Summary
Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.
Abstract
Pluripotent kök hücreler, in vitro hastalık modelleme çalışmaları ve rejeneratif tedaviler geliştirmek için yararlı olan karmaşık doku organoidleri üretebilir. Bu protokol, retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı primordial kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar, yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrid bir kültür sisteminde retinal organoidlerin üretilmesinin daha basit, sağlam ve aşamalı bir yöntemini tanımlamaktadır. Ayrıca, her EFP'deki çörek şeklindeki, dairesel ve yarı saydam nöro-retinal adalar, çok katmanlı 3D optik kaplar (OC-1M) üretmek için 1-2 hafta boyunca retinal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan kültür kapları kullanılarak süspansiyon altında manuel olarak toplanır ve kültürlenir. Bu olgunlaşmamış retinal organoidler PAX6+ ve ChX10+ proliferasyonlu, multipotent retinal öncülleri içerir. Öncü hücreler organoidler içinde doğrusal olarak kendi kendine monte edilir ve farklı radyal çizikler olarak görünür. Süspansiyon kültüründen 4 hafta sonra, retinal progenitörler post-mitotik arrest ve olgun retinal organoidleri (OC-2M) oluşturmak için soy farklılaşmasına uğrarlar. Fotoreseptör soyu işlenen öncüller, retinal organoidlerin en dış katmanlarında gelişir. Bu CRX + ve RCVRN + fotoreseptör hücreleri, iç segment benzeri uzantıları görüntülemek için morfolojik olarak olgunlaşır. Bu yöntem, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanılarak retinal organoidler üretmek için benimsenebilir. Tüm adımlar ve prosedürler, tekrarlanabilirliği sağlamak ve temel bilim ve çeviri araştırmalarında daha geniş uygulamalar için açıkça açıklanmış ve gösterilmiştir.
Introduction
Retina, omurgalı gözün arkasında bulunan ve ışık sinyallerini foto-transdüksiyon yolu olarak bilinen biyokimyasal bir fenomenle sinir uyarılarına dönüştüren ışığa duyarlı bir dokudur. Retinanın fotoreseptör hücrelerinde üretilen ilk sinir uyarıları, diğer retinal internöronlara ve retinal ganglion hücrelerine (RGC'ler) dönüştürülür ve beynin görsel korteksine ulaşır, bu da görüntü algısına ve görsel tepkiye yardımcı olur.
Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 1 milyonu Asya'da olmak üzere tahmini 1,5 milyon çocuk kördür. Kalıtsal Retina Distrofisi (IRD), dünya çapında 4.000 kişiden 1'ini etkileyen majör bir körleme hastalığıdır 1,2,3, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili körlük prevalansı gelişmekte olan ülkelerde %0,6-%1,1 arasında değişmektedir 4. IRD'ler, retina gelişimi ve fonksiyonunda rol oynayan 300'den fazla farklı gendeki kalıtsal genetik kusurlardan kaynaklanır5. Bu tür genetik değişiklikler, normal retina fonksiyonlarının bozulmasına ve retina hücrelerinin, yani fotoreseptör hücrelerin ve retina pigmentli epitelin (RPE) kademeli olarak dejenerasyonuna neden olur ve böylece ciddi görme kaybına ve körlüğe yol açar. Kornea, lens vb. ile ilgili diğer kör edici durumlarda muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, retina distrofileri ve optik sinir atrofilerinin bugüne kadar kanıtlanmış bir tedavisi yoktur. Yetişkin bir insan retinasında kök hücrelerbulunmadığından 6, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi alternatif kaynaklar, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir tedarikini sağlayabilir ve in vitro hastalık modelleme çalışmaları için gerekli olan karmaşık doku organoidlerinin geliştirilmesi ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için büyük bir umut vaat edebilir7, 8,9,10.
Birkaç yıllık retinal araştırma, erken retina gelişimini düzenleyen moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. PSC'lerden retinal hücreler ve 3D organoidler üretmek için kullanılan protokollerin çoğu, bilinen biyolojik süreçleri aşamalı bir şekilde modüle etmek için hücreleri karmaşık bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller kokteylinde kültürleyerek bu gelişimsel olayları in vitro olarak özetlemeyi amaçlamaktadır. Bu şekilde üretilen retinal organoidler başlıca retinal hücrelerden oluşur: retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), internöronlar, fotoreseptörler ve retina pigmentli epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Retinal organoidleri kullanarak IRD'leri modellemeye yönelik başarılı girişimlere rağmen, farklılaşma sırasında büyüme faktörlerinin ve küçük moleküllerin karmaşık kokteyline olan gereksinim ve retinal organoid üretiminin nispeten düşük verimliliği, çoğu protokolde büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bunlar büyük ölçüde embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından in vitro gelişimin farklı aşamalarında karmaşık kültür koşullarını kullanarak retinal soylara kademeli olarak farklılaşmalarını içerir20,21,22.
Burada, sağlıklı kontrol ve retina hastalığına özgü hiPSC'lerden kompleks 3D nöro-retinal organoidler geliştirmek için basitleştirilmiş ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, embriyoid vücut oluşumuna ihtiyaç duymadan yakın birleşimli hiPSC kültürlerinin doğrudan farklılaşmasını kullanır. Ayrıca, kültür ortamının karmaşıklığı basitleştirilmiştir, bu da onu yeni araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir teknik haline getirmektedir. Retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı ilkel kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrit bir kültür sistemini içerir. Ayrıca, her EFP içindeki dairesel nöro-retinal adalar, PAX6 + ve CHX10 + prolifere eden nöro-retinal öncüllerden oluşan çok katmanlı 3D retinal kaplar veya organoidler hazırlamak için 1-2 hafta boyunca süspansiyon kültürlerinde manuel olarak toplanır ve yetiştirilir. Retinal organoidlerin 100 μM Taurin içeren ortamda 4 hafta daha uzatılmış kültürü, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve ilkel iç segment benzeri uzantılara sahip olgun hücrelerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HiPSC'leri içeren tüm deneyler, standart laboratuvar uygulamalarına, etik ve biyogüvenlik kılavuzlarına bağlı kalınarak ve Kurumsal Etik Komitesi (IEC), Kurumsal Kök Hücre Araştırmaları Komitesi (IC-SCR) ve Kurumsal Biyo-Güvenlik Komitesi (IBSC) gibi düzenleyici kurumların onaylarıyla aseptik olarak gerçekleştirilmiştir.
1. iPSC kültürü ve retina farklılaşma ortamı ve reaktiflerinin hazırlanması
- iPSC kültürü ve bakım ortamı
- Normal hiPSC hattı 23'ü (hiPSC-F2-3F1) ve CRISPR düzenlenmiş, RB1-/- hiPSC hattını (LVIP15-RB1-CS3, biallelik, insan RB1 geninin ekzon 18'i içinde 10 bp'lik kare kaydırmalı silme ile) matris kaplı (bazal membran matrisi kaplı; bkz.
NOT: Bu protokol, bazal membran matrisinin rekombinant vitronektin (VTN-N) kaplama ile değiştirilmesiyle tamamen ksenosuz hale getirilebilir. 50x Essential 8 takviyesi (Essential 8 orta boy kiti ile birlikte verilir; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 100 U/mL Penisilin-Streptomisin çözeltisi ekleyerek eksiksiz Essential 8 ortamını hazırlayın. Alternatif olarak, hiPSC'ler tam mTeSR1 ortamı kullanılarak da kültürlenebilir.
