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Developmental Biology

स्वस्थ और रेटिना रोग-विशिष्ट मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64509
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1, 1,3, 1
1Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, 2Manipal Academy of Higher Education, 3Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एचआईपीएससी को आंख क्षेत्र समूहों में अलग करने और सरलीकृत संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके न्यूरो-रेटिना ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न करने की एक कुशल विधि का वर्णन करता है जिसमें अनुयायी और निलंबन संस्कृति प्रणाली दोनों शामिल हैं। अन्य ओकुलर सेल प्रकार, जैसे आरपीई और कॉर्नियल एपिथेलियम, रेटिना संस्कृतियों में परिपक्व आंख क्षेत्रों से भी अलग किए जा सकते हैं।

Abstract

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल जटिल ऊतक ऑर्गेनोइड उत्पन्न कर सकते हैं जो इन विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययन और पुनर्योजी उपचार विकसित करने के लिए उपयोगी हैं। यह प्रोटोकॉल एक हाइब्रिड कल्चर सिस्टम में रेटिना ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने की एक सरल, मजबूत और चरणबद्ध विधि का वर्णन करता है, जिसमें रेटिना भेदभाव के पहले 4 हफ्तों के दौरान अलग, स्व-संगठित नेत्र क्षेत्र प्राइमर्डियल क्लस्टर (ईएफपी) के उद्भव तक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृतियां शामिल हैं। इसके अलावा, प्रत्येक ईएफपी के भीतर डोनट के आकार के, गोलाकार और पारभासी न्यूरो-रेटिना द्वीपों को मैन्युअल रूप से चुना जाता है और मल्टीलेयर 3 डी ऑप्टिक कप (ओसी -1 एम) उत्पन्न करने के लिए 1-2 सप्ताह के लिए रेटिना भेदभाव माध्यम में गैर-अनुयायी संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करके निलंबन के तहत सुसंस्कृत किया जाता है। इन अपरिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स में पैक्स 6 + और सीएचएक्स 10 + प्रसार, मल्टीपोटेंट रेटिना अग्रदूत होते हैं। अग्रदूत कोशिकाएं ऑर्गेनोइड्स के भीतर रैखिक रूप से स्व-इकट्ठी होती हैं और अलग-अलग रेडियल स्ट्राइक के रूप में दिखाई देती हैं। निलंबन संस्कृति के 4 सप्ताह बाद, रेटिना पूर्वजों को परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ओसी -2 एम) बनाने के लिए पोस्ट-माइटोटिक गिरफ्तारी और वंश भेदभाव से गुजरना पड़ता है। फोटोरिसेप्टर वंश प्रतिबद्ध अग्रदूत रेटिना ऑर्गेनोइड्स की सबसे बाहरी परतों के भीतर विकसित होते हैं। ये सीआरएक्स + और आरसीवीआरएन + फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं आंतरिक खंड जैसे एक्सटेंशन प्रदर्शित करने के लिए रूपात्मक रूप से परिपक्व होती हैं। इस विधि को मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न करने के लिए अपनाया जा सकता है। प्रतिकृति सुनिश्चित करने और बुनियादी विज्ञान और अनुवाद अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए सभी चरणों और प्रक्रियाओं को स्पष्ट रूप से समझाया और प्रदर्शित किया गया है।

Introduction

रेटिना कशेरुक आंख के पीछे मौजूद एक प्रकाश-संवेदनशील ऊतक है जो प्रकाश संकेतों को एक जैव रासायनिक घटना द्वारा तंत्रिका आवेगों में परिवर्तित करता है जिसे फोटो-ट्रांसडक्शन मार्ग के रूप में जाना जाता है। रेटिना की फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में उत्पन्न प्रारंभिक तंत्रिका आवेग अन्य रेटिना इंटरन्यूरॉन और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) में स्थानांतरित हो जाते हैं और मस्तिष्क के दृश्य कॉर्टेक्स तक पहुंचते हैं, जो छवि धारणा और दृश्य प्रतिक्रिया में मदद करता है।

विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, अनुमानित 1.5 मिलियन बच्चे अंधे हैं, जिनमें से 1 मिलियन एशिया में हैं। वंशानुगत रेटिना डिस्ट्रॉफी (आईआरडी) एक प्रमुख अंधा बीमारी है जो दुनिया भर में 4,000 व्यक्तियों में से 1 को प्रभावित करती है 1,2,3, जबकि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) से जुड़े अंधेपन की व्यापकताविकासशील देशों में 0.6% -1.1% तक होती है। आईआरडी रेटिना विकास और कार्य5 में शामिल 300 से अधिक विभिन्न जीनों में विरासत में मिले आनुवंशिक दोषों के कारण होते हैं। इस तरह के आनुवंशिक परिवर्तनों के परिणामस्वरूप सामान्य रेटिना कार्यों में व्यवधान होता है और रेटिना कोशिकाओं का क्रमिक अध: पतन होता है, अर्थात् फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई), इस प्रकार गंभीर दृष्टि हानि और अंधापन होता है। कॉर्निया, लेंस आदि से जुड़ी अन्य अंधा स्थितियों में भारी प्रगति हुई है। हालांकि, रेटिना डिस्ट्रोफी और ऑप्टिक तंत्रिका एट्राफियों में आज तक कोई सिद्ध चिकित्सा नहीं है। चूंकि एक वयस्क मानव रेटिना में स्टेम सेल6 नहीं होते हैं, इसलिए भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) जैसे वैकल्पिक स्रोत वांछित सेल प्रकारों की असीमित आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं और इन विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययनों के लिए आवश्यक जटिल ऊतक ऑर्गेनोइड्स विकसित करने और पुनर्योजी उपचार विकसित करने के लिए एक महान वादा रखते हैं। 8,9,10.

रेटिना अनुसंधान के कई वर्षों ने आणविक घटनाओं की बेहतर समझ पैदा की है जो प्रारंभिक रेटिना विकास को व्यवस्थित करते हैं। पीएससी से रेटिना कोशिकाओं और 3 डी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन विकास ता्मक घटनाओं को विट्रो में पुन: उत्पन्न करना है, विकास कारकों और छोटे अणुओं के जटिल कॉकटेल में कोशिकाओं को विकसित करके ज्ञात जैविक प्रक्रियाओं को चरणबद्ध तरीके से संशोधित करना है। इस प्रकार उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स में प्रमुख रेटिना कोशिकाएं शामिल हैं: रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी), इंटरन्यूरॉन, फोटोरिसेप्टर, और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) 11,12,13,14,15,16,17,18,19।. रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके आईआरडी मॉडलिंग के सफल प्रयासों के बावजूद, भेदभाव के दौरान विकास कारकों और छोटे अणुओं के जटिल कॉकटेल की आवश्यकता और रेटिना ऑर्गेनॉइड पीढ़ी की अपेक्षाकृत कम दक्षता अधिकांश प्रोटोकॉल के साथ एक बड़ी चुनौती है। इनमें प्रमुख रूप से भ्रूण निकायों का गठन शामिल है, इसके बाद इन विट्रो विकास20,21,22 के विभिन्न चरणों में जटिल संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके रेटिना वंशावली में उनके चरणबद्ध भेदभाव शामिल हैं।

यहां, स्वस्थ नियंत्रण और रेटिना रोग-विशिष्ट एचपीएससी से जटिल 3 डी न्यूरो-रेटिना ऑर्गेनोइड्स विकसित करने की एक सरलीकृत और मजबूत विधि बताई गई है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल भ्रूण शरीर के गठन की आवश्यकता के बिना निकट-कॉन्फ्लुएंट एचआईपीएस संस्कृतियों के प्रत्यक्ष भेदभाव का उपयोग करता है। इसके अलावा, संस्कृति माध्यम की जटिलता को सरल बनाया गया है, जिससे यह एक लागत प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक बन जाती है जिसे नए शोधकर्ताओं द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है। इसमें एक संकर संस्कृति प्रणाली शामिल है जिसमें रेटिना भेदभाव के पहले 4 हफ्तों के दौरान अलग-अलग, स्व-संगठित नेत्र क्षेत्र आदिम समूहों (ईएफपी) के उद्भव तक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृतियां शामिल हैं। इसके अलावा, प्रत्येक ईएफपी के भीतर गोलाकार न्यूरो-रेटिना द्वीपों को मैन्युअल रूप से चुना जाता है और 1-2 सप्ताह के लिए निलंबन संस्कृतियों में उगाया जाता है ताकि पैक्स 6 + और सीएचएक्स 10 + प्रसार न्यूरो-रेटिना अग्रदूतों से युक्त बहुस्तरीय 3 डी रेटिना कप या ऑर्गेनोइड तैयार किए जा सकें। आगे 4 सप्ताह के लिए 100 μM टॉरिन युक्त माध्यम में रेटिना ऑर्गेनोइड्स की विस्तारित संस्कृति के परिणामस्वरूप RCVRN + और CRX + फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और अल्पविकसित आंतरिक खंड जैसे विस्तार के साथ परिपक्व कोशिकाओं का उद्भव हुआ।

