Summary
Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att differentiera hiPSC i ögonfältkluster och generera neuro-retinala organoider med hjälp av förenklade odlingsförhållanden som involverar både vidhäftande och suspensionskultursystem. Andra okulära celltyper, såsom RPE och hornhinneepitel, kan också isoleras från mogna ögonfält i retinala kulturer.
Abstract
Pluripotenta stamceller kan generera komplexa vävnadsorganoider som är användbara för in vitro-sjukdomsmodelleringsstudier och för att utveckla regenerativa terapier. Detta protokoll beskriver en enklare, robust och stegvis metod för att generera retinala organoider i ett hybridodlingssystem bestående av vidhäftande monolagerkulturer under de första 4 veckorna av retinal differentiering till uppkomsten av distinkta, självorganiserade ögonfältprimordiala kluster (EFP). Vidare plockas de munkformade, cirkulära och genomskinliga neuro-retinala öarna inom varje EFP manuellt och odlas under suspension med hjälp av icke-vidhäftande odlingsrätter i ett retinalt differentieringsmedium i 1-2 veckor för att generera flerskiktade 3D-optiska koppar (OC-1M). Dessa omogna retinala organoider innehåller PAX6+ och ChX10+ prolifererar, multipotenta retinala prekursorer. Föregångarcellerna är linjärt självmonterade inom organoiderna och framträder som distinkta radiella strimmor. Vid 4 veckor efter suspensionskulturen genomgår retinala förfäder postmitotisk arrestering och härstamningsdifferentiering för att bilda mogna retinala organoider (OC-2M). Fotoreceptorlinjen begångna prekursorer utvecklas inom de yttersta lagren av retinala organoider. Dessa CRX+ och RCVRN+ fotoreceptorceller mognar morfologiskt för att visa inre segmentliknande förlängningar. Denna metod kan användas för att generera retinala organoider med hjälp av humana embryonala stamceller (hESC) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Alla steg och förfaranden förklaras tydligt och demonstreras för att säkerställa reproducerbarhet och för bredare tillämpningar inom grundvetenskap och translationell forskning.
Introduction
Näthinnan är en ljuskänslig vävnad som finns på baksidan av ryggradsdjurens öga som omvandlar ljussignaler till nervimpulser genom ett biokemiskt fenomen som kallas fototransduktionsvägen. De initiala nervimpulserna som genereras i näthinnans fotoreceptorceller transduceras till andra retinala interneuroner och retinala ganglieceller (RGC) och når hjärnans visuella cortex, vilket hjälper till med bilduppfattning och visuellt svar.
Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) är uppskattningsvis 1,5 miljoner barn blinda, varav 1 miljon i Asien. Ärftlig retinal dystrofi (IRD) är en stor blindande sjukdom som drabbar 1 av 4 000 individer över hela världen 1,2,3, medan förekomsten av blindhet i samband med åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) varierar från 0,6% -1,1% i utvecklingsländer 4. IRD orsakas av ärftliga genetiska defekter i över 300 olika gener som är involverade i näthinnans utveckling och funktion5. Sådana genetiska förändringar resulterar i störningar av normala näthinnefunktioner och gradvis degenerering av näthinneceller, nämligen fotoreceptorcellerna och det retinala pigmenterade epitelet (RPE), vilket leder till allvarlig synförlust och blindhet. Enorma framsteg har gjorts i andra bländande förhållanden som involverar hornhinnan, linsen etc. Retinala dystrofier och optiska nervatrofier har dock hittills ingen beprövad behandling. Eftersom en vuxen mänsklig näthinna inte har stamceller6, kan alternativa källor såsom embryonala stamceller (ESC) och patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) ge ett obegränsat utbud av önskade celltyper och hålla ett stort löfte för att utveckla komplexa vävnadsorganoider som krävs för in vitro-sjukdomsmodelleringsstudier och för att utveckla regenerativa terapier7, 8,9,10.
Flera års näthinneforskning har lett till en bättre förståelse av molekylära händelser som orkestrerar tidig näthinneutveckling. De flesta protokoll för att generera retinala celler och 3D-organoider från PSC syftar till att rekapitulera dessa utvecklingshändelser in vitro genom att odla cellerna i en komplex cocktail av tillväxtfaktorer och små molekyler för att modulera de kända biologiska processerna på ett stegvis sätt. De retinala organoider som sålunda genereras består av stora retinala celler: retinala ganglieceller (RGC), interneuroner, fotoreceptorer och retinalt pigmenterat epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Trots framgångsrika försök att modellera IRD med retinala organoider utgör kravet på den komplexa cocktailen av tillväxtfaktorer och små molekyler under differentiering och den relativt låga effektiviteten hos retinal organoidgenerering en stor utmaning med de flesta protokoll. De inkluderar huvudsakligen bildandet av embryoidkroppar, följt av deras stegvisa differentiering i retinala linjer med hjälp av komplexa odlingsförhållanden vid olika stadier av in vitro-utveckling 20,21,22.
Här rapporteras en förenklad och robust metod för att utveckla komplexa 3D-neuro-retinala organoider från friska kontroll- och retinala sjukdomsspecifika hiPSC. Protokollet som beskrivs här använder direkt differentiering av nästan konfluenta hiPSC-kulturer utan att behöva embryoidkroppsbildning. Dessutom förenklas komplexiteten hos odlingsmediet, vilket gör det till en kostnadseffektiv och reproducerbar teknik som lätt kan antas av nya forskare. Det involverar ett hybridodlingssystem bestående av vidhäftande monolagerkulturer under de första 4 veckorna av retinal differentiering tills uppkomsten av distinkta, självorganiserade ögonfältprimordiala kluster (EFP). Vidare plockas de cirkulära neuro-retinala öarna inom varje EFP manuellt och odlas i suspensionskulturer i 1-2 veckor för att förbereda flerskiktade 3D-retinalkoppar eller organoider bestående av PAX6+ och CHX10+ prolifererande neuro-retinala prekursorer. Förlängd odling av retinala organoider i 100 μM taurininnehållande medium i ytterligare 4 veckor resulterade i uppkomsten av RCVRN+ och CRX+ fotoreceptorprekursorer och mogna celler med rudimentära inre segmentliknande förlängningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med hiPSC utfördes aseptiskt, i enlighet med standardlaboratoriepraxis, etiska riktlinjer och biosäkerhetsriktlinjer och med godkännanden från tillsynsorgan som Institutional Ethics Committee (IEC), Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR) och Institutional Bio-Safety Committee (IBSC).
