Etablering av en musekontusjon ryggmargsskademodell basert på en minimal invasiv teknikk

Summary

Minimalt invasive teknikker og en enkel laboratorieanordning forbedrer reproduserbarheten av ryggmargsskademodellen ved å redusere operativ skade på forsøksdyrene og tillate anatomisk morfologivedlikehold. Metoden er verdt fordi pålitelige resultater og reproduserbar prosedyre letter undersøkelser av mekanismene for sykdomsoppreisning.

Abstract

Bruk av minimalt invasive metoder for å modellere ryggmargsskade (SCI) kan minimere atferdsmessige og histologiske forskjeller mellom eksperimentelle dyr, og dermed forbedre reproduserbarheten av forsøkene.

Disse metodene trenger to krav som skal oppfylles: klarhet i den kirurgiske anatomiske banen og enkelhet og bekvemmelighet av laboratorieenheten. Avgjørende for operatøren er at en klar anatomisk vei gir minimal invasiv eksponering, noe som unngår ytterligere skade på forsøksdyret under de kirurgiske prosedyrene og gjør det mulig for dyret å opprettholde en konsistent og stabil anatomisk morfologi under forsøket.

I denne studien undersøkes bruken av en ny integrert plattform kalt SCI-koaksialplattformen for ryggmargsskade hos små dyr for å eksponere ryggmargen på T9-nivå på en minimal invasiv måte og stabilisere og immobilisere vertebraen til mus ved hjelp av en vertebral stabilisator, og til slutt brukes en koaksial tyngdekraftspåvirkning til å forvirre ryggmargen til mus for å nærme seg forskjellige grader av T9 ryggmargsskade. Til slutt gis histologiske resultater som referanse for leserne.

Introduction

Traumatisk ryggmargsskade (SCI) predisponerer lett individet for alvorlige konsekvenser¹; Likevel er det ingen effektiv behandling i dag ^1,2. Dyrekontusjonsmodeller er en av de viktigste metodene for å studere SCI ^3,4.

Fra 2004 til 2014⁴ ble rotter brukt som modellorganismer i 289 av 407 studier (71%) og mus i 69 (16,9%). Faktisk har andelen eksperimenter med mus gradvis økt gjennom årene på grunn av deres fordeler i forhold til andre modeller, spesielt det store potensialet for genreguleringsstudier ^3,4,5. Derfor er det nødvendig med mer kompatible verktøy for å gjennomføre flere studier ved å bruke musen som modell på grunn av den store betydningen som er knyttet til modellkonsistens⁶. De vanlige enhetene som er rapportert i tidligere studier, er i utgangspunktet basert på Allens ryggmargspåvirkningsprinsipp, for eksempel den grunnleggende vektdråpepåvirkningen^7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor^1,9, og Infinite Horizon (IH) impactor^10,11 . Vektfallspåvirkningen og NYU/MASCIS-støtfangeren deler det samme prinsippet om å sikte mot den målrettede ryggmargen og slippe en fast vekt fra forskjellige høyder for å gjøre forskjellige skadealvorlighetsgrader. IH-impactoren skaper ryggmargsskaden i henhold til forskjellige krefter.

For enkelhets skyld ved bruk av musemodellen i SCI-studier og for å etablere grunnlaget for effektive behandlingsmetoder, utvikles en integrert ryggmargsskadeskadeplattform, kalt ryggmargsskadekoaksialplattformen (SCICP). Plattformen består av fire hovedkomponenter: (1) et dyreoperasjonsbord designet for en passende posisjon for opererte mus, som er svært kompakt og gir bekvemmelighet uten posisjonsbegrensning; (2) en mikro-retractor på begge sider for å holde paravertebrale muskler under drift; (3) en vertebral stabilisator for å holde vertebraen før prosedyren for SCI (to vertebrale stabilisatorer er tilgjengelige for drift på større dyr som rotter); (4) en hylse, en støtfangerspiss, vekter og en trekkpinne. De tre delene skal monteres til en avtagbar X-Y-Z-arm. For presis målretting plasseres en støtfangerspiss på overflaten av ryggmargen, og X-Y-Z-armen går forsiktig ned til forventet høyde ved hjelp av merket mellom støtfangerspissen og hylsen. Støtfangerspissen er laget av en 0,12 g aluminiumslegering for å unngå skade på ryggmargen som tilskrives stor vektkompresjon før prosedyren. Trekkstiften er for å holde vektene på toppen av ermet for å forberede vektfallet (figur 1).

