Summary
Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l'attività di segnalazione del calcio cellulare nell'epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.
Abstract
La guarigione della ferita epiteliale corneale è un processo migratorio avviato dall'attivazione dei recettori purinergici espressi sulle cellule epiteliali. Questa attivazione si traduce in eventi di mobilizzazione del calcio che si propagano da cellula a cellula, che sono essenziali per iniziare la motilità cellulare nel letto della ferita, promuovendo un'efficiente guarigione della ferita. Il laboratorio Trinkaus-Randall ha sviluppato una metodologia per l'imaging della risposta di guarigione delle ferite corneali in globi murini ex vivo in tempo reale. Questo approccio prevede l'enucleazione di un globo intatto da un topo che è stato eutanasia secondo protocolli stabiliti e l'incubazione immediata del globo con un colorante indicatore di calcio. Una contromacchia che colora altre caratteristiche della cellula può essere applicata in questa fase per aiutare con l'imaging e mostrare punti di riferimento cellulari. Il protocollo ha funzionato bene con diversi coloranti di cellule vive utilizzati per la controcolorazione, tra cui l'actina SiR per colorare l'actina e la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per colorare la membrana cellulare. Per esaminare la risposta a una ferita, l'epitelio corneale viene ferito utilizzando un ago da 25 G e i globi vengono posizionati in un supporto stampato in 3D. Le dimensioni del supporto stampato in 3D sono calibrate per garantire l'immobilizzazione del globo per tutta la durata dell'esperimento e possono essere modificate per ospitare occhi di diverse dimensioni. L'imaging cellulare vivo della risposta della ferita viene eseguito continuamente a varie profondità in tutto il tessuto nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo ci consente di generare immagini ad alta risoluzione e di qualità pubblicativa utilizzando un obiettivo aereo 20x su un microscopio confocale. Altri obiettivi possono essere utilizzati anche per questo protocollo. Rappresenta un miglioramento significativo nella qualità dell'imaging di cellule vive in globi murini ex vivo e consente l'identificazione di nervi ed epitelio.
Introduction
Cornea
La cornea è una struttura avascolare chiara che copre la superficie anteriore dell'occhio che rifrange la luce per consentire la visione e protegge l'interno dell'occhio dai danni. Poiché la cornea è esposta all'ambiente, è suscettibile di danni sia da cause meccaniche (graffi) che da infezioni. Una lesione corneale in un paziente altrimenti sano guarisce in genere entro 1-3 giorni. Tuttavia, nei pazienti con condizioni di base tra cui deficit di cellule staminali limbari e diabete di tipo II, il processo di guarigione della ferita corneale può essere notevolmente prolungato1. Poiché la cornea è altamente innervata, queste ulcere corneali non cicatrizzanti e le erosioni corneali ricorrenti sono molto dolorose e diminuiscono notevolmente la qualità della vita dei pazienti che le sperimentano1.
Segnalazione cellulare
Quando una cornea altrimenti sana è ferita, gli eventi di segnalazione del calcio nelle cellule adiacenti alla ferita precedono e inducono la migrazione cellulare nel letto della ferita, dove chiudono la lesione senza il rischio di cicatrici 2,3. Questi eventi di segnalazione sono stati ben caratterizzati in modelli di coltura cellulare epiteliale corneale utilizzando l'imaging cellulare vivo2. Gli esperimenti preliminari dimostrano significativamente più segnalazione di calcio dopo la lesione nelle cellule non diabetiche rispetto alle cellule diabetiche. Tuttavia, la caratterizzazione degli eventi di segnalazione cellulare nei globi ex vivo si è rivelata una sfida tecnica.
Imaging cellulare vivo
Studi precedenti hanno registrato con successo eventi di segnalazione del calcio da modelli di coltura cellulare in vitro di guarigione della ferita corneale 4,5,6. Lo sviluppo di una metodologia per produrre immagini di alta qualità di questi eventi di segnalazione in tessuto ex vivo è di grande interesse perché consentirebbe lo studio di questi eventi in un sistema più complesso e realistico. Gli approcci precedenti hanno comportato la dissezione della cornea seguita dall'immobilizzazione in un gel PEG indotto dai raggi UV 7,8,9. L'immobilizzazione è un passo essenziale ma impegnativo quando si lavora con tessuti vivi, in quanto deve rimanere vitale e idratato per tutto il corso dell'esperimento. Inoltre, l'immobilizzazione non deve danneggiare il tessuto. Mentre la soluzione PEG immobilizzava il tessuto, la risoluzione e la qualità delle immagini prodotte non erano coerenti. Pertanto, i supporti stampati in 3D sono stati sviluppati per immobilizzare globi intatti per produrre immagini di qualità superiore con meno rischi di danni ai tessuti.