- Normal hiPSC hattı 23'ü (hiPSC-F2-3F1) ve CRISPR düzenlenmiş, RB1-/- hiPSC hattını (LVIP15-RB1-CS3, biallelik, insan RB1 geninin ekzon 18'i içinde 10 bp'lik kare kaydırmalı silme ile) matris kaplı (bazal membran matrisi kaplı; bkz.
- Hücre Ayrışma Çözeltisi (1x CDS)
- İnsan iPSC'lerinin enzimsiz ayrışması ve geçişi için, 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) 0.5 mM EDTA, pH 8.0 ve 30 mM NaCl içeren CDS'yi hazırlayın (bkz.
- 100 mL 1x CDS hazırlamak için, 99 mL 1x DPBS'ye 100 μL 0,5M EDTA ve 1 mL 3 M NaCl stok çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve 0,22 μm filtre kullanarak sterilize edin.
- Diferansiyasyon İndüksiyon Ortamı (DIM)
- %10 Nakavt Serum Replasmanı (KOSR), 1x Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U/mL Penisilin-Streptomisin, 200 μM L-Askorbik asit ve %1 N2 takviyesi ile desteklenmiş DMEM-F12 Bazal ortamını kullanarak DIM'i hazırlayın (bkz.
- Retina Diferansiyasyon Ortamı (RDM)
- RDM'yi,% 10 Nakavt Serumu (KOSR), 1x Esansiyel Olmayan Amino Asit (NEAA), 2 mM GlutaMax, 100 U / mL Penisilin-Streptomisin, 200 μM L-Askorbik asit ve% 2 B27 takviyesi (A vitamini ile) ile desteklenmiş DMEM-F12 Bazal ortamı kullanarak hazırlayın (bkz.
- Hücre dışı matris kaplı hücre kültürü yüzeyleri
- hESC nitelikli bodrum membran matrisini gece boyunca bir buz kovasında, tercihen 4-8 ° C'de bir buzdolabının içinde çözün. 20 mL buz gibi soğuk DMEM-F12 bazal ortam ekleyerek çözülmüş 100x matris stoğunu (5 mL) 1:5 oranında seyreltin ve 20x stok çözeltisi hazırlamak için hafifçe dönerek karıştırın.
- Önceden soğutulmuş pipet uçları ve steril mikrosantrifüj tüpleri kullanarak buz üzerinde 0,5 mL alikot hazırlayın. Şişeleri 20x stok olarak etiketleyin ve -80 ° C'lik bir dondurucuda 6 aya kadar dondurulmuş olarak saklayın.
- Hücre kültürü yüzeylerini (kültür kapları veya 6 delikli plakalar) kaplamak için, buz üzerinde 20x matrisli bir aliquot çözün ve 100 mm'lik bir tabağı veya 6 delikli bir plakayı (1.5 mL / kuyucuk) kaplamak için yeterli olan 10 mL 1x matris kaplama çözeltisi hazırlamak için buz gibi soğuk DMEM-F12 bazal ortamı kullanarak 1:20 oranında seyreltin.
NOT: Matris çözeltisini kullanmadan önce pipetleri/mikro uçları buz gibi soğuk ve steril DPBS aspire ederek önceden soğutun. Çözme ve matrisin tüm işlemleri, oda sıcaklıklarında polimerizasyonu ve jelleşmeyi önlemek için önceden soğutulmuş pipetler/mikro uçlar kullanılarak buz üzerinde yapılmalıdır. - 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1,5 mL 1x matris kaplama çözeltisi ekleyin, eşit kaplamayı sağlamak için plakayı yavaşça döndürün ve plakaları% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Matrisin kültür yüzeylerinde düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için plakaları en az 1 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
- Hücreleri tohumlamadan önce, 5 mL'lik steril bir pipet kullanarak kaplama çözeltisini aspire edin ve sıvı atıkları atın. Hemen taze kültür ortamı ekleyin (6 delikli bir plakanın 2 mL / kuyusu) ve hücreleri 150.000-200.000 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Kullanım sırasında plakaların kurumasına izin vermeyin.
NOT: Alternatif olarak, ksenosuz bir kültür protokolü için 0,5 μg/mL'lik son konsantrasyonda rekombinant vitronektin (VTN-N) kaplama kullanılabilir.
- hESC nitelikli bodrum membran matrisini gece boyunca bir buz kovasında, tercihen 4-8 ° C'de bir buzdolabının içinde çözün. 20 mL buz gibi soğuk DMEM-F12 bazal ortam ekleyerek çözülmüş 100x matris stoğunu (5 mL) 1:5 oranında seyreltin ve 20x stok çözeltisi hazırlamak için hafifçe dönerek karıştırın.
2. İnsan iPSC kültürlerinin oluşturulması
- HiPSC'lerin çözülmesi ve yeniden canlandırılması
- 6 delikli bir plakanın bir kuyusunu 1x membran matris çözeltisi ile kaplayın. Kültür yüzeyinin polimerizasyonuna ve homojen kaplamasına izin vermek için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 1 saatlik inkübasyondan sonra, kaplama çözeltisini çıkarın ve hücreleri canlandırmadan önce 10 μM Rho-kinaz inhibitörü, Y-27632 (10 mM stokun 1 μL / mL'si; Malzeme Tablosuna bakınız) içeren 1 mL önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamı ekleyin.
- Bir hiPSC kriyoviyal stoğunu (1 x 106 hücre/şişe) sıvı azot kabından çıkarın. Kriyoviyal 37 ° C'lik bir su banyosunda yumuşak bir dönüş ile hızla çözülür.
NOT: Şişeyi tamamen çözmeyin; Geçiş numarasını not edin, şişeyi yüzey sterilize edin ve% 70 izopropil alkol içeren tüy bırakmayan bir çubukla kurulayın. - Steril 1 mL'lik pipet ucu kullanarak, kriyovyal içerikleri, Y-27632 içermeyen 2 mL önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamından oluşan taze bir 15 mL tüpe aspire edin. Tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin. Supernatan'ı atın.
- Hücre peletini 10 μM Y-27632 içeren 1.0 mL tam Essential 8 ortamında yeniden askıya alın.
- Bu hücre süspansiyonunu, matrisi rahatsız etmeden matris kaplı yüzeylere, duvarlar boyunca dağıtarak ekleyin. Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için plakayı yavaşça çapraz yönde sallayın.
- Hücrelerin yapışmasını ve çoğalmaya başlamasını sağlamak için% 5 CO2 inkübatörde plakaları 37 ° C'de inkübe edin.
- 12-24 saat sonra, harcanan ortamı değiştirin ve kültürleri Y-27632 olmadan önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamında tutun.
- Her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin ve kültürleri% 70 -% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
NOT: HiPSC kültürleri için 1:6'lık bir bölünme oranı rutin olarak takip edilir ve 3-4 günlük düzenli aralıklarla geçirilir.
- Retinal soy farklılaşmasını başlatmak için hiPSC'lerin geçişi ve kaplanması
- Harcanan ortamı, 6 kuyucuklu plakalarda% 70-80 oranında akıcı insan iPSC kültürlerinden aspire edin.
