは確かに受容体発現に影響を与える可能性があります。トランスフェクトされたプールの早期カルシウム蛍光試験を組み込むこと、およびクローン細胞株を選択するプロセス中に組み込むことが理想的です。
カルシウム蛍光アッセイの限界は、リガンドの受容体への直接結合の代わりに二次メッセンジャーの活性を測定することである。標的受容体を発現しない細胞上のヒット分子をスクリーニングすることによりオフターゲットアゴニストヒットを排除することは可能であるが、一部の分子がGPCRシグナル伝達の下流の細胞カルシウム放出経路を阻害する可能性があるため、このアッセイを用いてオフターゲットアンタゴニストヒット分子を完全に排除することはできない。したがって、以前に蚊31で行われたように、既知のアゴニストを用いたダニ組織アッセイなど、生物レベルでの検証のためのリガンド結合アッセイまたはバイオアッセイのいずれかを使用して、さらなる検証が必要である31。
GPCR活性化を検出するほとんどの機能アッセイは、主にGタンパク質依存性経路とGタンパク質非依存性経路の2つの主要なシグナル伝達経路における細胞内イベントを測定します。Gタンパク質依存性アッセイでは、Ca2+、イノシトール三リン酸(IP3)、またはcAMP濃度を測定しますが、Gタンパク質非依存アッセイでは、主に受容体輸送またはβアレスチン動員を検出します7。アッセイが異なれば、Ca2+感受性色素(蛍光アッセイ)、エクオリンなどの光タンパク質(Ca 2+生物発光アッセイ)14、タグ付き蛍光タンパク質、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのアッセイ、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ、ラベルフリーの光学バイオセンサーベースの細胞アッセイなど、異なる技術が読み出しに使用されます。これらのアッセイおよび対応する利用可能な読み出し技術は、ZhangおよびXie35によって詳細にレビューされた。いくつかのアッセイは任意のGPCRに適用可能であり、いくつかは特定のGPCRに特異的である(例えば、Gq共役受容体のCa2+アッセイ、G/ o-またはGs-共役受容体のためのcAMP)。しかし、組換え細胞において特定のGタンパク質を受容体と無差別に共発現させることにより、シグナル伝達経路を変化させることができる。例えば、Gq15/16タンパク質は、PLC-IP3-Ca2+シグナル伝達検出のために非Gq共役受容体と共発現することができる7、36。単一の分子イベントを測定するアッセイとは対照的に、リガンド特異性を改善するために大量の生物学的データを収集するハイコンテント分析アッセイがあります37。このタイプのアッセイはまた、実行するのにより複雑で費用がかかります7。
無脊椎動物の研究では、最も広く使用されている機能アッセイは、Ca2+やcAMPなどのセカンドメッセンジャーの濃度の変動を分析することにより、GPCR活性化を検出します。哺乳類と無脊椎動物ではシグナル伝達経路が異なるため、上記の他の読み出し技術のほとんどは、無脊椎動物のGPCR研究にはまだ広く採用されていません。ただし、Gタンパク質は動物界全体で比較的保存されています。最近、Lismontら38は、いくつかのヒトBRETベースのGタンパク質バイオセンサーが、受容体組換え細胞で共発現したときに昆虫GPCRの活性化を検出するようにも適応できることを実証しました。異なるGタンパク質ベースのバイオセンサー(Gs、Gi / o、G q / 11、またはG12/13)のそれぞれを特定のGPCRと共発現させることにより、Gタンパク質の結合メカニズムを解明することができます。Lismontらによる研究38では、Schgr-CRF-DHはGi / oおよびG q / 11バイオセンサーを用量依存的に活性化することができ、GsおよびG12/13バイオセンサーを活性化しなかった。
全体として、ここで説明する「二重付加」アプローチと組み合わせて384ウェルプレートで実施されるカルシウム蛍光アッセイは、比較的短時間で数万個の分子のスクリーニングを可能にする。これは、ダウンストリームの検証とアプリケーションのためにヒット分子を発見するための比較的時間とコスト効率の高いアプローチです。
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Disclosures
著者は開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-being賞(賞番号2022-67015-36336、PVP [プロジェクトディレクター])およびTexas A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases Grant Program(FY'22-23)からP.V.P.への競争的資金から支援されました。 農業生命科学部TAMUのA.W.E.S.O.M.E.教員グループは、原稿の編集を支援したことで認められています。 補足表S2 には、テキサスA&M大学のJames Sacchettini博士の研究室とTexas A&M AgriLife Researchから入手した社内のランダム低分子ライブラリからのデータが含まれています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | with phenol red |
| 0.4% trypan blue | MilliporeSigma | T8154 | liquid, sterile |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes |
| 5 mL serological pipette | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 10 mL serological pipette | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352196 | sterile |
| 20 µL filter tips | USA Scientifc Inc. | P1121 | sterile, barrier |
| 25 mL serological pipette | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430828 | graduated, sterile |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6317 | sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1 |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6318 | sterile, stacked, for loading dye in day 2 |
| 384/ 12.5 µL low retention tips | Integra Bioscience | 6405 | long, sterile filter |
| 384/ 12.5 µL tips | Integra Bioscience | 6404 | long, sterile filter |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat |
| Aluminum plate seals | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | polyester-based |
| Aluminum foil wrap | Walmart | ||
| Biosafty cabinet II | NuAire | NU-540-300 | |
| Cell counter | Nexcelom | AutoT4 | |
| cell counting slides | Nexcelom | SD-100 | 20 µL chamber |
| CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| Desk Lamp | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimethyl sulfoxide | MilliporeSigma | 276855 | anhydous, >99.9% |
| Drug plate | Corning | 3680 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CV | DPBS, 1x without calcium amd magnesium |
| Ethanol | Koptec | 2000 | |
| F-12K Nutrient Mixture | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) with L-glutamine |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| Fluorescent calcium assay kit | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10x96 tests |
| G418 sulfate | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL |
| Hank's buffer | MilliporeSigma | 55037C | HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read |
| HEPES buffer | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 Molar |
| HTS data storage plateform | CDD vault | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Liquid handling system | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µL |
| Plate centrifuge | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| Plate reader | BMG technology | Clariostar | |
| Poly-D-lysine | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 agonist peptide | Genscript | custom order | QFSPWGamide |
| T-75 flask | Falcon | 353136 |
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