L'approccio
È stato sviluppato un esclusivo supporto stampato in 3D per immobilizzare globi ex vivo intatti per l'imaging di cellule vive. Questo supporto previene i danni da due fonti principali: consente l'imaging di un globo enucleato senza la necessità di sezionare la cornea ed elimina l'esposizione alla luce UV. Senza queste fonti di danno, le immagini ottenute rappresentavano più accuratamente la risposta alle lesioni da graffio fatte sperimentalmente. Inoltre, il supporto stampato in 3D è stato calibrato alle dimensioni precise dell'occhio murino. Ciò ha fornito un adattamento molto migliore rispetto all'immobilizzazione nella soluzione PEG, portando a un'immagine di qualità superiore a obiettivi a bassa potenza a causa della diminuzione del movimento dei tessuti. Una barra di copertura attaccata alla parte superiore del supporto assicura che il globo rimanga immobile per tutta la durata dell'esperimento e che non vi sia alcuno spostamento del globo quando vengono applicati terreni di crescita per mantenere l'idratazione e la vitalità. La possibilità di stampare il supporto su dimensioni precise ci consente anche di generare una vestibilità ottimale per occhi murini di diverse dimensioni a causa dell'età o dello stato di malattia. Questa tecnologia può essere applicata in modo più ampio per sviluppare supporti per gli occhi di diverse specie in base alle loro dimensioni.
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Protocol
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso di animali nella cura oftalmica e nella ricerca sulla visione e dal protocollo IACUC dell'Università di Boston (201800302).
1. Progettazione dei supporti stampati in 3D e della barra di copertura
- Progetta i supporti stampati in 3D e la barra di copertura tenendo conto del diametro medio dei globi del mouse e stampa in 3D il design (Figura 1A, B).
- Mantenere il diametro della parete interna del supporto leggermente più grande del diametro medio del globo per tenere conto delle diverse dimensioni dei singoli topi. Mantieni l'altezza del supporto a circa la metà del diametro del globo, assicurando una perfetta aderenza del globo quando fissato dalla barra di copertura stampata in 3D.
- Dimensionare la barra di copertura del supporto alla lunghezza del diametro esterno del supporto con una larghezza compresa tra 1/4 e 1/2 del diametro del supporto. La barra di copertura è dimensionata per consentire l'accesso al globo quando fissata nel supporto per l'idratazione e la rimozione dell'occhio alla conclusione dell'esperimento.
- Stampare il supporto e la barra di copertura.
2. Raccolta dei campioni
- Per questo studio sono stati utilizzati topi eutanasia (topi maschi C57BL / 6 di età compresa tra 9-12 settimane e 27 settimane di età) utilizzando protocolli stabiliti in conformità con le linee guida istituzionali. Per questo protocollo, eseguire l'eutanasia con anidride carbonica seguita da decapitazione.
- Rimuovere la testa del topo e posizionarla immediatamente sul ghiaccio per preservare la vitalità del tessuto. Enucleare i globi utilizzando strumenti di dissezione prevenendo danni ai tessuti.
- Proptose il globo usando una pinzetta. Aggancia il nervo ottico usando le forbici da dissezione appena sotto dove è tenuto dalle pinzette.
NOTA: per ulteriori precauzioni, eseguire i seguenti passaggi in una cappa a flusso laminare. - Incubare i globi in 2 ml di terreno in un piatto di coltura cellulare p35 che include un indicatore di calcio e/o una colorazione di membrana cellulare per 1 ora in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 con condizioni di scarsa illuminazione. Assicurarsi che i globi siano immersi nel mezzo di colorazione per una colorazione uniforme.
