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Biochemistry

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64505
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, Texas A&M University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Summary

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Abstract

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) representam a maior superfamília de receptores e são os alvos de inúmeras drogas humanas. A triagem de alto rendimento (HTS) de bibliotecas aleatórias de pequenas moléculas contra GPCRs é usada pela indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos específicos do alvo. Neste estudo, um HTS foi empregado para identificar novos ligantes de moléculas pequenas de neuropeptídeos específicos de invertebrados GPCRs como sondas para estudos fisiológicos de vetores de patógenos humanos e veterinários mortais.

O receptor de cinina específico para invertebrados foi escolhido como alvo porque regula muitos processos fisiológicos importantes em invertebrados, incluindo diurese, alimentação e digestão. Além disso, a farmacologia de muitos GPCRs de invertebrados é mal caracterizada ou não é caracterizada; portanto, a farmacologia diferencial desses grupos de receptores em relação aos GPCRs relacionados em outros metazoários, especialmente humanos, acrescenta conhecimento às relações estrutura-atividade dos GPCRs como uma superfamília. Um ensaio HTS foi desenvolvido para células em placas de 384 poços para a descoberta de ligantes do receptor de cinina do carrapato da febre do gado, ou carrapato do gado do sul, Rhipicephalus microplus. O receptor de cinina do carrapato foi expresso de forma estável em células CHO-K1.

O receptor de cinina, quando ativado por neuropeptídeos endógenos de cinina ou outros agonistas de moléculas pequenas, desencadeia a liberação de Ca2+ das reservas de cálcio no citoplasma. Este ensaio de fluorescência de cálcio combinado com uma abordagem de "adição dupla" pode detectar moléculas de "impacto" de agonistas funcionais e antagonistas na mesma placa de ensaio. Cada ensaio foi conduzido usando placas de drogas carregando uma matriz de 320 pequenas moléculas aleatórias. Um fator Z confiável de 0,7 foi obtido, e três moléculas de ataque agonista e dois antagonistas foram identificados quando o HTS estava em uma concentração final de 2 μM. O ensaio de fluorescência de cálcio relatado aqui pode ser adaptado para rastrear outros GPCRs que ativam a cascata de sinalização Ca2 +.

Introduction

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que estão presentes desde a levedura até os seres humanos, representam a maior superfamília de receptores em muitos organismos1. Eles desempenham papéis críticos na regulação de quase todos os processos biológicos em animais. Existem 50-200 GPCRs no genoma dos artrópodes, o que significa que eles representam a maior superfamília de receptores de membrana2. Eles são classificados em seis classes principais, A-F, com base em sua similaridade de sequência e funções3. Os GPCRs transduziram vários sinais extracelulares, como os de hormônios, neuropeptídeos, aminas biogênicas, glutamato, prótons, lipoglicoproteínas e fótons4. Os GPCRs se acoplam às proteínas G heterotrímeras (Gα, Gβ e Gγ) para transmitir sinais a jusante. Os GPCRs acoplados às proteínas Gαs ou Gαi/o aumentam ou diminuem, respectivamente, os níveis intracelulares de 3', 5'-monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) ativando ou inibindo a adenilil ciclase. GPCRs acoplados a Gαq/11 induzem a liberação de cálcio dos estoques de cálcio do retículo endoplasmático ativando a via fosfolipase C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfato (IP3). GPCRs acoplados a Gα12/13 ativam fatores de troca de nucleotídeos RhoGTPase 5,6. Os GPCRs são alvo de mais de 50% dos medicamentos humanos e de um acaricida, o amitraz4. À medida que os GPCRs transduzem sinais tão diversos, eles são alvos promissores para o desenvolvimento de novos pesticidas que interrompem as funções fisiológicas específicas dos invertebrados.

O objetivo do HTS é identificar moléculas de sucesso que podem modular as funções do receptor. A HTS envolve o desenvolvimento de ensaios, miniaturização e automação7. Os GPCRs neuropeptídicos artrópodes estão envolvidos na maioria das funções fisiológicas, como desenvolvimento, muda e ecdise, excreção, mobilização de energia e reprodução4. A maioria dos GPCRs neuropeptídicos de artrópodes e metazoários sinaliza através da cascata de sinalização de cálcio 2,6,8,9,10, como nos receptores de peptídeo mioinibitório e SIFamida do carrapato Ixodes scapularis; seus ligantes são antagônicos nos ensaios de motilidade do intestino traseiro, com o SIF provocando contração e a PImáx inibindo-a11,12. Um receptor do mosquito da febre amarela, semelhante ao NPY, o Aedes aegypti, regula a busca de hospedeiros fêmeas13. Em comparação com outros ensaios alternativos de mobilização de cálcio, como o ensaio de bioluminescência de cálcio aequorina14, o ensaio de fluorescência de cálcio é fácil de executar, não requer a transfecção de outras proteínas recombinantes de detecção de cálcio e é econômico. O ensaio de fluorescência de cálcio produz um sinal prolongado em comparação com o sinal cinético rápido obtido no ensaio de bioluminescência de cálcio de aequorina14,15.

