Etablering af en musekontusion rygmarvsskademodel baseret på en minimalt invasiv teknik

Summary

Minimalt invasive teknikker og et simpelt laboratorieudstyr forbedrer reproducerbarheden af rygmarvsskademodellen ved at reducere operativ skade på forsøgsdyrene og muliggøre anatomisk morfologivedligeholdelse. Metoden er umagen værd, fordi de pålidelige resultater og den reproducerbare procedure letter undersøgelserne af mekanismerne for sygdomserstatning.

Abstract

Brug af minimalt invasive metoder til modellering af rygmarvsskade (SCI) kan minimere adfærdsmæssige og histologiske forskelle mellem forsøgsdyr og derved forbedre reproducerbarheden af forsøgene.

Disse metoder kræver to krav, der skal opfyldes: klarhed i den kirurgiske anatomiske vej og enkelhed og bekvemmelighed af laboratorieudstyret. Afgørende for operatøren giver en klar anatomisk vej minimalt invasiv eksponering, hvilket undgår yderligere skade på forsøgsdyret under de kirurgiske procedurer og gør det muligt for dyret at opretholde en konsistent og stabil anatomisk morfologi under eksperimentet.

I denne undersøgelse undersøges brugen af en ny integreret platform kaldet SCI koaksial platform til rygmarvsskade hos små dyr til at udsætte rygmarven på T9-niveau på en minimalt invasiv måde og stabilisere og immobilisere hvirvlen hos mus ved hjælp af en vertebral stabilisator, og endelig bruges en koaksial tyngdekraftpåvirkning til at kontaminere rygmarven hos mus til at nærme sig forskellige grader af T9 rygmarvsskade. Endelig gives histologiske resultater som reference for læserne.

Introduction

Traumatisk rygmarvsskade (SCI) disponerer let individet for alvorlige konsekvenser¹; Ikke desto mindre er der ingen effektiv behandling på nuværende tidspunkt ^1,2. Kontusionsmodeller til dyr er en af de vigtigste metoder til undersøgelse af SCI ^3,4.

Fra 2004 til 2014⁴ blev rotter anvendt som modelorganismer i 289 ud af 407 undersøgelser (71 %) og mus i 69 (16,9 %). Faktisk er andelen af forsøg med mus gradvist steget gennem årene på grund af deres fordele i forhold til andre modeller, især det store potentiale for genreguleringsundersøgelser ^3,4,5. Derfor er der behov for mere kompatible værktøjer til at gennemføre flere undersøgelser ved hjælp af musen som model på grund af den store betydning, der tillægges modelkonsistens⁶. De almindelige enheder, der er rapporteret i tidligere undersøgelser, er grundlæggende baseret på Allens rygmarvspåvirkningsprincip, for eksempel den grundlæggende vægtfaldsslagor^7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) slaglegeme^1,9 og Infinite Horizon (IH) slaglegeme^10,11 . Vægtfaldsstødlegemet og NYU/MASCIS slaglegemet deler det samme princip om at sigte mod den målrettede rygmarv og tabe en fast vægt fra forskellige højder for at gøre forskellige skadesalvorligheder. IH-slaglegemet skaber rygmarvsskaden i henhold til forskellige kræfter.

For nemheds skyld ved brug af musemodellen i SCI-undersøgelser og for at etablere grundlaget for effektive behandlingsmetoder udvikles en integreret platform for rygmarvsskade, kaldet spinal cord injury coaxial platform (SCICP). Platformen består af fire hovedkomponenter: (1) et operationsbord designet til en passende position for opererede mus, som er meget kompakt og giver bekvemmelighed uden positionsbegrænsning; 2) en mikroretraktor på begge sider til at holde paravertebrale muskler under drift (3) en vertebral stabilisator til at holde ryghvirvlen før proceduren for SCI (to vertebrale stabilisatorer er tilgængelige til operation på større dyr såsom rotter); (4) en ærme, en slaglegemespids, vægte og en trækstift. De tre dele skal samles til en aftagelig X-Y-Z-arm. For præcis målretning placeres en slaglegemespids på rygmarvens overflade, og X-Y-Z-armen sænkes forsigtigt ned til den forventede højde ved hjælp af mærket mellem slaglegemespidsen og bøsningen. Slaglegemespidsen er lavet af en 0,12 g aluminiumslegering for at undgå beskadigelse af rygmarven, der tilskrives stor vægtkompression før proceduren. Trækstiften er til at holde vægtene på toppen af ærmet for at forberede vægtfaldet (figur 1).