- Her bir kuyucuğa 1 mL CDS (adım 1.2) ekleyin ve hücreler toplanana kadar 5-7 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. CDS'yi dikkatlice çıkarın, hücreleri ayırmamaya dikkat edin ve 2 mL taze Essential 8 ortamı ekleyin ve bir pipet kullanarak hafifçe tritüre edin.
- Hücre süspansiyonunu 6 hücreli bir plakanın bir kuyucuğundan 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplayın ve tüpü oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1.000 x g'de döndürün. Supernatan'ı atın.
- Hücre peletini 1,2 mL Essential 8 ortamında yeniden askıya alın ve adım 1.5'te açıklandığı gibi, 1.5 mL iPSC kültür ortamı içeren 1.5 mL iPSC kültür ortamı içeren matris kaplı 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna hücre süspansiyonunun 200μL'sinin 200μL'sini (1:6 bölünme oranı) dağıtın.
- 12-24 saat sonra, harcanan ortamı değiştirin ve kültürleri Y-27632 olmadan önceden ısıtılmış tam Essential 8 ortamında tutun.
- Kültürler %70-%80 birleşim noktasına ulaşana kadar her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin.
3. HiPSC'lerin göz alanlarına ve retina soyuna farklılaşması
NOT: Farklılaştırma işleminin şematik bir taslağı Şekil 1'de gösterilmiştir.
- HiPSC kültürleri %70-%80 birleşim noktasına ulaştığında farklılaşma prosedürünü başlatın.
- 0. günde, hiPSC bakım ortamını 1 ng/mL bFGF ve 1 ng/mL Noggin içeren DIM (adım 1.3) olarak değiştirin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2.0 mL orta ekleyin ve hücreleri% 5'lik bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de tutun.
NOT: bFGF'nin kademeli olarak geri çekilmesi PSC'lerin farklılaşmasına neden olur ve başlangıç aşamalarında artan Noggin konsantrasyonlarının (birkaç BMP'nin inhibitörü) eklenmesi, ektodermal soy farklılaşmasına ve nevralizasyonaneden olur 11,12 ve mezoderm ve endoderm taahhüdünü bloke eder. Alternatif olarak, Noggin LDN193189 ile değiştirilebilir. Daha önce20,21 bildirilen ikili SMAD inhibisyon stratejisinin aksine, bu protokol Aktivin veya SB-431542 eklenmesini gerektirmez. - 1. günde, harcanan ortamı değiştirin ve 1 ng / mL bFGF ve 10 ng / mL Noggin içeren DIM ekleyin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve koruyun.
- 2-3. günde, harcanan ortamı çıkarın ve yalnızca 10 ng / mL Noggin içeren DIM ekleyin. 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin. Hücreleri% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin ve koruyun.
NOT: Kullanmadan önce kültür ortamını daima 30-37 °C'ye ısıtın. Erken farklılaşma kültürlerinde aşırı yüzerler ve ölü hücreler gözlenebilir. Bu koşullar altında, kültürleri bir kez 1x DPBS ile yıkayın ve retinal farklılaşma ortamını ekleyin. Harcanan ortam üzerindeki sterilite testleri haftalık veya gerektiğinde yapılabilir. - 4. günde, harcanan ortamı kaldırın ve RDM'yi ekleyin (adım 1.4). 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2,0 mL ekleyin ve RDM'deki kültürleri %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de tutmaya devam edin ve her gün taze bir ortam değişimi yapın.
NOT : Alternatif olarak, PSC'ler, DIM'de aynı kültür koşulları altında embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için 5 x 10 3 hücre/100 μL/kuyu hücre yoğunluğunda, yapışkan olmayan ve yuvarlak tabanlı 96 delikli plakalarda,1-3 . günlerden itibaren süspansiyon kültürleri olarak yetiştirilebilir. 4. günde iyi biçimlendirilmiş EB'ler, RDM içeren matris kaplı plakalara kaplanabilir ve yapışmasına izin verilir, çoğalır ve aşağıda açıklandığı gibi farklılaşır. - 14-18. günlerde, erken göz alanı progenitörlerinden oluşan nöral rozet benzeri alanların ortaya çıkması için kültürleri mikroskop altında 10x büyütmede gözlemleyin (Şekil 2B).
- 21-28. günlerde (3-4 hafta), nöro epitel ve oküler yüzey epitelinin bitişik çıkıntıları ile çevrili merkezi bir dairesel 3D nöro-retinal yapı adası ile kendi kendini organize eden, farklı EFP'lerin ortaya çıkışını gözlemlemek için kültürleri mikroskop altında 4x ve 10x büyütmede gözlemleyin (Şekil 2C, D).
NOT: Normal bir hiPSC retinal farklılaşma kültürünün 6 delikli plakasının kuyucuğu başına yaklaşık 20-30 EFP gözlenebilir. Bu sayı, genetik arka planlarına ve retinal soy farklılaşma potansiyellerine bağlı olarak diğer hastalığa özgü hiPSC hatlarına göre değişebilir.
4. Retinal organoidlerin toplanması
- Camın alev çekmesi Retinal bardakların manuel olarak toplanması için Pasteur pipetler.
NOT: Göz alanı toplama için otoklavlanmış ve steril cam Pasteur pipetler kullanın.- Bir Bunsen brülörünü açın. Steril bir Pasteur pipet alın ve tabanı bir elinizde ve kılcal ucu diğer elinizde tutun. Alev, kılcal ucun ortasına yakın bölgeyi, cam esnek hale gelene kadar dönme hareketleriyle sterilize eder ve ısıtır. Ardından alevden uzaklaşın ve kapalı bir lümeni olan ince bir kılcal uç oluşturmak için hızla dışarı doğru çekin.
- İnce ucu alevin önünde yatay olarak tutun ve pürüzsüz bir kanca veya L şeklinde bir kılcal uç oluşturmak için alevin içinden dışa doğru bir hareketle hızla geçirin.
- Bozulmamış nöro-retinal kapları EFP kümelerinden nazikçe kaldırmak ve ayırmak için kılcal kancanın pürüzsüz dış eğrilik bölgesini ince bir kepçe olarak kullanın.
NOT: Cam kılcal kancanın düzgün açısı ne hücrelere zarar verir ne de kültür yüzeylerinde çizikler oluşturur. Bu basit araç, ızgara desenlerinde bireysel hiPSC koloni bölünmesi ve klonal genişleme sırasında küçük hücre kümeleri olarak geçirilmesi için de etkili bir şekilde kullanılabilir.
- 3D retinal organoidler üretmek için retinal bardakların kültürü ve bakımı.
- 25-30. günde, nöro-retinal kapların hasadına hazırlanmadan önce, düşük ataşmanlı 60 mm'lik bir tabağa 4.0 mL önceden ısıtılmış retinal farklılaşma ortamı ekleyin.
- Bireysel EFP'lerden iyi biçimlendirilmiş nöro-retinal kapları gözlemlemek ve manuel olarak seçmek için 0.63x-4.5x büyütmede stereo mikroskop altında çalışın.