No exemplo aqui, o receptor de cinina do carrapato da febre bovina, Rhipicephalus microplus, foi expresso recombinantemente na linhagem celular CHO-K1 e usado para o ensaio de fluorescência de cálcio. Existe apenas um gene receptor de cinina encontrado em R. microplus; o receptor sinaliza através de uma via de sinalização dependente da proteína Gq e desencadeia o efluxo de Ca2+ das reservas de cálcio para o espaço intracelular16. Esse processo pode ser detectado e quantificado por um fluoróforo, que provoca um sinal de fluorescência ao se ligar a íons cálcio (Figura 1).

O receptor de cinina é um GPCR específico de invertebrados, que pertence aos receptores de classe A do tipo rodopsina. A cinina é um antigo neuropeptídeo sinalizador presente em Mollusca, Crustacea, Insecta e Acari 4,17,18. Os coleópteros (besouros) não possuem o sistema de sinalização de cinina; no mosquito Aedes aegypti, há apenas um receptor de cinina que se liga a três aedeskininas, enquanto a Drosophila melanogaster possui um receptor de cinina com drosocinina como ligante único 19,20,21. Não existem cininas homólogas ou receptores de cinina em vertebrados. Embora a função exata da cinina seja desconhecida em carrapatos, as fêmeas silenciadas pelo RNAi do receptor de cinina de R. microplus apresentam aptidão reprodutiva significativamente reduzida22. As cininas são peptídeos pleotrópicos em insetos. Em Drosophila melanogaster, estão envolvidos nos sistemas reguladores nervosos central e periférico 23, pré-ecdise24, alimentação 25, metabolismo 26 e padrões de atividade do sono26,27, bem como locomoção larval 28. As cininas regulam a contração do intestino traseiro, a diurese e a alimentação do mosquito A. aegypti 29,30,31. Os peptídeos de cinina possuem um pentapeptídeo C-terminal conservado Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, que é a sequência mínima necessária para a atividade biológica32. A especificidade dos artrópodes, o pequeno tamanho do ligante endógeno, que os torna passíveis de interferência de moléculas pequenas, e as funções pleiotrópicas em insetos tornam o receptor de cinina um alvo promissor para o controle de pragas4.

O ensaio de "dupla adição" (Figura 2) permite a identificação de agonistas ou antagonistas no mesmo ensaio de HTS15. É adaptado de um ensaio de "dupla adição" que é comumente usado na indústria farmacêutica para a descoberta de medicamentos33. Em resumo, a primeira adição de fármacos na placa celular permite a identificação de potenciais agonistas na biblioteca química quando um sinal de fluorescência mais alto é detectado em comparação com a aplicação do controle de solvente. Após 5 minutos de incubação com essas pequenas moléculas, um agonista conhecido (peptídeo cinina) é aplicado a todos os poços. Os poços que receberam aleatoriamente um antagonista da placa de droga exibem um sinal de fluorescência mais baixo após a adição de agonista em comparação com os poços de controle que receberam o solvente na primeira adição. Este ensaio permite então a identificação de potenciais agonistas e antagonistas com as mesmas células. Em um projeto HTS padrão, essas moléculas atingidas seriam validadas através de ensaios de dose-resposta e por ensaios adicionais de atividade biológica, que não são mostrados aqui.

Figure 1
Figura 1: Ilustração do mecanismo de ensaio de fluorescência de cálcio. A proteína Gq desencadeia a via de sinalização de cálcio intracelular. O receptor de cinina (receptor acoplado à proteína G) foi expresso recombinantemente em células CHO-K1. Quando o ligante agonista se liga ao receptor, a proteína Gq associada ao receptor de cinina ativa o PLC, que catalisa a conversão de uma molécula PIP2 em IP3 e DAG. O IP 3 então se liga ao IP3R na superfície do retículo endoplasmático, levando à liberação de Ca 2+ no citoplasma, onde os íons Ca2+ se ligam aos fluoróforos e provocam um sinal de fluorescência. O sinal de fluorescência pode ser obtido por excitação a 490 nm e detectado a 514 nm. Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado à proteína G; PLC = fosfolipase C; PIP2 = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato; IP3 = trisfosfato de inositol; DAG = diacilglicerol; IP3 R = receptor IP3. Criado com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: O fluxo de trabalho para a triagem de alto rendimento de pequenas moléculas em um receptor acoplado à proteína G expresso em células CHO-K1. (A) Células CHO-K1 recombinantes expressando de forma estável o receptor de cinina foram adicionadas à placa de 384 poços (10.000 células/poço) usando um sistema de manuseio de líquidos (25 μL/poço) e incubadas em uma incubadora de CO2 umidificada por 12-16 h. (B ) O tampão de ensaio contendo o corante fluorescente (25 μL/poço) foi adicionado à placa celular utilizando um sistema de manuseio de líquidos. A placa foi incubada por 30 min a 37 °C por 30 min e equilibrada em RT por mais 30 min. (C) O sinal de fluorescência de fundo das células em cada poço foi medido com um leitor de placas. (D) Soluções medicamentosas de uma placa de biblioteca de 384 poços e solvente em branco (todos a 0,5 μL/poço) foram adicionados à placa de ensaio celular usando um sistema de manuseio de líquidos. (E) As respostas celulares de fluorescência de cálcio foram medidas com o leitor de placas imediatamente após a adição das soluções medicamentosas; composto(s) que provocaram sinais de fluorescência acima da média foram escolhidos como a(s) agonista(s) atingida(s). Golpes antagonistas que bloqueiam o GPCR (ícone abaixo) foram revelados após a adição do agonista peptídico durante a etapa G. (F) Na mesma placa de ensaio, após 5 min de incubação das células com compostos de triagem, um peptídeo agonista endógeno Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) do receptor de cinina do carrapato foi adicionado a cada poço (1 μM). (G) As respostas de fluorescência celular após a adição do peptídeo agonista foram medidas pelo leitor de placas imediatamente. O(s) composto(s) inibidor(es) do sinal de fluorescência foram selecionados como antagonista(s) hit(s). Abreviaturas: GPCR = receptor acoplado à proteína G; RT = temperatura ambiente; RFU = unidades de fluorescência relativa. Criado com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