I tidligere studier ble slagkraftdeling definert i henhold til IH-enhetens slagkraftdata, som er henholdsvis 30 Kdyn, 50 Kdyn og 70 Kdyn, ^6,10. Under forskningsprosessen ble serielle grader av SCI-modeller vist seg å være etablert basert på SCICP, som kan brukes i ulike studier. Derfor, før eksperimentet offisielt startet, ble slagkreftene generert av forskjellige vekter av forskjellige masser testet ved hjelp av en topptrykkstestingsanordning. Som et resultat ble tre standardiserte representative SCI-musemodeller valgt som tre forskjellige grader av skade, inkludert graderte milde, moderate og alvorlige grupper, henholdsvis ^6,10, og vektene ble utgitt i samme høyde, med en vekt på 1,3 g for mild, 2,0 g for moderat og ^2,7 g for alvorlig skade.

Som et annet middel for å garantere brukbarhet og nøyaktighet, rapporteres en ny og minimal invasiv operativ tilnærming. Gjennom å undersøke anatomien til normale mus, finnes en ny metode for å lokalisere det interspinøse rommet til T12-T13. Metoden for lokalisering av ryggvirvler i operasjonstrinnene er enkel å mestre og nøyaktig, noe som sikrer presis lokalisering for minimalt invasive operasjoner.

Forhåpentligvis kan denne teknikken for kontusjonsskade hjelpe forskning og forståelse av ryggmargsskade, inkludert patofysiologisk forståelse, ledelsesevaluering og så videre.

Protocol

MERK: Alle forsøkene ble godkjent av Laboratory Animal Ethical and Welfare Committee ved Shandong University Cheeloo College of Medicine (godkjenningsnummer: 21L60) og ble utført i henhold til Veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr utgitt av National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revidert 1996).

1. Mekanisme for ryggmargsskade koaksial plattform og mekaniske tester

1. Monter plattformen med et kirurgisk operasjonsbord, en vertebral stabilisator og en støtfangerspiss (figur 1).
   MERK: Hold vektdråpe- og eksossporene, som forhindrer at vekten støter på luftstrømmer, rene, fordi smuss på vektfallet eller hylsen kan påvirke plattformens presisjon.
2. Sett spissen, som muliggjør nøyaktig ryggmargslokalisering, i ermet.
3. Velg riktige masser av vektdråpene for forsøket, som er 1,3 g, 2,0 g og 2,7 g for henholdsvis de milde, moderate og alvorlige gruppene.
4. Plugg trekkstiften inn i hullene i vektfallet.
5. Monter vektfallet til toppen av ermet med trekkstiften montert i sporet på X-Y-Z-armen, slik at når lokaliseringen er fullført, frigjøres vekten for å treffe støtfangerspissen, og dermed kontiserer ryggmargen, og endringer i ryggmargen observeres under mikroskopet.
6. Juster den avtakbare X-Y-Z-armen med 0,1 mm presisjon for å gjøre det enklere for operatøren å gi tilstrekkelig arbeidsplass (figur 1D, E).
   MERK: For å bekrefte konsistensen av resultatene av studien, før eksperimentet begynner, må du måle kraften som genereres når vekten slippes inne i hylsen ved hjelp av en topptrykksdeteksjonsenhet. En gjentakelse av bekreftelse er ikke nødvendig for fremtidige studier.
7. Slå på enheten, plasser metalltrykkreseptoren under spissen, nullstill adapteren, slipp trekkstiften og registrer den faktiske slagkraften.

2. Lokalisering og laminektomi av 9.^thorax vertebra (T9)

MERK: Kvinnelige C57BL / 6J mus 9-10 uker gamle ble kjøpt fra Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Kina).