1. Beredning av iPSC-kultur och retinalt differentieringsmedium och reagens
- iPSC-kultur och underhållsmedium
- Odla och bibehålla den normala hiPSC-linjen23 (hiPSC-F2-3F1) och en CRISPR-redigerad, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-deletion av 10 bp inom exon 18 i den humana RB1-genen) i essentiellt 8-medium på matrigelbelagda (basalmembranmatrisbelagda; se materialtabell) odlingsplattor under matarfria odlingsförhållanden.
OBS: Detta protokoll kan göras helt xenofritt genom att ersätta basalmembranmatrisen med den rekombinanta vitronektinbeläggningen (VTN-N). Förbered komplett Essential 8-medium genom att tillsätta 50x Essential 8-tillskott (levereras med Essential 8-mediumsatsen; se Materialtabell) och 100 U / ml penicillin-streptomycinlösningar. Alternativt kan hiPSC också odlas med hjälp av hela mTeSR1-mediet.
- Odla och bibehålla den normala hiPSC-linjen23 (hiPSC-F2-3F1) och en CRISPR-redigerad, RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3, med biallelisk, frameshift-deletion av 10 bp inom exon 18 i den humana RB1-genen) i essentiellt 8-medium på matrigelbelagda (basalmembranmatrisbelagda; se materialtabell) odlingsplattor under matarfria odlingsförhållanden.
- Celldissociationslösning (1x CDS)
- För en enzymfri dissociation och passaging av humana iPSCs, bereda CDS innehållande 0,5 mM EDTA, pH 8,0 och 30 mM NaCl i 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) (se materialtabell).
- För att förbereda 100 ml 1x CDS, tillsätt 100 μL 0,5M EDTA och 1 ml 3 M NaCl stamlösningar till 99 ml 1x DPBS, blanda väl och filtrera sterilisera med ett 0,22 μm filter.
- Differentieringsinduktionsmedium (DIM)
- Förbered DIM med DMEM-F12 basalmedium kompletterat med 10% Knockout Serum Replacement (KOSR), 1x icke-essentiell aminosyra (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 200 μM L-askorbinsyra och 1% N2-tillägg (se materialtabell).
- Retinal differentiering medium (RDM)
- Förbered RDM med DMEM-F12 basalmedium kompletterat med 10% knockout serum (KOSR), 1x icke-essentiell aminosyra (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / ml penicillin-streptomycin, 200 μM L-askorbinsyra och 2% B27-tillskott (med vitamin A) (se materialtabell).
- Extracellulära matrisbelagda cellodlingsytor
- Tina den hESC-kvalificerade basalmembranmatrisen över natten i en ishink, helst i ett kylskåp vid 4-8 °C. Späd den tinade 100x matrismassan (5 ml) i förhållandet 1:5 genom att tillsätta 20 ml iskallt DMEM-F12 basmedium och blanda försiktigt virvlande för att bereda en 20x stamlösning.
- Bered 0,5 ml alikvoter på is med förkylda pipettspetsar och sterila mikrocentrifugrör. Märk injektionsflaskorna som 20x lager och förvara dem frysta i en frys på -80 °C i upp till 6 månader.
- För beläggning av cellodlingsytorna (odlingsskålar eller 6-brunnsplattor), tina en alikvot av 20x matris på is och späd den i förhållandet 1:20 med iskall DMEM-F12 basalmedium för att förbereda 10 ml 1x matrisbeläggningslösning, vilket är tillräckligt för att belägga en 100 mm skål eller en 6-brunnsplatta (1,5 ml / brunn).
OBS: Förkyl pipetter/mikrospetsar genom att aspirera iskall och steril DPBS innan matrislösningen hanteras. Upptining och all hantering av matrisen måste göras på is med förkylda pipetter/mikrospetsar för att undvika polymerisation och gelning vid rumstemperatur. - Tillsätt 1,5 ml 1x matrisbeläggningslösning till varje brunn på en 6-brunnsplatta, snurra försiktigt plattan för att säkerställa jämn beläggning och inkubera plattorna vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator . Lämna plattorna ostörda i minst 1 timme för att säkerställa jämn beläggning av matrisen på odlingsytorna.
- Innan du såddar cellerna, aspirera ut beläggningslösningen med en 5 ml steril pipett och kassera det flytande avfallet. Tillsätt färskt odlingsmedium omedelbart (2 ml / brunn på en 6-brunnsplatta) och frö cellerna med en densitet av 150 000-200 000 celler / brunn. Låt inte plattorna torka under hantering.
OBS: Alternativt kan rekombinant vitronektin (VTN-N) beläggning vid en slutlig koncentration av 0,5 μg / ml användas för ett xenofritt odlingsprotokoll.
- Tina den hESC-kvalificerade basalmembranmatrisen över natten i en ishink, helst i ett kylskåp vid 4-8 °C. Späd den tinade 100x matrismassan (5 ml) i förhållandet 1:5 genom att tillsätta 20 ml iskallt DMEM-F12 basmedium och blanda försiktigt virvlande för att bereda en 20x stamlösning.
2. Etablera mänskliga iPSC-kulturer
- Upptining och återupplivande av hiPSC
- Belägg en brunn av en 6-brunnsplatta med 1x membranmatrislösning. Inkubera vid 37 °C i 1 timme för att möjliggöra polymerisation och enhetlig beläggning av odlingsytan.
- Efter 1 timmes inkubation, avlägsna beläggningslösningen och tillsätt 1 ml förvärmt komplett essentiellt 8-medium innehållande 10 μM rhokinashämmare, Y-27632 (1 μl/ml 10 mM lager; se materialförteckning), innan cellerna återupplivas.
- Ta bort en kryovialstam med hiPSC (1 x 106 celler/injektionsflaska) från behållaren med flytande kväve. Tina snabbt kryovialen i ett 37 ° C vattenbad med lätt virvlande.