1. Manutenção celular

NOTA: UMA LINHAGEM CELULAR CHO-K1 que expressa de forma estável o receptor de cinina de R. microplus, denominada BMLK3, foi desenvolvida por Holmes et al.16. Os detalhes do desenvolvimento da linhagem celular são apresentados em outro lugar14. Todas as etapas a seguir são realizadas em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de classe II.

  1. Cultivar a linhagem celular recombinante em meio seletivo (meio F-12K contendo 10% de soro fetal bovino [FBS] e 800 μg/mL de sulfato G418) para garantir a expressão do receptor alvo. Armazenar as células expressando de forma estável o receptor em 1 mL de meio de congelamento (90% FBS e 10% de dimetilsulfóxido [DMSO]) em um criovial de 2 mL em um freezer de -80 °C.
    NOTA: Para armazenamento a longo prazo das células congeladas, armazene-as em nitrogênio líquido.
  2. Pré-aqueça todos os meios antes da cultura celular. Em um armário de biossegurança, transfira 13 mL de meio seletivo pré-aquecido (meio F-12K contendo 10% de FBS e 800 μg/mL de sulfato G418) para um frasco T-75 e mantenha-o no gabinete de biossegurança. Descongele um frasco para injetáveis das células BMLK 3 congeladas (~1,5 × 106 células) num banho-maria de 37 °C durante2-3 min. Transferir as células descongeladas para o balão T-75. Manter as células numa incubadora humidificada a 37 °C e 5% de CO2, salvo especificação em contrário.
  3. Quando as células atingirem 90% de confluência (1-2 dias), pré-aqueça todos os meios a 37 °C, exceto a solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco, que é mantida à temperatura ambiente. Num armário de biossegurança, retirar o meio gasto do balão T-75, lavar as células durante 5 s com 10 ml de DPBS rodopiando suavemente o balão e, em seguida, retirar o DPBS com uma pipeta serológica.
    NOTA: Uma imagem de células CHO-K1 com 90% de confluência é mostrada em Lu et al.14.
  4. Retirar as células do balão de T-75 adicionando 2 ml de tripsina-EDTA a 0,25% e incubar durante 3-5 min a 37 °C na incubadora. Em seguida, adicione 8 mL de meio seletivo e misture bem pipetando e liberando suavemente 2x-3x com a mesma pipeta sorológica.
  5. Transferir 2 ml da suspensão celular (~1 × 106 células) do passo 1.4 para um novo balão T-75 contendo 10 ml de meio seletivo quente. Cultive as células por 1-2 dias na incubadora até atingirem 90% de confluência.
  6. Use as células para o ensaio seguindo as próximas etapas ou repita as etapas 1.4-1.5 uma ou duas vezes antes de usar as células no ensaio.
    NOTA: Não exceda três a quatro passagens, pois o sinal de ensaio com certas linhas celulares pode se tornar mais fraco com outras passagens.