NOT: Pigmentli RPE hücre büyümelerinin ortaya çıkması, EFP'lerin ve merkezi olarak yerleştirilmiş nöro-retinal kapların kolayca tanımlanmasına yardımcı olur. Retinal kaplar, CNS nöronları veya nöral krest hücreleri tarafından oluşturulan sıkıca paketlenmiş ve küresel veya düzensiz kümelerin aksine, doğrusal olarak düzenlenmiş ve kendi kendine monte edilmiş retinal kök hücreler tarafından oluşturulan net radyal çizgilenmelere sahip, çörek şeklinde, dairesel ve yarı saydam 3D yapılar olarak görünür23. - Alev ile çekilen Mera pipet kancalarını kullanarak merkezi nöro-retinal adayı tek tek EFP'ler içinde nazikçe dürtün ve çıkarın.
- 100 μL'yi aspire etmek için 1 mL'lik bir mikropipet ayarlayın ve yüzen retinal kapları aspire etmek ve adım 4.2.1'de hazırlanan taze, düşük yapışkanlı kültür yemeklerine aktarmak için geniş delikli açıklıklara sahip 1 mL mikro uçlar kullanın.
NOT: Daha küçük delik boyutuna ve daha yüksek emme basıncına sahip uçların kullanılması kesmeye neden olabilir ve retinal kapların bütünlüğünü etkileyebilir. Retinal bardakların yaklaşık boyutları yaklaşık 1-2 mm çapındadır. - Retinal kapları RDM'de yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutun ve% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
- 30-45. Gün: Çanağı yavaşça eğerek ve retinal bardakların yaklaşık 30 sn yerleşmesine izin vererek ortamı günlük olarak değiştirin. Kısmi bir besleme yöntemi izleyin, harcanan ortamın yarım hacimlerini çıkarın ve eşit miktarda taze ortam ile değiştirin.
NOT: Retinal bardaklara herhangi bir zarar gelmesini önlemek için tekrarlanan aspirasyon ve transferlerden kaçının. 1-2 haftalık süspansiyon kültüründen sonra, retinal kaplar hafifçe büyür (1-3 mm) ve PAX6 ve CHX10'u eksprese eden doğrusal olarak düzenlenmiş, erken nöro-retinal progenitörlerden oluşan kendi kendini organize eden 3D retinal organoidlere (OC-1M) dönüşür (Şekil 3Bi). - 45-60. Gün: Nöro-retinal progenitörlerin daha iyi sağkalımını ve soy farklılaşmasını ve olgun retinal hücre tipinin (OC-2M) gelişimini desteklemek için 100 μM Taurin içeren RDM'de retinal organoidleri 4 hafta daha kültürleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: EFP'lerden seçilen retinal veya optik kapların yaklaşık% 70-80'i bozulmadan kalır, laminasyonlarını korur ve 4 haftalık süspansiyon kültüründen (OC-2M) sonra olgun retinal organoidlere dönüşür. - 4 haftalık süspansiyon kültüründeki olgun retinal organoidlerin, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve en dış hücre katmanlarında ilkel bir iç segment benzeri uzantıya sahip olgun hücrelerin ortaya çıktığını gösterdiğini, böylece normal retinal gelişim ve olgunlaşma sürecini in vitro olarak özetlediğini kontrol edin (Şekil 3Bii).
NOT: Nöroretinal bardaklar çıkarıldıktan sonra, farklılaşma kültürleri RDM'de sürekli olarak korunabilir. Nöroretinayı çevreleyen proksimal epitel çıkıntıları, tipik parke taşı morfolojisine sahip pigmentli RPE monokatmanları oluşturmak üzere daha da genişleyen ve olgunlaşan retinal pigmentli epitel (RPE) hücre öncülleri içerir (Şekil 4). Distal çıkıntılar ağırlıklı olarak lens ve korneaepiteline katkıda bulunan oküler yüzey epitelinden oluşur.İstenilen hücre tipleri, EFP büyümelerinin farklı bölgelerinden toplanabilir ve saf kültürler oluşturmak için daha da zenginleştirilebilir.
5. Retinal organoidlerin karakterizasyonu
- Morfolojik ve moleküler karakterizasyon
- Yapışkan EFP'leri ve yüzen retinal organoidleri faz-kontrast mikroskobu altında 4x ve 10x büyütmede gözlemleyin ve morfolojilerini ve boyutlarını belgeleyin.
- Olgunlaşmanın farklı aşamalarında (adım 4.2.3-4.2.6) yaklaşık 20 retinal organoidi, geniş delikli 1.000 μL uçları kullanarak 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Organoidlerin dibe çökmesine ve ortamı aspire etmesine izin verin. Bardakları 1x PBS ile yıkayın.
- Fazla PBS'yi çıkarın ve 1,0 mL TRIzol reaktifi ekleyin (bkz. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bir tüp havaneli kullanarak dokuyu homojenize edin ve 1,0 mL'lik bir pipet kullanarak tritüre edin.
- Üreticinin talimatlarına göre, standart reaktif RNA izolasyonu ve saflaştırma yöntemini izleyerek toplam RNA'yı hazırlayın (bkz.
- Agaroz jeli üzerindeki RNA kalitesini kontrol edin ve NanoDrop Spektrofotometresini kullanarak ölçün (bakınız Malzeme Tablosu).
- Üreticinin talimatlarına göre ters transkriptaz enzimini kullanarak 1-2 μg toplam RNA'yı cDNA'ya dönüştürün (bkz. Gen-spesifik primerlerin bir listesi için Tablo 1'e bakınız.
- Kısaca, RNA-primer ana karışımını Tablo 2'de belirtildiği gibi toplam hacmin 10 μL'sinde hazırlayın ve tüpü bir termal döngüleyicide 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin. Tüpü termal döngüleyiciden 2 dakika boyunca buza aktarın.
- Bu arada, ana karışım 2'yi Tablo 3'te belirtilen reaktiflerle hazırlayın. Bu ana karışımı adım 5.1.7'de hazırlanan RNA-primer karışım tüpüne ekleyin. Yavaşça karıştırın.
- Numuneyi 50 dakika boyunca 50 ° C'de, daha sonra 5 dakika boyunca 85 ° C'de inkübe edin ve ardından reaksiyonu durdurmak için 4 ° C'de tutun.
- Sentezlenen cDNA'yı, nöro-retinal progenitör ve olgun retinal hücre belirteçlerinin ekspresyonunu kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında bir şablon olarak kullanın.
- Her bir numunenin toplam cDNA şablonlarını, yani F2-UD (hiPSC-F2-3F1; farklılaşmamış hücreler), OC-1M (süspansiyon kültüründe 1 haftalık optik kap) ve OC-2M (süspansiyon kültüründe 4 haftalık optik kap) gibi hE1fα veya GAPDH gibi temizlik genlerini kullanarak yarı kantitatif PCR ile normalleştirin.
- Ana karışımı Tablo 4'te belirtildiği gibi yarı kantitatif PCR için hazırlayın ve amplifikasyon için test numunesi tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin. PCR amplifikasyon koşulları Tablo 5'te belirtilmiştir.
- Histoloji ve immünohistokimya
- Optik kapları 2,0 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve fazla ortamı aspire edin (adım 4.2.3-4.2.6). Organoidleri 1x PBS ile durulayın ve daha sonra oda sıcaklığında gece boyunca sabitlemek için 500 μL% 4 Paraformaldehit içinde yıkayın ve askıya alın.