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Protocol

मानक प्रयोगशाला प्रथाओं, नैतिक और जैव सुरक्षा दिशानिर्देशों के पालन में और संस्थागत नैतिकता समिति (आईईसी), स्टेम सेल अनुसंधान के लिए संस्थागत समिति (आईसी-एससीआर), और संस्थागत जैव-सुरक्षा समिति (आईबीएससी) जैसे नियामक निकायों के अनुमोदन के साथ एचआईपीएससी से जुड़े सभी प्रयोग ों को रोकनेवाला रूप से किया गया था।

1. आईपीएससी संस्कृति और रेटिना भेदभाव माध्यम और अभिकर्मकों की तैयारी

  1. आईपीएससी संस्कृति और रखरखाव माध्यम
    1. फीडर-मुक्त कल्चर स्थितियों के तहत आवश्यक 8 माध्यम में मैट्रिगेल-लेपित (बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स लेपित; सामग्री की तालिका देखें) कल्चर प्लेटों में सामान्य HIPSC लाइन23 (HIPSC-F2-3F1) और CRISPR संपादित, RB1-/- HIPSC लाइन (LVIP15-RB1-CS3, मानव RB1 जीन के एक्सॉन 18 के भीतर 10 bp के फ्रेमशिफ्ट विलोपन के साथ) को बनाए रखें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल को पुनः संयोजक विट्रोनेक्टिन (वीटीएन-एन) कोटिंग के साथ तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बदलकर पूरी तरह से क्सीन-मुक्त बनाया जा सकता है। 50x आवश्यक 8 पूरक (आवश्यक 8 मध्यम किट के साथ आपूर्ति; सामग्री की तालिका देखें) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान जोड़कर पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, HIPSC को पूर्ण mTeSR1 माध्यम का उपयोग करके भी सुसंस्कृत किया जा सकता है।
  2. सेल पृथक्करण समाधान (1x CDS)
    1. मानव आईपीएससी के एंजाइम-मुक्त पृथक्करण और पासिंग के लिए, 1x डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) में 0.5 एमएम ईडीटीए, पीएच 8.0 और 30 एमएम एनएसीएल युक्त सीडीएस तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. 1x CDS के 100 mL तैयार करने के लिए, 1x DPBS के 99 mL में 0.5M EDTA के 100 μL और 3 M NaCl स्टॉक समाधानों के 1 mL जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं, और 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके निष्फल फ़िल्टर करें।
  3. विभेदन प्रेरण माध्यम (डीआईएम)
    1. डीएमईएम-एफ 12 बेसल माध्यम का उपयोग करके डीआईएम तैयार करें जो 10% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (केओएसआर), 1 एक्स गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 2 एमएम ग्लूटामैक्स, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 μM L-एस्कॉर्बिक एसिड, और 1% N2 पूरक ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक है।
  4. रेटिना भेदभाव माध्यम (RDM)
    1. डीएमईएम-एफ 12 बेसल माध्यम का उपयोग करके आरडीएम तैयार करें जो 10% नॉकआउट सीरम (केओएसआर), 1 एक्स गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 2 एमएम ग्लूटामैक्स, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 200 μM L-एस्कॉर्बिक एसिड, और 2% B27 पूरक (विटामिन ए के साथ) के साथ पूरक है ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. बाह्य मैट्रिक्स-लेपित सेल कल्चर सतह।
    1. एचईएससी-योग्य तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बर्फ की बाल्टी में रात भर पिघलाएं, अधिमानतः 4-8 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज के अंदर। पिघले हुए 100x मैट्रिक्स स्टॉक (5 एमएल) को 1: 5 के अनुपात में 20 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा डीएमईएम-एफ 12 बेसल माध्यम जोड़कर पतला करें और 20x स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए कोमल चक्करदार द्वारा मिलाएं।
      1. प्री-चिल्ड पिपेट टिप्स और बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग करके बर्फ पर 0.5 एमएल एलिकोट तैयार करें। शीशियों को 20x स्टॉक के रूप में लेबल करें और उन्हें 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए स्टोर करें।
    2. सेल कल्चर सतहों (कल्चर डिश या 6-वेल प्लेट्स) को कोटिंग करने के लिए, बर्फ पर 20x मैट्रिक्स के एलिकोट को पिघलाएं और इसे 1: 20 के अनुपात में 1: 20 के अनुपात में पतला करें, बर्फ-ठंडे डीएमईएम-एफ 12 बेसल माध्यम का उपयोग करके 10 एमएल 1एक्स मैट्रिक्स कोटिंग समाधान तैयार करें, जो 100 मिमी डिश या 6-वेल प्लेट (1.5 एमएल / वेल) को कोट करने के लिए पर्याप्त है।
      नोट: मैट्रिक्स समाधान को संभालने से पहले बर्फ-ठंडा और बाँझ डीपीबीएस को मिलाकर पिपेट / माइक्रोटिप्स को प्रीचिल करें। कमरे के तापमान पर पोलीमराइजेशन और जेलिंग से बचने के लिए प्री-चिल्ड पिपेट / माइक्रोटिप्स का उपयोग करके मैट्रिक्स को पिघलाना और सभी हैंडलिंग बर्फ पर किया जाना चाहिए।
    3. 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1.5 मिलीलीटर 1x मैट्रिक्स कोटिंग समाधान जोड़ें, कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से घुमाएं, और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। संस्कृति सतहों पर मैट्रिक्स की समान कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए प्लेटों को कम से कम 1 घंटे के लिए अबाधित छोड़ दें।
    4. कोशिकाओं को बोने से पहले, 5 एमएल बाँझ पिपेट का उपयोग करके कोटिंग समाधान को बाहर निकालें और तरल अपशिष्ट को फेंक दें। तुरंत ताजा कल्चर माध्यम जोड़ें (6-वेल प्लेट का 2 एमएल / वेल) और कोशिकाओं को 150,000-200,000 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर बीज दें। हैंडलिंग के दौरान प्लेटों को सूखने न दें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, 0.5 μg / mL की अंतिम एकाग्रता पर पुनः संयोजक विट्रोनेक्टिन (VTN-N) कोटिंग का उपयोग क्सीन-मुक्त संस्कृति प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है।

2. मानव आईपीएससी संस्कृतियों की स्थापना

  1. HIPSC का पिघलना और पुनरुद्धार
    1. 1x झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के साथ 6-वेल प्लेट के एक कुएं को कोट करें। संस्कृति की सतह के पोलीमराइजेशन और समान कोटिंग की अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. 1 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, कोटिंग समाधान को हटा दें और कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने से पहले 1 एमएल पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम जोड़ें, जिसमें 10 μM Rho-kinese अवरोधक, Y-27632 (1 μL / mL 10 mM स्टॉक; सामग्री की तालिका देखें) शामिल हैं।
    3. तरल नाइट्रोजन कंटेनर से एक HIPSC क्रायोवियल स्टॉक (1 x 106 सेल / शीशी) निकालें। जल्दी से क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोमल चक्करदार घुमावके साथ पिघलाएं।
      नोट: शीशी को पूरी तरह से पिघलाएं नहीं; मार्ग संख्या को नोट करें, शीशी को सतह पर बाँझ करें, और 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल युक्त लिंट-फ्री स्वैब का उपयोग करके इसे सूखा दें।
    4. एक बाँझ 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके, क्रायोवियल सामग्री को एक ताजा 15 एमएल ट्यूब में एस्पिरेट करें, जिसमें वाई -27632 के बिना 2 एमएल प्रीवार्म्ड पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम शामिल हैं। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए ट्यूब को 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    5. सेल गोली को 10 μM Y-27632 युक्त पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम के 1.0 मिलीलीटर में पुन: निलंबित करें।
    6. इस सेल निलंबन को मैट्रिक्स को परेशान किए बिना मैट्रिक्स-लेपित सतहों पर जोड़ें, इसे दीवारों के साथ वितरित करके। कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए प्लेट को धीरे से क्रॉसवाइज हिलाएं।
    7. 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं का पालन हो सके और प्रसार शुरू हो सके।
    8. 12-24 घंटे के बाद, खर्च किए गए माध्यम को प्रतिस्थापित करें और वाई -27632 के बिना पूर्व-गर्म पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम में संस्कृतियों को बनाए रखें।
    9. हर 24 घंटे में संस्कृति माध्यम बदलें और संस्कृतियों को 70% -80% संगम तक पहुंचने के बाद पारित करें।
      नोट: 1: 6 का एक विभाजित अनुपात नियमित रूप से HIPSC संस्कृतियों के लिए पालन किया जाता है और 3-4 दिनों के नियमित अंतराल पर पारित किया जाता है।
  2. रेटिना वंश भेदभाव शुरू करने के लिए HIPSC की पासिंग और प्लेटिंग
    1. 6-वेल प्लेटों में 70% -80% मानव आईपीएससी संस्कृतियों से खर्च किए गए माध्यम को अलग करें।
    2. प्रत्येक कुएं में 1 एमएल सीडीएस (चरण 1.2) जोड़ें और कोशिकाओं के गोल होने तक 5-7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सीडीएस को सावधानीपूर्वक हटा दें, ध्यान रखें कि कोशिकाओं को अलग न करें, और 2 मिलीलीटर ताजा आवश्यक 8 मध्यम जोड़ें और धीरे से एक पिपेट का उपयोग करके ट्राइट्यूरेट करें।
    3. सेल सस्पेंशन को 6-सेल प्लेट के एक कुएं से 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और ट्यूब को कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए 1,000 एक्स जी पर स्पिन करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    4. सेल गोली को आवश्यक 8 माध्यम के 1.2 एमएल में पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन (1: 6 विभाजित अनुपात) के सेल 200μएल के सेल 200μL को मैट्रिक्स-लेपित 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में वितरित करें, जिसमें 10 μM Y-27632 युक्त 1.5 मिलीलीटर आईपीएससी कल्चर माध्यम होता है, जैसा कि चरण 1.5 में वर्णित है।
    5. 12-24 घंटे के बाद, खर्च किए गए माध्यम को प्रतिस्थापित करें और वाई -27632 के बिना पूर्व-गर्म पूर्ण आवश्यक 8 माध्यम में संस्कृतियों को बनाए रखें।
    6. संस्कृति माध्यम को हर 24 घंटे में बदलें जब तक कि संस्कृतियां 70% -80% संगम तक न पहुंच जाएं।

