Summary
Минимально инвазивные методы и простое лабораторное устройство улучшают воспроизводимость модели повреждения спинного мозга, уменьшая оперативное повреждение экспериментальных животных и позволяя поддерживать анатомическую морфологию. Этот метод имеет смысл, поскольку надежные результаты и воспроизводимая процедура облегчают исследование механизмов репарации заболеваний.
Abstract
Использование минимально инвазивных методов для моделирования травмы спинного мозга (ТСМ) может свести к минимуму поведенческие и гистологические различия между экспериментальными животными, тем самым улучшая воспроизводимость экспериментов.
Эти методы требуют выполнения двух требований: ясности хирургического анатомического пути и простоты и удобства лабораторного устройства. Что крайне важно для оператора, четкий анатомический путь обеспечивает минимально инвазивное воздействие, что позволяет избежать дополнительного повреждения подопытного животного во время хирургических процедур и позволяет животному поддерживать последовательную и стабильную анатомическую морфологию во время эксперимента.
В этом исследовании исследуется использование новой интегрированной платформы, называемой коаксиальной платформой SCI для травмы спинного мозга у мелких животных, чтобы обнажить спинной мозг уровня Т9 минимально инвазивным способом и стабилизировать и обездвижить позвонок мышей с помощью стабилизатора позвонков, и, наконец, коаксиальный гравитационный ударный элемент используется для ушиба спинного мозга мышей, чтобы приблизиться к различным степеням повреждения спинного мозга T9. Наконец, гистологические результаты предоставляются в качестве справочного материала для читателей.
Introduction
Травматическое повреждение спинного мозга (ТСМ) легко предрасполагает индивида к тяжелым последствиям1; тем не менее, эффективного лечения в настоящее времяне существует 1,2. Модели ушиба животных являются одним из основных методов изучения SCI 3,4.
С 2004 по 2014 год4 крысы использовались в качестве модельных организмов в 289 из 407 исследований (71%) и мыши в 69 (16,9%). Действительно, доля экспериментов с мышами постепенно увеличивалась с годами из-за их преимуществ перед другими моделями, особенно большого потенциала для исследований регуляции генов 3,4,5. Поэтому для проведения большего количества исследований с использованием мыши в качестве модели требуются более совместимые инструменты из-за большого значения, придаваемого согласованности моделей6. Общие устройства, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях, в основном основаны на принципе удара спинного мозга Аллена, например, основной ударный элемент для снижения веса 7,8, ударный элемент 1,9 Нью-Йоркского университета (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Studies (MASCIS) и ударный элемент Infinite Horizon (IH)10,11 . Ударный элемент для снижения веса и ударный элемент NYU / MASCIS имеют один и тот же принцип нацеливания на целевой спинной мозг и сброса фиксированного веса с разных высот, чтобы сделать разную тяжесть травмы. Ударный элемент IH создает травму спинного мозга в соответствии с различными силами.
Для удобства использования мышиной модели в исследованиях ТСМ и для создания основы для эффективных методов лечения разработана интегрированная платформа повреждения спинного мозга мыши, называемая коаксиальной платформой повреждения спинного мозга (SCICP). Платформа состоит из четырех основных компонентов: (1) операционный стол для животных, предназначенный для подходящего положения для управляемых мышей, который очень компактен и обеспечивает удобство без ограничения положения; (2) микроретрактор с обеих сторон для удержания паравертебральных мышц во время операции; (3) стабилизатор позвонков для удержания позвонка перед процедурой ТСМ (два стабилизатора позвонков доступны для работы на более крупных животных, таких как крысы); (4) втулка, наконечник ударного элемента, гири и вытягивающий штифт. Три части должны быть собраны в съемный кронштейн X-Y-Z. Для точного наведения наконечник ударного элемента помещается на поверхность спинного мозга, а рычаг X-Y-Z осторожно опускается на ожидаемую высоту с помощью метки между наконечником ударного элемента и рукавом. Наконечник ударного элемента изготовлен из алюминиевого сплава весом 0,12 г, чтобы избежать повреждения спинного мозга, приписываемого компрессии большого веса перед процедурой. Вытягивающий штифт предназначен для удержания гирь на верхней части рукава для подготовки к падению веса (рисунок 1).