I tidligere undersøgelser blev slagkraftdeling defineret i henhold til IH-enhedens slagkraftdata, som er henholdsvis 30 Kdyn, 50 Kdyn og 70 Kdyn, ^6,10. Under forskningsprocessen blev serielle grader af SCI-modeller bevist at være etableret baseret på SCICP, som kan bruges i forskellige undersøgelser. Derfor, før eksperimentet officielt startede, blev slagkræfterne genereret af forskellige vægte af forskellige masser testet ved hjælp af en toptrykprøvningsenhed. Som følge heraf blev tre standardiserede repræsentative SCI-musemodeller valgt som tre forskellige grader af skade, herunder graduerede milde, moderate og svære grupper, henholdsvis ^6,10, og vægtene blev frigivet i samme højde med en vægt på 1,3 g for mild, 2,0 g for moderat og ^2,7 g for alvorlig skade.

Som et andet middel til at garantere funktionsdygtighed og nøjagtighed rapporteres en ny og minimalt invasiv operativ tilgang. Ved at undersøge normale mus' anatomi findes en ny metode til at lokalisere det interspinøse rum i T12-T13. Metoden til hvirvellokalisering i operationstrinnene er let at mestre og nøjagtig, hvilket sikrer præcis lokalisering til minimalt invasive operationer.

Forhåbentlig kan denne teknik til kontusionsskade hjælpe forskningen og forståelsen af rygmarvsskade, herunder patofysiologiforståelse, ledelsesevaluering og så videre.

Protocol

BEMÆRK: Alle eksperimenterne blev godkendt af Laboratory Animal Ethical and Welfare Committee of Shandong University Cheeloo College of Medicine (godkendelsesnummer: 21L60) og blev udført i henhold til vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr udgivet af National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revideret 1996).

1. Mekanisme for rygmarvsskade, koaksial platform og mekaniske test

1. Saml platformen med et kirurgisk operationsbord, en vertebral stabilisator og en slaglegemespids (figur 1).
   BEMÆRK: Hold vægtfalds- og udstødningsåbningerne, som forhindrer vægten i at støde på luftstrømme, rene, fordi snavs på vægtfaldet eller ærmet kan påvirke platformens præcision.
2. Sæt spidsen, som giver mulighed for nøjagtig rygmarvslokalisering, i ærmet.
3. Vælg de korrekte masser af vægtfaldene til eksperimentet, som er henholdsvis 1,3 g, 2,0 g og 2,7 g for de milde, moderate og svære grupper.
4. Sæt trækstiften i hullerne i vægtfaldet.
5. Saml vægtfaldet til toppen af ærmet med trækstiften monteret i rillen på X-Y-Z-armen, så når lokaliseringen er afsluttet, frigøres vægten for at ramme slagspidsen og følgelig kontusing rygmarven, og ændringer i rygmarven observeres under mikroskopet.
6. Juster den aftagelige 0,1 mm præcisions X-Y-Z-arm for at gøre det lettere for operatøren at give tilstrækkelig arbejdsplads (figur 1D, E).
   BEMÆRK: For at bekræfte konsistensen af resultaterne af undersøgelsen, før eksperimentet begynder, skal du måle den kraft, der genereres, når vægten falder inde i ærmet ved hjælp af en toptrykdetekteringsanordning. En gentagelse af bekræftelse er ikke nødvendig for fremtidige undersøgelser.
7. Tænd for enheden, placer metaltrykreceptoren under spidsen, nul adapteren, slip trækstiften, og registrer den faktiske slagkraft.

2. Lokalisering og laminektomi af 9^. brysthvirvel (T9)

BEMÆRK: Hunmus C57BL/6J 9-10 uger gamle blev købt fra Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Kina).