3. आंखों के क्षेत्रों और रेटिना वंश में HIPSC का भेदभाव

नोट: भेदभाव प्रक्रिया की एक योजनाबद्ध रूपरेखा चित्रा 1 में दिखाया गया है।

  1. एक बार जब HIPSC संस्कृतियां 70% -80% संगम तक पहुंच जाती हैं तो भेदभाव प्रक्रिया शुरू करें।
  2. दिन 0 पर, HIPSC रखरखाव माध्यम को DIM (चरण 1.3) में बदलें जिसमें 1 ng / mL bFGF और 1 ng / mL Noggin शामिल हैं। 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2.0 एमएल मध्यम जोड़ें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    नोट: बीएफजीएफ की क्रमिक वापसी पीएससी के भेदभाव को प्रेरित करती है, और प्रारंभिक चरणों के दौरान नोगिन (कई बीएमपी के अवरोधक) की बढ़ती सांद्रता को जोड़ने से एक्टोडर्मल वंश भेदभाव और तंत्रिकाकरण11,12 प्रेरित होता है और मेसोडर्म और एंडोडर्म प्रतिबद्धता को अवरुद्ध करता है। वैकल्पिक रूप से, Noggin को LDN193189 द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। पहले रिपोर्ट की गई दोहरी एसएमएडी निषेध रणनीति के विपरीत20,21, इस प्रोटोकॉल को एक्टिविन या एसबी -431542 को जोड़ने की आवश्यकता नहीं है।
  3. पहले दिन, खर्च किए गए माध्यम को बदलें और डीआईएम जोड़ें जिसमें 1 ng/mL bFGF और 10 ng/mL Noggin शामिल हों। 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2.0 एमएल जोड़ें। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट और बनाए रखें।
  4. दिन 2-3 पर, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और केवल 10 एनजी / एमएल नोगिन युक्त डीआईएम जोड़ें। 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2.0 एमएल जोड़ें और हर 24 घंटे में माध्यम बदलें। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट और बनाए रखें।
    नोट: उपयोग से पहले हमेशा संस्कृति माध्यम को 30-37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें। प्रारंभिक भेदभाव संस्कृतियों में अतिरिक्त फ्लोटर्स और मृत कोशिकाएं देखी जा सकती हैं। ऐसी परिस्थितियों में, संस्कृतियों को एक बार 1x DPBS से धोएं और रेटिना भेदभाव माध्यम जोड़ें। खर्च किए गए माध्यम पर बाँझपन परीक्षण साप्ताहिक या आवश्यकतानुसार किया जा सकता है।
  5. दिन 4 पर, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और आरडीएम (चरण 1.4) जोड़ें। 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2.0 एमएल जोड़ें और हर दिन एक ताजा माध्यम परिवर्तन के साथ 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर आरडीएम में संस्कृतियों को बनाए रखना जारी रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, PSCs को 1-3 दिन से, गैर-अनुगामी और गोल-तल वाली 96-वेल प्लेटों में, 5 x 103 कोशिकाओं / 100 μL / अच्छी तरह से सेल घनत्व पर निलंबन संस्कृतियों के रूप में विकसित किया जा सकता है ताकि डीआईएम में समान संस्कृति स्थितियों के तहत भ्रूण निकाय (EBs) बनाया जा सके। दिन 4 पर अच्छी तरह से गठित EB को RDM युक्त मैट्रिक्स-लेपित प्लेटों पर चढ़ाया जा सकता है और इसका पालन करने की अनुमति दी जाती है। प्रसार, और अंतर जैसा कि नीचे वर्णित है।
  6. लगभग 14-18 वें दिन, प्रारंभिक नेत्र क्षेत्र पूर्वजों से युक्त तंत्रिका रोसेट जैसे डोमेन के उद्भव के लिए 10x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें (चित्रा 2 बी)।
  7. लगभग 21-28 (3-4 सप्ताह) के आसपास, स्व-संगठित, विशिष्ट ईएफपी के उद्भव का निरीक्षण करने के लिए 4x और 10x आवर्धन पर एक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें, जिसमें परिपत्र 3 डी न्यूरो-रेटिना संरचनाओं का एक केंद्रीय द्वीप है जो न्यूरो एपिथेलियम और ओकुलर सतह उपकला (चित्रा 2 सी, डी) के सन्निहित आउटग्रोथ से घिरा हुआ है।
    नोट: एक सामान्य HIPSC रेटिना भेदभाव संस्कृति के 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में लगभग 20-30 EFP देखे जा सकते हैं। यह संख्या अन्य रोग-विशिष्ट एचआईपीएस लाइनों के साथ भिन्न हो सकती है, उनकी आनुवंशिक पृष्ठभूमि और रेटिना वंश भेदभाव क्षमता के आधार पर।