В предыдущих исследованиях разделение силы удара было определено в соответствии с данными о силе удара устройства IH, которые составляют 30 Кдын, 50 Кдын и 70 Кдын соответственно 6,10. В процессе исследования было доказано, что серийные степени моделей SCI установлены на основе SCICP, которые могут быть использованы в различных исследованиях. Поэтому перед официальным началом эксперимента силы удара, создаваемые различными весами разных масс, были проверены с помощью устройства для испытания пиковым давлением. В результате были выбраны три стандартизированные репрезентативные модели мышей SCI с тремя различными степенями травмы, включая градуированные легкие, умеренные и тяжелые группы, соответственно 6,10, и веса были выпущены на той же высоте, с весом 1,3 г для легкой, 2,0 г для умеренной и 2,7 г для тяжелого повреждения.
В качестве еще одного средства обеспечения работоспособности и точности сообщается о новом и минимально инвазивном оперативном подходе. Благодаря исследованию анатомии нормальных мышей найден новый метод определения местонахождения межостистого пространства T12-T13. Метод определения местоположения позвонков на этапах операции прост в освоении и точен, что обеспечивает точное определение местоположения для малоинвазивных операций.
Надеемся, что этот метод ушиба может помочь в исследовании и понимании травмы спинного мозга, включая понимание патофизиологии, оценку управления и так далее.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике и благополучию лабораторных животных Медицинского колледжа Чилу Шаньдунского университета (номер одобрения: 21L60) и были выполнены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальными институтами здравоохранения (публикации NIH No 85-23, пересмотрены в 1996 году).
1. Механизм повреждения спинного мозга коаксиальной платформой и механические испытания
- Соберите платформу с хирургическим операционным столом, стабилизатором позвонков и наконечником ударного элемента (рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите сброс веса и выхлопные пазы, которые предотвращают столкновение веса с воздушными потоками, чистыми, потому что любая грязь на падении веса или рукаве может повлиять на точность платформы. - Поместите наконечник, который позволяет точно определить местоположение спинного мозга, в рукав.
- Выберите правильные массы весовых капель для эксперимента, которые составляют 1,3 г, 2,0 г и 2,7 г для легкой, умеренной и тяжелой групп соответственно.
- Подключите штифт к отверстиям капли веса.
- Соберите каплю веса в верхнюю часть рукава с помощью штифта, установленного в канавке на руке X-Y-Z, так что, как только определение местоположения будет завершено, вес будет выпущен, чтобы ударить по кончику ударного элемента, следовательно, контузировав спинной мозг, и изменения в спинном мозге наблюдаются под микроскопом.
- Отрегулируйте съемный кронштейн X-Y-Z с точностью 0,1 мм для удобства оператора, чтобы обеспечить достаточное рабочее пространство (рисунок 1D, E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подтвердить согласованность результатов исследования, до начала эксперимента измерьте силу, возникающую при падении веса внутрь рукава, используя устройство обнаружения пикового давления. Повторение подтверждения не является необходимым для будущих исследований. - Включите устройство, поместите металлический регулятор давления ниже наконечника, обнулите адаптер, отпустите вытягивающий штифт и запишите фактическую силу удара.
2. Локализация и ламинэктомия9-го грудного позвонка (Т9)
ПРИМЕЧАНИЕ: Самки мышей C57BL/6J в возрасте 9-10 недель были приобретены у Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Цзинань, Китай).
- Автоклав набор хирургических инструментов для эксперимента и стерилизует операционный стол 75% спиртом перед операцией.
- Вводят бупренорфин для обезболивания (0,05-2,0 мг/кг, SQ) за 30 минут до анестезии при травматологических операциях. Затем обезболивают мышь изофлураном (индукция: ~3%-5%, поддержание: ~1,5%-2%). Проверьте, полностью ли животное обезболено рефлексами защемления хвоста или пальца ноги. После того, как анестезия действует, уложите мышь в положение лежа в назначенной части операционного стола и покройте роговицу офтальмологической мазью (нанесите офтальмологическую мазь на роговицу, чтобы защитить глаза от пересыхания во время операции).
- Сбрите волосы от каудального до рострального электробритвой над грудопоясничным отделом позвоночника. Стерилизуют кожу несколько раз круговыми движениями йодофором в течение 30 с последующим 75% спиртом. Нанесите стерильную хирургическую драпировку и сделайте продольный разрез примерно 1,5 см на коже примерно от Т6 до Т13 скальпелем и лезвием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пальпать вдоль реберного края до средней линии, где расположено межостистое пространство T12-T13. Сделайте разрез 1,5 см к росттралю, и разрез будет примерно вровень с позвонками Т6-Т13.
- Сбрите волосы от каудального до рострального электробритвой над грудопоясничным отделом позвоночника. Стерилизуют кожу несколько раз круговыми движениями йодофором в течение 30 с последующим 75% спиртом. Нанесите стерильную хирургическую драпировку и сделайте продольный разрез примерно 1,5 см на коже примерно от Т6 до Т13 скальпелем и лезвием.