2. Ensaio de fluorescência de cálcio

  1. Revestir a placa celular.
    1. Use um sistema de manuseio de líquidos colocado dentro de um gabinete de biossegurança para todas as etapas de pipetagem nas placas de 384 poços. Crie programas personalizados para pipetagem nas placas de 384 poços31 (Tabela Suplementar S1). Revesti as placas estéreis de 384 poços com antecedência. Em um gabinete de biossegurança, carregar 10 μL/poço de uma solução aquosa de poli-D-lisina (PDL) a 0,05 mg/mL em cada placa e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
    2. Esvazie o prato invertendo-o rapidamente e apagando-o suavemente em toalhas de papel estéreis. Em seguida, lave cada poço com 10 μL de água, esvazie a placa e deixe a placa secar no armário de biossegurança durante a noite sem a tampa. Feche a placa com a tampa e guarde a 4 °C no frigorífico.
      NOTA: As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 6 meses.
  2. Dia 1
    1. Retire a placa do fármaco (100 μM em 90% DPBS + 10% DMSO, a concentração final no poço para HTS será de 2 μM) armazenada no congelador a -20 °C e coloque-a à temperatura ambiente.
      NOTA: Layout da placa de droga: Cada placa de 384 poços (24 colunas x 16 linhas) contém 320 poços com diferentes compostos de biblioteca e 64 poços com solvente em branco (DPBS contendo 10% de DMSO), que estão dispostos em quatro colunas, com duas colunas na borda de cada lado. Consulte Tabela Suplementar S2 para o layout da placa.
    2. Quando as células atingirem uma confluência de ~70%-90% no balão T-75, desprenda as células do frasco T-75, conforme descrito abaixo. Pré-aqueça todos os meios a 37 °C, com excepção do DPBS (temperatura ambiente).
      1. Remova o meio gasto, lave as células com 10 mL de DPBS e, em seguida, remova o DPBS. Descole as células do balão T-75 utilizando 2 ml de tripsina-EDTA a 0,25% durante 3-5 min a 37 °C na incubadora, adicione 8 ml de meio seletivo e transfira a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml para centrifugar a 1.000 × g durante 3 min.
      2. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio F-12K contendo 1% de FBS e 400 μg/mL de sulfato G418. Mantenha a suspensão no gabinete de biossegurança enquanto determina a contagem de células.
    3. Determinar a densidade celular da suspensão para posterior diluição: Misture 20 μL de suspensão celular em 20 μL de azul de tripano a 0,4% e, em seguida, carregue 20 μL da mistura numa câmara de contagem de células para ser lida por um contador de células para a densidade celular.
    4. Diluir a suspensão celular no mesmo meio (meio F-12K contendo 1% de FBS e 400 μg/mL de sulfato G418) até um volume final de pelo menos 15 mL a uma densidade de 4 × 105 células/mL.
    5. Semeia as células na placa de 384 poços revestida com PDL. Transfira 15 mL da suspensão celular acima (4 × 105 células/mL) para um reservatório de reagente auto-amigável de 150 mL. Dispensar 25 μL da suspensão celular (~10.000 células/poço) em cada poço dos 384 poços da placa usando um sistema de manuseio de líquidos em duas etapas. Carregue as pontas de baixa retenção de 384/12,5 μL na cabeça do manipulador de líquidos, aspirar 12,5 μL do reservatório (velocidade 5,2 μL/s) e dispensar em cada poço (velocidade: 3,1 μL/s).
    6. Repita a pipetagem como no passo anterior 2.2.5 para atingir 25 μL por poço. Em seguida, incubar a placa durante a noite (14-16 h) a 37 °C e 5% de CO2 na incubadora umidificada.
      NOTA: Como o volume máximo de pipetagem é de 12,5 μL para esta cabeça específica, a pipetagem para 25 μL é realizada em duas etapas.
  3. Dia 2
    1. Na manhã seguinte, verifique a placa celular coberta sob um microscópio; se não for confluente, espere até que as células atinjam 90% de confluência.
    2. Preparar uma solução-mãe de corante fluorescente: Ressuscite o corante fluorescente liofilizado em 100 μL de DMSO e evite a luz direta na solução-mãe. Envolva o tubo com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento.
      NOTA: O estoque pode ser alíquotado em alíquotas de 15 μL para cada ensaio de placa, a fim de evitar congelamento e descongelamento repetidos; as alíquotas podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 mês.
    3. No armário de biossegurança com as luzes apagadas, preparar o corante de carga (1x) em um tubo cônico de 15 mL envolto com folha de alumínio, combinando 15 μL da solução-mãe de corante fluorescente (a partir da etapa 2.3.2) e o restante dos componentes do kit pré-aquecido (37 °C): 13,5 mL de 1x HHBS (tampão de Hank com HEPES de 20 mM) e 1,5 mL de reagente B (inibidor de efluxo de corante).
      NOTA: A luz da sala está acesa durante esta etapa.