- Ertesi gün, bardakları deiyonize suda yıkayın. Bardakların% 95 alkol (üç değişiklik, her biri 15-20 dakika), ardından% 100 alkol (üç değişiklik, her biri 15-20 dakika), 15 dakika boyunca 1: 1 mutlak alkol ve ksilen karışımı, ksilen (iki değişiklik, her biri 15 dakika) ve parafin (üç değişiklik, her biri 15 dakika) içinde durmasına izin verin. Standart prosedürleri izleyerek bir parafin bloğu hazırlamak için bu dokuyu gömün. Soğumasına ve katılaşmasına izin verin.
- Bir mikrotom kullanarak ince kesitler (~ 4-5 μm kalınlığında) hazırlayın ve standart histoloji prosedürlerini izleyerek silan kaplı mikroskobik slaytlara (bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- Deparafinizasyon için, slaytları 70 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerinde 15-20 dakika ısıtın. Balmumu eridikten sonra, slaytları parafini tamamen çıkaracak olan ksilen (üç değişiklik, her biri 3-4 dakika) ile yıkayın.
NOT: Parafinin eksik çıkarılması, büyük miktarda arka plan gürültüsü olan bölümlerin zayıf/yamalı boyanmasına neden olur. - Her biri 3 dakika boyunca farklı etanol yüzdeleri (% 100,% 90 ve% 80) kullanarak slaytları yeniden nemlendirin. Slaytları damıtılmış suyla durulayın ve antijen alımına devam edin.
- Antijen alımına başlamadan önce, sitrat tamponunu (pH 6.0) bir Coplin kavanozunda (bakınız Malzeme Tablosu) bir mikrodalga fırın kullanarak 95-100 ° C'ye ulaşana kadar önceden ısıtın.
- Slaytları önceden ısıtılmış sitrat tamponuna daldırın ve kavanozu mikrodalga fırında 15 dakika ısıtın. Coplin kavanozunu fırından çıkarın ve oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
- 5 dakika boyunca 1: 1 metanol ve hidrojen peroksit karışımı ekleyerek endojen peroksidaz için bölümleri bloke edin, ardından bölümleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Kesitleri 15 dakika boyunca% 0.5 Triton-X 100 kullanarak geçirgenleştirin. Slaytları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Bölümleri 1 saat boyunca 1x PBS'de% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile inkübe ederek primer antikorun spesifik olmayan bağlanmasını bloke edin.
- Bölümleri oda sıcaklığında 1 saat veya 4 ° C'de bir gece boyunca birincil antikorla inkübe edin. Bağlanmamış antikoru çıkarmak için slaytları her biri 3-5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Uygun floresan boya konjuge ikincil antikor ekleyin ve 45 dakika boyunca inkübe edin. Slaytları her biri 3-5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
NOT: Antikorlar ve bunların ilgili seyreltmeleri Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Retinal organoid kesitler, erken nöro-retinal öncü hücreleri tespit etmek için PAX6 ve CHX10 kullanılarak ve işlenen retinal ve fotoreseptör öncü hücrelerini tespit etmek için Recoverin ve CRX kullanılarak immüno-etiketlendi. Benzer şekilde, RPE öncüllerini tespit etmek için anti-PAX6 ve anti-MITF kullanıldı ve 2D tek katmanlı kültürlerin immünositokimyası ile pigmentli olgun RPE hücrelerini tespit etmek için anti-CRALBP ve anti-RPE65 kullanıldı. - Bölümleri DAPI veya PI ile karşı boyama ve antifade montaj ortamını kullanarak bir cam slayt üzerine monte edin (bkz.
- Farklı retinal belirteçleri ifade eden farklı hücre katmanlarını incelemek için floresan veya konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak retinal organoidlerin ve RPE kültürlerinin immüno-etiketli bölümlerini görüntüleyin ve belgeleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HiPSC'lerin göz soylarına farklılaşması, Şekil 1'de açıklandığı gibi, takviyeleri ve büyüme faktörlerini içeren farklı kültür ortamı kokteyllerindeki hücrelerin farklı zaman noktalarında sıralı adımlarla kültürlenmesiyle elde edilir. HiPSC kültürleri, pluripotent kök hücre bakım ortamı olan Essential 8 ortamında tutulur. % 70-80 akıcılığa ulaştıklarında (Şekil 2A), ortam 1 ng / mL bFGF, 1 ng / mL Noggin ve% 1 N2 takviyesi içeren 0. günde (adım 3.2'ye bakınız) Farklılaşma İndüksiyon Ortamı (DIM) ile değiştirilir. Nöral indükleyici N2 takviyesi ile birlikte, BMP sinyal inhibitörü Noggin, mezodermal ve endodermal bağlılığı bloke ederek hücreleri nöroektodermal soya yönlendirmede çok önemli bir rol oynar. 1., 2. ve 3. günlerde, Noggin konsantrasyonu 10 ng / mL'ye yükseltilir (adım 3.3 ve 3.4'e bakınız). 4. günden itibaren, DIM Retinal Diferansiyasyon Ortamı (RDM) (adım 3.5) ile değiştirilir ve kültürler 30 güne kadar sürekli olarak korunur. RDM kokteylindeki B27, aerobik metabolizmayı teşvik eden ve oksidatif stresi azaltmaya yardımcı olan, farklılaşan progenitör hücrelerin yaşayabilirliğini artıran çoklu antioksidanlar ve D-Galaktoz gibi ek takviyeler içerir. Ek olarak, retinol asetat (A vitamini) ve triiodo-I-tironin (T3) gibi büyüme hormonlarının varlığı, nöral ve retinal soy farklılaşmasını teşvik eder.
14. ila 18. günlerde, göz alanı bağlılığının başlangıcını gösteren nöral rozetlerin oluşumu gözlenir (Şekil 2B). Nöral rozetlerdeki göz alanı öncülleri daha da çoğalır ve kendilerini merkezde dairesel nöro-retinal yapılara sahip farklı göz alanı primordial kümeleri (EFP'ler) halinde kendi kendine organize eder. Retinal pigmentli epitel (RPE), nöral krest epiteli ve oküler yüzeye katkıda bulunanlar gibi diğer hücre tipleri, iyi tanımlanmış kenar boşluklarına sahip bitişik epitel olarak ortaya çıkar ve göç eder. İyi biçimlendirilmiş göz alanları, yukarıda tarif edildiği gibi, farklılaşmanın 21. ila 28. günleri arasında gözlemlenebilir (Şekil 2C, D). Merkezi nöro-retinal bardak adası, alev çekilmiş cam Pasteur pipeti kullanılarak 25-30. günler arasında hasat edilir (Şekil 2E) ve RDM'de 45. güne kadar 1-2 hafta daha yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutulur. Proliferasyon yapan retinal progenitörler, yaklaşık 2-3 mm çapında çok katmanlı 3D retinal organoidler oluşturmak için kendilerini daha da organize ederler (Şekil 2F, G). 46. günden itibaren RDM, nörogenezi teşvik etmek ve in vitro uzun süreli organoid kültürlerde hücre sağkalımını iyileştirmek için 100 μM Taurin ile desteklenir (Şekil 2H).