- Исследуйте 13-е ребро с одной стороны от костной части под операционным микроскопом. Исследуйте остистый процесс в средней линии, слегка коснувшись области костовертебрального угла, а затем к ростралю, чтобы найти межостистое пространство T12-T13. Исследуйте межостистое пространство T9-T10 от пространства T12-T13 до ростральной стороны. (Рисунок 2А, 3А)
- Рассечение параспинальной мышцы вдоль остистого отростка Т9 до переднего и заднего фасеточных суставов обеих сторон микронарезами (рисунок 3В). Втягивайте параспинальные мышцы микроретракторами и очищайте мягкие ткани на пластинке и в межостистом пространстве Т8-Т9 и Т9-Т10 микроножницами.
- Выполните ламинэктомию Т9, зажмите остистый отросток Т9 микрохирургическими щипцами, слегка приподнимите его вверх, вставьте микроножницы параллельно вдоль правой дорсолатеральной стороны пластинки, избегая повреждения спинного мозга, и отрежьте пластинку микроножницами. Повторите с левой стороны, и спинной мозг может быть обнажен (рисунок 2B, 3C).
- Перед фиксацией позвонка ослабьте универсальную руку и медленно зажмите 9-10 фасеточные суставы по обеим сторонам позвонка микромоскитными щипцами стабилизатора позвонков. Затяните винты на микромоскитных щипцах, и позвонок таким образом стабилизируется. Отрегулируйте спинной мозг в горизонтальной плоскости, подтяните универсальную руку, и позвонок зафиксируется (рисунок 3D).
3. Ушиб Т9
- Как только спинной мозг уровня Т9 обнажается и позвонок фиксируется, цельтесь в спинной мозг кончиком внутри рукава под операционным микроскопом (рисунок 3E).
- Проверьте, параллельна ли поверхность кончика спинному мозгу от заднего и бокового аспектов спинного мозга, так как под микроскопом легко наблюдать взаимосвязь между спинным мозгом и кончиком, и что операционный стол можно легко повернуть.
- Проверьте, параллельна ли поверхность кончика двусторонним границам сохраненной пластинки, прежде чем кончик соприкоснется со спинным мозгом после ламинэктомии, поскольку это естественная плоскость отсчета, параллельная спинному мозгу.
- После обнаружения межостистого пространства Т12-Т13 опустите гильзу до тех пор, пока конец ударного элемента не будет соответствовать отметке на окне наблюдения и не будет достигнута указанная высота в 22 мм. Вытащите булавку, чтобы освободить вес (1,3 г, 2,0 г или 2,7 г в зависимости от группы, причем каждая группа включает 3 мышей, а каждая группа имеет одну мышь для каждого момента времени).
ПРИМЕЧАНИЕ: Спинной мозг должен быть параллельным земле и перпендикулярным кончику; переместите операционный стол для обеспечения микроскопического поля зрения, так как стол очень компактный. - Удалите ударный элемент, когда контузия сделан, и наблюдайте за степенью ТСМ под операционным микроскопом. В легкой группе можно увидеть изменение светло-красного цвета, в то время как в умеренной группе место травмы проявляет темно-красный цвет через 3-4 с, и, возможно, может наблюдаться возвышение. В тяжелой группе могут появиться сразу темно-красные проявления, и проявляется явное возвышение в твердой мозговой оболочке, но твердая мозговая оболочка все еще находится в последовательной форме (рисунок 3F).
- Швы поверхностной фасции и кожи швами (полипропиленовый нерассасывающийся шов, размер: 6-0).
- После завершения шва стерилизуйте хирургическую область, поместите мышь на блокнот с контролируемой температурой до восстановления полного сознания, а затем поместите мышь в клетки для мышей.
4. Уход за животными
- Поместите животное на грелку для восстановления и наблюдайте за движением обеих задних конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, перенесшие операцию, не должны быть возвращены в компанию других животных до полного выздоровления. - Поместите высоководную диету на пол клетки, чтобы животные могли легко добраться до пищи. В качестве альтернативы используйте клетку с более низким столом для кормления.
- Опорожняйте мочевой пузырь мышей два раза в день после операции, потому что группам с умеренными и тяжелыми травмами трудно восстановить функцию мочевого пузыря. Вводят бупренорфин для обезболивания (0,05-2,0 мг/кг, SQ) 8-12 ч/сут в течение 3 дней.
5. Транскардиальная перфузия, окрашивание и иммуноокрашивание
- На 1-й, 28-й и 56-й дни после травмы приносят в жертву по одной мыши из каждой группы, соответственно, путем перфузии.