1. Autoklave en række kirurgiske instrumenter til eksperimentet og steriliser operationsbordet med 75% alkohol før operationen.
2. Injicer buprenorphin til analgesi (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 30 minutter før anæstesi til skadeoperationer. Derefter bedøves musen med isofluran (induktion: ~ 3% -5%, vedligeholdelse: ~ 1,5% -2%). Kontroller, om dyret er fuldt bedøvet af reflekserne af hale eller tåspids. Når anæstesi er i kraft, læg musen i en udsat position i en bestemt del af operationsbordet og belæg hornhinden med oftalmisk salve (påfør oftalmisk salve på hornhinderne for at beskytte øjnene mod tørring under operationen).
   1. Barber håret fra kaudal til rostral med en elektrisk barbermaskine over thoracolumbal rygsøjlen. Steriliser huden flere gange i en cirkulær bevægelse med iodophor i 30 s og efterfulgt af 75% alkohol. Påfør et sterilt kirurgisk forhæng og lav et langsgående snit på ca. 1,5 cm på huden fra ca. T6 til T13 med en skalpel og et blad.
      BEMÆRK: Palperer langs kystmargenen til midterlinjen, hvor T12-T13 interspinous space er placeret. Lav et snit på 1,5 cm til rostralen, og snittet er omtrent flush med T6-T13 hvirvler.
3. Udforsk den 13. ribben på den ene side fra den benede del under operationsmikroskopet. Udforsk den spinøse proces i midterlinjen ved let at berøre området af costovertebralarklen og derefter mod rostral for at lokalisere det interspinøse rum i T12-T13. Udforsk det interspinøse rum i T9-T10 fra rummet af T12-T13 til rostral side. (Figur 2A, 3A)
4. Dissekere paraspinalmusklen langs T9's spinøse proces til de forreste og bageste facetled på begge sider med mikrosaks (figur 3B). Træk paraspinale muskler tilbage med mikroretraktorer og rengør blødt væv på laminaen og i det interspinøse rum i T8-T9 og T9-T10 med mikrosaks.
5. Udfør T9 laminektomi, klem den spinøse proces af T9 med mikrokirurgi tang, løft den lidt op, indsæt mikrosaksen parallelt langs højre dorsolaterale side af laminaen, undgå beskadigelse af rygmarven og skær lamina af med mikrosaks. Gentag på venstre side, og rygmarven kan eksponeres (figur 2B, 3C).
6. Før du fastgør hvirvlen, løsnes universalarmen, og klemmer langsomt de 9. til 10. facetled på begge sider af hvirvlen med rygsøjlens mikromygtang. Stram skruerne på mikromyggepincetten, og ryghvirvlen stabiliseres således. Juster rygmarven til vandret plan, stram universalarmen, og hvirvlen er fastgjort (figur 3D).

3. T9 kontusionsskade

1. Når rygmarven på T9-niveau er blottet, og ryghvirvlen er fastgjort, skal du sigte mod rygmarven ved spidsen inde i ærmet under driftsmikroskopiet (figur 3E).
2. Kontroller, om spidsen er parallel med rygmarven fra rygmarvens bageste og laterale aspekter, da det er let at observere forholdet mellem rygmarven og spidsen under mikroskopet, og at operationsbordet let kan drejes.
3. Kontroller, om spidsen er parallel med de bilaterale grænser for den sparede lamina, før spidsen er i kontakt med rygmarven efter laminektomien, da det er et naturligt referenceplan parallelt med rygmarven.
4. Efter at have lokaliseret T12-T13's interspinøse rum, skal du sænke muffen, indtil enden af slaglegemet er i overensstemmelse med mærket på observationsvinduet, og den angivne højde på 22 mm er nået. Træk trækstiften ud for at frigøre vægten (1,3 g, 2,0 g eller 2,7 g afhængigt af gruppen, hvor hver gruppe inkluderer 3 mus, og hver gruppe har en mus for hvert tidspunkt).
   BEMÆRK: Rygmarven skal være parallel med jorden og vinkelret på spidsen; Flyt operationsbordet for at sikre det mikroskopiske synsfelt, da bordet er meget kompakt.
5. Fjern slaglegemet, når kontusionen er færdig, og observer graden af SCI under driftsmikroskopet. I den milde gruppe ses en lysrød farveændring, mens skadestedet i den moderate gruppe udviser mørkerød i 3-4 s, og muligvis kan eminens observeres. I den alvorlige gruppe kan de mørkerøde manifestationer forekomme umiddelbart, og åbenbar eminens i dura manifesteres, men dura er stadig i en konsistent form (figur 3F).
6. Sutur den overfladiske fascia og hud med suturer (polypropylen ikkeabsorberbar sutur, størrelse: 6-0).
7. Når suturen er afsluttet, steriliseres det kirurgiske område, placeres musen på en temperaturstyret pude, indtil fuld bevidsthed er genoprettet, og sæt derefter musen i museburene.