Retinal organoidler, ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) ve immünohistokimya (IHC) kullanılarak çeşitli retinal progenitör belirteçlerin ekspresyonu için olgunlaşmanın farklı aşamalarında karakterize edilir. Bunun için, organoidler farklılaşmanın 30. ve 60. günlerinde toplam RNA izolasyonu için toplanır. RT-PCR sonuçları, 1 haftalık retinal organoidlerde (farklılaşmadan 4-5 hafta sonra, OC-1M) ve 4 haftalık retinal organoidlerde NEUROD1, ChX10, CRX, PKCß1, RLBP1, RHOK, OPN1SW, RCVRN, ABCA4, RD3 ve PDE6C gibi nöro-retinal belirteçlerin indüksiyonunu ve ekspresyonunu doğruladı (Şekil 3A). İmmünohistokimya ve floresan görüntüleme, OC-1M'de erken retinal progenitör belirteçleri PAX6, CHX10 ve OTX2'nin ekspresyonunu ve OC-2M 8,12'de olgun retinal belirteçler RCVRN ve CRX'in ekspresyonunu doğrulamıştır (Şekil 3Bi, ii).
Santral nöro-retinal kaplara ek olarak, retinal pigmente epitel (RPE), nöral krest epiteli ve oküler yüzey epitel hücreleri gibi diğer oküler hücre tipleri EFP'lerden ortaya çıkar ve göç eder. Nöroektoderm kaynaklı RPE progenitörleri, EFP'leri çevreleyen kompakt olarak düzenlenmiş epitel hücreleri olarak ortaya çıkar ve 30-45. günlerden itibaren göç marjları boyunca yavaş yavaş olgunlaşır ve pigmentlenir (Şekil 4A-C). Bu nedenle, retinal kapların çıkarılmasından sonra, bu yapışkan farklılaşma kültürleri, tamamen olgun pigmentli RPE hücrelerinin tek katmanlı kültürlerini hazırlamak için daha da zenginleştirilebilen çoğalan RPE öncüllerini (Şekil 4D) toplamak için 45. güne kadar uzatılabilir. Matür pigmentli RPE, tipik parke taşı morfolojisine sahip monotabakalar olarak görülebilir (Şekil 4E). RPE hücre kimliği, MITF (RPE progenitör belirteci), PAX6 (progenitör ve olgun RPE belirteci) ve RPE65 (olgun RPE belirteci)10,12 (Şekil 4F-H) gibi RPE'ye özgü belirteçlere karşı antikorlar kullanılarak immünositokimya ile daha da doğrulanır.
Pluripotent kök hücre kaynaklı retinal organoidler, çeşitli kalıtsal retina hastalıklarını incelemek için in vitro modeller olarak hizmet edebilir 7,8,9. Hastalığa özgü kök hücre modelleri, hastaya özgü iPSC hatları oluşturularak veya CRISPR tabanlı gen düzenleme yaklaşımı 7,8 kullanılarak sağlıklı kontrol iPSC hatlarında hastalığa özgü mutasyonlar tanıtılarak geliştirilmiştir. Mutant iPSC'ler, ilgili gen mutasyonlarına bağlı olarak retinal hücre tiplerine etkili bir şekilde farklılaşabilir veya farklılaşmayabilir. Çoğu sağlıklı kontrol hücresi çizgisi yukarıda açıklanan zaman çizelgesini takip ederken, hastalığa özgü iPSC'lerde farklılaşma zaman çizelgeleri, EFP morfolojisi, retinal fincan boyutu, laminasyon ve olgunlaşma açısından sapmalar olabilir. İnsan RB1 geninin ekzon 18'inde 10 bp'lik bir bialelik delesyon taşıyan bir RB1-/- hiPSC hattının (LVIP15-RB1-CS3) retinal farklılaşma potansiyeli incelendi, bu da bir çerçeve kayması ve RB1 protein ekspresyonunun tamamen kaybıyla sonuçlandı. RB1 ekspresyonunun kaybının gözü ve mutant hiPSC hattının erken retinal soy farklılaşmasını etkilemediği gözlendi. Bununla birlikte, zaman çizelgelerinde belirgin bir gecikme ve EFP oluşturma verimliliğinde bir azalma gözlenmiştir. Ortaya çıkan atipik EFP'lerde, uygun retinal bardaklara lamine edilemeyen ve kendi kendini organize edemeyen (Şekil 5A, B) veya RPE ve oküler yüzey epitelinin (OSE) çevresindeki bölgeden yoksun olan anormal retinal progenitör agregaları vardı (Şekil 5C). Süspansiyon kültürleri olarak seçilip muhafaza edildiğinde, bu retinal progenitör kümeler düzensiz nöro-retinal agregalar oluşturdu (Şekil 5D).
Şekil 1: iPSC'lerin retinal organoidlere farklılaşmasını gösteren zaman çizelgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kendi kendine organize edilen 3D retinal organoid üretimi. (A) HiPSC kültürlerinin besleyicisiz koşullar altında yetiştirilmesi. (B) Farklılaşmanın 14. gününde nöronal rozetlerin geliştirilmesi (yıldız işareti). (C,D) Farklılaşmanın 21-28. günlerinde epitelin göç eden bölgesi (beyaz oklar) ile çevrili merkezi nöro-retinal fincan benzeri bir yapı (siyah oklar) içeren göz alanı primordial (EFP) kümeleri. (E) Kancalı uçlu, alev çekilmiş cam Pasteur pipeti. Menteşe bölgesindeki düz eğri, retinal bardakları (ok) dürtmek ve kaldırmak için kullanılır. (F,G) Retinal bardaklar 25. günde hasat edilir ve kendi kendini organize eden 3D retinal organoidler üretmek için süspansiyon altında kültürlenir. (H) 45. günde süspansiyon kültüründe olgun retinal organoidler. Ölçek çubukları: 100 μm (A,B,D,G); 200 μm (C,F,H). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Retinal organoidlerin karakterizasyonu. (A) Farklılaşmamış normal hiPSC hattı 23'ün (hiPSC-F2-3F1) (F2-UD) RT-PCR ile retinal gen ekspresyon profillemesi ve farklılaşmış normal optik kapların 3-4 haftalık farklılaşmada toplanması ve süspansiyon kültüründe sırasıyla 1 hafta (OC-1M) ve 4 hafta (OC-2M) boyunca daha da olgunlaşması. Tüm test örneklerinin cDNA'ları, yükleme kontrolü olarak eEF1a kullanılarak normalleştirildi. (B) (i) nöro-retinal progenitör belirteçleri CHX10, PAX6 ve OTX2'ye (kırmızı renkte) karşı antikorlar kullanan olgunlaşmamış retinal organoidlerin (OC-1M) immüno-etiketli kesitlerinin konfokal görüntüleri ve (ii) fotoreseptör öncü belirteçleri Recoverin ve CRX'e (kırmızı renkte) karşı antikorlar kullanan olgun retinal organoidlerin (OC-2M). Sol panellerde farklılaşan fotoreseptör hücreler (kutu) bulunan retinal organoidlerin belirgin en dış tabakası yakınlaştırılır ve sağ panellerde gösterilir. DAPI karşı leke olarak kullanıldı (mavi renkte). İlkel iç segment benzeri uzantılar beyaz oklarla işaretlenmiştir. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı oküler hücre tiplerinin ortaya çıkışı. (A) Merkezde nöro-retinal fincan bulunan EFP kümeleri ve ön kenarlar boyunca pigmentasyon gösteren RPE çıkıntıları (beyaz ok). (B) Nöro-retinal adanın her yerindeki çoklu EFP'lerden iyi diferansiye pigmente epitel çıkıntıları. (C) Bir EFP'nin daha yüksek büyütmesi, bir nöro-retinal kabı çevreleyen RPE progenitörlerinin (beyaz ok) ve oküler yüzey epitelinin (yıldız işareti) göç bölgesini gösterir. (D) Hem pigmentli hem de pigmentli olmayan hücreleri içeren olgunlaşmamış RPE hücrelerinin tek katmanlarını geliştiren genişletilmiş yapışkan kültürler. (E) 60. günde parke taşı morfolojisi gösteren tamamen olgun ve pigmentli RPE hücrelerinin tek katmanlı kültürleri. (F-H) PAX6, MITF ve RPE65'i yeşil renkte eksprese eden RPE hücreleri. Ölçek çubuğu: 200 μm (A,B); 100 μm (C-E); 20 μm (F-Y). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: RB1-/- mutant iPSC'lerde anormal retinal fincan oluşumu. (A,B) Retinal progenitörlerin anormal agregaları olan EFP'ler, çarpık laminasyon ve çiziklerin eksikliği. (C) Minyatür nöroretinal fincan ile EFP, ancak RPE ve oküler yüzey epitelinin çevresindeki bölgeden (ok) yoksun olmak. (D) Süspansiyon kültüründe oluşan düzensiz nöro-retinal agregalar. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar adı | Asal dizi (5'-3') | Bant boyutu (bp) | Referans Kimliği | |||
| 1 | heEF1α | F: GAAGTCTGGTGATGCTGCCATTGT | 198 | NM_001402 | ||
| R: TTCTGAGCTTTCTGGGCAGACTTG | ||||||
| 2 | hNöroD1 | F: CGCGCTTAGCATCACTAACT | 349 | NM_002500 | ||
| R: GCGTCTCTCTTGGGCTTTTGAT | ||||||
| 3 | hCHX10 | F: CAAGTCAGCCAAGGATGGCA | 382 | NM_182894 | ||
| R: CTTGACCTAAGCCATGTCCT | ||||||
| 4 | hCRX | F: TCAACGCCTTGGCCCTAAGT | 357 | NM_000554 | ||
| R: ACACATCTGTGGAGGGTCTCTT | ||||||
| 5 | hPKC-β1 | F: AAAGGCAGCTTTGGCAAGGT | 376 | NM_212535 | ||
| R: CGAGCATCACGTTGTCAAGT | ||||||
| 6 | RLBP1 | F: TGCACCATTGAAGCTGGCTA | 361 | NM_000326 | ||
| R: AGAAGGGCTTGACCACATTG | ||||||
| 7 | RHOK | F: CAAGCTGTATGCCTGCAAGA | 360 | NM_002929 | ||
| R: ATCCGGACATTGCCGTCATT | ||||||
| 8 | hOPN1SW | F: TGCTTCATTGTGCCTCTCTC | 373 | NM_001708 | ||
| R: AGCTGCATGTGTCGGATTCA | ||||||
| 9 | cesaret | F: AGACCAACCAGAAGCTGGAGT | 367 | NM_002903 | ||
| R: ACGGGTGTCATGTGAGTGGTA | ||||||
| 10 | hABCA4 | F: CACCGTAGCAGGCAAGAGTATT | 271 | NG_009073 | ||
| R: AATGAGTGCGATGGCTGTGGAGA | ||||||
| 11 | hRD3 | F: ATGGTGCTGGAGACGCTTAT | 328 | NM_183059 | ||
| R: CTTCCTGCTTCATCCTCTCCA | ||||||
| 12 | hPDE6C | F: GTTGATGCCTGTGAACAAATGC | 351 | NM_006204 | ||
| R: ACCACTCAGCATAGGTGTGAT | ||||||
Tablo 1: RT-PCR için gen-spesifik primerlerin listesi.
| RNA-Primer karışımı için bileşenler | Hacim (μL cinsinden) |
| RNA (1-2 μg) | n |
| 10 mM dNTP | 1 |
| 10 mM Oligo dT | 1 |
| DEPC ile arıtılmış su | 10'a kadar |
| Toplam Reaksiyon Hacmi | 10 |
Tablo 2: cDNA dönüşümü için RNA-primer ana karışımı.
| Mastermix 2 için bileşenler | Hacim (μL cinsinden) |
| 10x RT Arabelleği | 2 |
| 25 mM MgCl2 | 4 |
| 0,1 M DTT | 2 |
| SuperScript III Ters Transkriptaz | 1 |
| RNaseOUT | 1 |
| Toplam Reaksiyon Hacmi | 10 |
Tablo 3: cDNA dönüşümü için ana karışım 2.
| PCR'nin bileşenleri | Hacim (μL cinsinden)/reaksiyon |
| 10x PCR Arabelleği | 2 |
| 2 mM dNTP | 2 |
| İleri astar (5 μM) | 1 |
| Ters astar (5 μM) | 1 |
| Taq Polimeraz | 0.2 |
| cDNA Şablonu (50-100 ng) | 1 |
| Steril Milli-Q su | 12.8 |
| Toplam Reaksiyon Hacmi | 20 |
Tablo 4: Yarı kantitatif PCR için ana karışım.
| Sıcaklık | Saat | Döngü sayısı | |
| Denatürasyon | 95 °C | 5 dk | x 1 |
| Denatürasyon | 95 °C | 30 saniye | x 35 |
| Tavlama | 50-60 °C | 30 saniye | |
| Uzantı | 72 °C | 30 saniye | |
| Son Uzatma | 72 °C | 10 dk | x 1 |
Tablo 5: PCR amplifikasyon koşulları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hiPSC'ler in vitro organ ve doku gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır. Sağlıklı ve hastalığa özgü hiPSC'leri retina soyuna doğru ayırt ederek hastalık fenotipinin özetlenmesi, kalıtsal retina distrofilerinin farklı formlarının patofizyolojisi hakkında daha yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir. PSC'lerin retinal hücre tiplerine in vitro farklılaşması için çeşitli protokoller tanımlanmış ve benimsenmiştir. Bunların çoğu, rekombinant büyüme faktörlerinin, takviyelerin, küçük moleküllerin ve reaktiflerin karmaşık kokteyllerini içeren kültür ortamının kullanımını içerir: N1, N2 ve B27 takviyeleri; Noggin, SB431542, LDN193189 ve Follistatin gibi BMP ve TGFβ sinyal blokerleri veya Activin A, Lefty ve IDE1 gibi indükleyiciler; DKK1, SFRP, IWP-2 ve IWR-1-endo gibi kanonik Wnt sinyal engelleyicileri veya CHIR99021, SB216763 ve CKI-7 gibi indükleyiciler; PD0325901 ve PD173074 gibi FGF reseptör sinyal blokerleri veya bFGF gibi indükleyiciler; DAPT gibi çentik sinyal inhibitörleri; insülin benzeri büyüme faktörü (IGF-1) gibi diğer sinyal molekülleri; retinoik asit; Triiodotironin (T3) ve Hidrokortizon gibi büyüme hormonları; ve antioksidanlar ve Askorbik asit, Nikotinamid, Taurin, Dokosaheksaenoik asit, 1-Tiyogliserol gibi diğer hayatta kalma yanlısı faktörler. Bu bileşenler, göz ve retina soyağacı bağlılığını 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 indüklemek için çeşitli sinyal kaskadlarını uyarmak veya modüle etmek için kök hücre farklılaşmasının farklı aşamalarında kültür ortamına dahil edilir.