- Перфузируйте мышей 60 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и 20 мл 4% параформальдегида после чрезмерной анестезии (4%-6% изофлурана).
- Соберите позвоночник микроножными ножницами, простирающимися рострально и каудально на 1 см соответственно от очага поражения.
- Резекция лишних мышц, резервирование неповрежденных сегментов позвоночника с частичными ребрами для удержания инструментов на шаге 5.1.4 и замачивание его в 4% параформальдегиде в течение 24 ч.
- Зажмите ребра гемостатическими щипцами для фиксации и определите очаг поражения под микроскопом по резецированной пластинке и изменению цвета в очаге поражения спинного мозга.
- Резекция всех пластинчатых и суставных отростков микронарезами от каудальной.
- Отрежьте нервные корешки микроножными ножницами и выньте спинной мозг.
- Соберите 0,5 см спинного мозга, простирающегося каудально и рострально, соответственно, от очага поражения микроножными ножницами.
- Поместите спинной мозг в 30% сахарозы при 4 °C в течение 48 ч.
- Разрезать ткани на участки толщиной 6 мкм после замораживания по типу гистологического исследования.
- Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E).
- Согрейте срезы до комнатной температуры и замочите участки толщиной 6 мкм в 4% формальдегиде в течение примерно 15 мин, а затем замочите в 1x PBS в течение 1 мин четыре раза, чтобы удалить остаточный OCT.
- Окрашивают участки гематоксилином на 90 с, а смывают двойной дистиллированной водой.
- Затем промыть участки проточной водой в течение 3 мин.
- Окрашивают эозином в течение 4 мин и замачивают в 95% спирте на 30 с дважды, чтобы смыть избыток эозина.
- Наконец, обезвоживать градиентным спиртом (95% спирта и 50% спирта один раз, последовательно) в течение 30 с и замочить в ксилоле для прозрачности в течение 2 мин. Затем запечатайте образцы смоляным гелем (корональное плоское сечение: Рисунок 4; сагиттальное плоское сечение: Рисунок 5).
- Выполняют иммунофлуоресцентное окрашивание.
- Согрейте срезы до комнатной температуры и замочите участки толщиной 6 мкм в 4% формальдегиде примерно на 2 мин.
- Промыть секции в TBST в течение 5 мин в течение трех раз.
- Инкубируют участки блокирующим раствором (10% козьей нормальной сывороткой в ПБС) и блокируют в течение 1 ч, блокируя неспецифическое связывание иммуноглобулина.
- Инкубируют участки спинного мозга в течение ночи при 4 °C как фибриллярным кислым белком мышиного антиглии (GFAP, маркер реактивных астроцитов), поликлональным антителом (1:600) и антителом против NF200 кролика (1:2000), маркером нейрофиламента в 0,4 мл блокирующего раствора.
- Промыть участки PBS и добавить 0,4 мл блокирующего раствора с козьими анти-кроликами Alexa 594-конъюгированным IgG (1:1000) и козьими антимышевыми Alexa 488-конъюгированными IgG (1:1000) вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа в 10 раз путем автоматического панорамного сканирования на длинах волн 594 нм и 488 нм соответственно (рисунок 6).
- Включите флуоресцентный микроскоп, поместите затвор на ступень микроскопа, переключитесь на флуоресцентный канал, используйте клавишу позиционирования, чтобы расположить три-четыре точки на ткани, и сфокусируйтесь для завершения съемки. После завершения съемки сохраните изображения разных каналов в нужном формате, а затем сохраните объединенное изображение.
Representative Results
Чтобы проверить точность устройства, сила, которую три разные массы весов сделали с одной и той же высоты, была измерена с помощью устройства для испытания пикового давления. Двадцать четыре испытания были проведены с различными группами весов, в результате чего (среднее ± SD) составило 0,323 Н ± 0,02 Н для веса 1,3 г, 0,543 Н ± 0,15 Н для масс 2,0 г и 0,723 Н ± 0,26 Н для веса 2,7 г (рис. 7). Предыдущие исследования использовали dyne (dyn) или Kilodyne (Kdyn) в качестве единиц для измерения интенсивности контузии. Для лучшего сравнения с предыдущими исследованиями приведены преобразования между ньютонами (N) и dyne/Kilodyne (1 N = 1 кг × 1 м/с2 = 1 × 103 г × 1 × 100 см/с2 = 1 × 105 дин; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).