4. रेटिना ऑर्गेनोइड्स की कटाई

  1. रेटिना कप के मैनुअल चयन के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट की लौ खींचना।
    नोट: आंख क्षेत्र चुनने के लिए आटोक्लेव और बाँझ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
    1. बनसेन बर्नर चालू करें। एक बाँझ पाश्चर पिपेट लें और एक हाथ में आधार और दूसरे में केशिका टिप पकड़ें। आंच केशिका की नोक के बीच के क्षेत्र को निष्फल और गर्म करती है, घूर्णी आंदोलनों के साथ जब तक कि कांच व्यवहार्य न हो जाए। फिर लौ से दूर जाएं और एक बंद लुमेन के साथ एक महीन केशिका टिप बनाने के लिए तेजी से बाहर की ओर खींचें।
    2. महीन नोक को लौ के सामने क्षैतिज रूप से पकड़ें और एक चिकनी हुक या एल-आकार की केशिका नोक बनाने के लिए इसे बाहरी गति में लौ के माध्यम से जल्दी से पारित करें।
    3. ईएफपी क्लस्टर से बरकरार न्यूरो-रेटिना कप को धीरे से उठाने और अलग करने के लिए केशिका हुक के चिकनी बाहरी वक्रता क्षेत्र का उपयोग एक ठीक स्कूप के रूप में करें।
      नोट: ग्लास केशिका हुक का चिकनी कोण न तो कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाता है और न ही संस्कृति सतहों पर खरोंच बनाता है। इस सरल उपकरण का उपयोग ग्रिड पैटर्न में व्यक्तिगत एचआईपीएस कॉलोनी विभाजन के लिए और क्लोनल विस्तार के दौरान उन्हें छोटे सेल क्लस्टर के रूप में पारित करने के लिए भी प्रभावी ढंग से किया जा सकता है।
  2. 3 डी रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए रेटिना कप की संस्कृति और रखरखाव।
    1. 25-30 वें दिन, न्यूरो-रेटिना कप की फसल की तैयारी से पहले कम-लगाव वाले 60 मिमी डिश में 4.0 मिलीलीटर प्रीवार्मरेटिना भेदभाव माध्यम जोड़ें।
    2. अलग-अलग ईएफपी से अच्छी तरह से गठित न्यूरो-रेटिना कप का निरीक्षण करने और मैन्युअल रूप से चुनने के लिए 0.63x-4.5x आवर्धन पर स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत काम करें।
      नोट: पिगमेंटेड आरपीई सेल आउटग्रोथ की उपस्थिति ईएफपी और केंद्रीय रूप से रखे गए न्यूरो-रेटिना कप की आसान पहचान में मदद करती है। रेटिना कप डोनट के आकार के, गोलाकार और पारभासी 3 डी संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं, जिसमें स्पष्ट रेडियल स्ट्राइक होते हैं, जो रैखिक रूप से व्यवस्थित और स्व-इकट्ठे रेटिना स्टेम कोशिकाओं द्वारा गठित होते हैं, जो सीएनएस न्यूरॉन्स या तंत्रिका शिखा कोशिकाओं23 द्वारा गठित कसकर पैक और गोलाकार या अनियमित समूहों के विपरीत होते हैं।
    3. अलग-अलग ईएफपी के भीतर केंद्रीय न्यूरो-रेटिना द्वीप को धीरे से घुमाने और बाहर निकालने के लिए लौ-खींचे गए चरागाह पिपेट हुक का उपयोग करें।
    4. 100 μL को एस्पिरेट करने के लिए 1 एमएल माइक्रोपिपेट सेट करें और चरण 4.2.1 में तैयार किए गए ताजा, कम-अनुयायी संस्कृति व्यंजनों में फ्लोटिंग रेटिना कप को एस्पिरेट और स्थानांतरित करने के लिए चौड़े बोर ओपनिंग के साथ 1 एमएल माइक्रोटिप्स का उपयोग करें।
      नोट: छोटे बोर आकार और उच्च सक्शन दबाव के साथ युक्तियों का उपयोग करने से कतरन हो सकता है और रेटिना कप की अखंडता प्रभावित हो सकती है। रेटिना कप के अनुमानित आयाम व्यास में लगभग 1-2 मिमी हैं।
    5. आरडीएम में रेटिना कप को गैर-अनुयायी निलंबन संस्कृतियों के रूप में बनाए रखें और उन्हें 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    6. दिन 30-45: पकवान को धीरे से झुकाकर और रेटिना कप को लगभग 30 सेकंड तक व्यवस्थित करने की अनुमति देकर दैनिक रूप से माध्यम बदलें। आंशिक भोजन विधि का पालन करें, खर्च किए गए माध्यम की आधी मात्रा को हटा दें और ताजा माध्यम की समान मात्रा के साथ प्रतिस्थापित करें।
      नोट: रेटिना कप को किसी भी नुकसान को रोकने के लिए बार-बार आकांक्षा और स्थानांतरण से बचें। निलंबन संस्कृति के 1-2 सप्ताह के बाद, रेटिना कप आकार (1-3 मिमी) में थोड़ा बढ़ जाते हैं और स्व-संगठित 3 डी रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ओसी -1 एम) में विकसित होते हैं जिसमें पैक्स 6 और सीएचएक्स 10 (चित्रा 3 बी) को व्यक्त करने वाले रैखिक रूप से व्यवस्थित, प्रारंभिक न्यूरो-रेटिना पूर्वज शामिल होते हैं।
    7. दिन 45-60: न्यूरो-रेटिना पूर्वजों के बेहतर अस्तित्व और वंश भेदभाव और परिपक्व रेटिना सेल प्रकार (ओसी -2 एम) के विकास का समर्थन करने के लिए 100 μM टॉरिन ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त RDM में 4 सप्ताह के लिए रेटिना ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करें।
      नोट: ईएफपी से उठाए गए रेटिना या ऑप्टिक कप का लगभग 70% -80% बरकरार रहता है, उनके लैमिनेशन को बनाए रखता है, और निलंबन संस्कृति (ओसी -2 एम) के 4 सप्ताह के बाद परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड ्स में विकसित होता है।
    8. जांच ें कि निलंबन संस्कृति के 4 सप्ताह में परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स आरसीवीआरएन + और सीआरएक्स + फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और परिपक्व कोशिकाओं के उद्भव को सबसे बाहरी सेल परतों में अल्पविकसित आंतरिक खंड जैसे विस्तार के साथ दिखाते हैं, इस प्रकार विट्रो में सामान्य रेटिना विकास और परिपक्वता प्रक्रिया को पुन: उत्पन्न करते हैं (चित्रा 3बीआई)।
      नोट: न्यूरो-रेटिना कप को हटाने के बाद, भेदभाव संस्कृतियों को लगातार आरडीएम में बनाए रखा जा सकता है। न्यूरो-रेटिना के आसपास के समीपस्थ उपकला अतिवृद्धि में रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल (आरपीई) सेल अग्रदूत होते हैं, जो विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान के साथ पिगमेंटेड आरपीई मोनोलेयर बनाने के लिए आगे विस्तार और परिपक्व होते हैं (चित्रा 4)। डिस्टल आउटग्रोथ में मुख्य रूप से ओकुलर सतह उपकला होती है जो लेंस और कॉर्नियलएपिथेलियम में योगदान देती है।वांछित सेल प्रकारों को ईएफपी आउटग्रोथ के विभिन्न क्षेत्रों से काटा जा सकता है और शुद्ध संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए और समृद्ध किया जा सकता है।

5. रेटिना ऑर्गेनोइड्स का लक्षण वर्णन

  1. रूपात्मक और आणविक लक्षण वर्णन।
    1. 4x और 10x आवर्धन पर एक चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत अनुयायी ईएफपी और फ्लोटिंग रेटिना ऑर्गेनोइड्स का निरीक्षण करें और उनकी आकृति विज्ञान और आयामों का दस्तावेजीकरण करें।
    2. परिपक्वता के विभिन्न चरणों (चरण 4.2.3-4.2.6) में लगभग 20 रेटिना ऑर्गेनोइड्स को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में विस्तृत बोर 1,000 μL युक्तियों का उपयोग करके एकत्र करें। ऑर्गेनोइड्स को नीचे बैठने दें और माध्यम को बाहर निकालें। कप को 1x PBS से धो लें।
    3. अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें और 1.0 एमएल टीआरआईज़ोल अभिकर्मक जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब मूसल का उपयोग करके ऊतक को समरूप करें और 1.0 एमएल पिपेट का उपयोग करके ट्राइट्यूरेट करें।
    4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, आरएनए अलगाव और शुद्धिकरण की मानक अभिकर्मक विधि का पालन करके कुल आरएनए तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. अगारोस जेल पर आरएनए की गुणवत्ता की जांच करें और नैनोड्रॉप स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके इसकी मात्रा निर्धारित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. निर्माता के निर्देशों के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम का उपयोग करके कुल आरएनए के 1-2 μg को सीडीएनए में परिवर्तित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। जीन-विशिष्ट प्राइमरों की सूची के लिए तालिका 1 देखें।
    7. संक्षेप में, तालिका 2 में उल्लिखित कुल मात्रा के 10 μL में आरएनए-प्राइमर मास्टर मिश्रण तैयार करें और थर्मल साइकलर में 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। ट्यूब को थर्मल साइकलर से बर्फ में 2 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
    8. इस बीच, तालिका 3 में उल्लिखित अभिकर्मकों के साथ मास्टर मिक्स 2 तैयार करें। चरण 5.1.7 में तैयार आरएनए-प्राइमर मिक्स ट्यूब में इस मास्टर मिश्रण को जोड़ें। धीरे से मिलाएं।
    9. 50 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें, फिर 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस, और फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ें।
    10. न्यूरो-रेटिना पूर्वज और परिपक्व रेटिना सेल मार्करों की अभिव्यक्ति की जांच के लिए पीसीआर प्रतिक्रियाओं में एक टेम्पलेट के रूप में संश्लेषित सीडीएनए का उपयोग करें।
    11. प्रत्येक नमूने के कुल सीडीएनए टेम्प्लेट को सामान्य करें, अर्थात् एफ 2-यूडी (एचआईपीएससी-एफ 2-3 एफ 1; अविभाजित कोशिकाएं), ओसी -1 एम (निलंबन संस्कृति में 1 सप्ताह पुराना ऑप्टिक कप), और ओसी -2 एम (निलंबन संस्कृति में 4 सप्ताह पुराना ऑप्टिक कप) अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर द्वारा हाउसकीपिंग जीन जैसे एचई 1 एफ या जीएपीडीएच का उपयोग करके।
    12. अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें, जैसा कि तालिका 4 में बताया गया है, और थर्मल साइकलर में प्रवर्धन के लिए परीक्षण नमूना ट्यूब रखें। पीसीआर प्रवर्धन स्थितियों का उल्लेख तालिका 5 में किया गया है।
  2. हिस्टोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
    1. ऑप्टिक कप को 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और अतिरिक्त माध्यम (चरण 4.2.3-4.2.6) को एस्पिरेट करें। 1x PBS के साथ ऑर्गेनोइड्स को कुल्ला करें और फिर उन्हें कमरे के तापमान पर रात भर ठीक करने के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 500 μL में धोएं और निलंबित करें।
    2. अगले दिन, कप को विआयनीकृत पानी में धो लें। कप को 95% अल्कोहल (तीन परिवर्तन, 15-20 मिनट प्रत्येक) में खड़े होने दें, इसके बाद 100% अल्कोहल (तीन परिवर्तन, 15-20 मिनट प्रत्येक), 15 मिनट के लिए पूर्ण अल्कोहल और जाइलीन का 1: 1 मिश्रण, जाइलीन (दो परिवर्तन, 15 मिनट प्रत्येक), और पैराफिन (तीन परिवर्तन, 15 मिनट प्रत्येक) लें। मानक प्रक्रियाओं का पालन करते हुए पैराफिन ब्लॉक तैयार करने के लिए इस ऊतक को एम्बेड करें। इसे ठंडा होने और जमने दें।
    3. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके पतले खंड (~ 4-5 μm मोटाई) तैयार करें और मानक हिस्टोलॉजी प्रक्रियाओं का पालन करते हुए उन्हें सिलन-लेपित सूक्ष्म स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) पर रखें।
    4. डिपैराफिनाइजेशन के लिए, स्लाइड्स को 15-20 मिनट के लिए हीटिंग ब्लॉक पर 70 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। एक बार जब मोम पिघल जाता है, तो स्लाइड को जाइलीन (तीन परिवर्तन, 3-4 मिनट प्रत्येक) से धो लें, जो पैराफिन को पूरी तरह से हटा देगा।
      नोट: पैराफिन को अपूर्ण रूप से हटाने से बड़ी मात्रा में पृष्ठभूमि शोर के साथ खंडों का खराब / पैची धुंधलापन होता है।
    5. प्रत्येक 3 मिनट के लिए इथेनॉल (100%, 90%, और 80%) के विभिन्न प्रतिशत का उपयोग करके स्लाइड को फिर से हाइड्रेट करें। आसुत जल के साथ स्लाइड को कुल्ला करें और एंटीजन पुनर्प्राप्ति के साथ आगे बढ़ें।
    6. एंटीजन पुनर्प्राप्ति शुरू करने से पहले, माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके कोप्लिन जार (सामग्री की तालिका देखें) में साइट्रेट बफर (पीएच 6.0) को 95-100 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक पूर्व-गर्म करें।
    7. स्लाइड्स को पहले से गर्म साइट्रेट बफर में डुबोएं और माइक्रोवेव ओवन में जार को 15 मिनट के लिए गर्म करें। ओवन से कोप्लिन जार निकालें और इसे कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
    8. 5 मिनट के लिए मेथनॉल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 1: 1 मिश्रण को जोड़कर अंतर्जात पेरोक्सीडेज के लिए अनुभागों को अवरुद्ध करें, इसके बाद 1x पीबीएस के साथ तीन बार अनुभागों को धोएं।
    9. 15 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन-एक्स 100 का उपयोग करके अनुभागों को प्रतिस्थापित करें। स्लाइड्स को 1x PBS से तीन बार धोएं।
    10. 1 घंटे के लिए 1x PBS में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ वर्गों को इंजेक्ट करके प्राथमिक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करें।
    11. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें। अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए स्लाइड्स को 3-5 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    12. उपयुक्त फ्लोरोसेंट डाई-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। स्लाइड्स को 3-5 मिनट के लिए 1x PBS के साथ तीन बार धोएं।
      नोट: एंटीबॉडी और उनके संबंधित कमजोर पड़ने का उल्लेख सामग्री की तालिका में किया गया है। रेटिना ऑर्गनॉइड वर्गों को प्रारंभिक न्यूरो-रेटिना अग्रदूत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए पैक्स 6 और सीएचएक्स 10 का उपयोग करके इम्यूनोलेबल किया गया था, और प्रतिबद्ध रेटिना और फोटोरिसेप्टर अग्रदूत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए रिकवरीन और सीआरएक्स का उपयोग किया गया था। इसी तरह, एंटी-पैक्स 6 और एंटी-एमआईटीएफ का उपयोग आरपीई अग्रदूतों का पता लगाने के लिए किया गया था, और एंटी-सीआरएएलबीपी और एंटी-आरपीई 65 का उपयोग 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा पिगमेंटेड परिपक्व आरपीई कोशिकाओं का पता लगाने के लिए किया गया था।
    13. डीएपीआई या पीआई के साथ अनुभागों को काउंटरस्टेन करें और एंटीफैड माउंटिंग माध्यम का उपयोग करके उन्हें ग्लास स्लाइड पर माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    14. विभिन्न रेटिना मार्करों को व्यक्त करने वाली विभिन्न सेल परतों की जांच करने के लिए प्रतिदीप्ति या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड्स और आरपीई संस्कृतियों के इम्यूनोलेबल वर्गों को छवि और दस्तावेज करें।