1. Autoklav en pakke med kirurgiske instrumenter for eksperimentet og steriliser operasjonsbordet med 75% alkohol før kirurgi.
2. Injiser buprenorfin for analgesi (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 30 minutter før anestesi for skadeoperasjoner. Deretter bedøves musen med isofluran (induksjon: ~ 3% -5%, vedlikehold: ~ 1,5% -2%). Sjekk om dyret er fullt bedøvet av refleksene av hale eller tåklemme. Når anestesi er i kraft, legg musen i en utsatt stilling i en bestemt del av operasjonsbordet og belegg hornhinnen med oftalmisk salve (bruk oftalmisk salve på hornhinnen for å beskytte øynene mot tørking under operasjonen).
   1. Barber håret fra kaudal til rostral med en elektrisk barbermaskin over thoracolumbar ryggraden. Steriliser huden flere ganger i en sirkulær bevegelse med iodofor i 30 s og etterfulgt av 75% alkohol. Påfør en steril kirurgisk drapering og gjør et langsgående snitt på ca. 1,5 cm på huden fra ca. T6 til T13 med skalpell og blad.
      MERK: Palpere langs kystmarginen til midtlinjen, der T12-T13 interspinous space ligger. Gjør et 1,5 cm snitt til rostralen, og snittet er omtrent flush med T6-T13 ryggvirvler.
3. Utforsk den 13. ribben på den ene siden fra den benete delen under operasjonsmikroskopet. Utforsk den spinøse prosessen i midtlinjen ved å berøre området av costovertebral vinkelen lett og deretter mot rostralen for å finne det interspinøse rommet til T12-T13. Utforsk det interspinøse rommet til T9-T10 fra plassen til T12-T13 til rostralsiden. (Figur 2A, 3A)
4. Disseker den paraspinale muskelen langs den spinøse prosessen til T9 til de fremre og bakre fasettleddene på begge sider med mikrosaks (figur 3B). Trekk tilbake de paraspinale musklene med mikroretraktorer og rengjør bløtvevet på lamina og i det interspinøse rommet til T8-T9 og T9-T10 med mikrosaks.
5. Utfør T9 laminektomi, klem den spinøse prosessen med T9 med mikrokirurgiske tang, løft den litt opp, sett mikrosaksen parallelt langs høyre dorsolaterale side av lamina, unngå skade på ryggmargen og kutt av lamina med mikrosaks. Gjenta på venstre side, og ryggmargen kan eksponeres (figur 2B, 3C).
6. Før du fester ryggvirvelen, løsner du den universelle armen og klemmer sakte de 9. til 10. fasettleddene på begge sider av vertebraen med mikromyggtangen til vertebral stabilisatoren. Stram skruene på mikromyggtangen, og ryggvirvelen stabiliseres dermed. Juster ryggmargen til horisontalplanet, stram universalarmen, og ryggvirvelen er fast (figur 3D).

3. T9 kontusjon skade

1. Når ryggmargen på T9-nivå er eksponert og ryggvirvelen er festet, sikter du mot ryggmargen med spissen inne i hylsen under operasjonsmikroskopisk (figur 3E).
2. Sjekk om overflaten av spissen er parallell med ryggmargen fra bakre og laterale aspekter av ryggmargen, siden det er lett å observere forholdet mellom ryggmargen og spissen under mikroskopet, og at operasjonsbordet lett kan snus.
3. Sjekk om overflaten av spissen er parallell med de bilaterale grensene til spart lamina før spissen er i kontakt med ryggmargen etter laminektomi, siden det er et naturlig referanseplan parallelt med ryggmargen.
4. Etter å ha funnet det interspinøse rommet til T12-T13, senk hylsen til enden av støtfangeren stemmer overens med merket på observasjonsvinduet og den angitte høyden på 22 mm er nådd. Trekk ut trekkstiften for å frigjøre vekten (1,3 g, 2,0 g eller 2,7 g i henhold til gruppen, med hver gruppe inkludert 3 mus og hver gruppe har en mus for hvert tidspunkt).
   NOTAT: Ryggmargen skal være parallell med bakken og vinkelrett på spissen; Flytt operasjonstabellen for å sikre det mikroskopiske synsfeltet, siden bordet er veldig kompakt.
5. Fjern støtfangeren når kontusjonen er ferdig, og observer graden av SCI under operasjonsmikroskopet. I den milde gruppen kan man se en lys rød fargeendring, mens i den moderate gruppen viser skadestedet mørkerødt i 3-4 s, og muligens kan eminense observeres. I den alvorlige gruppen kan de mørkerøde manifestasjonene vises umiddelbart, og åpenbar eminens i dura manifesteres, men dura er fortsatt i en konsistent form (figur 3F).
6. Sutur overfladisk fascia og hud med suturer (polypropylen ikke-absorberbar sutur, størrelse: 6-0).
7. Etter å ha fullført suturen, steriliser det kirurgiske området, legg musen på en temperaturkontrollert pute til full bevissthet er gjenopprettet, og sett deretter musen i museburene.