OBS: Tina inte injektionsflaskan helt; Anteckna passagenumret, ytsterilisera injektionsflaskan och torka den torr med en luddfri pinne som innehåller 70% isopropylalkohol. - Använd en steril 1 ml pipettspets och aspirera kryovialinnehållet till ett nytt 15 ml rör bestående av 2 ml förvärmt komplett Essential 8-medium utan Y-27632. Centrifugera röret vid 1 000 x g i 4 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1,0 ml komplett Essential 8-medium innehållande 10 μM Y-27632.
- Lägg till denna cellsuspension på de matrisbelagda ytorna utan att störa matrisen genom att fördela den längs väggarna. Gunga plattan försiktigt tvärs för att säkerställa jämn fördelning av celler.
- Inkubera plattorna vid 37 °C i en 5 % CO2-inkubator så att cellerna kan fästa och börja föröka sig.
- Efter 12-24 timmar, byt ut det använda mediet och behåll kulturerna i förvärmt komplett Essential 8-medium utan Y-27632.
- Byt odlingsmedium var 24: e timme och passera kulturerna när de når 70% -80% sammanflöde.
OBS: Ett delningsförhållande på 1: 6 följs rutinmässigt för hiPSC-kulturer och passeras med jämna mellanrum på 3-4 dagar.
- Passaging och plätering av hiPSC för att initiera retinal härstamningsdifferentiering
- Aspirera det förbrukade mediet från 70% -80% konfluenta humana iPSC-kulturer i 6-brunnsplattor.
- Tillsätt 1 ml CDS (steg 1.2) till varje brunn och inkubera vid 37 °C i 5-7 minuter tills cellerna rundas uppåt. Ta försiktigt bort CDS, var försiktig så att cellerna inte lossnar och tillsätt 2 ml färskt Essential 8-medium och triturera försiktigt med en pipett.
- Samla upp cellsuspensionen från en brunn på en 6-cellsplatta till ett 15 ml centrifugrör och snurra röret vid 1 000 x g i 4 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 1,2 ml Essential 8-medium och dispensera 200 μL av cellen 200 μL av cellsuspensionen (1: 6 delningsförhållande) i varje brunn i en matrisbelagd 6-brunnsplatta innehållande 1,5 ml iPSC-odlingsmedium innehållande 10 μM Y-27632, enligt beskrivningen i steg 1.5.
- Efter 12-24 timmar, byt ut det använda mediet och behåll kulturerna i förvärmt komplett Essential 8-medium utan Y-27632.
- Byt odlingsmedium var 24: e timme tills kulturerna når 70% -80% sammanflöde.
3. Differentiering av hiPSC i ögonfält och retinal härstamning
OBS: En schematisk översikt över differentieringsprocessen visas i figur 1.
- Initiera differentieringsproceduren när hiPSC-kulturerna når 70% -80% sammanflöde.
- På dag 0, byt hiPSC-underhållsmedium till DIM (steg 1.3) som innehåller 1 ng/ml bFGF och 1 ng/ml Noggin. Tillsätt 2,0 ml medium per brunn på en 6-brunnsplatta och håll cellerna vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
OBS: Gradvis tillbakadragande av bFGF inducerar differentiering av PSC, och tillsats av ökande koncentrationer av Noggin (hämmare av flera BMP) under de inledande stadierna inducerar ektodermal härstamningsdifferentiering och neuralisering11,12 och blockerar mesoderm- och endodermåtagandet. Alternativt kan Noggin ersättas med LDN193189. Till skillnad från den dubbla SMAD-hämningsstrategin som rapporterades tidigare20,21, kräver detta protokoll inte tillägg av Activin eller SB-431542. - På dag 1, byt använt medium och tillsätt DIM innehållande 1 ng/ml bFGF och 10 ng/ml Noggin. Tillsätt 2,0 ml per brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera och behåll cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
- På dag 2-3, ta bort det förbrukade mediet och tillsätt DIM som innehåller endast 10 ng / ml Noggin. Tillsätt 2,0 ml per brunn på en 6-brunnsplatta och byt medium var 24: e timme. Inkubera och behåll cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2-inkubator .
OBS: Förvärm alltid odlingsmediet till 30-37 °C före användning. Överskott av floaters och döda celler kan observeras i tidiga differentieringskulturer. Under sådana förhållanden, tvätta kulturerna en gång med 1x DPBS och tillsätt retinaldifferentieringsmediet. Sterilitetstester på det använda mediet kan göras varje vecka eller efter behov. - På dag 4 tar du bort det använda mediet och lägger till RDM (steg 1.4). Tillsätt 2,0 ml per brunn av en 6-brunnsplatta och fortsätt att bibehålla kulturerna i RDM vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator , med en ny mediumförändring varje dag.
OBS: Alternativt kan PSC odlas som suspensionskulturer från dag 1-3, i icke-vidhäftande och rundbottnade 96-brunnsplattor, vid en celldensitet på 5 x 103 celler/100 μl/brunn för att bilda embryoidkroppar (EB) under identiska odlingsförhållanden i DIM. Välformade EB på dag 4 kan pläteras på matrisbelagda plattor innehållande RDM och får fästa, föröka sig och differentiera enligt beskrivningen nedan. - Vid omkring dag 14-18, observera kulturerna under ett mikroskop vid 10x förstoring för uppkomsten av neurala rosettliknande domäner bestående av tidiga ögonfältsprogenitorer (figur 2B).
- Omkring dag 21-28 (3-4 veckor), observera kulturer under ett mikroskop med 4x och 10x förstoring för att observera uppkomsten av självorganiserade, distinkta EFP, med en central ö av cirkulära 3D-neuro-retinala strukturer omgivna av sammanhängande utväxter av neuroepitel och okulärt ytepitel (figur 2C, D).
OBS: Cirka 20-30 EFP kan observeras per brunn av en 6-brunnsplatta med en normal hiPSC-retinaldifferentieringskultur. Detta antal kan variera med andra sjukdomsspecifika hiPSC-linjer, baserat på deras genetiska bakgrund och retinal härstamningsdifferentieringspotential.
4. Skörd av retinala organoider
- Flamdragning av glas Pasteurpipetter för manuell plockning av näthinnekoppar.