    4. Feche o tubo e misture bem invertendo suavemente o tubo várias vezes (normalmente 3-5x).
      NOTA: Manter à temperatura ambiente e utilizar a mistura de corante de carga no prazo de 30 minutos.
    5. Quando as células atingirem 90% de confluência, remova o meio gasto da placa de ensaio de 384 poços, invertendo rapidamente a placa e apagando suavemente em toalhas de papel estéreis; repita este movimento 2x-3x para remover todo o líquido da placa. Descarte as toalhas molhadas.
    6. Desligue a maioria das luzes diretas artificiais na sala (deixando uma lâmpada de mesa macia e fraca acesa ou semelhante para permitir condições de trabalho visíveis) e no armário de biossegurança para todas as etapas até o final do ensaio (aproximadamente por 1,5 h).
    7. Coloque 15 mL do corante de carga (1x) da etapa 2.3.3 em um reservatório auto-amigável de 150 mL.
      1. Transferir 25 μL do corante de carga (1x) do reservatório para cada poço usando um sistema de manuseio de líquidos com pontas de baixa retenção de 384/12,5 μL, dispensando 12,5 μL em cada poço da placa (velocidade de aspiração e dispensação: 3,8 μL/s).
    8. Repetir a etapa de pipetagem como indicado no ponto 2.3.7.1 para atingir um volume final de 25 μL em cada alvéolo da placa. Cubra e envolva a placa com papel alumínio para protegê-la da luz ambiente.
    9. Incubar a placa celular coberta a 37 °C na incubadora humidificada de CO2 durante 30 min, retirá-la da incubadora e equilibrá-la à temperatura ambiente no interior do leitor de placas ou no banco, mantendo a placa coberta e envolvida com papel alumínio durante mais 30 minutos. As células estão então prontas para a triagem de alto rendimento (HTS).
    10. Preparação química: Gire a placa do fármaco a partir da etapa 2.2.1 a 1.200 × g em uma centrífuga de placa por 1 min à temperatura ambiente.
      1. Preparar uma solução de peptídeo agonista 10x de Rhimi-K-1 (QFSPWGamida) (10 μM) ressuspendendo 100 nmoles de peptídeo liofilizado em 10 mL de 1x HHBS contendo 0,1% de DMSO e transferir a solução para um reservatório auto-amigável de 150 mL.
    11. Medir o sinal de fundo: Para todo o ensaio HTS no leitor de placas, em Protocolos, escolha o modo de fluorescência do ponto final.
      NOTA: O sinal fluorescente é lido a partir da parte inferior da placa em comprimentos de onda de excitação/emissão de 495 nm/525 nm.
      1. Insira a placa celular no leitor de placas. No painel de instrumentos, selecione ajustar ganho, selecionar um poço aleatório na placa, atribuí-lo como 5% a 10% do valor máximo mensurável de fluorescência e selecione ajustar (leitura) altura.
      2. Clique em iniciar medição para ler toda a placa para o sinal de fluorescência de fundo em unidades de fluorescência relativa (RFU).
    12. Ensaio de "adição dupla"
      1. Usando o sistema de manuseio de líquidos com pontas de 384/12,5 μL, para misturar a solução de droga em cada poço da placa de droga, pipetar 3x para cima e para baixo 10 μL da solução de droga (em DPBS contendo 10% de DMSO) (velocidade de pipetagem: 5,2 μL/s) e "aspirar" 1,5 μL de cada poço da placa de droga (velocidade de aspiração: 1,0 μL/s).
      2. "Dispensar" 0,5 μL dos compostos na placa de ensaio celular (velocidade de pipetagem: 1 μL/s) para atingir uma concentração final de 2 μM em DMSO a 0,2%.
      3. Coloque a placa de ensaio imediatamente no leitor de placas depois de adicionar os compostos de peneiramento. Leia a mesma placa nas direções de leitura para frente e para trás. Para obter essas leituras, defina um programa para ler do "poço 1-384" e imediatamente de "384-1".
        NOTA: A leitura em ambas as direções leva 2 minutos no total. Este projeto de leitura é para compensar a diminuição na intensidade do sinal que ocorre durante a leitura da placa em cada direção. Consulte a etapa 3.1 para obter as análises de leitura.
      4. Descarte o restante 1 μL de solução medicamentosa nas pontas imergindo as pontas em um reservatório de resíduos de 150 mL contendo ~50 mL de DPBS (velocidade de dispensação: 1,0 μL/s).
      5. Incubar os compostos de triagem com as células por um total de 5 min (inclui os 2 min de leitura da placa) à temperatura ambiente no gabinete de biossegurança com as luzes apagadas. Adicionar 3 μL do peptídeo agonista, Rhimi-K-1 (QFSPWGamida), do reservatório (velocidade de aspiração: 3,1 μL/s) para a placa de ensaio utilizando o sistema de manuseamento de líquidos (velocidade de distribuição: 3,1 μL/s) com pontas de 384/12,5 μL.
      6. Coloque a placa no leitor de placas imediatamente após a adição do peptídeo agonista. Leia a placa nas direções dianteira e inversa usando o mesmo programa da etapa 2.3.12.3