4. Dyrepleie

1. Plasser dyret på varmeputen for utvinning og observer bevegelsen av begge bakre lemmer.
   MERK: Dyr som har gjennomgått kirurgi bør ikke returneres til selskap med andre dyr før de er fullstendig gjenopprettet.
2. Sett et høyvannsdiett på burgulvet slik at dyr lett kan nå maten. Alternativt kan du bruke et bur med et lavere fôringsbord.
3. Tøm musens blærer to ganger om dagen etter operasjonen fordi det er vanskelig for de moderate og alvorlige skadegruppene å gjenopprette blærefunksjonen. Injiser buprenorfin for analgesi (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 timer / dag i 3 dager.

5. Transkardial perfusjon, farging og immunostaining

1. På 1., 28. og 56. dag etter skade, ofre henholdsvis en mus av hver gruppe ved perfusjon.
   1. Perfuse musene med 60 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og 20 ml 4% paraformaldehyd etter overdreven anestesi (4% -6% isofluran).
   2. Samle ryggraden med mikrosaks, som strekker seg henholdsvis rostralt og kaudalt 1 cm fra lesjonssenteret.
   3. Resect de overskytende musklene, reserver intakte ryggradssegmenter med delvise ribber for instrumenter å holde i trinn 5.1.4 og suge den i 4% paraformaldehyd i 24 timer.
   4. Klem ribbeina med hemostatisk tang for fiksering og definer lesjonssenteret under mikroskopet i henhold til den resekterte lamina og fargeendring i lesjonssenteret i ryggmargen.
   5. Resect alle laminae og artikulære prosesser med mikro saks fra kaudal.
   6. Klipp av nerverøttene med mikrosaks og ta ut ryggmargen.
   7. Samle 0,5 cm av ryggmargen som strekker seg henholdsvis kaudalt og rostralt fra lesjonssenteret med mikrosaks.
   8. Sett ryggmargen i 30% sukrose ved 4 °C i 48 timer.
2. Skjær vevet i 6 μm tykke seksjoner etter frysing i henhold til histologisk undersøkelsestype.
3. Utfør farging av hematoksylin og eosin (H&E).
   1. Varm opp seksjonene til romtemperatur og bløtlegg de 6 μm tykke seksjonene i 4% formaldehyd i ca. 15 minutter, etterfulgt av bløtlegging i 1x PBS i 1 min fire ganger for å fjerne gjenværende OCT.
   2. Flekk seksjonene med hematoksylin i 90 s, og skyll med dobbeltdestillert vann.
   3. Vask deretter seksjonene med rennende vann i 3 minutter.
   4. Flekk med eosin i 4 minutter og suge i 95% alkohol i 30 s to ganger for å skylle overflødig eosin.
   5. Til slutt, dehydrer med gradientalkohol (95% alkohol og 50% alkohol en gang, suksessivt) i 30 s og suge i xylen for gjennomsiktighet i 2 minutter. Deretter forsegler du prøvene med harpiksgel (koronaplanseksjon: Figur 4; sagittalplanseksjon: Figur 5).
4. Utfør immunfluorescerende farging.
   1. Varm opp seksjonene til romtemperatur og bløtlegg de 6 μm tykke seksjonene i 4% formaldehyd i ca. 2 minutter.
   2. Vask seksjonene i TBST i 5 minutter i tre ganger.
   3. Inkuber seksjonene med blokkerende oppløsning (10% geit normalt serum i PBS) og blokk i 1 time for å blokkere uspesifikk binding av immunoglobulin.
   4. Inkuber ryggmargsseksjonene over natten ved 4 °C med både mus anti-glia fibrillært surt protein (GFAP, en markør for reaktive astrocytter), polyklonalt antistoff (1:600) og kanin anti-NF200 antistoff (1:2000), en markør for nevrofilament i 0,4 ml blokkeringsløsning.
   5. Skyll seksjonene med PBS og tilsett 0,4 ml blokkeringsløsning med Geit anti-kanin Alexa 594-konjugert IgG (1: 1,000) og geit anti-mus Alexa 488-konjugert IgG (1: 1,000) sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur.
   6. Ta bilder med fluorescerende mikroskop ved 10x ved automatisk panoramaskanning ved bølgelengder på henholdsvis 594 nm og 488 nm (figur 6).
      1. Slå på fluorescensmikroskopet, sett lysbildet på mikroskopstadiet, bytt til fluorescenskanalen, bruk posisjoneringstasten til å plassere tre til fire punkter på vevet, og fokuser for å fullføre skytingen. Når du er ferdig med å skyte, lagrer du bildene fra forskjellige kanaler i ønsket format, og lagrer deretter det sammenslåtte bildet.