OBS: Använd autoklaverade och sterila Pasteur-pipetter av glas för plockning av ögonfält.- Slå på en Bunsen-brännare. Ta en steril Pasteur-pipett och håll basen i ena handen och kapillärspetsen i den andra. Flamsterilisera och värm området nära mitten av kapillärspetsen, med rotationsrörelser tills glaset blir smidigt. Flytta sedan bort från lågan och dra snabbt utåt för att skapa en fin kapillärspets med en sluten lumen.
- Håll den fina spetsen horisontellt framför lågan och för den snabbt genom lågan i en utåtgående rörelse för att skapa en slät krok eller en L-formad kapillärspets.
- Använd den släta yttre krökningszonen på kapillärkroken som en fin skopa för att försiktigt lyfta och ta bort de intakta neuro-retinalkopparna från EFP-klustren.
OBS: Den släta vinkeln på glaskapillärkroken orsakar varken skador på cellerna eller skapar repor på odlingsytor. Detta enkla verktyg kan också användas effektivt för individuell hiPSC-kolonidelning i rutmönster och för att passera dem som små cellkluster under klonal expansion.
- Odling och underhåll av retinala koppar för att generera 3D-retinala organoider.
- Vid dag 25-30, tillsätt 4,0 ml förvärmt retinalt differentieringsmedium i en 60 mm skål med låg fastsättning innan du förbereder dig för skörden av neuro-retinala koppar.
- Arbeta under ett stereomikroskop med 0,63x-4,5x förstoring för att observera och manuellt plocka välformade neuro-retinalkoppar från enskilda EFP.
OBS: Utseendet på pigmenterade RPE-cellutväxter hjälper till att enkelt identifiera EFP och de centralt placerade neuro-retinala kopparna. Näthinnekopparna framträder som munkformade, cirkulära och genomskinliga 3D-strukturer, med tydliga radiella strimmor, bildade av de linjärt arrangerade och självmonterade retinala stamcellerna, i motsats till de tätt packade och sfäriska eller oregelbundna kluster som bildas av CNS-neuronerna eller neuralkamcellerna23. - Använd de flamdragna Pasture-pipettkrokarna för att försiktigt knuffa och skopa ut den centrala neuro-retinala ön inom enskilda EFP.
- Ställ in en 1 ml mikropipett för att aspirera 100 μL och använd 1 ml mikrospetsar med breda hålöppningar för att aspirera och överföra de flytande näthinnekopparna till de färska, lågvidhäftande odlingsrätterna tillagade i steg 4.2.1.
OBS: Användning av spetsar med mindre hålstorlek och högre sugtryck kan orsaka skjuvning och påverka näthinnekopparnas integritet. De ungefärliga dimensionerna på retinalkopparna är ca 1-2 mm i diameter. - Behåll näthinnekopparna i RDM som icke-vidhäftande suspensionskulturer och inkubera dem vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator .
- Dag 30-45: Byt medium dagligen genom att försiktigt luta skålen och låta näthinnekopparna sätta sig i cirka 30 sekunder. Följ en partiell matningsmetod, ta bort halva volymer förbrukat medium och ersätt med lika stora volymer färskt medium.
OBS: Undvik upprepad aspiration och överföringar för att förhindra skador på näthinnans koppar. Efter 1-2 veckors suspensionskultur växer näthinnekopparna något i storlek (1-3 mm) och utvecklas till självorganiserade 3D-retinala organoider (OC-1M) bestående av linjärt arrangerade, tidiga neuro-retinala förfäder som uttrycker PAX6 och CHX10 (figur 3Bi). - Dag 45-60: Odla retinala organoider i ytterligare 4 veckor i RDM innehållande 100 μM taurin (se materialtabell) för att stödja bättre överlevnad och härstamningsdifferentiering av neuro-retinala förfäder och utveckling av mogen retinal celltyp (OC-2M).
OBS: Cirka 70% -80% av de retinala eller optiska kopparna som plockas från EFP förblir intakta, behåller sin laminering och utvecklas till mogna retinala organoider efter 4 veckors suspensionskultur (OC-2M). - Kontrollera att de mogna retinala organoiderna vid 4 veckors suspensionskultur visar uppkomsten av RCVRN + och CRX + fotoreceptorprekursorer och mogna celler med en rudimentär inre segmentliknande förlängning i de yttersta cellskikten, vilket rekapitulerar den normala retinala utvecklingen och mognadsprocessen in vitro (figur 3Bii).
OBS: Efter avlägsnande av neuro-retinala koppar kan differentieringskulturerna kontinuerligt bibehållas i RDM. De proximala epitelutväxterna som omger neuronäthinnan innehåller retinala pigmenterade epitelceller (RPE), som ytterligare expanderar och mognar för att bilda pigmenterade RPE-monolager med typisk kullerstensmorfologi (figur 4). De distala utväxterna består huvudsakligen av okulärt ytepitel som bidrar till linsen och hornhinnansepitel. Önskade celltyper kan skördas från olika zoner av EFP-utväxt och berikas ytterligare för att etablera rena kulturer.
5. Karakterisering av retinala organoider
- Morfologisk och molekylär karakterisering
- Observera de vidhäftande EFP: erna och flytande retinala organoider under ett faskontrastmikroskop vid 4x och 10x förstoring och dokumentera deras morfologi och dimensioner.
- Samla cirka 20 retinala organoider i olika mognadsstadier (steg 4.2.3-4.2.6) i 1,5 ml mikrocentrifugrör med 1 000 μl spetsar med bred borrning. Låt organoiderna sätta sig i botten och aspirera ut mediet. Tvätta kopparna med 1x PBS.
- Ta bort överskott PBS och tillsätt 1,0 ml TRIzol-reagens (se materialförteckning). Inkubera vid rumstemperatur i 5 min. Homogenisera vävnaden med en rörstöt och triturera med en 1,0 ml pipett.
- Bered totalt RNA genom att följa standardreagensmetoden för RNA-isolering och rening, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
- Kontrollera RNA-kvaliteten på agarosgelen och kvantifiera den med hjälp av NanoDrop Spectrophotometer (se materialtabell).
- Konvertera 1-2 μg totalt RNA till cDNA med hjälp av det omvända transkriptasenzymet enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Se tabell 1 för en lista över genspecifika primrar.