Burada, retinal organoidleri doğrudan yakın-birleşik, yapışkan hiPSC kültürlerinden üretmek için daha basit, sağlam ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Basitleştirilmiş protokol, PSC'lerin nöroektodermal soya ilk farklılaşmasını tetikleyen daha az takviye, büyüme faktörü ve küçük moleküllerin kullanılmasını içerir. Sonraki farklılaşma adımları, PSC'lerin ilgili soyların hücre tipine eşzamanlı olarak farklılaşma kabiliyetine dayanır, bu da daha sonra karmaşık dokuların oluşumuna katkıda bulunan çoklu hücre tiplerinin gelişimini ve mekansal organizasyonunu kendi kendine organize eder ve karşılıklı olarak düzenler. BFGF'nin kademeli olarak geri çekilmesi ve Noggin ilavesi, farklılaşmadan sonraki 3 gün içinde erken nöro-ektodermal kader taahhüdünün başarılı bir şekilde indüklenmesine yardımcı olur. Nöral indükleyici RDM'de farklılaşma kültürlerinin herhangi bir büyüme faktörü veya küçük molekül eklemeden devam etmesi, farklılaşmadan sonraki 3-4 hafta içinde göz alanı primordial (EFP) yapılarının net marjlarla indüksiyonuna neden olur. EFP'ler, bozulmamış ve sürekli bakım üzerine, retinal pigmentli epitel (RPE), nöral krest epiteli ve oküler yüzey epiteli gibi diğer ilgili oküler hücre tipleri ile çevrili, merkezi olarak konumlandırılmış nöro-retinal kaplar veya optik bardaklardan (OC'ler) oluşan karmaşık EFP'ler oluşturmak için çok etkili progenitör hücreler içerir. Alternatif olarak, PSC'ler aynı kültür koşulları altında EB'ler oluşturmak için 1-3. günlerden itibaren süspansiyon kültürleri olarak yetiştirilebilir. EB'ler 4. günde daha da kaplanabilir ve yukarıda açıklandığı gibi retinal soy farklılaşmasını başlatmak için RDM'deki matris kaplı yüzeylerde yapışkan kültürler olarak yetiştirilebilir. Sağlıklı farklılaştırıcı kültürler rutin olarak 6 delikli bir plakanın kuyusu başına yaklaşık 20-30 EFP'ye yol açar. OC'ler, retinal farklılaşmanın 3-4 haftasında EFP'lerden toplanabilir ve nöro-retinal progenitörlerin farklılaşmasını sağlamak ve olgun retinal organoidler üretmek için 30-60 gün daha süspansiyon kültürlerinde tutulur. 4 haftalık süspansiyon kültüründen sonra, EFP'lerden toplanan optik kapların yaklaşık% 70-80'i bozulmadan kalır, laminasyonlarını korur ve RCVRN + ve CRX + bağlı fotoreseptör hücreleri ve en dış katmanlarda iç segment benzeri uzantılarla olgun retinal organoidlere (OC-2M) dönüşür.
Büyüyen iPSC kültürlerinin birleşmesi, farklılaşmanın başlatılması ve kültürlerin DIM'e kaydırılması sırasında kritik öneme sahiptir. Daha küçük kolonilere sahip kültürler ve% 60'ın altında birleşenler ve erken farklılaşanlar, EFP sayılarının önemli ölçüde azalmasına neden olur. Göz alanı kümeleri ortaya çıktığında, nöro-retinal bardakların merkezi adası 1 hafta içinde hasat edilmelidir. Bu, protokol bölümünde açıklandığı gibi, alev çekilmiş cam kılcal ucun açısını veya kavisli bölgesini kullanarak sağlam bardakları hafifçe dürterek ve kaldırarak yapılabilir. Bardaklara zarar vermemeye özen gösterilmelidir. Toplamada daha fazla gecikme, nöro-retinal progenitör hücrelerin çoğalması ve göçü nedeniyle düzleşmeye ve 3D organizasyon kaybına neden olur, bu da hasadı zorlaştırır ve atipik retinal organoidlerle sonuçlanır.
Retina kaplarının göz alanı indüksiyonu ve olgunlaşmasının etkinliği, altta yatan genetik bozukluklara bağlı olarak farklı hastalıklar veya hastaya özgü hiPSC çizgileri arasında değişir. Örneğin, retinal soy bağlılığı ve RP hastalığına özgü bir hattın EFP oluşturma verimlilikleri, sağlıklı kontrol hücrelerininkiyle aynıyken, bir RB1 null çizgisi EFP'leri oluşturamadı (veriler gösterilmedi). Leber Konjenital Amaurosis ile bağlantılı mutasyonlar taşıyan bazı çizgiler, retinal progenitörlerin boyutlarında, kendi kendine montajında, laminasyonunda ve olgunlaşmasında kusurları olan atipik EFP'ler oluşturmuştur (veriler gösterilmemiştir). Bir hastalık durumunun patofizyolojisini anlamak için hastaya özgü retinal organoidlerin sağlıklı kontrol dokularına kıyasla daha ileri moleküler validasyonları ve gen ekspresyon profillemesi gerekli olacaktır. Hasta genomlarındaki değişkenlik ve çoklu gen ağlarının hastalık bulgularına katılımı göz önüne alındığında, hastalık modelleme çalışmalarında mutlak bir genotip-fenotip korelasyonu kurmak için izojenik iPSC çizgilerinden türetilen retinal organoidlerin incelenmesi de önemli olabilir. Bu tür izojenik çizgiler, sağlıklı kontrol hatlarında hedeflenen gen nakavtları ile veya ileri genomdüzenleme teknikleri 8,9 kullanılarak hastaya özgü iPSC'lerdeki patojenik mutasyonların düzeltilmesiyle oluşturulabilir.
Normal veya hastalığa özgü iPSC hatlarından türetilen bu tür sağlam retinal organoidler, yeni ilaç tarama ve testlerinde kullanılabilir. Retinal organoidlerdeki fotoreseptör öncülleri ve EFP büyümelerindeki RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri, temel araştırma ve rejeneratif tıptaki uygulamaları için daha da izole edilebilir ve zenginleştirilebilir. Burada açıklanan protokol, klinik öncesi ve klinik çalışma değerlendirmeleri için klinik dereceli hücrelerin hazırlanması için GMP uyumlu süreçlere kolayca uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarların çıkar çatışması veya finansal açıklamaları yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Genetikçi Dr. Chitra Kannabiran'ın bilimsel ve teknik desteğini kabul ediyor; Dr. Subhadra Jalali, Retina Danışmanı; Dr. Milind Naik, Oküloplastik Cerrah; ve Dr. Swathi Kaliki, LV Prasad Göz Enstitüsü, Haydarabad'da Oküler Onkolog normal ve hastaya özgü iPSC hatlarının oluşturulmasına doğru. Yazarlar, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Bilim ve Teknoloji Bölümü (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Biyoteknoloji Bölümü (IM), (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ve ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ve CSIR (V.K.P.), Hindistan Hükümeti'nden Kıdemli Araştırma Burslarından Ar-Ge hibelerini kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P.
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- RetNet - Retinal Information Network. , Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022).
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