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Representative Results

आंखों के वंश में एचआईपीएससी का विभेदन संस्कृति माध्यम के विभिन्न कॉकटेल में कोशिकाओं को संवर्धन करके प्राप्त किया जाता है जिसमें विभिन्न समय बिंदुओं पर अनुक्रमिक चरणों में पूरक और विकास कारक होते हैं, जैसा कि चित्र 1 में वर्णित है। HIPSC संस्कृतियों को आवश्यक 8 माध्यम, प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल रखरखाव माध्यम में बनाए रखा जाता है। एक बार जब वे 70% -80% कंफ्लुएंसी (चित्रा 2 ए) तक पहुंच जाते हैं, तो माध्यम को दिन 0 पर विभेदन प्रेरण माध्यम (डीआईएम) के साथ बदल दिया जाता है (चरण 3.2 देखें) जिसमें 1 एनजी / एमएल बीएफजीएफ, 1 एनजी / एमएल नोगिन और 1% एन 2 पूरक होता है। तंत्रिका-उत्प्रेरण एन 2 पूरक के साथ, नोगिन, बीएमपी सिग्नलिंग अवरोधक, मेसोडर्मल और एंडोडर्मल प्रतिबद्धता को अवरुद्ध करके कोशिकाओं को न्यूरोएक्टोडर्मल वंश की ओर निर्देशित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। 1, 2और 3 दिन पर, नोगिन की एकाग्रता 10 एनजी / एमएल तक बढ़ जाती है (चरण 3.3 और 3.4 देखें)। 4वें दिन से, डीआईएम को रेटिना भेदभाव माध्यम (आरडीएम) (चरण 3.5) के साथ बदल दिया जाता है, और संस्कृतियों को 30 दिनों तक लगातार बनाए रखा जाता है। आरडीएम कॉकटेल में बी 27 में कई एंटीऑक्सिडेंट और डी-गैलेक्टोज जैसे अतिरिक्त पूरक होते हैं, जो एरोबिक चयापचय को बढ़ावा देता है और ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने में मदद करता है, पूर्वज कोशिकाओं को अलग करने की व्यवहार्यता में सुधार करता है। इसके अलावा, रेटिनॉल एसीटेट (विटामिन ए) और विकास हार्मोन जैसे ट्राइआयोडो-आई-थायरोनिन (टी 3) की उपस्थिति तंत्रिका और रेटिना वंश भेदभाव को बढ़ावा देती है।

14 वें से 18वें दिन, तंत्रिका रोसेट का गठन देखा जाता है, जो आंख-क्षेत्र प्रतिबद्धता (चित्रा 2 बी) की शुरुआत को चिह्नित करता है। तंत्रिका रोसेट के भीतर आंख क्षेत्र अग्रदूत आगे बढ़ते हैं और केंद्र में गोलाकार न्यूरो-रेटिना संरचनाओं के साथ अलग-अलग आंख क्षेत्र प्राइमर्डियल क्लस्टर (ईएफपी) में खुद को व्यवस्थित करते हैं। अन्य सेल प्रकार जैसे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई), न्यूरल क्रेस्ट एपिथेलियम, और जो ओकुलर सतह में योगदान करते हैं, उभरती हैं और अच्छी तरह से परिभाषित मार्जिन के साथ सन्निहित उपकला के रूप में बाहर निकलती हैं। अच्छी तरह से गठित आंख क्षेत्र, जैसा कि ऊपर वर्णित है, भेदभाव के 21 वें से 28वें दिन के बीच देखा जा सकता है (चित्रा 2 सी, डी)। न्यूरो-रेटिना कप के केंद्रीय द्वीप को लौ-खींचे गए ग्लास पाश्चर पिपेट (चित्रा 2 ई) का उपयोग करके 25-30 दिन के बीच काटा जाता है और 45 वें दिन तक आरडीएम में गैर-अनुयायी निलंबन संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा जाता है। प्रसार रेटिना पूर्वज ों ने लगभग 2-3 मिमी व्यास के बहुस्तरीय 3 डी रेटिना ऑर्गेनोइड बनाने के लिए खुद को स्वयं को व्यवस्थित किया (चित्रा 2 एफ, जी)। 46 वें दिन से, आरडीएम को न्यूरोजेनेसिस को बढ़ावा देने और विट्रो में दीर्घकालिक ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों में सेल अस्तित्व में सुधार करने के लिए 100 μM टॉरिन के साथ पूरक किया जाता है (चित्रा 2 एच)।

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर (आरटी-पीसीआर) और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का उपयोग करके कई रेटिना पूर्वज मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए रेटिना ऑर्गेनोइड्स को परिपक्वता के विभिन्न चरणों में विशेषता है। इसके लिए, भेदभाव के 30वें और 60वें दिन कुल आरएनए अलगाव के लिए ऑर्गेनोइड्स की कटाई की जाती है। आरटी-पीसीआर परिणामों ने न्यूरो-रेटिना मार्करों जैसे न्यूरो-रेटिना मार्करों जैसे न्यूरोडी 1, सीएचएक्स 10, सीआरएक्स, पीकेसी 1, आरएलबीपी 1, आरएचओके, ओपीएन 1एसडब्ल्यू, आरसीवीआरएन, एबीसीए 4, आरडी 3, और पीडीई 6 सी के प्रेरण और अभिव्यक्ति की पुष्टि की।). इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और फ्लोरेसेंस इमेजिंग ने ओसी -1 एम में प्रारंभिक रेटिना पूर्वज मार्कर पैक्स 6, सीएचएक्स 10 और ओटीएक्स 2 और ओसी -2 एम 8,12 में परिपक्व रेटिना मार्कर आरसीवीआरएन और सीआरएक्स की अभिव्यक्ति की पुष्टि की है (चित्रा 3 बी, ii)।