В таблице 1 и на рисунке 4 приведены данные о поражениях легкой, средней и тяжелой групп на корональных срезах. Судя по рисунку 4, на 28-й день после травмы непрерывность различимых границ серого и белого вещества в легкой, умеренной и тяжелой группах последовательно уменьшалась, при этом площадь рубцовой ткани увеличивалась и увеличивалась пропорция на поперечном сечении очага поражения. Были очевидные морфологические различия во всех экспериментальных группах по сравнению с нормальной группой. Это доказало рациональность деления степеней травматизма в экспериментальных группах.
Таблица 2 и рисунок 5 описывают травмы спинного мозга на 1-й и 56-й дни после травмы на сагиттальных отделах. Видно, что площадь поражения постепенно значительно увеличивалась от легкой до тяжелой групп на 1-й день после травмы. Между тем, непрерывность белого вещества по обе стороны спинного мозга была лучше в легкой группе, с наблюдаемыми небольшими круглыми вакуолями, которые являются характеристиками интерстициального отека. В умеренной группе белое вещество демонстрировало плохую непрерывность, а структура вентрального белого вещества не была упорядочена. В тяжелой группе вентральное белое вещество проявляло более серьезные нарушения, и в центре травмы появился большой участок полости. Кроме того, окружающие ткани показали очевидное заполнение эритроцитов, а красные кровяные клетки возле центрального канала собрались в полоски. На 56-й день после травмы наблюдалось образование рубцов в травматологическом центре трех групп, площадь которых увеличивалась в зависимости от тяжести травмы.
Целостность нейрофиламента спинного мозга на 56-й день после травмы также может быть получена из анализа результатов иммунофлуоресцентного окрашивания (рисунок 6). Рисунок также показывает, что перекрывающиеся рубцообразующие астроциты были видны в центре всех трех групп травм, причем длина области повреждения увеличивалась с тяжестью травмы, в то время как диаметр рубца уменьшался. Это говорит о наличии рубцовой контрактуры, которая может привести к уменьшению диаметра спинного мозга.
Рисунок 1: Целое и части коаксиальной платформы повреждения спинного мозга. (A) Рука X-Y-Z и операционный стол могут быть разделены, что оставляет достаточно места для процедуры операции, во время которой обнажается спинной мозг маленького животного. Рабочий стол можно свободно перемещать во время работы, уменьшая потенциальную эксплуатационную сложность, связанную с ограничениями положения. Корпус стабилизатора позвонков имеет трехсуставную универсальную руку для помощи в направлении, что повышает его гибкость. (B) Вставьте наконечник ударного элемента в гильзу и соберите последний в кронштейн X-Y-Z. Поместите наконечник штифта в отверстия груза, чтобы предотвратить падение веса, и поместите вес в рукав. Собрав детали, найдите целевую область повреждения под микроскопом. Затем опустите рычаг X-Y-Z до тех пор, пока конец наконечника ударного элемента не будет соответствовать нижнему уровню окна наблюдения, что указывает на то, что была достигнута единая высота ушиба (высота между весом и наконечником ударного элемента составляет 22 мм при начале падения). Потяните за штифт, и удар будет выполнен. (C) После того, как травматическая область обнажена, используйте зажимы для зажима и фиксации позвоночника мыши и затягивающего болта для стабилизации стабилизатора позвонков. (D) Рекомендуемые функции для канавок на операционном столе. Подопытное животное предполагается поместить в среднюю канавку, головой к передней, грудной части на склоне. Кронштейн X-Y-Z отделен от операционного стола. (E) Демонстрация собранного SCICP. Стрелки обозначают детали. С наконечником, направленным на целевую область ушиба, чтобы начать ушиб, вытащите штифт, и вес упадет на кончик ударного элемента, чтобы ушибить спинной мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: График визуализации метода определения местоположения позвонков T13. (A) 13-е ребро и T13 являются относительно постоянными анатомическими структурами. Костовертебральный угол T13 может быть легко обнаружен под микроскопом, из которого оператор может исследовать остистый процесс и найти межостистое пространство T12-T13. Затем последовательно прощупывайте ростральную сторону, чтобы найти целевую травму позвонка (например, Т9). (B) Минимально инвазивная 9-я торакальная ламинэктомия может сохранить адекватную пластинку и фасеточные суставы между соседними телами позвонков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Воздействие и ушиб спинного мозга уровня Т9 у мышей. (А) Исследуйте костовертебральный угол Т13. (B) Когда параспинальная мышца втягивается микроретракторами, чтобы освободить достаточное пространство для работы, обнажите Т9. (C) Проводят ламинэктомию Т9 микроножными