- Per gli esperimenti eseguiti qui, utilizzare l'indicatore di calcio, Fluo4-AM (1:100)2, e la colorazione contro la membrana cellulare, colorazione della membrana plasmatica rosso intenso (1:10.000)2, con una concentrazione finale dell'1% (v/v) di DMSO e dello 0,1% (p/v) di acido pluronico in 2 ml di terreno privo di siero di cheratinociti (KSFM) con i seguenti integratori di crescita: 25 μg/mL di estratto ipofisario bovino, 0,02 nM fattore di crescita epidermico, 0,3 mM CaCl2 e penicillina-streptomicina (100 unità/ml e 100 μg/ml, rispettivamente).
NOTA: Le condizioni e i tempi di incubazione variano a seconda dell'indicatore di calcio, del tipo di tessuto e del volume del campione. Quando si utilizza l'acido pluronico, si consiglia cautela in quanto rende permeabile il tessuto. Questo protocollo richiede il 10% di acido pluronico. Concentrazioni più basse di acido pluronico sono state determinate sperimentalmente per essere inefficaci, e concentrazioni più elevate rischiano danni al tessuto.
- Per gli esperimenti eseguiti qui, utilizzare l'indicatore di calcio, Fluo4-AM (1:100)2, e la colorazione contro la membrana cellulare, colorazione della membrana plasmatica rosso intenso (1:10.000)2, con una concentrazione finale dell'1% (v/v) di DMSO e dello 0,1% (p/v) di acido pluronico in 2 ml di terreno privo di siero di cheratinociti (KSFM) con i seguenti integratori di crescita: 25 μg/mL di estratto ipofisario bovino, 0,02 nM fattore di crescita epidermico, 0,3 mM CaCl2 e penicillina-streptomicina (100 unità/ml e 100 μg/ml, rispettivamente).
3. Preparazione dei portacampioni
- Far aderire i supporti a un coprislip con fondo di vetro pulito con colla che non è stata utilizzata in precedenza. La colla utilizzata in questo protocollo proviene da contenitori monouso per garantire la sterilità e ogni volta viene utilizzato un nuovo contenitore non aperto.
- Lavare il supporto in etanolo al 70%. Posizionare la colla sul supporto e far aderire il supporto al coperchio inferiore in vetro. Assicurarsi che non vi sia colla all'interno dell'area interna del supporto poiché la colla può fluoresce, complicando l'imaging.
- Attendere che la colla si solidifichi. Verificare che il supporto sia saldamente contro il coprifoglio.
NOTA: Le lastre di celle P35 con coperchi con fondo di vetro sono state utilizzate per gli esperimenti presentati in questo manoscritto. Altri vetrini e/o lastre con fondo di vetro possono essere sostituiti in base alle esigenze dell'esperimento.
4. Ferita dei globi oculari
- Rimuovere i globi dalla soluzione colorante utilizzando contagocce sterili, avendo cura di prevenire danni ai tessuti nella regione di interesse. Lavare i globi per 5 minuti a temperatura ambiente utilizzando soluzione salina sterile tamponata con fosfato per rimuovere la macchia in eccesso e posizionare i globi nel mezzo per il trasporto al microscopio.
- Avvolgere i globi usando un ago sterile da 25 G nella regione di interesse.
- Utilizzando un contagocce sterile, raccogliere e tenere il globo dalla parte posteriore dell'occhio. Ciò manterrà stabile il globo, impedirà che rotoli e consentirà di creare ferite consistenti. Utilizzando questa configurazione, il nervo ottico sarà all'interno dell'ugello contagocce e la cornea sarà rivolta verso l'esterno.
- Per una ferita da graffio, spostare delicatamente un ago sterile da 25 G sulla cornea esposta. Per una ferita da puntura, premere delicatamente l'ago direttamente nella cornea centrale. Assicurarsi che la ferita non fori la cornea.
NOTA: ignorare questo passaggio se per l'esperimento non è necessaria una risposta della ferita o un ambiente ferito. Studi precedenti hanno dimostrato che sia le ferite da graffio che le ferite da puntura alle cornee murine realizzate con questo metodo sono coerenti sia nel diametro che nella profondità10. La conferma delle dimensioni della ferita tra globi indipendenti è stata eseguita utilizzando un'analisi della regione di interesse.