केंद्रीय न्यूरो-रेटिना कप के अलावा, अन्य ओकुलर सेल प्रकार, जैसे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई), न्यूरल क्रेस्ट एपिथेलियम और ओकुलर सतह उपकला कोशिकाएं, ईएफपी से बाहर निकलती हैं और पलायन करती हैं। न्यूरोएक्टोडर्म-व्युत्पन्न आरपीई पूर्वज ईएफपी के आसपास कॉम्पैक्ट रूप से व्यवस्थित उपकला कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं, जो धीरे-धीरे परिपक्व होते हैं और दिन 30-45 से प्रवासी मार्जिन के साथ रंजित हो जाते हैं (चित्रा 4 ए-सी)। रेटिना कप को हटाने के बाद इन अनुयायी भेदभाव संस्कृतियों को इसलिए 45 वें दिन तक बढ़ाया जा सकता है, ताकि आरपीई अग्रदूतों (चित्रा 4 डी) का प्रसार किया जा सके, जिसे पूरी तरह से परिपक्व पिगमेंटेड आरपीई कोशिकाओं के मोनोलेयर संस्कृतियों को तैयार करने के लिए और समृद्ध किया जा सकता है। परिपक्व पिगमेंटेड आरपीई को विशिष्ट कोबलस्टोन आकृति विज्ञान (चित्रा 4 ई) के साथ मोनोलेयर के रूप में देखा जा सकता है। आरपीई सेल पहचान को आगे आरपीई-विशिष्ट मार्करों जैसे एमआईटीएफ (आरपीई पूर्वज मार्कर), पैक्स 6 (पूर्वज और परिपक्व आरपीई मार्कर), और आरपीई 65 (परिपक्व आरपीई मार्कर) 10,12 (चित्रा 4 एफ-एच) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा पुष्टि की जाती है।

प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स इस प्रकार विभिन्न वंशानुगत रेटिना रोगों 7,8,9 का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं। रोग-विशिष्ट स्टेम सेल मॉडल या तो रोगी-विशिष्ट आईपीएससी लाइनों को उत्पन्न करके या सीआरआईएसपीआर-आधारित जीन संपादन दृष्टिकोण 7,8 का उपयोग करके स्वस्थ नियंत्रण आईपीएससी लाइनों में रोग-विशिष्ट उत्परिवर्तन पेश करके विकसित किए जाते हैं। उत्परिवर्ती आईपीएससी जीन उत्परिवर्तन के आधार पर रेटिना सेल प्रकारों में कुशलता से अंतर कर सकते हैं या नहीं भी कर सकते हैं। जबकि अधिकांश स्वस्थ नियंत्रण सेल लाइनों ने ऊपर वर्णित समयरेखा का पालन किया, भेदभाव समयसीमा, ईएफपी आकृति विज्ञान, रेटिना कप आकार, लैमिनेशन और परिपक्वता के संदर्भ में रोग-विशिष्ट आईपीएससी के मामले में विचलन हो सकता है। मानव आरबी 1 जीन के एक्सॉन 18 के भीतर 10 बीपी के द्वि-विलोपन को वहन करने वाली आरबी 1-/-एचआईपीएस लाइन (एलवीआईपी 15-आरबी 1-सीएस 3) की रेटिना भेदभाव क्षमता की जांच की गई, जिसके परिणामस्वरूप आरबी 1 प्रोटीन अभिव्यक्ति का फ्रेमशिफ्ट और पूर्ण नुकसान होता है। यह देखा गया कि आरबी 1 अभिव्यक्ति के नुकसान ने उत्परिवर्ती एचआईपीएस लाइन के आंख और प्रारंभिक रेटिना वंश भेदभाव को प्रभावित नहीं किया। हालांकि, समयसीमा में उल्लेखनीय देरी और ईएफपी बनाने की दक्षता में कमी देखी गई। उभरने वाले एटिपिकल ईएफपी में रेटिना पूर्वजों के असामान्य समुच्चय थे जो उचित रेटिना कप (चित्रा 5 ए, बी) में लैमिनेट और आत्म-व्यवस्थित करने में विफल रहे या आरपीई और ओकुलर सतह उपकला (ओएसई) के आसपास के क्षेत्र की कमी थी (चित्रा 5 सी)। जब निलंबन संस्कृतियों के रूप में उठाया और बनाए रखा जाता है, तो इन रेटिना पूर्वज समूहों ने अनियमित न्यूरो-रेटिना समुच्चय (चित्रा 5 डी) का गठन किया।

Figure 1
चित्रा 1: रेटिना ऑर्गेनोइड्स में आईपीएससी के भेदभाव का प्रतिनिधित्व करने वाली समयरेखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्व-संगठित 3 डी रेटिना ऑर्गनॉइड पीढ़ी । (ए) फीडर-मुक्त परिस्थितियों में उच्च रक्तचाप संस्कृतियों को बढ़ाना। (बी) भेदभाव (तारांकन) के दिन 14 पर न्यूरोनल रोसेट विकसित करना। (C, D) आई फील्ड प्राइमर्डियल (ईएफपी) क्लस्टर जिसमें एक केंद्रीय न्यूरो-रेटिना कप जैसी संरचना (काले तीर) होती है, जो भेदभाव के दिन 21-28 पर एपिथेलियम (सफेद तीर) के माइग्रेटिंग ज़ोन से घिरी होती है। (ई) लौ से खींचा गया ग्लास पाश्चर पिपेट एक हुक टिप के साथ। हिंज क्षेत्र में चिकनी वक्र का उपयोग रेटिना कप (तीर) को घुमाने और उठाने के लिए किया जाता है। (F, G) रेटिना कप को 25 वें दिन काटा जाता है और स्व-संगठित 3 डी रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए निलंबन के तहत सुसंस्कृत किया जाता है। (एच) 45 वें दिन निलंबन संस्कृति में परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स। स्केल बार: 100 μm (A, B, D, G); 200 μm (C, F, H)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: रेटिना ऑर्गेनोइड्स का लक्षण वर्णन। (ए) आरटी-पीसीआर द्वारा अविभाजित सामान्य एचआईपीएससी लाइन23 (एचआईपीएससी-एफ 2-3 एफ 1) (एफ 2-यूडी) और विभेदित सामान्य ऑप्टिक कप ों की रेटिना जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग 3-4 सप्ताह के भेदभाव पर उठाए गए और क्रमशः 1 सप्ताह (ओसी -1 एम) और 4 सप्ताह (ओसी -2 एम) के लिए निलंबन संस्कृति में आगे परिपक्व हुए। लोडिंग नियंत्रण के रूप में ईईएफ 1 ए का उपयोग करके सभी परीक्षण नमूनों के सीडीएनए को सामान्यीकृत किया गया था। (बी) फोटोरिसेप्टर अग्रदूत मार्कर ों रिकवरीन, और सीआरएक्स (लाल रंग में) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके (i) अपरिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ओसी -1 एम) के इम्यूनोलेबल वर्गों की कॉन्फोकल छवियां। बाएं पैनलों में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं (बॉक्स) को अलग करने के साथ रेटिना ऑर्गेनोइड्स की चिह्नित सबसे बाहरी परत को ज़ूम किया जाता है और दाएं पैनलों में दिखाया जाता है। DAPI का उपयोग काउंटरस्टेन (नीले रंग में) के रूप में किया जाता था। अल्पविकसित आंतरिक खंड जैसे एक्सटेंशन को सफेद तीर द्वारा चिह्नित किया जाता है। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न ओकुलर सेल प्रकारों का उद्भव। (ए) केंद्र में न्यूरो-रेटिना कप के साथ ईएफपी क्लस्टर और माइग्रेट आरपीई आउटग्रोथ प्रमुख किनारों (सफेद तीर) के साथ रंजकता दिखाते हैं। (बी) न्यूरो-रेटिना द्वीप के चारों ओर कई ईएफपी से अच्छी तरह से विभेदित पिगमेंटेड एपिथेलियल आउटग्रोथ। (सी) ईएफपी का उच्च आवर्धन एक न्यूरो-रेटिना कप के आसपास आरपीई पूर्वजों (सफेद तीर) और ओकुलर सतह उपकला (तारांकन) के प्रवासी क्षेत्र को दर्शाता है। (डी) विस्तारित अनुयायी संस्कृतियां जो अपरिपक्व आरपीई कोशिकाओं के मोनोलेयर विकसित करती हैं जिनमें पिगमेंटेड और नॉन-पिगमेंटेड दोनों कोशिकाएं होती हैं। (ई) 60 वें दिन कोबलस्टोन आकृति विज्ञान दिखाने वाली पूरी तरह से परिपक्व और रंजित आरपीई कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियां। (F-H) RPE कोशिकाएं हरे रंग में PAX6, MITF, और RPE65 व्यक्त करती हैं। स्केल बार: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: आरबी 1-/- उत्परिवर्ती आईपीएससी में असामान्य रेटिना कप गठन(ए, बी) विकृत लैमिनेशन और स्ट्राइक की कमी के साथ रेटिना पूर्वजों के असामान्य समुच्चय के साथ ईएफपी। (सी) लघु न्यूरो-रेटिना कप के साथ ईएफपी लेकिन आरपीई और ओकुलर सतह उपकला (तीर) के आसपास के क्षेत्र की कमी है। (डी) निलंबन संस्कृति में गठित अनियमित न्यूरो-रेटिना समुच्चय। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर का नाम प्राइम सीक्वेंस (5'-3') बैंड आकार (बीपी) रेफरी आईडी।
1 heEF1α एफ: GAAGTCTGTGTGTGGCTGCCATGT 198 NM_001402
आर: टीटीसीटीजीएसीटीसीटीसीटीजीजीजीसीएजीएसीटीटीजी
2 hNeuroD1 एफ: सीजीसीजीसीटीएजीसीएसीटीएसीएक्ट 349 NM_002500
आर: जीसीजीटीसीटीसीटीटीजीजीजीटीएटी
3 hCHX10 एफ: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA 382 NM_182894
आर: सीटीटीजीएसीटीएजीसीसीएटीजीटीसीटी
4 एचसीआरएक्स एफ: टीसीएएसीजीसीसीटीजीजीसीसीटीएएजीटी 357 NM_000554
आर: ACACATCTGTGGGGGTCTCTT
5 hPKC-β1 एफ: एएएजीसीएजीसीटीटीजीजीसीएजीटीजीएटी 376 NM_212535
R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT
6 RLBP1 एफ: टीजीसीएसीएसीटीटीजीएजीसीटीए 361 NM_000326
आर: AGAAGGGCTTGACCACATTG
7 RHOK एफ: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA 360 NM_002929
आर: एटीसीसीजीजीएसीएटीजीसीसीजीटीसीएटी
8 hOPN1SW एफ: टीजीसीटीटीटीजीटीजीसीसीटीसी 373 NM_001708
आर: एजीसीटीजीसीएटीजीटीजीटीसीजीएटीसीए
9 RCVRN F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT 367 NM_002903
आर: ACGGGTGTCATGTGAGTGTGTGTTA
10 hABCA4 F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT 271 NG_009073
आर: एएटीजीएजीटीजीसीजीएटीजीजीजीएजीए
11 hRD3 एफ: एटीजीजीटीजीसीटीजीजीएजीएसीजीसीटीएटी 328 NM_183059
आर: सीटीटीसीसीटीजीसीटीसीसीए
12 hPDE6C एफ: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC 351 NM_006204
R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT

तालिका 1: आरटी-पीसीआर के लिए जीन-विशिष्ट प्राइमरों की सूची।

आरएनए-प्राइमर मिश्रण के लिए घटक वॉल्यूम (μL में)
आरएनए (1-2 μg) n
10 mM dNTP 1
10 mM Oligo dT 1
डीईपीसी-उपचारित पानी 10 तक
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 10

तालिका 2: सीडीएनए रूपांतरण के लिए आरएनए-प्राइमर मास्टर मिश्रण।

मास्टरमिक्स 2 के लिए घटक वॉल्यूम (μL में)
10x RT बफर 2
25 mM MgCl2 4
0.1 M DTT 2
सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस 1
RNaseOUT 1
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 10

तालिका 3: सीडीएनए रूपांतरण के लिए मास्टर मिक्स 2।

पीसीआर के घटक आयतन (μL में)/प्रतिक्रिया
10x पीसीआर बफर 2
2 mM dNTP 2
फॉरवर्ड प्राइमर (5 μM) 1
रिवर्स प्राइमर (5 μM) 1
टैक पोलीमरेज़ 0.2
सीडीएनए टेम्पलेट (50-100 एनजी) 1
बाँझ मिली-क्यू पानी 12.8
कुल प्रतिक्रिया मात्रा 20
 

तालिका 4: अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर के लिए मास्टर मिश्रण।

तापमान समय चक्रों की संख्या
विकृतीकरण। 95 °C 5 मिनट x 1
विकृतीकरण। 95 °C 30 s x 35
एनीलिंग 50-60 °C 30 s
विस्तार 72 °C 30 s
अंतिम विस्तार 72 °C 10 मिनट x 1

तालिका 5: पीसीआर प्रवर्धन की स्थिति।

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Discussion

HIPSC विट्रो में अंग और ऊतक विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। रेटिना वंश की ओर स्वस्थ बनाम रोग-विशिष्ट एचपीएससी को अलग करके रोग फेनोटाइप को पुन: परिभाषित करने से विरासत में मिली रेटिना डिस्ट्रॉफी के विभिन्न रूपों के पैथोफिज़ियोलॉजी में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद मिल सकती है। रेटिना सेल प्रकारों में पीएससी के इन विट्रो भेदभाव के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन और अपनाया गया है। उनमें से अधिकांश में पुनः संयोजक विकास कारकों, पूरक, छोटे अणुओं और अभिकर्मकों के जटिल कॉकटेल युक्त संस्कृति माध्यम का उपयोग शामिल है, जैसे: एन 1, एन 2, और बी 27 की खुराक; बीएमपी और टीजीएफ सिग्नलिंग ब्लॉकर्स जैसे नोगिन, एसबी 431542, एलडीएन 193189, और फोलिस्टेटिन, या एक्टिविन ए, लेफ्टी और आईडीई 1 जैसे प्रेरक; कैननिकल डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग ब्लॉकर्स जैसे डीकेके 1, एसएफआरपी, आईडब्ल्यूपी -2, और आईडब्ल्यूआर -1-एंडो, या सीएचआईआर 99021, एसबी 216763 और सीकेआई -7 जैसे इंड्यूसर; एफजीएफ रिसेप्टर सिग्नलिंग ब्लॉकर्स जैसे पीडी0325901 और पीडी173074 या बीएफजीएफ जैसे प्रेरक; डीएपीटी जैसे नॉच सिग्नलिंग इनहिबिटर; अन्य सिग्नलिंग अणु जैसे इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF-1); रेटिनोइक एसिड; विकास हार्मोन जैसे ट्राइआयोडोथायरोनिन (टी 3) और हाइड्रोकार्टिसोन; और एंटी-ऑक्सीडेंट और अन्य प्रो-सर्वाइवल कारक जैसे एस्कॉर्बिक एसिड, निकोटिनामाइड, टॉरिन, डोकोसाहेक्साएनोइक एसिड, 1-थियोग्लिसरॉल, आदि। इन घटकों को स्टेम सेल भेदभाव के विभिन्न चरणों में संस्कृति माध्यम में शामिल किया जाता है ताकि आंख और रेटिना वंश प्रतिबद्धता 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 को प्रेरित करने के लिए विभिन्न सिग्नलिंग कैस्केड को उत्तेजित या संशोधित किया जा सके।

यहां, हाईपीएससी के निकट-संगत, अनुयायी संस्कृतियों से सीधे रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने की एक सरल, मजबूत और कुशल विधि का वर्णन किया गया है। सरलीकृत प्रोटोकॉल में कम पूरक, विकास कारक और छोटे अणुओं का उपयोग करना शामिल है जो मुख्य रूप से न्यूरोएक्टोडर्मल वंश में पीएससी के प्रारंभिक भेदभाव को ट्रिगर करते हैं। बाद के भेदभाव कदम संबंधित वंशों के सेल प्रकार में तुल्यकालिक रूप से अंतर करने के लिए पीएससी की अंतर्निहित क्षमता पर निर्भर करते हैं, जो तब कई सेल प्रकारों के विकास और स्थानिक संगठन को आत्म-व्यवस्थित और पारस्परिक रूप से विनियमित करते हैं जो जटिल ऊतकों के गठन में योगदान करते हैं। बीएफजीएफ की क्रमिक वापसी और नोगिन को जोड़ने से भेदभाव के 3 दिनों के भीतर प्रारंभिक न्यूरो-एक्टोडर्मल भाग्य प्रतिबद्धता के सफल प्रेरण में मदद मिलती है। तंत्रिका-उत्प्रेरण आरडीएम में विभेदन संस्कृतियों के निरंतर रखरखाव, किसी भी विकास कारक या छोटे अणुओं को जोड़े बिना, भेदभाव के 3-4 सप्ताह के भीतर स्पष्ट मार्जिन के साथ नेत्र क्षेत्र प्राइमर्डियल (ईएफपी) संरचनाओं के प्रेरण के परिणामस्वरूप होता है। ईएफपी में मल्टीपोटेंट पूर्वज कोशिकाएं होती हैं, जो अबाधित और निरंतर रखरखाव पर, जटिल ईएफपी बनाने के लिए बहु-वंश भेदभाव और आत्म-संयोजन का परिणाम होती हैं, जिसमें केंद्रीय रूप से स्थित न्यूरो-रेटिना कप या ऑप्टिक कप (ओसी) होते हैं, जो अन्य संबंधित ओकुलर सेल प्रकारों जैसे रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई), न्यूरल क्रेस्ट एपिथेलियम और ओकुलर सतह उपकला से घिरे होते हैं। वैकल्पिक रूप से, पीएससी को समान संस्कृति स्थितियों के तहत ईबी बनाने के लिए दिन 1-3 से निलंबन संस्कृतियों के रूप में विकसित किया जा सकता है। ईबी को आगे 4 वें दिन चढ़ाया जा सकता है और रेटिना वंश भेदभाव शुरू करने के लिए आरडीएम में मैट्रिक्स-लेपित सतहों पर अनुयायी संस्कृतियों के रूप में उगाया जा सकता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है। स्वस्थ विभेदक संस्कृतियां नियमित रूप से 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में लगभग 20-30 ईएफपी को जन्म देती हैं। रेटिना भेदभाव के 3-4 सप्ताह में ईएफपी से ओसी को काटा जा सकता है और न्यूरो-रेटिना पूर्वजों के भेदभाव को सक्षम करने और परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए निलंबन संस्कृतियों में 30-60 दिनों तक बनाए रखा जाता है। निलंबन संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद, ईएफपी से उठाए गए ऑप्टिक कप का लगभग 70% -80% बरकरार रहता है, उनके लैमिनेशन को बनाए रखता है, और परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ओसी -2 एम) में विकसित होता है, जिसमें आरसीवीआरएन + और सीआरएक्स + प्रतिबद्ध फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं और सबसे बाहरी परतों के भीतर आंतरिक खंड जैसे विस्तार होते हैं।