Representative Results

For å teste enhetens presisjon ble kraften som tre forskjellige vektmasser laget av samme høyde målt ved hjelp av en topptrykkstestingsenhet. Tjuefire tester ble utført med varierende vektgrupper, noe som resulterte i (gjennomsnittlig ± SD) 0,323 N ± 0,02 N for 1,3 g vekter, 0,543 N ± 0,15 N for 2,0 g vekter og 0,723 N ± 0,26 N for 2,7 g vekter (figur 7). Tidligere studier har tatt i bruk dyne (dyn) eller Kilodyne (Kdyn) som enheter for å måle kontusjonsintensitetene. For bedre sammenligning med tidligere studier er konverteringene mellom Newtons (N) og dyne/Kilodyne listet opp (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10³ g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

Tabell 1 og figur 4 viser data om lesjonene i de milde, moderate og alvorlige gruppene på koronale seksjoner. Å dømme fra figur 4, den 28. dagen etter skade, ble kontinuiteten i de distinkte grensene for grå og hvit substans i de milde, moderate og alvorlige gruppene redusert suksessivt, med området av arrvev som vokste seg større og en økende andel på tverrsnittet av lesjonssenteret. Det var åpenbare morfologiske forskjeller i alle forsøksgruppene sammenlignet med normalgruppen. Dette viste rasjonaliteten i fordelingen av skadegrader i forsøksgruppene.

Tabell 2 og figur 5 beskriver ryggmargsskade 1. og 56. dag etter sagittalsnitt. Det kan sees at lesjonsområdet gradvis økte betydelig fra de milde til alvorlige gruppene på 1. dag etter skaden. I mellomtiden var kontinuiteten av hvitt materiale på begge sider av ryggmargen bedre i den milde gruppen, med observerbare små runde vakuoler, som er egenskapene til interstitial ødem. I den moderate gruppen viste den hvite substansen dårlig kontinuitet, og strukturen til den ventrale hvite substansen ble ikke bestilt. I den alvorlige gruppen viste den ventrale hvite substansen mer alvorlig forstyrrelse, og et stort område av hulrommet dukket opp i midten av skaden. I tillegg viste det omkringliggende vevet tydelig fylling av de røde blodcellene, og de røde blodcellene nær sentralkanalen samlet seg i strimler. Den 56. dagen etter skaden ble det observert arrdannelse i skadesenteret til de tre gruppene, hvis område økte i henhold til alvorlighetsgraden av skaden.

Integriteten til ryggmargsnevrofilament den 56. dagen etter skaden kan også utledes fra analysen av immunfluorescensfargingsresultatene (figur 6). Figuren viser også at overlappende arrdannende astrocytter var synlige i midten av alle tre skadegruppene, med lengden på skadeområdet som økte med alvorlighetsgraden av skaden, mens arrdiameteren gikk ned. Dette antyder tilstedeværelsen av arrkontraktur, noe som kan føre til en reduksjon i ryggmargsdiameteren.