4. Dyrepleje

1. Placer dyret på varmepuden til genopretning og observer bevægelsen af begge bagben.
   BEMÆRK: Dyr, der har gennemgået kirurgi, bør ikke returneres til andre dyrs selskab, før de er helt genoprettet.
2. Sæt en højvandsdiæt på burgulvet, så dyrene nemt kan nå maden. Alternativt kan du bruge et bur med et lavere fodringsbord.
3. Tøm musenes blære to gange dagligt efter operationen, fordi det er svært for de moderate og svære skadegrupper at genvinde blærefunktionen. Injicer buprenorphin til analgesi (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 8-12 timer/dag i 3 dage.

5. Transkardial perfusion, farvning og immunfarvning

1. På 1., 28. og 56. dag efter skade ofres henholdsvis en mus i hver gruppe ved perfusion.
   1. Perfus musene med 60 ml fosfatbufret saltvand (PBS) og 20 ml 4% paraformaldehyd efter overdreven anæstesi (4% -6% isofluran).
   2. Saml rygsøjlen med mikrosaks, der strækker sig henholdsvis rostralt og caudalt 1 cm fra læsionscentret.
   3. De overskydende muskler resekteres, intakte rygsegmenter med delvise ribben resekteres, så instrumenterne kan holde fast i trin 5.1.4, og det lægges i blød i 4% paraformaldehyd i 24 timer.
   4. Klem ribbenene med hæmostatisk tang til fiksering og definer læsionscentret under mikroskopet i henhold til den resekterede lamina og farveændring i rygmarvens læsionscenter.
   5. Resect alle laminae og artikulære processer med mikrosaks fra kaudalen.
   6. Skær nerverødderne af med mikrosaks og tag rygmarven ud.
   7. Saml 0,5 cm af rygmarven, der strækker sig henholdsvis kaudisk og rostralt fra læsionscentret med mikrosaks.
   8. Rygmarven anbringes i 30% saccharose ved 4 °C i 48 timer.
2. Skær vævene i 6 μm tykke sektioner efter frysning i henhold til histologisk undersøgelsestype.
3. Udfør hæmatoxylin og eosin (H&E) farvning.
   1. Opvarm sektionerne til stuetemperatur og blød de 6 μm tykke sektioner i 4% formaldehyd i ca. 15 min, efterfulgt af blødgøring i 1x PBS i 1 minut fire gange for at fjerne resterende OCT.
   2. Plet sektionerne med hæmatoxylin i 90 s, og skyl med dobbeltdestilleret vand.
   3. Vask derefter sektionerne med rindende vand i 3 min.
   4. Plet med eosin i 4 minutter og blød i 95% alkohol i 30 s to gange for at skylle overskydende eosin.
   5. Til sidst dehydreres med gradientalkohol (95% alkohol og 50% alkohol en gang successivt) i 30 sekunder og blødlægges i xylen for gennemsigtighed i 2 minutter. Derefter forsegles prøverne med harpiksgel (koronalplansektion: figur 4; sagittalplansektion: figur 5).
4. Udfør immunofluorescerende farvning.
   1. Opvarm sektionerne igen til stuetemperatur og blød de 6 μm tykke sektioner i 4% formaldehyd i ca. 2 min.
   2. Vask sektionerne i TBST i 5 min i tre gange.
   3. Inkuber sektionerne med blokerende opløsning (10% gedenormalt serum i PBS) og bloker i 1 time for at blokere ikke-specifik binding af immunglobulin.
   4. Rygmarvssektionerne inkuberes natten over ved 4 °C med både museanti-glia fibrillært surt protein (GFAP, en markør for reaktive astrocytter), polyklonalt antistof (1:600) og kaninanti-NF200-antistof (1:2000), en markør for neurofilament i 0,4 ml blokerende opløsning.
   5. Skyl sektionerne med PBS og tilsæt 0,4 ml blokeringsopløsning med ged anti-kanin Alexa 594-konjugeret IgG (1:1,000) og ged anti-mus Alexa 488-konjugeret IgG (1:1,000) sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur.
   6. Tag billeder med et fluorescerende mikroskop ved 10x ved automatisk panoramascanning ved bølgelængder på henholdsvis 594 nm og 488 nm (figur 6).
      1. Tænd fluorescensmikroskopet, sæt diaset på mikroskoptrinnet, skift til fluorescenskanalen, brug positioneringstasten til at placere tre til fire punkter på vævet, og fokuser for at fuldføre optagelsen. Når du er færdig med optagelsen, skal du gemme billederne af forskellige kanaler i det ønskede format og derefter gemme det flettede billede.