ножницами. (D) Стабилизировать позвонок с помощью зажимов стабилизатора позвонков. (E) Нацеливайтесь на целевую зону ушиба с помощью ударного наконечника. (F) Отек и застойные явления отмечаются в зоне травмы после контузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные участки на 28-й день после различных степеней ТСМ у мышей (корональные срезы). (А) Нормальный грудной спинной мозг мыши. Шкала бара = 500 мкм. (B) Для легкой группы может быть отмечено незначительное повреждение в дорсальном аспекте спинного мозга, при этом морфология спасенного белого вещества и серого вещества существенно сохраняется. (C) Для умеренной группы в спинном мозге наблюдается очевидная рубцовая ткань (обозначена красной звездочкой). Дифференцирующие характеристики между белым и серым веществом едва различимы. (D) Для сравнения, спинной мозг тяжелой группы почти утратил свою первоначальную морфологию и почти был заменен рубцовой тканью. Зеленая пунктирная линия указывает на область повреждения, а черная пунктирная линия указывает на границу наблюдаемого серого вещества. По мере увеличения тяжести травмы в спинном мозге мыши появлялось более крупное поражение и менее щадящая структура, причем граница серого вещества едва различима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативные участки на 1-й и 56-й день после травмирования спинного мозга мышей (сагиттальные отделы). (А) Нормальный грудной спинной мозг мыши. (B) B1-B3 представляют, соответственно, спинной мозг на 1-й день после травмы в легкой, средней и тяжелой группах. Можно видеть, что по мере увеличения повреждения большая площадь была нарушена или разжижена в очаге поражения. Непрерывность белого вещества в вентральном спинном мозге различалась из-за разной интенсивности травм. B1 показывает, что белое вещество в вентральном спинном мозге имеет лучшую непрерывность при незначительном отеке. B2 показывает более плохую непрерывность белого вещества в вентральном спинном мозге и более сильный отек. Ткань в центре Б3 ТСМ утратила почти всю непрерывность, и возникает обширный отек в области вне центра травмы. (C) C1-C3 представляют, соответственно, спинной мозг на 56-й день после травмы в легкой, умеренной и тяжелой группах. Разная степень контрактуры рубца проявлялась в травмированном центре между разными группами, и наблюдалась существенная разница в диаметре травмируемой области. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Репрезентативные участки на 56-й день после травмы спинного мозга у мышей (сагиттальные срезы). (А) Репрезентативный участок легкой группы. NF200 указывает на нейрофиламент, в то время как GFAP указывает на астроциты. Перекрывающиеся астроциты наблюдаются в эпицентре поражения, в то время как нейрофиламент в вентральной части спинного мозга находится в хорошей непрерывности. (B) Представительная секция умеренной группы. В дополнение к перекрывающимся астроцитам можно наблюдать два рубцовых центра (обозначенных красными звездочками), в то время как нейрофиламент в вентральном аспекте имеет непрерывность. (C) Репрезентативный участок тяжелой группы, с большим диапазоном поражения и массивными рубцообразующими астроцитами. Очевидного очага рубца не наблюдается, а нейрофиламент имеет плохую непрерывность. Шкала bar= 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Сила, создаваемая одной и той же высотой, но с разным весом. До эксперимента сила, создаваемая различными массами весов, высвобождаемых с одной и той же высоты, была обнаружена с помощью устройства обнаружения пикового давления. После того, как каждая группа завершила 24 обнаружения, были получены более надежные данные о гравитации для ссылки на ударную силу. Данные были проанализированы с помощью статистического программного обеспечения SPSS19.0. Данные представлены в виде среднего ± SD, n = 24 в каждой группе. Сравнения между большим количеством групп основывались на одностороннем дисперсионном анализе (ANOVA), используемом для проверки различий; p < 0,05 было признано статистически значимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| 28 точек на дюйм | |||
| Группа | GMR (%) | WMR (%) | ДР (%) |
| Нормальный | 35.44 | 64.57 | 0 |
| Легкая | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| Умеренный | 0 | 41.14 | 58.86 |
| Сильная | 0 | 0 | 100 |
Таблица 1: Норма белого вещества, серого вещества и повреждений на 28-й день после травмы. Сокращения: dpi = дни после травмы, DA = поврежденная область; GMR = скорость серого вещества; WMR = скорость белого вещества; DR = частота повреждения.
| Группа | 1dpi DA (мкм2) | 56 точек на дюйм DA (мкм2) |
| Нормальный | 0 | 0 |
| Легкая | 2391250 | 666091 |
| Умеренный | 4383381 | 1263191 |
| Сильная | 5118833 | 1943962 |
Таблица 2: Сравнение поражений на сагиттальных участках на 1-й и 56-й день после травмы.