Figur 1: En hel og deler utstilling av ryggmargsskade koaksial plattform . (A) X-Y-Z-armen og operasjonsbordet kan skilles, noe som gir tilstrekkelig plass til operasjonsprosedyren der et lite dyrs ryggmarg blir utsatt. Operasjonsbordet kan flyttes fritt under drift, noe som reduserer potensielle driftsproblemer som tilskrives posisjonsbegrensninger. Kroppen til vertebral stabilisatoren har en tre-felles universell arm for retningsassistanse, noe som øker fleksibiliteten. (B) Sett støtfangerspissen inn i hylsen og monter sistnevnte i X-Y-Z-armen. Sett spissen av trekkstiften inn i hullene i vekten for å forhindre at vekten faller og legg vekten i ermet. Med delene montert, finn det målrettede skadeområdet under mikroskopet. Senk deretter X-Y-Z-armen til enden av støtfangerspissen er i samsvar med det nedre nivået av observasjonsvinduet, noe som indikerer at en enhetlig kontusjonshøyde er nådd (høyden mellom vekten og støtfangerspissen er 22 mm når fallet starter). Trekk trekkpinnen, og virkningen vil bli gjort. (C) Etter at skadeområdet er eksponert, bruk klipsene til å klemme og fikse musens ryggrad og strammebolten for å stabilisere vertebral stabilisatoren. (D) Anbefalte funksjoner for spor på operasjonsbordet. Forsøksdyret skal settes i midtsporet, med hodet mot den fremre, thoraxdelen i skråningen. X-Y-Z-armen er skilt fra operasjonstabellen. (E) En visning av den monterte SCICP. Pilene angir delene. Med spissen rettet mot målkontusjonsområdet, for å starte kontusjonen, trekk ut trekkpinnen, og vekten vil falle på støtfangerspissen for å forvirre ryggmargen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: En avbildningsgraf av T13 costovertebral vertebra lokaliseringsmetode . (A) Den 13. ribben og T13 er relativt konstante anatomiske strukturer. T13 costovertebral vinkel kan lett oppdages under mikroskopet, hvorfra operatøren kan sonde mot den spinøse prosessen og finne T12-T13 interspinous space. Deretter sonder mot rostralsiden suksessivt for å finne målskadevirvelen (for eksempel T9). (B) En minimal invasiv 9. thorax laminektomi kan bevare tilstrekkelig lamina og fasettledd mellom tilstøtende vertebrale legemer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Eksponering og kontusjon av ryggmargen på T9-nivå hos mus . (A) Sonder T13 costovertebral vinkel. (B) Med den paraspinale muskelen trukket tilbake av mikroretraktorer for å få tilstrekkelig plass til drift, utsett T9. (C) Utfør T9 laminektomi med mikrosaks. (D) Stabiliser vertebraen med klipsene til vertebral stabilisatoren. (E) Sikt mot målkontusjonsområdet med støtfangerspissen. (F) Ødem og overbelastning er notert i skadeområdet etter kontusjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative seksjoner den 28. dagen etter ulik grad av ryggmarg hos mus (koronale snitt). (A) Normal thorax ryggmargen av musen. Skalabar = 500 μm. (B) For den milde gruppen kan liten skade noteres i ryggmargens dorsale aspekt, mens morfologien til den sparte hvite substansen og gråstoffet er vesentlig bevart. (C) For den moderate gruppen observeres tydelig arrvev i ryggmargen (indikert med den røde stjernen). De differensierende egenskapene mellom hvit substans og grå materie kan knapt skilles. (D) Til sammenligning har ryggmargen til den alvorlige gruppen nesten mistet sin opprinnelige morfologi og har nesten blitt erstattet av arrvev. Den grønne stiplede linjen indikerer skadeområdet, og den svarte stiplede linjen indikerer grensen til det observerbare grå stoffet. Etter hvert som alvorlighetsgraden av skaden økte, oppstod en større lesjon og mindre spart struktur i musens ryggmarg, med grensen til grå materie knapt å skille mellom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Representative seksjoner 1. og 56. dag etter skade på ryggmargen hos mus (sagittale seksjoner). (A) Normal thorax ryggmargen av musen. (B) B1-B3 representerer henholdsvis ryggmargen den 1. dagen etter skade i de milde, moderate og alvorlige gruppene. Det kan sees at etter hvert som skaden økte, ble et større område forstyrret eller flytende i lesjonssenteret. Kontinuiteten av hvit substans i den ventrale ryggmargen var forskjellig på grunn av forskjellige skadeintensiteter. B1 viser at den hvite substansen i ventral ryggmargen har bedre kontinuitet med lett ødem. B2 viser dårligere kontinuitet i den hvite substansen i ventral ryggmarg og ødem. Vevet i midten av B3 SCI har mistet nesten all kontinuitet, og det er omfattende ødem i området utenfor sentrum av skaden. (C) C1-C3 representerer henholdsvis ryggmargen den 56. dagen etter skaden i de milde, moderate og alvorlige gruppene. Ulike grader av arrkontraktur manifesterte seg i skadesenteret mellom ulike grupper, og det var en signifikant forskjell i diameteren på skadeområdet. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Representative seksjoner den 56. dagen etter ryggmargsskade hos mus (sagittale snitt). (A) Representativ del av den milde gruppen. NF200 indikerer nevrofilamentet, mens GFAP indikerer astrocytter. Overlappende astrocytter observeres i lesjonens episenter, mens nevrofilamentet i den ventrale delen av ryggmargen er i god kontinuitet. (B) Representativ del av den moderate gruppen. To arrsentre kan observeres (indikert med røde stjerner) i tillegg til overlappende astrocytter, mens nevrofilamentet i det ventrale aspektet har kontinuitet. (C) Representativ del av den alvorlige gruppen, med et stort lesjonsområde og massive arrdannende astrocytter. Det er ikke observert noe tydelig arrsenter, og nevrofilamentet har dårlig kontinuitet. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Kraft generert fra samme høyde, men med forskjellige vekter. Før forsøket ble kraften generert av forskjellige vektmasser frigjort fra samme høyde oppdaget ved hjelp av en topptrykksdeteksjonsanordning. Etter at hver gruppe hadde fullført 24 deteksjoner, ble det oppnådd mer pålitelige gravitasjonsdata for referanse til slagkraft. Dataene ble analysert ved hjelp av statistikkprogrammet SPSS19.0. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD, n = 24 i hver gruppe. Sammenligninger mellom flere grupper var basert på en enveis variansanalyse (ANOVA) som ble brukt til å teste forskjellene; p < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