- Bered kortfattat masterblandningen av RNA-primer i 10 μl total volym enligt tabell 2 och inkubera röret vid 65 °C i 5 minuter i en termisk cykler. Överför röret från termocykeln till is i 2 minuter.
- Bered under tiden mastermix 2 med de reagens som nämns i tabell 3. Tillsätt denna masterblandning till RNA-primerblandningsröret som beretts i steg 5.1.7. Blanda försiktigt.
- Inkubera provet vid 50 °C i 50 minuter, därefter 85 °C i 5 minuter och håll sedan 4 °C för att stoppa reaktionen.
- Använd det syntetiserade cDNA som en mall i PCR-reaktioner för att kontrollera uttrycket av neuro-retinal stamfader och mogna retinala cellmarkörer.
- Normalisera de totala cDNA-mallarna för varje prov, nämligen F2-UD (hiPSC-F2-3F1; odifferentierade celler), OC-1M (1 vecka gammal optisk kopp i suspensionskultur) och OC-2M (4 veckor gammal optisk kopp i suspensionskultur) genom semikvantitativ PCR med hjälp av hushållsgenerna såsom hE1fα eller GAPDH.
- Förbered masterblandningen för semikvantitativ PCR, såsom anges i tabell 4, och placera provrören för amplifiering i en termisk cykler. PCR-amplifieringsvillkoren nämns i tabell 5.
- Histologi och immunhistokemi
- Samla upp de optiska kopparna i ett 2,0 ml mikrocentrifugrör och aspirera överskottsmediet (steg 4.2.3-4.2.6). Skölj organoiderna med 1x PBS och tvätta och suspendera dem sedan i 500 μL 4% paraformaldehyd för att fixera dem över natten vid rumstemperatur.
- Nästa dag, tvätta kopparna i avjoniserat vatten. Låt kopparna stå i 95% alkohol (tre byten, 15-20 min vardera), följt av 100% alkohol (tre byten, 15-20 min vardera), en 1:1 blandning av absolut alkohol och xylen i 15 min, xylen (två byten, 15 min vardera) och paraffin (tre byten, 15 min vardera). Bädda in denna vävnad för att förbereda ett paraffinblock enligt standardprocedurer. Låt det svalna och stelna.
- Förbered tunna sektioner (~ 4-5 μm tjocklek) med hjälp av en mikrotom och placera dem på silanbelagda mikroskopiska glas (se materialförteckning) enligt standardhistologiprocedurer.
- För avparaffinisering, värm glasen vid 70 °C på ett värmeblock i 15-20 minuter. När vaxet smälter, tvätta glasen med xylen (tre byten, 3-4 min vardera), vilket tar bort paraffinet helt.
OBS: Ofullständig borttagning av paraffin resulterar i dålig / fläckig färgning av sektioner med en stor mängd bakgrundsljud. - Rehydrera glasen med olika procentsatser etanol (100%, 90% och 80%) i 3 minuter vardera. Skölj glasen med destillerat vatten och fortsätt med antigenhämtning.
- Innan antigenhämtningen påbörjas, förvärm citratbufferten (pH 6,0) i en Coplin-burk (se materialförteckning) med en mikrovågsugn tills den når 95-100 °C.
- Sänk ner glasen i förvärmd citratbuffert och värm burken i 15 minuter i en mikrovågsugn. Ta bort Coplin -burken från ugnen och låt den svalna vid rumstemperatur.
- Blockera sektionerna för endogent peroxidas genom att tillsätta en 1:1 blandning av metanol och väteperoxid i 5 minuter, följt av att tvätta sektionerna tre gånger med 1x PBS.
- Permeabilisera sektionerna med 0,5% Triton-X 100 i 15 min. Tvätta bilderna tre gånger med 1x PBS.
- Blockera den ospecifika bindningen av primär antikropp genom att inkubera sektionerna med 10% Fetal Bovine Serum (FBS) i 1x PBS i 1 timme.
- Inkubera sektionerna med primär antikropp i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta objektglasen tre gånger med 1x PBS i 3-5 minuter vardera för att avlägsna den obundna antikroppen.
- Tillsätt lämplig fluorescerande färgkonjugerad sekundär antikropp och inkubera i 45 minuter. Tvätta bilderna tre gånger med 1x PBS i 3-5 minuter vardera.
OBS: Antikropparna och deras respektive utspädningar nämns i materialtabellen. De retinala organoidsektionerna immunmärktes med PAX6 och CHX10 för att detektera tidiga neuro-retinala prekursorceller och med Recoverin och CRX för att detektera engagerade retinala och fotoreceptorprekursorceller. På liknande sätt användes anti-PAX6 och anti-MITF för att detektera RPE-prekursorer, och anti-CRALBP och anti-RPE65 användes för att detektera pigmenterade mogna RPE-celler genom immunocytokemi av 2D-monolagerkulturer. - Motfärga sektionerna med DAPI eller PI och montera dem på en glasskiva med antifade monteringsmediet (se Materialförteckning).
- Avbilda och dokumentera de immunmärkta sektionerna av retinala organoider och RPE-kulturer med hjälp av ett fluorescens- eller konfokallaserskanningsmikroskop för att undersöka olika cellskikt som uttrycker olika retinala markörer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Differentiering av hiPSC i ögonlinjer uppnås genom odling av cellerna i olika cocktails av odlingsmedium innehållande tillskott och tillväxtfaktorer i sekventiella steg vid olika tidpunkter, som beskrivs i figur 1. HiPSC-kulturerna bibehålls i Essential 8-medium, det pluripotenta stamcellsunderhållsmediet. När de når 70% -80% sammanflöde (figur 2A) ersätts mediet med differentieringsinduktionsmedium (DIM) på dag 0 (se steg 3.2) innehållande 1 ng / ml bFGF, 1 ng / ml Noggin och 1% N2-tillskott. Tillsammans med det neuralinducerande N2-tillskottet spelar Noggin, BMP-signaleringshämmaren, en avgörande roll för att rikta cellerna mot neuroektodermal härstamning genom att blockera mesodermalt och endodermalt engagemang. På 1: a, 2:a och 3: e dagen ökas koncentrationen av Noggin till 10 ng / ml (se steg 3.3 och 3.4). Från den 4: e dagen, DIM ersätts med Retinal Differentiation Medium (RDM) (steg 3.5), och kulturerna upprätthålls kontinuerligt i upp till 30 dagar. B27 i RDM-cocktail innehåller ytterligare tillskott som flera antioxidanter och D-galaktos, vilket främjar aerob metabolism och hjälper till att minska oxidativ stress, vilket förbättrar livskraften hos differentierande stamceller. Dessutom främjar närvaron av retinolacetat (vitamin A) och tillväxthormoner såsom trijod-I-tyronin (T3) neural och retinal härstamningsdifferentiering.