5. Posizionamento del campione sul supporto
- Posizionare la cornea o la regione limbare sul coprivetrino nella zona interna del supporto e stabilizzare utilizzando la copertina stampata in 3D (Figura 1C-H).
- Verificare che il globo sia posizionato correttamente e che il sito di interesse sia a contatto con il vetrino. Una volta che il globo è stato inserito nel supporto, non cercare di rimuovere il globo in quanto ciò potrebbe causare danni ai tessuti.
- Far aderire la copertina stampata in 3D al supporto utilizzando la colla, garantendo la stabilizzazione. Assicurati che la barra di copertura aderisca al supporto e non al globo.
NOTA: l'area da visualizzare viene posizionata verso il basso perché il protocollo è scritto per l'uso su un microscopio invertito. Il protocollo può essere adattato per microscopi verticali utilizzando supporti con un raggio interno più piccolo e la rimozione della barra di copertura. Ciò si tradurrà in una minore stabilizzazione del globo.
6. Imaging del campione
- Accendere il microscopio e la camera ambientale e verificare che la camera sia umidificata. Impostare la camera ambientale a 35 °C e al 5% di CO2 per tutta la durata dell'esperimento.
NOTA: I microscopi con camere ambientali sono preferibili per questa procedura per prevenire la disidratazione e mantenere il globo a temperature ottimali, ma non sono necessari. - Posizionare il coprifoglio, il supporto e il globo stabilizzato sul palco del microscopio all'interno della camera ambientale e l'immagine utilizzando tecniche di imaging di cellule vive9.
- Pipettare ulteriori mezzi di crescita sul vetrino di copertura per prevenire la disidratazione e mantenere la vitalità dei tessuti. Assicurarsi che ci sia abbastanza mezzo nel pozzo per coprire il globo nel supporto. A seconda della durata dell'imaging, aggiungere un nuovo mezzo quando necessario durante l'esperimento.
- Inizia gli esperimenti utilizzando tecniche e protocolli di imaging di cellule vive. Utilizzare impostazioni laser a bassa potenza per preservare il tessuto e prevenire danni ai tessuti in esperimenti di lunga durata. Utilizzare obiettivi appropriati per lunghe distanze di lavoro. Gli esperimenti in questo manoscritto sono stati eseguiti utilizzando un obiettivo 20x.
NOTA: La potenza e il guadagno del laser, la durata sperimentale, la posizione e il piano di imaging sono tutte variabili a seconda dei parametri sperimentali. Esperimenti di imaging su globi intatti di durata compresa tra 1 h e 4 h sono stati eseguiti con successo nelle pubblicazioni precedenti10. - Registra e salva i dati nel formato di file preferito. Il software utilizzato dal microscopio produce file .czi per la registrazione dei dati.
- Smaltire i globi secondo i protocolli istituzionali standard alla fine del protocollo.
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Representative Results
Questo protocollo è stato utilizzato per produrre costantemente dati e immagini di qualità di pubblicazione10. Le immagini ottenute rappresentano un miglioramento significativo rispetto agli approcci precedenti (Figura 2). Utilizzando il supporto stampato in 3D, le immagini possono essere catturate attraverso gli strati della cornea e si può osservare la mobilizzazione del calcio in diversi piani z (Figura 3). Questo approccio è stato utilizzato per confrontare la segnalazione cellula-cellula tra strati cellulari apicali e basali in una ferita in topi giovani e vecchi10.
La migliore stabilità ha anche permesso di acquisire immagini dei globi per molto più tempo di quanto fosse possibile in precedenza. Ciò ha permesso agli studi sulla migrazione cellulare nel letto della ferita di essere estesi di diverse ore oltre le capacità precedenti. Con questa linea temporale estesa, differenze sostanziali nel comportamento cellulare possono essere osservate durante la risposta di guarigione della ferita tra topi giovani e anziani dopo lesione corneale10. Per questo protocollo, i dati sono stati raccolti ogni 5 minuti per 4 ore. Quando si utilizza il supporto, non è stata osservata alcuna deriva significativa nei piani x, y o z nel corso dell'esperimento (Figura 4, Video 1).
