Summary
这项工作描述了一种新的实验方案，该方案利用3D打印支架来实现去核球的高分辨率活细胞成像。通过该协议，可以实时观察离 体 球受伤角膜上皮中的细胞钙信号活性。
Abstract
角膜上皮伤口愈合是由上皮细胞上表达的嘌呤能受体的激活引发的迁移过程。这种激活导致钙动员事件在细胞之间传播，这对于启动细胞运动进入伤口床至关重要，促进有效的伤口愈合。Trinkaus-Randall实验室开发了一种在 离体 鼠球中实时成像角膜伤口愈合反应的方法。这种方法涉及从已按照既定方案安乐死的小鼠身上取出完整的球体，并立即用钙指示剂染料孵育球体。在此阶段可以应用染色细胞其他特征的复染剂，以帮助成像并显示细胞标志。该方案适用于用于复染的几种不同的活细胞染料，包括用于染色肌动蛋白的SiR肌动蛋白和用于染色细胞膜的深红色质膜染色。为了检查对伤口的反应，使用25G针损伤角膜上皮，并将地球仪放置在3D打印支架中。3D打印支架的尺寸经过校准，以确保在整个实验期间地球固定，并且可以修改以适应不同大小的眼睛。随着时间的推移，使用共聚焦显微镜在整个组织的不同深度连续进行伤口反应的活细胞成像。该协议使我们能够在共聚焦显微镜上使用20倍空气物镜生成高分辨率，出版质量的图像。其他目标也可用于此协议。它代表了 离体 鼠球活细胞成像质量的显着提高，并允许识别神经和上皮。
Introduction
角膜
角膜是一种透明的无血管结构，覆盖眼睛前表面，可折射光线以实现视力并保护眼睛内部免受损伤。由于角膜暴露在环境中，它容易受到机械原因（抓挠）和感染的损害。其他方面健康的患者的角膜损伤通常会在 1-3 天内愈合。然而，在患有包括角膜缘干细胞缺乏症和II型糖尿病在内的潜在疾病患者中，角膜伤口愈合过程可以大大延长1。由于角膜是高度神经支配的，这些不愈合的角膜溃疡和复发性角膜糜烂非常痛苦，并大大降低了经历它们的患者的生活质量1。
细胞信号传导
当原本健康的角膜受伤时，伤口附近细胞中的钙信号事件先于并促使细胞迁移到伤口床上，在那里它们闭合损伤而没有疤痕的风险2，3。这些信号传导事件已在使用活细胞成像的角膜上皮细胞培养模型中得到了很好的表征2。初步实验表明，与糖尿病细胞相比，非糖尿病细胞损伤后的钙信号传导明显更多。然而，在 离体 球中表征细胞信号事件已被证明是一项技术挑战。
活细胞成像
以前的研究已经成功地记录了角膜伤口愈合的体外细胞培养模型的钙信号传导事件4，5，6。开发一种方法在离体组织中产生这些信号事件的高质量图像是非常有趣的，因为它将允许在更复杂和逼真的系统中研究这些事件。以前的方法包括解剖角膜，然后固定在紫外线诱导的PEG凝胶7，8，9中。在处理活组织时，固定化是一个重要但具有挑战性的步骤，因为它必须在整个实验过程中保持活力和水合。此外，固定不得损坏组织。虽然PEG溶液固定了组织，但产生的图像的分辨率和质量并不一致。因此，开发了3D打印支架来固定完整的地球仪，以产生更高质量的图像，同时降低组织损伤的风险。
A. 方法
开发了一种独特的3D打印支架，用于固定完整的 离体 地球仪以进行活细胞成像。该支架可防止来自两个主要来源的损坏：它允许对去核眼球进行成像而无需解剖角膜，并且它消除了暴露于紫外线。没有这些损伤源，获得的图像更准确地代表了对实验造成的划痕伤害的反应。此外，3D打印支架被校准到小鼠眼睛的精确尺寸。这提供了比PEG溶液中固定更好的拟合，由于组织运动减少，在低倍物镜下可获得更高质量的图像。固定器顶部的盖杆可确保地球仪在整个实验过程中保持不动，并且在应用生长培养基以保持水合作用和活力时，地球仪不会移位。将支架打印到精确尺寸的能力也使我们能够为由于年龄或疾病状态而不同大小的鼠眼产生最佳贴合度。这项技术可以更广泛地应用于根据不同物种的尺寸开发支架。