På den 14: e till 18:e dagen observeras bildandet av neurala rosetter, vilket markerar initieringen av ögonfältengagemang (figur 2B). Ögonfältsföregångarna inom neurala rosetter sprider sig ytterligare och självorganiserar sig i distinkta ögonfältprimordiala kluster (EFP) med cirkulära neuro-retinala strukturer i mitten. Andra celltyper som retinalt pigmenterat epitel (RPE), neuralkamepitel och de som bidrar till ögonytan dyker upp och migrerar ut som sammanhängande epitel med väldefinierade marginaler. Välformade ögonfält, som beskrivits ovan, kan observeras mellan den 21: e och 28:e differentieringsdagen (figur 2C, D). Den centrala ön av neuro-retinala koppar skördas mellan dag 25-30 med hjälp av en flamdragen glaspasteurpipett (figur 2E) och bibehålls som icke-vidhäftande suspensionskulturer i RDM i ytterligare 1-2 veckor, fram till dag 45. De prolifererande retinala förfäderna självorganiserar sig vidare för att bilda flerskiktade 3D-retinala organoider med en diameter på cirka 2-3 mm (figur 2F, G). Från dag 46 kompletteras RDM med 100 μM taurin för att främja neurogenes och för att förbättra cellöverlevnaden i långsiktiga organoidkulturer in vitro (figur 2H).
Retinala organoider karakteriseras vid olika mognadsstadier för uttryck av flera retinala stamfadermarkörer med användning av omvänd transkription PCR (RT-PCR) och immunohistokemi (IHC). För detta skördas organoiderna för total RNA-isolering den 30: e och 60: e differentieringsdagen. RT-PCR-resultat bekräftade induktion och uttryck av neuro-retinala markörer såsom NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 och PDE6C i 1 vecka gamla retinala organoider (4-5 veckor efter differentiering, OC-1M) och 4 veckor gamla retinala organoider 8,12 (7-8 veckor efter differentiering, OC-2M) (Figur 3A). Immunohistokemi och fluorescensavbildning har bekräftat uttrycket av tidiga retinala stamfadermarkörer PAX6, CHX10 och OTX2 i OC-1M och mogna retinala markörer RCVRN och CRX i OC-2M 8,12 (figur 3Bi,ii).
Förutom de centrala neuro-retinala kopparna framträder de andra okulära celltyperna, såsom retinalt pigmenterat epitel (RPE), neuralkamepitel och okulära ytepitelceller, och migrerar ut ur EFP. De neuroektoderm-härledda RPE-progenitorerna framträder som kompakt arrangerade epitelceller som omger EFP, som gradvis mognar och pigmenteras längs migrationsmarginalerna från dag 30-45 (figur 4A-C). Dessa vidhäftande differentieringskulturer, efter avlägsnande av näthinnekoppar, kan därför förlängas till dag 45 för att skörda prolifererande RPE-prekursorer (figur 4D), som kan anrikas ytterligare för att förbereda monolagerkulturer av fullt mogna pigmenterade RPE-celler. Mogen pigmenterad RPE kan ses som monolager med typisk kullerstensmorfologi (figur 4E). RPE-cellidentiteten bekräftas ytterligare av immunocytokemi med antikroppar mot RPE-specifika markörer såsom MITF (RPE-stamfadermarkör), PAX6 (stamfader och mogen RPE-markör) och RPE65 (mogen RPE-markör)10,12 (figur 4F-H).
Pluripotenta stamcellshärledda retinala organoider kan således fungera som in vitro-modeller för att studera olika ärftliga näthinnesjukdomar 7,8,9. Sjukdomsspecifika stamcellsmodeller utvecklas antingen genom att generera patientspecifika iPSC-linjer eller genom att introducera sjukdomsspecifika mutationer i friska kontroll-iPSC-linjer med hjälp av den CRISPR-baserade genredigeringsmetoden 7,8. De muterade iPSC: erna kan eller inte kan differentieras effektivt till retinala celltyper beroende på de involverade genmutationerna. Medan de flesta friska kontrollcellinjer följde tidslinjen som beskrivs ovan, kan det finnas avvikelser vid sjukdomsspecifika iPSC när det gäller differentieringstidslinjer, EFP-morfologi, retinal koppstorlek, laminering och mognad. Den retinala differentieringspotentialen hos en RB1-/- hiPSC-linje (LVIP15-RB1-CS3) som bär en biallelisk deletion av 10 bp inom exon 18 av den humana RB1-genen undersöktes, vilket resulterar i en ramförskjutning och fullständig förlust av RB1-proteinuttryck. Det observerades att förlusten av RB1-uttryck inte påverkade ögat och tidig retinal härstamningsdifferentiering av den muterade hiPSC-linjen. En markant fördröjning av tidslinjerna och en minskning av EFP-formningseffektiviteten observerades dock. De atypiska EFP som uppstod hade onormala aggregat av retinala förfäder som misslyckades med att laminera och självorganisera sig i lämpliga näthinnekoppar (figur 5A, B) eller saknade den omgivande zonen av RPE och okulärt ytepitel (OSE) (figur 5C). När de plockades och upprätthölls som suspensionskulturer bildade dessa retinala stamfaderkluster oregelbundna neuro-retinala aggregat (figur 5D).