3. Análise dos dados

  1. Usando o software de análise associado ao leitor de placas instalado em um computador, calcule as respostas de fluorescência celular (em RFU) para ambas as leituras após a primeira adição do composto (Primeira leitura; RFUago [Tabela Suplementar S2]) e após as etapas de adição do agonista (Segunda leitura = formiga RFU [Tabela Suplementar S2]). Cada leitura é obtida pela média dos dois valores obtidos (não indicados) pelas leituras das chapas para a frente e para trás das etapas 2.3.12.3 e 2.3.12.6, respectivamente.
    NOTA: RFU atrás, RFUant referem-se às unidades de fluorescência relativa dos potenciais agonistas atingidos (leia na etapa 2.3.12.3) e os potenciais antagonistas atingidos (lidos na etapa 2.3.12.6), respectivamente.
  2. Exporte todos os três conjuntos de dados, RFU bg, RFU ago e RFUant, do software de análise em três planilhas separadas. Cada planilha terá apenas duas colunas: posição do poço e RFU bruta (arquivos não mostrados aqui).
    NOTA: RFU bg refere-se à RFU do plano de fundo lido na etapa 2.3.11.2.
  3. Formate os dados das três planilhas e organize os dados acima em um arquivo csv (consulte o exemplo na Tabela Suplementar S2). Subtraia o sinal de fundo lido da RFUago e daformiga RFU, respectivamente (colunas G e H na Tabela Suplementar S2).
  4. Importe o arquivo csv para uma "plataforma de dados HTS on-line" comercialmente disponível (consulte a Tabela de Materiais) para análise de dados a jusante (Tabela 1) e armazenamento.
  5. Calcular manualmente o fator Z' para o controle de qualidade de cada ensaio de placa usando a equação (1):
    equação (1):
    Equation 1(1)
    NOTA: μ c- e μc+ representam as RFUs médias das leituras dos mesmos poços, que servem como controles negativos na primeira adição após a adição do solvente (solvente em branco, n = 64; números em azul na Tabela Suplementar S2) e servem como controles positivos após a adição do agonista (solvente em branco + agonista, n = 64; números em magenta), respectivamente. Além disso, σ c- e σc+ representam seus desvios-padrão (DPs) correspondentes.
  6. Selecione manualmente as moléculas de impacto dos mapas de calor na "plataforma de dados HTS on-line" e calcule a ativação percentual normalizada (NPA) e a atividade inibitória (Io) para os acertos agonistas e antagonistas usando a equação (2) e a equação (3):
    Equation 2(2)
    Equation 3(3)

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Representative Results

Uma placa de fármaco interna (SAC2-34-6170) composta por 320 pequenas moléculas aleatórias foi utilizada para demonstrar este ensaio de HTS como exemplo. O HTS apresentou excelente qualidade do ensaio com fator Z' de 0,7 (Tabela 1). Esse fator Z' reflete a qualidade do ensaio independente dos compostos testados34. Um fator Z′ de 0,5 ou superior indica uma boa faixa dinâmica de sinal de ensaio entre as RFUs dos controles positivos e os controles negativos. Ensaios com um fator Z' menor que 0,5 têm uma faixa dinâmica de sinal abaixo do ideal, geralmente não são informativos para a seleção de acertos e, portanto, são descartados. A resposta (medida em unidades de fluorescência relativa, RFU) dos controles positivos (RFU média de 64 respostas positivas dos controles, μc+ = 130.139) foi, em média, 19 vezes maior do que a dos controles negativos (RFU média de 64 respostas negativas dos controles, μc- = 6.675). A fluorescência de corte para selecionar "acertos agonistas" aqui foi definida para uma razão máxima de ativação percentual normalizada (NPA) de >50%. A fluorescência de corte para a seleção de "antagonistas hits" foi definida para uma atividade inibitória observada (Io) de >50%. Foram selecionadas três moléculas de acometimento agonista e dois antagonistas: SACC-0090237 (NPA = 153%), SACC-0036982 (NPA = 118%) e SACC-0006532 (NPA = 152%) como agonistas, e SACC-0103392 (I o = 53%) e SACC-0041280 (I o = 56%) como antagonistas (os dados brutos são mostrados na Tabela Suplementar S2). Exemplos de cálculos de NPA e Io para agonistas (linhas verdes) e antagonistas (linhas laranjas), respectivamente, são mostrados na Tabela Suplementar S2.

Adição de compostos μs1 σs μc- σc- Valor Z'
(n = 320) (n = 320) (n = 64) (n = 64)
9,212 18,130 6,675 1,895 0.7
Adição de peptídeo agonista μs σs μc+ σc+ Equation 4
1,22,322 15,987 1,30,139 11,062

Tabela 1: Resumo das respostas celulares normalizadas de toda a placa no ensaio de HTS. A média (μ) e o desvio padrão (σ) são obtidos a partir da análise da abóbada CDD. Abreviaturas: HTS = triagem de alto rendimento; RFUs = unidades de fluorescência relativa; 1s (amostras) = 320 compostos ensaiados; μs = valor médio das respostas celulares (RFUs) de 320 poços; μc- = valor médio das RFUs de controles negativos; μc+ = valor médio das RFUs dos controlos positivos; σs = desvio padrão das respostas celulares (RFUs) de 320 poços; σc- = desvio padrão das RFUs em relação aos controles negativos; σc+ = desvio padrão das RFUs em relação aos controles positivos.

Tabela Suplementar S1: Programas personalizados do sistema de manuseio de líquidos para as etapas de pipetagem automática. Esta tabela foi modificada a partir de Xiong et al.31. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: Os dados brutos dos resultados representativos. As linhas destacadas em verde representam os agonistas atingidos, e as linhas destacadas em laranja representam os acertos antagonistas. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O objetivo do HTS é identificar moléculas atingidas através da triagem de um grande número de moléculas pequenas. Portanto, os resultados deste exemplo representam apenas uma pequena parte de um experimento HTS convencional. Além disso, as moléculas atingidas identificadas precisam ser validadas em ensaios a jusante, como um ensaio dose-dependente na mesma linhagem celular recombinante e em uma linhagem celular CHO-K1 carregando apenas o vetor vazio, que pode ser realizado simultaneamente para salvar pequenas moléculas. Os ensaios de citotoxicidade ajudarão a demonstrar que a falta de resposta na segunda adição não se deve à mortalidade celular. Outros bioensaios devem ser realizados para validar a atividade nos tecidos isolados in vitro, ou aplicando ou alimentando as pequenas moléculas em artrópodes vivos. O pipeline completo de identificação de ligantes de moléculas pequenas do receptor de cinina do carrapato pode ser encontrado em uma publicação anterior31. Através deste pipeline, um total de 36 acertos antagonistas do receptor de cinina do carrapato foram identificados. Três desses antagonistas foram testados em um ensaio de inibição de contração tecidual e mostraram atividade antimiotrópica no intestino posterior do mosquito, onde os receptores de cinina do mosquito ortólogo são expressos31.