Discussion
Благодаря стандартизированной процедуре могут быть получены стабильные данные, особенно в экспериментах in vivo на мелких животных, которые могут свести к минимуму отклонение результатов, вызванное индивидуальными различиями между животными. На основе вышеуказанных условий и удобных инструментов применения могут быть установлены стандартизированные, минимально инвазивные, точные и воспроизводимые модели ТСМ.
Благодаря своей практичности и удобству, ранее, ударный элемент снижения веса использовался в основном3. Ударный элемент, представленный в этом исследовании, разделяет тот же принцип, что и модельАллена 12. К счастью, из-за точных производственных преимуществ современной технологии обработки, исследовательская группа разработала ударный элемент для снижения веса с преимуществами простоты в эксплуатации, сильной стабильности и редко неточности. Устройство обнаружения пикового давления использовалось для измерения гравитации различных весов. В предыдущих исследованиях 6,10 о ударнике Infinite Horizons сообщалось, что диапазон силы ±5 Kdyn, отклоняющийся от предполагаемой силы, принят в 30 группах Kdyn, 50 Kdyn и 70 Kdyn, что обеспечивает ссылку для настоящего исследования с точки зрения группового деления и выбора степени контузии. В настоящем исследовании заранее измерялась возможная сила различных групп, и были получены более точные данные.
Более важным, чем устройство в экспериментах на животных моделях, является понимание и использование анатомии мыши. Хорошее использование анатомии может сделать процедуры минимально инвазивными. Малоинвазивная хирургия напрямую влияет на стабильность функционального состояния подопытного животного и последовательность последующего восстановления мышей. Предыдущие исследования показали, что минимально инвазивное создание моделей ТСМ повышает стабильность структуры позвонка и позволяет избежать дополнительных повреждений, вызванных нестабильностью позвоночника во время восстановления у крыс1. Предпосылкой минимально инвазивной хирургии является разумное использование естественных анатомических структур. Поэтому быстрое и точное определение местоположения сегментов спинного мозга должно производиться в соответствии с анатомическим строением мышей. Как сообщалось, метод визуализации был использован для поиска позвонка13. Несмотря на высокую точность, в реальном процессе экспериментальной эксплуатации метод визуализации для определения местоположения имеет недостатки неудобной работы, длительного времени работы, сложного комплектования оборудования и высоких требований к точности оборудования. McDonough et al. описали расположение T7 через нижние углы лопаток14, в то время как мыши действуют в лежачем простирании, поэтому упомянутые нижние углы должны быть задними углами. Более того, использование нижних лопаточных кончиков для поиска Т7 является методом определения местоположения для определенного положения в анатомии человека15, которое не подходит для мышей. Наконец, данные Микро-КТ также подтвердили гипотезу о том, что задние углы лопаток не находятся вровень с Т7 независимо от того, находится ли мышь в своем естественном или определенном положении тела. McDonough et al.14 также упомянули о расположении самой высокой точки спины, когда мышь выгибается, и определении самой высокой точки как T12. Для сравнения, в настоящем исследовании T9 расположен с помощью межостистого пространства T12-T13, которое не связано и не подвержено влиянию осанки мыши. Кроме того, с помощью этого метода целевой позвонок можно легко локализовать и оперировать. Следует прощупать под микроскопом 13-е ребро, осторожно коснуться области костовертебрального угла, провести линию в сторону остистого отростка, а затем прощупать пространство между остистыми отростками Т12-Т13 в сторону головки. Исследовательская группа использовала межостистое пространство T12-T13 для обнаружения T9 из 12 мышей. Наконец, 12 самок мышей C57BL/6J прошли микро-КТ-сканирование после локализации T9 и ламинэктомии. Результат сканирования Micro-CT показал, что удаленные пластинки у всех 12 мышей были T9. Результаты Микро-КТ показали, что все Т9 были точно локализованы, а точность была значительно выше, чем метод определения местоположения лопатки. Этот метод предоставляет нам быстрый и точный способ определения местоположения, что способствует согласованности модели травмы.
Минимальная инвазивность настоящего протокола выражена в основном в трех аспектах. Во-первых, после обнаружения параспинальные мышцы на уровне Т9 втягиваются только микроретракторами, не повреждая мышцы на уровнях Т8 или Т10. Кроме того, воздействие ламины микроретракторами не мешает полю зрения. Во-вторых, кровопотеря, которая в основном происходит от ламинэктомии, которая может вызвать отток крови из костной кости, очень низкая в процедуре операции, почти не более объема, чтобы окрасить треугольный кусок хлопка размером 2 мм х 2 мм х 3 мм. В-третьих, ламинэктомия проводилась ограниченной необходимой областью в наибольшей степени, сохраняя непрерывность боковой части пластинки и сильно ослабляя нестабильность позвонка. По сравнению с предыдущими протоколами16,17, настоящий протокол значительно снижает ненужный ущерб.