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Protocol
涉及动物受试者的程序得到了视觉和眼科研究协会在眼科护理和视觉研究中使用动物以及波士顿大学IACUC协议（201800302）的批准。
1. 设计3D打印支架和盖杆
- 设计3D打印支架和盖杆，考虑鼠标地球仪的平均直径，并3D打印设计（图1A，B）。
- 保持支架内壁的直径略大于地球仪的平均直径，以考虑个体小鼠的不同大小。将支架的高度保持在地球直径的一半左右，确保在由 3D 打印的盖杆固定时紧密贴合地球。
- 将支架盖杆的尺寸调整为支架外径的长度，宽度为支架直径的 1/4 到 1/2。盖杆的尺寸允许在固定在支架中以补水和在实验结束时取出眼睛时进入地球仪。
- 打印支架和盖杆。
2. 样品采集
- 安乐死小鼠（本研究使用9-12周龄和27周龄的雄性C57BL / 6小鼠）使用符合机构指南的既定方案。对于此协议，用二氧化碳执行安乐死，然后斩首。
- 取出小鼠头并立即将其放在冰上以保持组织的活力。使用解剖工具将地球仪去核，同时防止组织损伤。
- 用镊子支撑地球。用解剖剪刀夹住视神经，就在镊子固定视神经的下方。
注意：有关进一步的预防措施，请在层流罩中执行以下步骤。 - 将球体在p35细胞培养皿中的2mL培养基中孵育，包括钙指示剂和/或细胞膜染色剂，在37°C，5%CO2 培养箱中在低光照条件下孵育1小时。确保将球浸没在染色介质中以实现均匀染色。
- 对于此处进行的实验，使用钙指示剂Fluo4-AM （1：100）2和细胞膜复染，深红色质膜染色剂（1：10，000）2，最终浓度为1%（v / v）DMSO和0.1%（w / v）普鲁糖酸在2mL角质形成细胞无血清培养基（KSFM）中，并使用以下生长补充剂：25μg/ mL牛垂体提取物， 0.02 nM 表皮生长因子、0.3 mM CaCl2 和青霉素-链霉素（分别为 100 单位/mL 和 100 μg/mL）。
注意：孵育条件和时间因钙指示剂、组织类型和样品体积而异。使用多脲酸时，建议谨慎使用，因为它会使组织具有渗透性。该协议要求10%的多花酸。较低浓度的多花酸已被实验确定为无效，较高浓度的风险可能会损害组织。
- 对于此处进行的实验，使用钙指示剂Fluo4-AM （1：100）2和细胞膜复染，深红色质膜染色剂（1：10，000）2，最终浓度为1%（v / v）DMSO和0.1%（w / v）普鲁糖酸在2mL角质形成细胞无血清培养基（KSFM）中，并使用以下生长补充剂：25μg/ mL牛垂体提取物， 0.02 nM 表皮生长因子、0.3 mM CaCl2 和青霉素-链霉素（分别为 100 单位/mL 和 100 μg/mL）。
3. 样品架的制备
- 用以前未使用过的胶水将支架粘在干净的玻璃底盖玻片上。该协议中使用的胶水来自一次性容器，以确保无菌，并且每次都使用新的未开封容器。
- 用70%乙醇洗涤支架。将胶水涂在支架上，然后将支架粘在玻璃底盖玻片上。确保支架内部区域内没有胶水，因为胶水会发出荧光，使成像复杂化。
- 等到胶水凝固。确认支架与盖玻片牢固。
注意：带有玻璃底盖玻片的P35细胞板用于本手稿中介绍的实验。其他玻璃底载玻片和/或板可以根据实验的需要进行替代。
4. 眼球损伤
- 使用无菌滴管从染色溶液中取出地球仪，注意防止组织损伤感兴趣区域。使用无菌磷酸盐缓冲盐水在室温下洗涤地球仪5分钟以去除多余的污渍，并将地球仪放入培养基中以运输到显微镜。
- 使用无菌 25 G 针在感兴趣区域缠绕眼球。
- 使用无菌滴管，从眼睛后部拿起并握住眼球。这将保持地球稳定，防止其滚动，并允许制造一致的伤口。使用这种设置，视神经将位于滴管喷嘴内，角膜将朝外。
- 对于划痕伤口，轻轻地将无菌 25 G 针穿过暴露的角膜。对于穿刺伤口，将针头直接轻轻按入中央角膜。确保伤口不会刺穿角膜。