Representative Results

For at teste enhedens præcision blev den kraft, som tre forskellige vægtmasser lavede fra samme højde, målt ved hjælp af en toptrykprøvningsanordning. Fireogtyve tests blev udført med forskellige grupper af vægte, hvilket resulterede i (gennemsnit ± SD) 0,323 N ± 0,02 N for 1,3 g vægte, 0,543 N ± 0,15 N for 2,0 g vægte og 0,723 N ± 0,26 N for 2,7 g vægte (figur 7). Tidligere undersøgelser anvendte dyne (dyn) eller kilodyne (Kdyn) som enheder til måling af kontusionsintensiteterne. For bedre sammenligning med tidligere undersøgelser er omregningerne mellem Newton (N) og dyne/Kilodyne angivet (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

Tabel 1 og figur 4 viser data for læsionerne i de milde, moderate og svære grupper på koronale sektioner. At dømme ud fra figur 4, på den 28. dag efter skaden, faldt kontinuiteten i de skelnelige grænser for grå og hvidt stof i de milde, moderate og svære grupper successivt, idet området med arvæv voksede sig større og en stigende andel på tværsnittet af læsionscentret. Der var åbenlyse morfologiske forskelle i alle forsøgsgrupperne sammenlignet med normalgruppen. Dette beviste rationaliteten af opdelingen af skadesgrader i forsøgsgrupperne.

Tabel 2 og figur 5 beskriver skade på rygmarven på 1. og 56. dag efter skade på sagittale sektioner. Det kan ses, at læsionsområdet gradvist steg markant fra de milde til svære grupper på 1. dagen efter skaden. I mellemtiden var kontinuiteten af hvidt stof på begge sider af rygmarven bedre i den milde gruppe med observerbare små runde vakuoler, som er kendetegnende for interstitielt ødem. I den moderate gruppe viste det hvide stof dårlig kontinuitet, og strukturen af det ventrale hvide stof blev ikke ordnet. I den alvorlige gruppe udviste det ventrale hvide stof mere alvorlig forstyrrelse, og et stort område af hulrummet optrådte i midten af skaden. Derudover viste det omgivende væv tydelig fyldning af de røde blodlegemer, og de røde blodlegemer nær den centrale kanal samlet i strimler. På den 56. dag efter skaden blev ardannelse observeret i skadecentret for de tre grupper, hvis område steg i henhold til skadens sværhedsgrad.

Integriteten af rygmarvsneurofilament på den 56. dag efter skade kan også udledes af analysen af immunfluorescensfarvningsresultaterne (figur 6). Figuren viser også, at overlappende ardannende astrocytter var synlige i midten af alle tre grupper af skader, hvor længden af skadeområdet steg med skadens sværhedsgrad, mens ardiameteren faldt. Dette tyder på tilstedeværelsen af arkontraktur, hvilket kan føre til et fald i rygmarvsdiameteren.