Чтобы оценить различные степени ТСМ, результаты между всеми группами в гистопатологии сравнивали с тем, что предыдущие исследования уже показали 9,11,18. Этих результатов достаточно для завершения наблюдательного исследования разной степени травматизма и изменений в разные периоды. ОН и иммунофлуоресценция показали, что при увеличении тяжести ТСМ в ткани спинного мозга появлялось больше аномальной морфологии, а увеличение степени повреждения также приводило к увеличению степени структурного расстройства спинного мозга. С точки зрения наблюдения за морфологией тканей, степень и регулярность изменений морфологии тканей в каждой экспериментальной группе в этом исследовании в значительной степени согласуются с предыдущими исследованиями.
Согласно текущим результатам гистологического теста, указываются явные изменения различных показателей после разной степени травматичной ТСМ, что еще больше подтверждает достоверность модели, установленной в данном исследовании.
Несмотря на то, что этот метод является точным и эффективным, для методов могут существовать потенциальные ограничения. Что касается ламинэктомии, оператор должен быть квалифицирован с операциями под микроскопом, чтобы предотвратить повреждение спинного мозга по ошибке. Кроме того, настройка всей платформы основана на механических конструкциях, что создает более высокий спрос на оператора по сравнению с автоматизированным оборудованием. Действительно, все упомянутые проблемы могут быть улучшены путем повторного обучения операции.
Можно видеть, что минимально инвазивное и стандартизированное моделирование полезно для того, чтобы сделать результаты более однородными, стабильными и повторяемыми, точно оценить эффективность различных планов лечения и оптимизировать план исследований для травматической ТСМ.
Disclosures
Профессор Шицин Фэн владеет коаксиальной платформой повреждения спинного мозга.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Государственной ключевой программой национальных естественных наук Китая (81930070).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
- Duan, H., et al. A novel, minimally invasive technique to establish the animal model of spinal cord injury. Annals of Translational Medicine. 9 (10), 881 (2021).
- Piao, M. S., Lee, J. -K., Jang, J. -W., Kim, S. -H., Kim, H. -S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. Journal of Korean Neurosurgical Society. 46 (5), 479-483 (2009).
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: A systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Zhang, N., Fang, M., Chen, H., Gou, F., Ding, M. Evaluation of spinal cord injury animal models. Neural Regeneration Research. 9 (22), 2008-2012 (2014).
- Borges, P. A., et al. Standardization of a spinal cord lesion model and neurologic evaluation using mice. Clinics. 73, 293 (2018).
- Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Experimental Neurology. 196 (1), 9-17 (2005).
- Siddall, P., Xu, C. L., Cousins, M. Allodynia following traumatic spinal cord injury in the rat. Neuroreport. 6 (9), 1241-1244 (1995).
- Ford, J. C., et al. MRI characterization of diffusion coefficients in a rat spinal cord injury model. Magnetic Resonance in Medicine. 31 (5), 488-494 (1994).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Nishi, R. A., et al. Behavioral, histological, and ex vivo magnetic resonance imaging assessment of graded contusion spinal cord injury in mice. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 674-689 (2007).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Jakeman, L. B. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Experimental Neurology. 169 (2), 239-254 (2001).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. The Journal of the American Medical Association. (11), 878-880 (1911).
- Kuhn, P. L., Wrathall, J. R. A mouse model of graded contusive spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 15 (2), 125-140 (1998).
- McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martinez-Cerdeno, V. Calibrated forceps model of spinal cord compression injury. Journal of Visualized Experiments. (98), e52318 (2015).
- Ernst, M. J., Rast, F. M., Bauer, C. M., Marcar, V. L., Kool, J. Determination of thoracic and lumbar spinal processes by their percentage position between C7 and the PSIS level. BMC Research Notes. 6, 58 (2013).
- Wu, X., et al. A tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice. Journal of Visualized Experiments. (124), e54988 (2017).
- Bhalala, O. G., Pan, L., North, H., McGuire, T., Kessler, J. A. Generation of mouse spinal cord injury. Bio-protocol. 3 (17), 886 (2013).
- Shinozaki, M., et al. Novel concept of motor functional analysis for spinal cord injury in adult mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 157458 (2010).