注意：如果实验不需要伤口反应或受伤环境，请跳过此步骤。先前的研究表明，使用这种方法制成的小鼠角膜划痕伤口和穿刺伤口在直径和深度上都是一致的10。使用感兴趣区域分析确认独立球体之间的伤口尺寸。
5. 样品放置在支架上
- 将角膜或角膜缘区域放在支架内部区域的盖玻片上，并使用3D打印的盖子稳定（图1C-H）。
- 确认地球仪的位置正确，并且感兴趣的位置与玻璃盖玻片接触。将地球仪放入支架后，请勿尝试取下地球仪，因为这可能会导致组织损伤。
- 使用胶水将3D打印的盖子粘在支架上，确保稳定性。确保盖杆粘附在支架上，而不是地球仪上。
注意：要成像的区域被放下，因为协议是为在倒置显微镜上使用而编写的。该方案可以适用于使用具有较小内半径的支架和移除盖杆的正置显微镜。这将导致全球稳定性降低。
6. 样品成像
- 打开显微镜和环境室，并验证室是否加湿。在实验期间将环境室设置为35°C和5%CO2 。
注意：此程序最好使用带环境室的显微镜，以防止脱水并将地球仪保持在最佳温度，但不是必需的。 - 将盖玻片、支架和稳定球体放在环境室内的显微镜载物台上，并使用活细胞成像技术成像9.
- 将额外的生长培养基移液到盖玻片上，以防止脱水并保持组织活力。确保孔中有足够的介质覆盖支架中的地球仪。根据成像的持续时间，在整个实验过程中需要时添加新鲜培养基。
- 使用活细胞成像技术和方案开始实验。在长时间的实验中使用低功率激光设置来保存组织并防止组织损伤。在长工作距离下使用适当的物镜。本手稿中的实验是使用 20 倍物镜进行的。
注意：激光功率和增益、实验持续时间、位置和成像平面都是变量，具体取决于实验参数。在过去的出版物中，对持续时间为1小时至4小时的完整地球仪进行了成像实验10。 - 以首选文件格式记录和保存数据。显微镜使用的软件生成.czi文件用于数据记录。
- 按照协议末尾的标准机构协议处理地球仪。
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Representative Results
该协议已用于始终如一地生成出版质量的数据和图像10。与以前的方法相比，获得的图像具有显着的改进（图2）。使用3D打印支架，可以在整个角膜层中捕获图像，并且可以观察到不同z平面中的钙动员（图3）。该方法已被用于比较年轻和老年小鼠伤口处顶端和基底细胞层之间的细胞 - 细胞信号传导10。
改进的稳定性也允许地球成像的时间比以前更长。这使得细胞迁移到伤口床的研究比以前的能力延长了几个小时。通过这个延长的时间线，在角膜损伤后年轻和老年小鼠之间的伤口愈合反应期间可以观察到细胞行为的实质性差异10。对于该协议，每5分钟收集一次数据，持续4小时。使用支架时，在整个实验过程中，x、y 或 z 平面没有观察到明显的漂移（图 4， 视频 1）。
该协议的一个优点是它允许根据支架中地球的位置对角膜的不同区域进行成像。在最近的出版物中，利用这一特征收集中央角膜和角膜-角膜缘区域的图像（图5）10。发现中央角膜损伤会在角膜缘区域10神经附近的细胞中产生钙信号事件。支架的多功能性不仅仅是稳定地球以进行成像实验，还用于多种不同的应用。通过将角膜正面朝上放置在支架中，进行纳米压痕实验以测量年轻和老年小鼠角膜上皮，基底膜和基质的硬度10，11。
图 1：3D 打印支架的原理图和设置。 （A）具有注释的高度和宽度尺寸的3D打印支架的设计。（B）来自3D打印机软件的代表性CAD文件图像。（C）支架的代表性图像，附有包含鼠球的盖子。（D）将无菌的一次性胶水涂在3D打印支架的底部。（E）将3D打印支架粘附在玻璃底p35细胞培养皿上。（F）使用无菌滴管将去核球向下放入支架中。（G）盖杆粘附在3D打印支架的顶部，以确保地球固定。（H）将带有粘附支架和地球仪的玻璃底板放置在显微镜载物台上。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用专门的 3D 打印支架来稳定地球并产生多层结构的更高质量的成像数据。 （A）和（B）分别表示在没有3D打印支架的情况下稳定受伤离体角膜的典型实时成像数据。钙信号事件（绿色）和细胞复染（深红色质膜染色）可以在（B）的角膜顶端，基底和基质层中清楚地识别，但在（A）中则不能。请点击此处查看此图的大图。