Figur 1: En hel og dele udstilling af rygmarvsskadens koaksiale platform . A) X-Y-Z-armen og operationsbordet kan adskilles, hvilket giver tilstrækkelig plads til den operationsprocedure, hvor et lille dyrs rygmarv eksponeres. Operationsbordet kan bevæges frit under drift, hvilket reducerer potentielle driftsvanskeligheder, der tilskrives positionsbegrænsninger. Rygsøjlens krop har en tre-leddet universel arm til retningsassistance, hvilket øger dens fleksibilitet. (B) Sæt slaglegemets spids i bøsningen, og saml sidstnævnte i X-Y-Z-armen. Sæt spidsen af trækstiften i hullerne på vægten for at forhindre vægten i at falde, og læg vægten i ærmet. Når delene er samlet, skal du placere det målrettede skadeområde under mikroskopet. Sænk derefter X-Y-Z-armen, indtil slutningen af slagspidsen er i overensstemmelse med det nederste niveau af observationsvinduet, hvilket indikerer, at der er nået en samlet kontusionshøjde (højden mellem vægten og slagspidsen er 22 mm, når faldet starter). Træk trækstiften, og virkningen vil ske. (C) Når skadeområdet er blottet, skal du bruge klemmerne til at klemme og fastgøre musens rygsøjle og tilspændingsbolten for at stabilisere vertebralstabilisatoren. (D) Anbefalede funktioner til riller på operationsbordet. Forsøgsdyret skal placeres i den midterste rille med hovedet mod den forreste, thoraxdel på skråningen. X-Y-Z-armen er adskilt fra operationsbordet. E) En visning af det samlede SCICP. Pile angiver delene. Med spidsen rettet mod målkontusionsområdet, for at starte kontusionen, træk trækstiften ud, og vægten falder på slagspidsen for at kontuse rygmarven. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: En billeddannelsesgraf over T13 costovertebral vertebra lokaliseringsmetoden . (A) Det 13. ribben og T13 er relativt konstante anatomiske strukturer. T13 costovertebral vinkel kan let detekteres under mikroskopet, hvorfra operatøren kan sonde mod spinøs proces og finde T12-T13 interspinous space. Undersøg derefter successivt mod den rostrale side for at finde målskadehvirvlen (for eksempel T9). (B) En minimalt invasiv 9. thoraxlaminektomi kan bevare tilstrækkelig lamina og facetled mellem tilstødende hvirveldyr. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Eksponering og kontusion af rygmarven på T9-niveau hos mus . (A) Undersøg T13-costovertebralvinklen. (B) Når paraspinalmusklen trækkes tilbage af mikroretraktorer for at give tilstrækkelig plads til drift, eksponeres T9. (C) Udfør T9 laminektomi med mikrosaks. (D) Stabiliser ryghvirvlen med klemmerne på vertebral stabilisatoren. E) Sigt mod målkontusionsområdet med slaglegemets spids. (F) Ødem og overbelastning bemærkes i skadeområdet efter kontusion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Repræsentative afsnit på den 28. dag efter forskellige grader af SCI hos mus (koronale sektioner). (A) Normal thorax rygmarv i musen. Skalabar = 500 μm. (B) For den milde gruppe kan der konstateres let skade i rygmarvens dorsale aspekt, mens morfologien af det sparede hvide stof og grå stof bevares væsentligt. (C) For den moderate gruppe observeres tydeligt arvæv i rygmarven (angivet med den røde stjerne). De differentiative egenskaber mellem hvidt stof og gråt stof kan næppe skelnes. (D) Til sammenligning har rygmarven i den svære gruppe næsten mistet sin oprindelige morfologi og er næsten blevet erstattet af arvæv. Den grønne stiplede linje angiver skadeområdet, og den sorte stiplede linje angiver grænsen for det observerbare grå stof. Da sværhedsgraden af skaden steg, opstod en større læsion og mindre skånet struktur i musens rygmarv, med grænsen til gråt stof, der næppe kunne skelnes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Repræsentative afsnit på 1. og 56. dag efter skade på rygmarven hos mus (sagittale sektioner). (A) Normal thorax rygmarv i musen. (B) B1-B3 repræsenterer henholdsvis rygmarven på 1. dagen efter skaden i de milde, moderate og svære grupper. Det kan ses, at efterhånden som skaden steg, blev et større område forstyrret eller flydende i læsionscentret. Kontinuiteten af hvidt stof i den ventrale rygmarv varierede på grund af forskellige skadeintensiteter. B1 viser, at det hvide stof i den ventrale rygmarv har bedre kontinuitet med let ødem. B2 viser dårligere kontinuitet af den hvide substans i den ventrale rygmarv og alvorligere ødem. Vævet i midten af B3 SCI har mistet næsten al kontinuitet, og der er omfattende ødem i området uden for midten af skaden. (C) C1-C3 repræsenterer henholdsvis rygmarven på den 56. dag efter skaden i de milde, moderate og svære grupper. Forskellige grader af arkontraktur manifesterede sig i skadecentret mellem forskellige grupper, og der var en signifikant forskel i diameteren af skadeområdet. Skala bar = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Repræsentative sektioner på den 56. dag efter skade på rygmarven hos mus (sagittale sektioner). (A) Repræsentativt udsnit af den milde gruppe. NF200 angiver neurofilamentet, mens GFAP angiver astrocytter. Overlappende astrocytter observeres i læsionepicentret, mens neurofilamentet i den ventrale del af rygmarven er i god kontinuitet. (B) Repræsentativ del af den moderate gruppe. To arcentre kan observeres (angivet med røde stjerner) ud over overlappende astrocytter, mens neurofilamentet i det ventrale aspekt har kontinuitet. (C) Repræsentativ del af den alvorlige gruppe med et stort læsionsområde og massive ardannende astrocytter. Der er ikke observeret noget tydeligt arcenter, og neurofilamentet har dårlig kontinuitet. Skalabjælke= 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Kraft genereret fra samme højde, men med forskellige vægte. Før eksperimentet blev kraften genereret af forskellige vægtmasser frigivet fra samme højde detekteret ved hjælp af en toptrykdetekteringsanordning. Efter at hver gruppe havde gennemført 24 detektioner, blev der opnået mere pålidelige tyngdekraftdata til reference for slagkraft. Dataene blev analyseret ved hjælp af statistiksoftwaren SPSS19.0. Data præsenteres som gennemsnit ± SD, n = 24 i hver gruppe. Sammenligninger mellem flere grupper var baseret på en envejsanalyse af varians (ANOVA), der blev brugt til at teste forskellene; P < 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.