Cada linhagem celular que expressa GPCR deve ser validada para condições experimentais adequadas antes que a HTS seja realizada. Essas condições incluem a densidade celular (10.000 células por poço), a concentração dos compostos rastreados (2 μM), a concentração final de DMSO (0,2%) no ensaio, a concentração do ligante agonista usado para a segunda adição (1 μM), a velocidade e profundidade de pipetagem e o tempo de leitura após a adição do peptídeo agonista (5 min). É fundamental ajustar a profundidade e a velocidade do sistema de manuseio de líquidos para garantir que as etapas de dosagem não perturbem as células se as células forem aderentes. A validação dessas condições antes de embarcar no HTS ajudará na solução de problemas se a qualidade do ensaio for ruim. É importante ter as células em condições ideais: as células devem atingir 90% a 100% de confluência, mas não ser superconfluentes na placa celular quando usadas para HTS. Se os sinais de fundo em certos poços forem anormalmente baixos ou altos, após a confirmação ao microscópio para obviamente baixa ou alta densidade celular, os valores atípicos devem ser removidos manualmente ao analisar os dados. Antes de adaptar o ensaio de fluorescência de cálcio à HTS, a curva cinética do peptídeo positivo deve ser conhecida, pois a resposta cinética das células ao peptídeo agonista deve durar 1-2 min para que ele seja adaptado em um ensaio HTS e dure o suficiente para ler toda a placa. Para alcançar o sinal prolongado, uma concentração relativamente alta do peptídeo agonista deve ser aplicada, ou uma densidade celular mais alta deve ser testada. Se a resposta cinética de certas células receptoras for muito curta (durar menos de 1 min), recomenda-se ler a uma velocidade mais rápida na leitura do ponto final ou usar apenas uma parte da placa para HTS. Certamente, a qualidade da linhagem celular recombinante em relação ao nível de expressão do receptor é crucial para o sucesso. Diferentes linhagens celulares clonais provavelmente variarão, já que a inserção do plasmídeo é aleatória no genoma, e isso certamente poderia influenciar a expressão do receptor. Seria ideal incorporar um teste precoce de fluorescência de cálcio do pool transfectado e durante o processo de seleção de linhagens celulares clonais.

A limitação do ensaio de fluorescência de cálcio é que ele mede a atividade dos mensageiros secundários em vez da ligação direta do ligante ao receptor. Embora seja possível excluir os acertos agonistas fora do alvo rastreando as moléculas atingidas nas células que não expressam o receptor alvo, é impossível excluir completamente as moléculas antagonistas fora do alvo usando este ensaio, porque é possível que algumas moléculas possam inibir as vias celulares de liberação de cálcio a jusante da sinalização GPCR. Portanto, é necessária uma validação adicional usando um ensaio de ligação de ligantes ou um bioensaio para validação no nível do organismo, como em um ensaio de tecido de carrapato com um agonista conhecido, como feito anteriormente com mosquitos31.

A maioria dos ensaios funcionais que detectam a ativação da GPCR mede principalmente eventos intracelulares em duas vias principais de sinalização: vias dependentes da proteína G e independentes da proteína G. Os ensaios dependentes da proteína G medem as concentrações de Ca2+, trifosfato de inositol (IP3) ou AMPc, enquanto os ensaios independentes da proteína G detectam principalmente o tráfico de receptores ou o recrutamento de β-arrestina7. Diferentes ensaios utilizam diferentes tecnologias para leituras, como corantes sensíveis ao Ca 2+ (ensaios de fluorescência), fotoproteínas como aequorinas (ensaios de bioluminescência Ca2+)14, proteínas de fluorescência marcadas, ensaios baseados em transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), ensaios baseados em transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) ou ensaios celulares baseados em biossensores ópticos sem rótulo. Esses ensaios e as tecnologias de leitura disponíveis correspondentes foram revisados em detalhes por Zhang e Xie35. Alguns ensaios são aplicáveis a quaisquer GPCRs, e alguns são específicos para certos GPCRs (por exemplo, o ensaio Ca2+ para receptores acoplados Gq, cAMP para receptores Gi/o- ou Gs- acoplados). No entanto, ao co-expressar promiscuamente certas proteínas G com o receptor nas células recombinantes, a via de sinalização pode ser alterada. Por exemplo, as proteínas Gq15/16 podem ser co-expressas com receptores não acoplados a Gq para detecção de sinalização PLC-IP3-Ca 2+ 7,36. Em contraste com os ensaios que medem um único evento molecular, existem ensaios de análise de alto conteúdo, que coletam uma enorme quantidade de dados biológicos para melhorar a especificidade do ligante37. Esse tipo de ensaio também é mais complexo e caro de realizar7.