Un vantaggio di questo protocollo è che consente di visualizzare diverse regioni della cornea in base al posizionamento del globo nel supporto. In una recente pubblicazione, questa funzione è stata sfruttata per raccogliere immagini sia nella cornea centrale che nella regione corneale-limbare (Figura 5) 10. Una lesione alla cornea centrale è stata trovata per produrre eventi di segnalazione del calcio nelle cellule adiacenti ai nervi nella regione limbare10. La versatilità del supporto va oltre la stabilizzazione del globo per esperimenti di imaging ed è stata utilizzata per diverse applicazioni. Posizionando la cornea a faccia in su nel supporto, sono stati eseguiti esperimenti di nanoindentazione per misurare la rigidità dell'epitelio corneale, della membrana basale e dello stroma in topi giovani e vecchi10,11.
Figura 1: Schemi e configurazione del supporto stampato in 3D. (A) Progettazione del supporto stampato in 3D con dimensioni di altezza e larghezza annotate. (B) Immagine del file CAD rappresentativa dal software della stampante 3D. (C) Immagine rappresentativa del titolare con la copertina allegata contenente un globo murino. (D) La colla sterile monouso viene applicata sul fondo del supporto stampato in 3D. (E) Il supporto stampato in 3D è aderito a un piatto di coltura cellulare p35 con fondo di vetro. (F) Un globo enucleato viene inserito nella cornea verso il basso nel supporto utilizzando un contagocce sterile. (G) La barra di copertura è aderente alla parte superiore del supporto stampato in 3D per garantire l'immobilizzazione del globo. (H) La lastra con fondo di vetro con un supporto e un globo aderenti è posizionata sul palco del microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Utilizzo di supporti stampati in 3D specializzati per stabilizzare il globo e produrre dati di imaging di qualità superiore di strutture multistrato . (A) e (B) rappresentano i tipici dati di imaging dal vivo di una cornea ferita ex vivo stabilizzata senza e con un supporto stampato in 3D, rispettivamente. Gli eventi di segnalazione del calcio (verde) e la controcolorazione cellulare (colorazione della membrana plasmatica rosso intenso) possono essere chiaramente identificati negli strati apicale, basale e stromale della cornea in (B) ma non in (A). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Z-stack di una cornea immobilizzata nel supporto stampato in 3D. Immagini rappresentative di uno z-stack preso attraverso gli strati della cornea in una ferita da graffio (indicata con un asterisco bianco). Il campione è colorato con una colorazione di membrana plasmatica rosso intenso per visualizzare le membrane cellulari e Fluo4-AM (verde) per visualizzare la segnalazione del calcio. (A) Lo strato cellulare apicale, (B) le cellule apicali e basali, (C) lo strato di cellule basali e (D) lo stroma possono essere visti nel letto della ferita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Esperimento rappresentativo di serie temporali di 4 h di una cornea che rivela poco movimento del globo nelle direzioni x, y o z. L'immagine è di una ferita da graffio (indicata con un asterisco bianco) nella cornea centrale di un globo murino ex vivo. Il globo è colorato con una colorazione di membrana plasmatica rosso intenso per visualizzare le membrane cellulari e Fluo4-AM (verde) per visualizzare gli eventi di segnalazione del calcio. Il globo è immobilizzato utilizzando un supporto stampato in 3D. Le immagini sono state scattate a 1 ora di distanza, iniziando 5 minuti dopo l'infortunio. Una piccola deriva nelle direzioni x, y o z è stata osservata utilizzando questa configurazione di imaging nel corso dell'esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Diagramma delle posizioni di imaging su un globo intatto. Il supporto stampato in 3D consente l'imaging di un globo ex vivo intatto in varie posizioni. Il supporto è stato utilizzato per raccogliere immagini da entrambe le regioni centrali e limbari della cornea. I globi sono colorati con una colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per rilevare le membrane cellulari e Fluo4-AM (verde) per rilevare la segnalazione