28 dpi
Gruppe	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normal	35.44	64.57	0
Mild	11.59	64.88	23.53
Moderat	0	41.14	58.86
Svær grad	0	0	100

Tabel 1: Rate af hvidt stof, gråt stof og skader på den 28. dag efter skaden. Forkortelser: dpi = dage efter skade, DA = beskadiget område; GMR = grå stofhastighed; WMR = hvid stofhastighed; DR = beskadiget sats.

Gruppe	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normal	0	0
Mild	2391250	666091
Moderat	4383381	1263191
Svær grad	5118833	1943962

Tabel 2: Sammenligninger mellem læsionen på sagittale sektioner på 1. og 56. dag efter skade.

Discussion

Gennem den standardiserede procedure kan der opnås stabile data, især i små dyr in vivo-forsøg , hvilket kan minimere afvigelsen af resultater forårsaget af individuelle forskelle mellem dyrene. Baseret på ovenstående betingelser og praktiske applikationsinstrumenter kan der etableres standardiserede, minimalt invasive, nøjagtige og gentagelige SCI-modeller.

På grund af dets anvendelighed og bekvemmelighed blev vægtfaldspåvirkningen tidligere brugt mest³. Slaglegemet, der blev introduceret i denne undersøgelse, deler det samme princip med Allens model¹². På grund af de nøjagtige produktionsfordele ved moderne bearbejdningsteknologi designede forskerholdet heldigvis en vægtfaldsslaglegeme med fordelene ved at være let at betjene, stærkt stabil og sjældent unøjagtig. En toptrykdetekteringsenhed blev brugt til at måle tyngdekraften af forskellige vægte. Tidligere undersøgelser^6,10 om Infinite Horizons-slaglegemet rapporterede, at et kraftområde på ±5 Kdyn, der afviger fra den tilsigtede kraft, accepteres i grupperne 30 Kdyn, 50 Kdyn og ⁷⁰ Kdyn^, hvilket giver en reference for denne undersøgelse med hensyn til gruppedeling og valg af kontusionsgrad. I den nuværende forskning blev den mulige kraft af forskellige grupper målt på forhånd, og der blev opnået mere præcise data.