28 dpi
Gruppe	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normal	35.44	64.57	0
Litt	11.59	64.88	23.53
Moderat	0	41.14	58.86
Veldig	0	0	100

Tabell 1: Frekvens av hvit substans, grå substans og skade den 28. dagen etter skade. Forkortelser: dpi = dager etter skade, DA = skadet område; GMR = grå substans rate; WMR = hvit substans rate; DR = skadet hastighet.

Gruppe	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normal	0	0
Litt	2391250	666091
Moderat	4383381	1263191
Veldig	5118833	1943962

Tabell 2: Sammenligninger mellom lesjonen på sagittalavsnitt 1. og 56. dag etter skade.

Discussion

Gjennom den standardiserte prosedyren kan stabile data oppnås, spesielt i små dyr in vivo eksperimenter, noe som kan minimere avviket fra resultater forårsaket av individuelle forskjeller mellom dyrene. Basert på ovennevnte forhold og praktiske applikasjonsinstrumenter, kan standardiserte, minimalt invasive, nøyaktige og repeterbare SCI-modeller etableres.

På grunn av sin gjennomførbarhet og bekvemmelighet ble tidligere vektdråpepåvirkningen brukt mest³. Impactoren introdusert i denne studien deler det samme prinsippet med Allens modell¹². Heldigvis, på grunn av de nøyaktige produksjonsfordelene ved moderne maskineringsteknologi, designet forskerteamet en vektfallspåvirkning med fordelene ved å være enkel å betjene, sterkt stabil og sjelden unøyaktig. En topptrykksdeteksjonsenhet ble brukt til å måle tyngdekraften til forskjellige vekter. Tidligere studier^6,10 om Infinite Horizons-nedslagsfeltet rapporterte at et ±5 Kdyn-kraftområde som avviker fra den tiltenkte kraften, aksepteres i 30 Kdyn-, 50 Kdyn- og ⁷⁰ Kdyn-gruppene^, som gir en referanse for den nåværende studien når det gjelder gruppedeling og kontusjonsgradsvalg. I denne forskningen ble den mulige kraften til forskjellige grupper målt på forhånd, og mer nøyaktige data ble oppnådd.