del calcio. (A) Immagine rappresentativa della cornea centrale in corrispondenza di una ferita da graffio. (B) Immagine rappresentativa della regione limbare della cornea dopo una lesione alla cornea centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Filmato di un globo immobilizzato in un supporto stampato in 3D per 4 ore. Un globo è stato immobilizzato con il supporto stampato in 3D e colorato con una colorazione di membrana plasmatica rosso intenso (rosso) per visualizzare le membrane cellulari e Fluo4-AM (verde) per visualizzare gli eventi di segnalazione del calcio. Un'immagine è stata scattata ogni 5 minuti per 4 ore, iniziando 5 minuti dopo l'infortunio. Una piccola deriva nelle direzioni x, y o z è stata osservata utilizzando questa configurazione di imaging nel corso dell'esperimento. La velocità di riproduzione è di 30 fotogrammi al secondo. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Questo protocollo descrive una tecnica di imaging cellulare vivo che utilizza un supporto stampato in 3D per stabilizzare e immobilizzare gli occhi degli animali intatti. È progettato per aggirare diversi svantaggi significativi riconosciuti con precedenti protocolli di imaging di cellule vive del tessuto corneale ex vivo . Questo protocollo offre molti vantaggi per l'imaging di cellule vive di globi intatti. Riduce significativamente i danni tissutali non necessari che potrebbero interferire con la risposta di guarigione delle ferite da graffio indotte sperimentalmente. Ciò include danni ai nervi e all'epitelio dovuti alla dissezione e all'esposizione alla luce UV. Inoltre, questo protocollo facilita l'idratazione e la vitalità dei tessuti immobilizzando il tessuto in modo da consentire l'applicazione periodica del terreno di crescita senza interrompere gli esperimenti. Modificando l'orientamento dell'occhio nel supporto, il protocollo consente l'imaging di diverse regioni del globo. L'uso della microscopia confocale insieme a questo protocollo consente l'imaging di diversi piani del globo, consentendo l'osservazione delle interazioni tra strutture tissutali. Il protocollo è altamente versatile e può essere adattato a globi di varie dimensioni da topi e altre specie. I supporti e le coperture possono essere facilmente rimossi dai pozzetti di imaging, sterilizzati e riutilizzati. Il protocollo di stampa 3D è efficiente ed efficiente in termini di tempo, consentendo la creazione conveniente di molti supporti contemporaneamente. I globi possono essere fissati all'interno dei supporti se i campioni devono essere conservati e ripresi in un secondo momento. Il tessuto fisso mantiene la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso e le macchie Fluo4-AM per diverse settimane dopo la fissazione, che possono essere utilizzate come marcatori durante la colorazione per una o più proteine specifiche.
I protocolli precedenti richiedevano la dissezione dell'occhio e il successivo uso di un gel PEG attivato dai raggi UV per immobilizzare la cornea per l'imaging 7,8,9. I danni al tessuto subiti attraverso queste tecniche potrebbero confondere i risultati sperimentali. Questo è particolarmente importante da considerare quando si studiano i processi cellulari e tissutali coinvolti nella guarigione delle ferite, poiché questo danno aggiuntivo oltre alle ferite applicate sperimentalmente può alterare la risposta di guarigione della ferita 4,12. L'input dei nervi corneali sensoriali sarà influenzato dal protocollo precedente, poiché il processo di dissezione separa i nervi dai loro corpi cellulari nel ganglio trigemino13. Inoltre, la dissezione della cornea causerebbe essa stessa una risposta alla lesione, poiché i fattori solubili rilasciati da una lesione sono responsabili della risposta di guarigione della ferita4. Questa nuova procedura affronta queste debolezze visualizzando i globi intatti. Utilizzando questa metodologia, il danno all'occhio è limitato al taglio del nervo ottico dopo l'enucleazione e mantiene la vitalità cellulare all'interno della cornea per lunghi periodi di tempo. Insieme, questi miglioramenti creano una migliore simulazione della risposta della ferita.