Mere kritisk end enheden i dyremodelforsøg er forståelsen og udnyttelsen af musens anatomi. At gøre god brug af anatomi kan gøre procedurer minimalt invasive. Minimalt invasiv kirurgi påvirker direkte stabiliteten af forsøgsdyrets funktionelle tilstand og konsistensen af efterfølgende musegendannelse. Tidligere undersøgelser har vist, at den minimalt invasive etablering af SCI-modeller øger stabiliteten af rygsøjlestrukturen og undgår yderligere skader forårsaget af spinal ustabilitet under genopretning hos rotter¹. Forudsætningen for minimalt invasiv kirurgi er den rimelige anvendelse af naturlige anatomiske strukturer. Derfor bør hurtig og præcis lokalisering af rygmarvssegmenter ske i overensstemmelse med musens anatomiske struktur. Som rapporteret blev billeddannelsesmetoden brugt til at finde ryghvirvlen¹³. Selvom den har høj nøjagtighed, har billeddannelsesmetoden til lokalisering i den faktiske eksperimentelle driftsproces ulemperne ved ubelejlig drift, lang driftstid, kompleks udstyrsanskaffelse og høje krav til udstyrsnøjagtighed. McDonough et al. beskrev lokalisering af T7 gennem de ringere vinkler af scapulas¹⁴, mens mus virker i en løgneknæ, så de nævnte ringere vinkler formodes at være bageste vinkler. Desuden er brugen af de nedre scapular tips til at finde T7 en lokaliseringsmetode til en bestemt position i human anatomi¹⁵, som ikke er egnet til mus. Endelig validerede Micro-CT-data også hypotesen om, at scapulaens bageste vinkler ikke flugter med T7, uanset om musen er i deres naturlige eller specifikke kropsposition. McDonough et ^al.14 nævnte også at lokalisere det højeste punkt på ryggen, når musen er buet og definere det højeste punkt som T12. Til sammenligning er T9 i den nuværende forskning placeret ved hjælp af T12-T13 interspinøst rum, som hverken er forbundet med eller påvirket af musens kropsholdning. Desuden kan målhvirvlen med denne metode let lokaliseres og betjenes. Man skal sonde den 13. ribben under mikroskopet, forsigtigt røre området af costovertebralarvinklen, tegne en linje mod den spinøse proces og derefter sonde mellemrummet mellem de spinøse processer i T12-T13 mod hovedet. Forskerholdet brugte T12-T13 interspinous space til at lokalisere T9 på 12 mus. Endelig havde 12 kvindelige C57BL/6J-mus en mikro-CT-scanning efter T9-placeringen og laminektomi. Resultatet af Micro-CT-scanningen viste, at de fjernede laminer i alle 12 mus var T9. Resultaterne af Micro-CT viste, at alle T9 var nøjagtigt placeret, og nøjagtigheden var signifikant højere end scapula-lokaliseringsmetoden. Denne metode giver os en hurtig og præcis måde at lokalisere på, hvilket bidrager til konsistensen af skademodellen.

Den nuværende protokols minimale invasivitet er udtalt i hovedsageligt tre aspekter. For det første, efter lokalisering, trækkes paraspinalmusklerne på T9-niveau kun tilbage af mikroretraktorer uden at beskadige musklerne på T8- eller T10-niveauerne. Desuden forstyrrer eksponeringen af lamina af mikroretraktorerne ikke synsfeltet. For det andet er blodtab, som hovedsagelig skyldes laminektomi, som kan forårsage blodudstrømning fra den annullerede knogle, meget lavt i operationsproceduren, næsten ikke mere end volumenet til at plette et 2 mm x 2 mm x 3 mm trekantet stykke bomuld. For det tredje blev laminektomi udført begrænset til det nødvendige område i størst muligt omfang, idet kontinuiteten i den laterale del af lamina blev opretholdt og stærkt dæmpede hvirvelens ustabilitet. Sammenlignet med tidligere protokoller^16,17 reducerer den nuværende protokol mange unødvendige skader.

For at evaluere de forskellige grader af SCI blev resultaterne mellem alle grupper i histopatologi sammenlignet med, hvad tidligere undersøgelser allerede har vist 9,11,18. Disse resultater er tilstrækkelige til at gennemføre en observationsundersøgelse af forskellige grader af skade og ændringer i forskellige perioder. HE og immunofluorescens viste, at med stigninger i sværhedsgraden af SCI fremkom mere unormal morfologi i rygmarvsvævet, og stigningen i graden af skade førte også til en stigning i graden af strukturel lidelse i rygmarven. Fra perspektivet af vævsmorfologiobservation er graden og regelmæssigheden af vævsmorfologiske ændringer i hver eksperimentel gruppe i denne undersøgelse meget konsistent med tidligere undersøgelser.

Ifølge de nuværende histologiske testresultater indikeres klare ændringer i forskellige indikatorer efter forskellige grader af traumatisk SCI, hvilket yderligere bekræfter pålideligheden af den model, der er etableret i denne undersøgelse.

Selvom teknikken er nøjagtig og effektiv, kan der være potentielle begrænsninger for metoderne. Med hensyn til laminektomi skal operatøren være dygtig med operationer under mikroskopet for at forhindre, at rygmarven beskadiges ved en fejltagelse. Opsætningen af hele platformen er også baseret på mekaniske strukturer, hvilket stiller større krav til operatøren sammenlignet med automatiseret udstyr. Faktisk kan alle de nævnte problemer forbedres ved gentagen træning af operationen.

Det kan ses, at minimalt invasiv og standardiseret modellering er gavnlig for at gøre resultaterne mere ensartede, stabile og gentagelige, evaluere effektiviteten af forskellige behandlingsplaner nøjagtigt og optimere forskningsplanen for traumatisk SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7