Figur 1: Tidslinje som representerar differentieringen av iPSC till retinala organoider. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Självorganiserad 3D-retinal organoidgenerering. a) Odling av hiPSC-kulturer under foderfria förhållanden. (B) Utveckla neuronala rosetter vid dag 14 av differentiering (asterisk). (C,D) Ögonfälts primordiala (EFP) kluster som innehåller en central neuro-retinal koppliknande struktur (svarta pilar) omgiven av epitelets migrerande zon (vita pilar) vid dag 21-28 av differentiering. (E) Flamdragen glaspasteurpipett med krokspets. Den släta kurvan vid gångjärnsregionen används för att knuffa och lyfta näthinnekopparna (pil). (F,G) Retinalkoppar skördas vid dag 25 och odlas under suspension för att generera självorganiserade 3D-retinala organoider. (H) Mogna retinala organoider i suspensionskultur på dag 45. Skalstänger: 100 μm (A, B, D, G); 200 μm (C,F,H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Karakterisering av retinala organoider. (A) Profilering av retinalt genuttryck med RT-PCR av den odifferentierade normala hiPSC-linjen 23 (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) och de differentierade normala optiska kopparna plockade vid 3-4 veckors differentiering och mognade ytterligare i suspensionskulturen i 1 vecka (OC-1M) respektive 4 veckor (OC-2M). cDNA för alla testprover normaliserades med eEF1a som laddningskontroll. (B) Konfokala bilder av immunmärkta sektioner av (i) omogna retinala organoider (OC-1M) med antikroppar mot neuro-retinala stamfadermarkörer CHX10, PAX6 och OTX2 (i rött) och (ii) mogna retinala organoider (OC-2M) med antikroppar mot fotoreceptorprekursormarkörerna Recoverin och CRX (i rött). Det markerade yttersta lagret av retinala organoider med differentierande fotoreceptorceller (ruta) i de vänstra panelerna zoomas och visas i de högra panelerna. DAPI användes som motfläck (i blått). De rudimentära inre segmentliknande förlängningarna markeras med vita pilar. Skalstapel: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Uppkomst av olika okulära celltyper. (A) EFP-kluster med neuro-retinalkoppen i mitten och migrerande RPE-utväxter som visar pigmentering längs framkanterna (vit pil). (B) Väl differentierade pigmenterade epitelutväxter från flera EFP runt neuro-retinal ön. (C) Högre förstoring av en EFP visar migrationszonen för RPE-förfäder (vit pil) och okulärt ytepitel (asterisk) som omger en neuro-retinal kopp. D) Utvidgade vidhäftande kulturer som utvecklat monolager av omogna RPE-celler innehållande både pigmenterade och icke-pigmenterade celler. E) Enskiktskulturer av fullmogna och pigmenterade RPE-celler som visar kullerstensmorfologi dag 60. (F-H) RPE-celler som uttrycker PAX6, MITF och RPE65 i grönt. Skalstapel: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-H). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Onormal näthinnekoppbildning i RB1-/- muterade iPSC. (A,B) EFP med onormala aggregat av retinala stamfäder med förvrängd laminering och avsaknad av strimmor. (C) EFP med miniatyr neuro-retinal kopp men saknar den omgivande zonen av RPE och okulärt ytepitel (pil). (D) Oregelbundna neuro-retinala aggregat bildade i suspensionskulturen. Skalstapel: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Primer namn | Primtalssekvens (5'-3') | Bandstorlek (bp) | Referens-ID | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNeuroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | RCVRN | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tabell 1: Förteckning över genspecifika primrar för RT-PCR.
| Komponenter för RNA-Primer-blandning | Volym (i μL) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC-behandlat vatten | upp till 10 |
| Total reaktionsvolym | 10 |
Tabell 2: RNA-primer mastermix för cDNA-omvandling.
| Komponenter för Mastermix 2 | Volym (i μL) |
| 10x RT-buffert | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M DTT | 2 |
| SuperScript III omvänt transkriptas | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Total reaktionsvolym | 10 |
Tabell 3: Master mix 2 för cDNA-konvertering.
| Komponenter i PCR | Volym (i μl)/reaktion |
| 10x PCR-buffert | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| Främre primer (5 μM) | 1 |
| Omvänd primer (5 μM) | 1 |
| Taq-polymeras | 0.2 |
| cDNA-mall (50-100 ng) | 1 |
| Sterilt Milli-Q-vatten | 12.8 |
| Total reaktionsvolym | 20 |
Tabell 4: Mastermix för semikvantitativ PCR.
| Temperatur | Tid | Antal cykler | |
| Denaturering | 95 °C | 5 minuter | x 1 |
| Denaturering | 95 °C | 30 sekunder | x 35 |
| Glödgning | 50-60 °C | 30 sekunder | |
| Förlängning | 72 °C | 30 sekunder | |
| Slutlig förlängning | 72 °C | 10 minuter | x 1 |
Tabell 5: Villkor för PCR-amplifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC är ett kraftfullt verktyg för att studera organ- och vävnadsutveckling in vitro. Att rekapitulera sjukdomsfenotypen genom att differentiera friska kontra sjukdomsspecifika hiPSC mot retinallinjen kan hjälpa till att få nyare insikter i patofysiologin hos olika former av ärftliga retinala dystrofier. Flera protokoll har beskrivits och antagits för in vitro-differentiering av PSC till retinala celltyper. De flesta av dem involverar användning av odlingsmedium som innehåller komplexa cocktails av rekombinanta tillväxtfaktorer, kosttillskott, små molekyler och reagens, såsom: N1-, N2- och B27-tillskott; BMP- och TGFβ-signalblockerare som Noggin, SB431542, LDN193189 och Follistatin, eller inducerare såsom Activin A, Lefty och IDE1; kanoniska Wnt-signalblockerare såsom DKK1, SFRP, IWP-2 och IWR-1-endo, eller inducerare såsom CHIR99021, SB216763 och CKI-7; FGF-receptorsignalblockerare såsom PD0325901 och PD173074 eller inducerare som bFGF; hack signalhämmare såsom DAPT; andra signalmolekyler såsom insulinliknande tillväxtfaktor (IGF-1); retinsyra; tillväxthormoner såsom trijodtyronin (T3) och hydrokortison; och antioxidanter och andra överlevnadsfaktorer såsom askorbinsyra, nikotinamid, taurin, dokosahexaensyra, 1-tioglycerol, etc. Dessa komponenter ingår i odlingsmediet i olika stadier av stamcellsdifferentiering för att stimulera eller modulera olika signalkaskader för att inducera ögon- och retinal härstamningsåtagande 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.