L'immobilizzazione è un passo essenziale ma impegnativo quando si lavora con tessuti vivi, in quanto deve rimanere vitale e idratato per tutto il corso dell'esperimento. Mentre le cornee e i globi potrebbero essere fissati con gel PEG indotto dai raggi UV, la procedura richiede l'irradiazione UV dopo aver posizionato il tessuto nel supporto8. È stato osservato che l'irradiazione necessaria per polimerizzare il PEG ha diminuito la reattività cellulare. Inoltre, il PEG ha ridotto la risoluzione delle immagini e la funzione AiryScan è stata necessaria per osservare la segnalazione cellulare. In questo nuovo protocollo, le dimensioni del supporto sono ottimizzate per adattarsi con precisione ai globi e la barra di copertura fornisce un ulteriore livello di immobilizzazione. Il supporto e la barra di copertura eliminano la necessità di utilizzare PEG, che produce immagini di qualità superiore e ad alta risoluzione con filmati in tempo reale del processo di guarigione della ferita. Una soluzione ai problemi sopra menzionati sarebbe quella di rinunciare completamente all'imaging delle cellule vive e fissare i globi in paraformaldeide (4%) in momenti predeterminati dopo l'infortunio. Tuttavia, con il tessuto fisso, i processi cellulari in corso come la segnalazione del calcio e gli effetti di questi processi sui cambiamenti fisici nel tessuto non possono essere osservati. Per i gruppi interessati a registrare e quantificare gli eventi di comunicazione tra le cellule dell'epitelio corneale, i limiti imposti dalla fissazione tissutale rendono questa tecnica poco pratica per tali scopi.
Questo nuovo protocollo ha due passaggi chiave: (1) eutanasia ed enucleazione immediata del globo e (2) posizionamento e orientamento del globo all'interno del titolare. Il taglio del nervo ottico e l'enucleazione del globo devono essere eseguiti con attenzione appoggiando l'occhio senza posizionare un tutore per preservare le strutture interne ed esterne. Il posizionamento e l'orientamento sono necessari per l'imaging dei siti di interesse e per garantire che il più ampio campo visivo possibile sia a fuoco con dettagli adeguati. Il corretto posizionamento del globo è necessario prima di applicare la barra di copertura al supporto.
Diverse variabili del protocollo possono essere regolate a seconda dei requisiti dei parametri sperimentali. I supporti possono essere stampati in diverse dimensioni per ospitare globi di volumi diversi. I parametri relativi al diametro e all'altezza del supporto rispetto alle dimensioni del globo rimangono gli stessi in tutte le gamme di dimensioni. Se l'utente sperimenta una deriva nel piano z, la potenziale ragione potrebbe essere che il tessuto non è immobilizzato e il supporto dovrebbe essere rigenerato. La colorazione dei globi intatti può essere regolata in base ai parametri sperimentali, alle macchie utilizzate, all'ambiente e alle concentrazioni ottimali per il tessuto di interesse. La durata sperimentale può essere regolata finché viene mantenuta la vitalità del tessuto. Sono stati entrambi eseguiti con successo esperimenti a breve termine che comportano 1 ora di imaging costante del tessuto e esperimenti a lungo termine che coinvolgono l'imaging del tessuto a intervalli regolari nel corso di 4 ore. Questi esperimenti sono stati eseguiti su un microscopio invertito e questo protocollo è stato progettato per un uso ottimale con una configurazione di imaging simile. Una volta che il globo è stabilizzato e posizionato all'interno del supporto, la rimozione del globo può causare danni ai tessuti; Pertanto, il posizionamento e l'orientamento ottimali del globo prima di attaccare la barra di copertura sono essenziali. I globi possono essere fissati in paraformaldeide al 4% mentre sono ancora all'interno dei supporti per ulteriori analisi della localizzazione delle proteine. Dati preliminari hanno dimostrato che la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso e la colorazione Fluo4-AM sono entrambe mantenute attraverso il processo di fissazione.
Sebbene questo protocollo abbia molti vantaggi rispetto ai protocolli precedenti, ci sono alcune limitazioni a questo approccio sperimentale. Uno svantaggio è che è difficile rimuovere il globo dal supporto senza danneggiare l'epitelio corneale. Pertanto, il globo deve essere fissato nel supporto per il re-imaging utilizzando metodi di localizzazione di proteine o RNA in un secondo momento. Ciò può limitare gli studi di follow-up. Un altro svantaggio di questo protocollo durante i protocolli di imaging prolungati è che l'idratazione deve essere mantenuta. La necessità di riapplicare manualmente i supporti a intervalli regolari richiede che qualcuno monitori attivamente il processo di imaging per l'estensione dell'esperimento. Ciò può rivelarsi logisticamente impegnativo per i protocolli di imaging estesi.
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Disclosures
Non abbiamo conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere il NIH per il seguente sostegno di sovvenzione: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Vorremmo anche riconoscere il Massachusetts Lions Eye Research Fund e il New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