भेदभाव की शुरुआत और संस्कृतियों को डीआईएम में स्थानांतरित करने के समय बढ़ती आईपीएससी संस्कृतियों का सामंजस्य महत्वपूर्ण है। 60% से कम छोटी कॉलोनियों और संगम वाली संस्कृतियां, और जो तेजी से अंतर कर रही हैं, उनके परिणामस्वरूप ईएफपी संख्या में काफी कमी आई है। जब आंख क्षेत्र क्लस्टर उभरते हैं, तो न्यूरो-रेटिना कप के केंद्रीय द्वीप को 1 सप्ताह के भीतर काटा जाना चाहिए। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, लौ-खींचे गए ग्लास केशिका टिप के कोण या घुमावदार क्षेत्र का उपयोग करके बरकरार कप को धीरे से घुमाकर और उठाकर ऐसा किया जा सकता है। कप को नुकसान न पहुंचे, इसका ध्यान रखा जाना चाहिए। चुनने में और देरी के परिणामस्वरूप न्यूरो-रेटिना पूर्वज कोशिकाओं के प्रसार और प्रवास के कारण चपटापन और 3 डी संगठन का नुकसान होगा, जो कटाई को मुश्किल बनाता है और इसके परिणामस्वरूप एटिपिकल रेटिना ऑर्गेनोइड्स होते हैं।

नेत्र क्षेत्र प्रेरण और रेटिना कप की परिपक्वता की दक्षता अंतर्निहित आनुवंशिक दोषों के आधार पर विभिन्न बीमारी या रोगी-विशिष्ट एचपीएससी लाइनों के बीच भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, आरपी रोग-विशिष्ट लाइन की रेटिना वंशावली प्रतिबद्धता और ईएफपी बनाने की क्षमता स्वस्थ नियंत्रण कोशिकाओं के समान थी, जबकि एक आरबी 1 नल लाइन ईएफपी बनाने में विफल रही (डेटा नहीं दिखाया गया)। लेबर जन्मजात अमौरोसिस से जुड़े उत्परिवर्तन वाली कुछ लाइनों ने उनके आकार, आत्म-संयोजन, लैमिनेशन और रेटिना पूर्वजों की परिपक्वता (डेटा नहीं दिखाया गया) में दोषों के साथ एटिपिकल ईएफपी का गठन किया। स्वस्थ नियंत्रण ऊतकों की तुलना में रोगी-विशिष्ट रेटिना ऑर्गेनोइड्स के आगे आणविक सत्यापन और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग एक बीमारी की स्थिति के पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने के लिए आवश्यक होगी। रोगी जीनोम में परिवर्तनशीलता और रोग अभिव्यक्तियों में बहु-जीन नेटवर्क की भागीदारी को ध्यान में रखते हुए, रोग मॉडलिंग अध्ययनों में एक पूर्ण जीनोटाइप-फेनोटाइप सहसंबंध स्थापित करने के लिए इसोजेनिक आईपीएससी लाइनों से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स का अध्ययन करना भी महत्वपूर्ण हो सकता है। इस तरह की इसोजेनिक लाइनें या तो स्वस्थ नियंत्रण लाइनों में लक्षित जीन नॉकआउट द्वारा बनाई जा सकती हैं या उन्नत जीनोम संपादनतकनीकों 8,9 का उपयोग करके रोगी-विशिष्ट आईपीएससी में रोगजनक उत्परिवर्तन को सही करके बनाई जा सकती हैं।

सामान्य या रोग-विशिष्ट आईपीएससी लाइनों से प्राप्त इस तरह के बरकरार रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग नई दवा स्क्रीनिंग और परीक्षण में किया जा सकता है। रेटिना ऑर्गेनोइड्स और अन्य ओकुलर सेल प्रकारों के भीतर फोटोरिसेप्टर अग्रदूत, जैसे कि ईएफपी आउटग्रोथ के भीतर आरपीई और कॉर्नियल एपिथेलियम, बुनियादी अनुसंधान और पुनर्योजी चिकित्सा में उनके अनुप्रयोगों के लिए और अलग और समृद्ध हो सकते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्रीक्लिनिकल और नैदानिक परीक्षण मूल्यांकन के लिए नैदानिक ग्रेड कोशिकाओं को तैयार करने के लिए जीएमपी-अनुरूप प्रक्रियाओं के लिए आसानी से अपनाया जा सकता है।

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Disclosures

सभी लेखकों के पास हितों का कोई टकराव या वित्तीय प्रकटीकरण नहीं है।

Acknowledgments

लेखक डॉ चित्रा कन्नाबिरन, आनुवंशिकीविद् से वैज्ञानिक और तकनीकी समर्थन को स्वीकार करते हैं; डॉ. सुभद्रा जलाली, रेटिनल कंसल्टेंट; डॉ. मिलिंद नाइक, जनरल मेड़ीसिन डॉकटर / और डॉ स्वाति कलिकी, एलवी प्रसाद आई इंस्टीट्यूट, हैदराबाद में ओकुलर ऑन्कोलॉजिस्ट सामान्य और रोगी-विशिष्ट आईपीएससी लाइनों की पीढ़ी की ओर। लेखक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (आईएम), (एसबी/एसओ/एचएस/177/2013), जैव प्रौद्योगिकी विभाग (आईएम), (बीटी/पीआर32404/एमईडी/30/2136/2019) और आईसीएमआर (एसएम, डीपी), यूजीसी (टीए) और सीएसआईआर (वीकेपी), भारत सरकार से वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप से अनुसंधान एवं विकास अनुदान स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Syringe filters TPP 99722 
15 mL centrifuge tube TPP 91015
50 mL centrifuge tube TPP 91050
6 well plates TPP 92006
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal Santa Cruz SC365519 1:50 dilution
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal Abcam ab140603 1:300 dilution
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal Abcam ab3201 1:250 dilution
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal      Millipore AB5585 1:300 dilution
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher 17504044
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) Sigma Aldrich F0291
Centrifuge 5810R Eppendorf
Coplin Jar (50 mL) Tarson
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 354277
CryoTubes Thermo Fisher V7884
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) Thermo Fisher 10565-018
DreamTaq DNA polymerase Thermo Fisher EP0709
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 14190144
Essential 8 medium kit Thermo Fisher A1517001
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma Aldrich E5134
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm  Corning 351007
Fetal Bovine Serum, qualified, United States  Gibco 26140079
GelDocXR+ with Image lab software BIO-RAD Agarose Gel documentation system 
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 1:300 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 Invitrogen A11030 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 Invitrogen A11035 1:300 dilution
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A11008 1:300 dilution
HistoCore MULTICUT Leica For sectioning
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
L-Acsorbic acid Sigma Aldrich A92902
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140-050
N2 supplement (100x) Thermo Fisher 17502048
NanoDrop 2000 Thermo Fisher To quantify RNA
Paraformaldehyde Qualigens 23995
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged Corning 7095D-9
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher 15140-122
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal Abcam ab183951 1:300 dilution
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal Abcam ab195045 1:300 dilution
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal Abcam ab231782 1:300 dilution
Recombinant Human Noggin Protein R&D Systems 6057-NG
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Serological pipettes 10 mL TPP 94010
Serological pipettes 5 mL TPP 94005
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Sodium Citrate Tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641
Starfrost (silane coated) microscopic slides Knittel
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 18080051
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Invitrogen 18080051
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI  Vector laboratories H-1200 
Vitronectin Thermo Fisher A27940
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Sigma Aldrich Y0503
Zeiss LSM 880 Zeiss Confocal microscope

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 190 स्टेम सेल आईपीएससी रेटिना भेदभाव नेत्र क्षेत्र प्राइमोडियम रेटिना ऑर्गेनोइड्स रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम।
स्वस्थ और रेटिना रोग-विशिष्ट मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन
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Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, … More

Mahato, S., Agrawal, T., Pidishetty, D., Maddileti, S., Pulimamidi, V. K., Mariappan, I. Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (190), e64509, doi:10.3791/64509 (2022).

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