Här beskrivs en enklare, robust och effektiv metod för att generera retinala organoider direkt från nästan sammanflytande, vidhäftande kulturer av hiPSC. Det förenklade protokollet innebär att man använder färre kosttillskott, tillväxtfaktorer och små molekyler som primärt utlöser den initiala differentieringen av PSC i neuroektodermal härstamning. Efterföljande differentieringssteg är beroende av PSC: s inneboende förmåga att synkront differentiera i celltypen av relaterade linjer, som sedan självorganiserar och ömsesidigt reglerar utvecklingen och rumslig organisation av flera celltyper som bidrar till bildandet av komplexa vävnader. Det gradvisa tillbakadragandet av bFGF och tillägget av Noggin hjälper till med framgångsrik induktion av tidigt neuroektodermalt ödesåtagande inom 3 dagar efter differentiering. Fortsatt underhåll av differentieringskulturer i neuralinducerande RDM, utan tillägg av några tillväxtfaktorer eller små molekyler, resulterar i induktion av ögonfältets primordiala (EFP) strukturer med tydliga marginaler, inom 3-4 veckor efter differentiering. EFP innehåller multipotenta stamceller, som vid ostört och fortsatt underhåll resulterar i differentiering av flera linjer och självmontering för att bilda komplexa EFP bestående av centralt placerade neuro-retinala koppar eller optiska koppar (OC), omgivna av andra relaterade okulära celltyper såsom retinalt pigmenterat epitel (RPE), neuralkamepitel och okulärt ytepitel. Alternativt kan PSC odlas som suspensionskulturer från dag 1-3 för att bilda EB under identiska odlingsförhållanden. EB: erna kan pläteras ytterligare på dag 4 och odlas som vidhäftande kulturer på matrisbelagda ytor i RDM för att initiera retinal härstamningsdifferentiering, som beskrivits ovan. Friska differentierande kulturer ger rutinmässigt upphov till cirka 20-30 EFP per brunn av en 6-brunnsplatta. OC kan skördas från EFP vid 3-4 veckors retinal differentiering och bibehålls i suspensionskulturer i ytterligare 30-60 dagar, för att möjliggöra differentiering av neuro-retinala progenitorer och för att generera mogna retinala organoider. Efter 4 veckors suspensionskultur förblir cirka 70% -80% av de optiska kopparna som plockas från EFP intakta, behåller sin laminering och utvecklas till mogna retinala organoider (OC-2M), med RCVRN + och CRX + engagerade fotoreceptorceller och inre segmentliknande förlängningar inom de yttersta skikten.
Sammanflödet av växande iPSC-kulturer är avgörande vid tidpunkten för initiering av differentiering och förskjutning av kulturerna till DIM. Kulturer med mindre kolonier och sammanflöde under 60%, och de som är precociously differentierande, resulterar i signifikant minskade EFP-nummer. När ögonfältkluster dyker upp, ska den centrala ön av neuro-retinala koppar skördas inom 1 vecka. Detta kan göras genom att försiktigt knuffa och lyfta de intakta kopparna med hjälp av vinkeln eller det böjda området för den flamdragna glaskapillärspetsen, som beskrivs i protokollavsnittet. Försiktighet måste vidtas för att inte skada kopparna. Ytterligare förseningar i plockning skulle resultera i utplattning och förlust av 3D-organisation på grund av spridning och migration av neuro-retinala stamceller, vilket gör skörden svår och resulterar i atypiska retinala organoider.
Effektiviteten av ögonfältinduktion och mognad av näthinnekoppar varierar mellan olika sjukdoms- eller patientspecifika hiPSC-linjer, beroende på de underliggande genetiska defekterna. Till exempel var retinal härstamningsåtagande och EFP-bildande effektivitet för en RP-sjukdomsspecifik linje identisk med den för de friska kontrollcellerna, medan en RB1-nolllinje misslyckades med att bilda EFP (data visas inte). Vissa linjer som bär mutationer kopplade till Leber medfödd amauros bildade atypiska EFP med defekter i storlek, självmontering, laminering och mognad av retinala förfäder (data visas inte). Ytterligare molekylära valideringar och genuttrycksprofilering av patientspecifika retinala organoider jämfört med friska kontrollvävnader skulle vara nödvändiga för att förstå patofysiologin för ett sjukdomstillstånd. Med tanke på variationen i patientgenomer och involveringen av multigennätverk i sjukdomsmanifestationer kan det också vara viktigt att studera retinala organoider härledda från isogena iPSC-linjer för att fastställa en absolut genotyp-fenotypkorrelation i sjukdomsmodelleringsstudier. Sådana isogena linjer kan skapas antingen genom riktade genknockouts i friska kontrollinjletter eller genom att korrigera de patogena mutationerna i patientspecifika iPSCs, med hjälp av avancerade genomredigeringstekniker 8,9.
Sådana intakta retinala organoider härrörande från normala eller sjukdomsspecifika iPSC-linjer kan användas vid screening och testning av nya läkemedel. Fotoreceptorprekursorer inom retinala organoider och andra okulära celltyper, såsom RPE och hornhinneepitel inom EFP-utväxten, kan isoleras ytterligare och berikas för deras tillämpningar inom grundforskning och regenerativ medicin. Protokollet som beskrivs här kan enkelt anpassas till GMP-kompatibla processer för beredning av celler av klinisk kvalitet avsedda för prekliniska och kliniska prövningsutvärderingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har ingen intressekonflikt eller finansiella upplysningar.
Acknowledgments
Författarna erkänner det vetenskapliga och tekniska stödet från Dr. Chitra Kannabiran, genetiker; Dr. Subhadra Jalali, näthinnekonsult; Dr. Milind Naik, okuloplastikkirurg; och Dr. Swathi Kaliki, okulär onkolog vid LV Prasad Eye Institute, Hyderabad mot generering av normala och patientspecifika iPSC-linjer. Författarna erkänner FoU-bidragen från Science and Engineering Research Board, Institutionen för vetenskap och teknik (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Institutionen för bioteknik (IM), (BT / PR32404 / MED / 30/2136 / 2019) och Senior Research Fellowships från ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) och CSIR (V.K.P.), Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