图 3：固定在 3D 打印支架中的角膜的 Z 堆栈。 在划痕伤口处穿过角膜层拍摄的z堆栈的代表性图像（用白色星号表示）。用深红色质膜染色样品以可视化细胞膜，并用Fluo4-AM（绿色）染色以可视化钙信号传导。（A）在伤口床上可以看到顶端细胞层，（B）顶端细胞层和基底细胞层，（C）基底细胞层和（D）基质。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：角膜的代表性 4 小时时间序列实验，揭示了地球在 x、y 或 z 方向上的小运动。 该图像是离体鼠球中央角膜处的划伤伤口（用白色星号表示）。用深红色质膜染色剂染色眼球以可视化细胞膜，并用Fluo4-AM（绿色）染色以可视化钙信号传导事件。使用3D打印支架固定地球仪。图像间隔1小时拍摄，从受伤后5分钟开始。在整个实验过程中，使用此成像设置观察到x，y或z方向上的漂移很小。请点击此处查看此图的大图。
图 5：完整地球上的成像位置图。3D打印支架允许在不同位置对完整的离体地球仪进行成像。支架用于从角膜的中央和角膜缘区域收集图像。用深红色质膜染色剂对眼球进行染色以检测细胞膜，并用Fluo4-AM（绿色）染色以检测钙信号传导。（A）划痕伤口处中央角膜的代表性图像。（B）中央角膜损伤后角膜缘区域的代表性图像。请点击此处查看此图的大图。
视频1：将地球仪固定在3D打印支架中4小时的电影。 用3D打印支架固定地球仪，并用深红色质膜染色剂（红色）染色以可视化细胞膜和Fluo4-AM（绿色）以可视化钙信号传导事件。每5分钟拍摄一次图像，持续4小时，从受伤后5分钟开始。在整个实验过程中，使用此成像设置观察到x，y或z方向上的漂移很小。播放速度为每秒 30 帧。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
该协议描述了一种活细胞成像技术，该技术使用3D打印支架来稳定和固定完整的动物眼睛。它旨在规避先前离 体 角膜组织活细胞成像方案所识别的几个显着缺点。该协议为完整地球仪的活细胞成像提供了许多优势。它显着减少了不必要的组织损伤，这些损伤可能会干扰对实验诱导的划痕伤口的伤口愈合反应。这包括解剖和暴露于紫外线对神经和上皮的损害。此外，该协议通过固定组织的方式促进组织水合作用和活力，允许定期施用生长培养基而不会中断实验。通过改变支架中眼睛的方向，该协议允许对地球上的不同区域进行成像。使用共聚焦显微镜以及该协议允许对地球的不同平面进行成像，从而可以观察组织结构之间的相互作用。该方案用途广泛，可以适应小鼠和其他物种的各种大小的地球仪。支架和盖子可以很容易地从成像孔中取出、消毒和重复使用。3D打印协议高效且省时，可以一次方便地创建多个支架。如果需要保存样品并在以后再次成像，则可以将地球仪固定在支架内。固定组织在固定后数周内保留深红色质膜染色和 Fluo4-AM 染色，可在特定蛋白质染色时用作标志物。
以前的方案要求解剖眼睛，随后使用紫外线激活的PEG凝胶来固定角膜以进行成像7，8，9。通过这些技术对组织造成的损害可能会混淆实验结果。在研究伤口愈合所涉及的细胞和组织过程时，这一点尤其重要，因为超出实验应用伤口的这种额外损伤可能会改变伤口愈合反应4，12。感觉角膜神经的输入将受到先前协议的影响，因为解剖过程将神经与三叉神经节中的细胞体切断13。此外，角膜的解剖本身会引起损伤反应，因为损伤释放的可溶性因子负责伤口愈合反应4。这种新程序通过完整地对地球仪进行成像来解决这些弱点。使用这种方法，对眼睛的损害仅限于眼球摘除时切开视神经，并在角膜内长时间保持细胞活力。总之，这些改进可以更好地模拟伤口反应。