Na pesquisa de invertebrados, os ensaios funcionais mais utilizados detectam a ativação do GPCR analisando as flutuações nas concentrações de segundos mensageiros, como Ca2+ ou cAMP. Devido às diferenças nas vias de sinalização entre mamíferos e invertebrados, a maioria das outras tecnologias de leitura acima mencionadas ainda não foi amplamente adotada para estudos de GPCR de invertebrados. No entanto, as proteínas G são relativamente conservadas em todo o reino animal. Recentemente, Lismont et al.38 demonstraram que alguns biossensores de proteína G à base de BRET humanos também podem ser adaptados para detectar a ativação de um inseto GPCR quando co-expressos nas células recombinantes receptoras. Ao co-expressar cada um dos diferentesbiossensores à base de proteína G (G s, G i/o, Gq/11 ou G12/13) com GPCRs específicos,o mecanismo de acoplamento da proteína G pode ser elucidado. No estudo de Lismont et al.38, o Schgr-CRF-DH pôde ativar dose-dependente os biossensores Gi/o e G q/11 e não ativou os biossensores Gs e G12/13.

No geral, o ensaio de fluorescência de cálcio realizado em uma placa de 384 poços em combinação com a abordagem de "dupla adição" descrita aqui permite a triagem de dezenas de milhares de moléculas em um tempo relativamente curto. Esta é uma abordagem relativamente eficiente em termos de tempo e custo para descobrir moléculas de impacto para validações e aplicações a jusante.

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Disclosures

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio USDA-NIFA-AFRI Saúde Animal e Bem-Estar (número do Prêmio 2022-67015-36336, PVP [Diretor do Projeto]) e de fundos competitivos do Programa de Concessão de Doenças Vetoriais de Insetos de Pesquisa da Texas A & M AgriLife Research (FY'22-23) para P.V.P. O grupo de professores da A.W.E.S.O.M.E. da Faculdade de Agricultura e Ciências da Vida, TAMU, é reconhecido por ajudar a editar o manuscrito. A Tabela Suplementar S2 contém dados de uma biblioteca interna, aleatória e de pequenas moléculas obtida do laboratório do Dr. James Sachettini na Texas A & M University e Texas A & M AgriLife Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco Invitrogen 15050-065 with phenol red
0.4% trypan blue MilliporeSigma T8154 liquid, sterile
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher AM12400 RNase-free Microfuge Tubes
5 mL serological pipette Corning 29443-045 Corning Costar Stripette individually wrapped 
10 mL serological pipette Corning 29443-047 Corning Costar Stripette individually wrapped 
15 mL conical tubes Falcon 352196 sterile
20 µL filter tips USA Scientifc Inc. P1121 sterile, barrier
25 mL serological pipette Corning 29443-049 Corning Costar Stripette individually wrapped 
50 mL conical tubes Corning 430828 graduated, sterile
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6317 sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1
150 mL auto-friendly reservior Integra Bioscience 6318 sterile, stacked, for loading dye in day 2
384/ 12.5 µL low retention tips Integra Bioscience 6405 long, sterile filter
384/ 12.5 µL tips Integra Bioscience 6404 long, sterile filter
384-well plate Greiner 781091 CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat
Aluminum plate seals Axygen Scientific PCR-AS-200 polyester-based
Aluminum foil wrap Walmart
Biosafty cabinet II NuAire NU-540-300
Cell counter Nexcelom AutoT4
cell counting slides Nexcelom SD-100 20 µL chamber
CO2 humidified incubator Thermo Fisher Forma Series II
Desk Lamp SunvaleeyTEK RS1000B
Dimethyl sulfoxide MilliporeSigma 276855 anhydous, >99.9%
Drug plate Corning 3680
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CV DPBS, 1x without calcium amd magnesium
Ethanol Koptec 2000
F-12K Nutrient Mixture  Corning 45000-354 (Kaighn's Mod.) with L-glutamine
Fetal bovine serum Equitech-Bio SFBU30
Fluorescent calcium assay kit ENZO Lifescience ENZ-51017 10x96 tests
G418 sulfate Gibco Invitrogen 10131-027 Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL
Hank's buffer MilliporeSigma 55037C HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read
HEPES buffer Gibco Invitrogen 15630-080 1 Molar
HTS data storage plateform CDD vault  https://www.collaborativedrug.com/
Liquid handling system Integra Bioscience Viaflo 384/12.5 µL
Plate centrifuge Thermo Fisher Sorvall ST8
Plate reader BMG technology Clariostar
Poly-D-lysine MilliporeSigma P6407
Rhimi-K-1 agonist peptide Genscript custom order QFSPWGamide
T-75 flask Falcon 353136

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References

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Bioquímica Edição 190
Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante
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