在处理活组织时，固定化是一个重要但具有挑战性的步骤，因为它必须在整个实验过程中保持活力和水合。虽然角膜和眼球可以用紫外线诱导的PEG凝胶固定，但该过程需要在将组织放入支架8后进行紫外线照射。据观察，聚合PEG所需的照射降低了细胞反应性。此外，PEG降低了图像的分辨率，并且需要AiryScan功能来观察细胞信号传导。在这个新协议中，支架的尺寸经过优化，以精确地适合地球仪，盖杆提供了额外的固定层。支架和盖杆无需使用 PEG，PEG 可生成更高质量、更高分辨率的图像，其中包含伤口愈合过程的实时镜头。上述问题的一种解决方案是完全放弃活细胞成像，并在受伤后的预定时间将球固定在多聚甲醛（4%）中。然而，对于固定组织，无法观察到正在进行的细胞过程，例如钙信号传导以及这些过程对组织物理变化的影响。对于有兴趣记录和量化角膜上皮细胞之间通信事件的小组，组织固定施加的限制使得该技术无法用于此类目的。
这个新协议有两个关键步骤：（1）安乐死和立即眼球摘除，以及（2）持有人内地球的位置和方向。视神经的切除和眼球摘除术必须小心地进行，方法是撑起眼睛而不放置支架以保留内部和外部结构。定位和定向对于感兴趣部位的成像是必要的，并确保尽可能大的视野具有足够的细节。在将盖杆施加到支架上之前，必须正确放置地球仪。
可以根据实验参数的要求调整协议的几个变量。支架可以以不同的尺寸印刷，以适应不同体积的地球仪。有关支架直径和高度相对于地球尺寸的参数在尺寸范围内保持不变。如果用户在z平面上遇到漂移，潜在的原因可能是组织没有固定，支架应该重新制造。完整球体的染色可以根据实验参数、使用的染色剂以及目标组织的最佳环境和浓度进行调整。只要保持组织活力，就可以调整实验持续时间。涉及组织持续成像1小时的短期实验和涉及在4小时内定期对组织成像的长期实验都已成功进行。这些实验是在倒置显微镜上进行的，该协议旨在与类似的成像设置进行最佳使用。一旦地球仪稳定并定位在支架内，移除地球仪可能会导致组织损伤;因此，在安装盖杆之前，地球仪的最佳定位和方向至关重要。球体可以固定在4%多聚甲醛中，同时仍固定在支架内，以便进一步分析蛋白质定位。初步数据显示，深红色质膜染色和Fluo4-AM染色均通过固定过程保留。
尽管该协议与以前的协议相比具有许多优点，但这种实验方法存在一些局限性。一个缺点是很难在不损坏角膜上皮的情况下从支架上取下球。因此，必须将地球固定在支架中，以便以后使用蛋白质或RNA定位方法重新成像。这可能会限制后续研究。在长时间的成像方案中，该方案的另一个缺点是必须保持水合作用。需要定期手动重新应用培养基，需要有人主动监控成像过程的实验范围。对于扩展成像方案来说，这可能在逻辑上具有挑战性。
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Disclosures
我们没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢NIH的以下赠款支持：RO1EY032079（VTR），R21EY029097-01（VTR），1F30EY033647-01（KS）和5T32GM008541-24（KS）。我们还要感谢马萨诸塞州狮子会眼科研究基金和新英格兰角膜移植基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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