Mer kritisk enn enheten i dyremodellforsøk er forståelsen og bruken av museanatomi. Å gjøre god bruk av anatomi kan gjøre prosedyrer minimalt invasive. Minimal invasiv kirurgi påvirker direkte stabiliteten til det eksperimentelle dyrets funksjonelle tilstand og konsistensen av etterfølgende musegjenoppretting. Tidligere studier har vist at minimal invasiv etablering av SCI-modeller øker stabiliteten i vertebralstrukturen og unngår ytterligere skade forårsaket av spinal ustabilitet under gjenoppretting hos rotter¹. Forutsetningen for minimal invasiv kirurgi er rimelig bruk av naturlige anatomiske strukturer. Derfor bør den raske og presise lokaliseringen av ryggmargssegmenter gjøres i samsvar med musens anatomiske struktur. Som rapportert ble bildemetoden brukt til å finne vertebra¹³. Selv om den har høy nøyaktighet, i den faktiske eksperimentelle operasjonsprosessen, har bildemetoden for lokalisering ulempene med ubeleilig drift, lang driftstid, kompleks utstyrsinnsamling og høye krav til utstyrsnøyaktighet. McDonough og medarbeidere beskrev å lokalisere T7 gjennom de nedre vinklene til scapulas¹⁴, mens mus virker i en løgn nedbrutt, så de nevnte underordnede vinklene skal være bakre vinkler. Videre er bruk av de nedre scapular tipsene for å finne T7 en lokaliseringsmetode for en bestemt posisjon i menneskelig anatomi¹⁵, som ikke er egnet for mus. Til slutt validerte mikro-CT-data også hypotesen om at de bakre vinklene til scapulae ikke er flush med T7 uavhengig av om musen er i sin naturlige eller spesifikke kroppsposisjon. McDonough et ^al.14 nevnte også å finne det høyeste punktet på ryggen når musen er buet og definere det høyeste punktet som T12. Til sammenligning, i den foreliggende forskningen, ligger T9 ved hjelp av T12-T13 interspinøst rom, som verken er forbundet med eller påvirket av musens holdning. Dessuten, med denne metoden, kan målvirvelen lett lokaliseres og opereres på. Man bør sonde den 13. ribben under mikroskopet, forsiktig berøre området av costovertebral vinkelen, tegne en linje mot den spinøse prosessen, og deretter sonde mellomrommet mellom de spinøse prosessene til T12-T13 mot hodet. Forskningsgruppen brukte T12-T13 interspinous plass for å finne T9 av 12 mus. Til slutt hadde 12 kvinnelige C57BL / 6J-mus en mikro-CT-skanning etter T9-plasseringen og laminektomi. Resultatet av Micro-CT-skanningen indikerte at den fjernede laminae i alle 12 musene var T9. Resultatene av Micro-CT viste at alle T9 var nøyaktig plassert, og nøyaktigheten var betydelig høyere enn scapula-lokaliseringsmetoden. Denne metoden gir oss en rask og nøyaktig måte å lokalisere på, noe som bidrar til konsistensen av skademodellen.

Den nåværende protokollens minimale invasivitet uttales hovedsakelig i tre aspekter. For det første, etter lokalisering, blir de paraspinale musklene på T9-nivået bare trukket tilbake av mikroretraktorer, uten å skade musklene på T8- eller T10-nivåene. Dessuten forstyrrer eksponeringen av lamina av mikroretraktorene ikke synsfeltet. For det andre er blodtap, som hovedsakelig er fra laminektomi, noe som kan føre til blodutstrømning fra det avstivende beinet, svært lavt i operasjonsprosedyren, nesten ikke mer enn volumet for å flekke et 2 mm x 2 mm x 3 mm trekantet stykke bomull. For det tredje ble laminektomi utført begrenset til det nødvendige området i størst grad, opprettholde kontinuitet i den laterale delen av lamina og sterkt dempe vertebra ustabilitet. Sammenlignet med tidligere protokoller^16,17, reduserer den nåværende protokollen mye unødvendig skade.

For å evaluere de ulike grader av SCI ble resultatene mellom alle grupper i histopatologi sammenlignet med hva tidligere studier allerede har vist 9,11,18. Disse resultatene er tilstrekkelige til å fullføre en observasjonsstudie av ulike grader av skade og endringer i ulike perioder. HE og immunfluorescens viste at med økning i alvorlighetsgraden av SCI oppstod mer unormal morfologi i ryggmargsvevet, og økningen i graden av skade førte også til en økning i graden av strukturell lidelse i ryggmargen. Fra perspektivet til vevsmorfologiobservasjon er graden og regelmessigheten av vevsmorfologiendringer i hver eksperimentell gruppe i denne studien svært konsistent med tidligere studier.

I henhold til gjeldende histologiske testresultater indikeres klare endringer i ulike indikatorer etter ulike grader av traumatisk SCI, noe som ytterligere bekrefter påliteligheten til modellen etablert i denne studien.

Nøyaktig og effektiv selv om teknikken er, kan potensielle begrensninger eksistere for metodene. Når det gjelder laminektomi, bør operatøren være dyktig med operasjoner under mikroskopet for å forhindre at ryggmargen blir skadet ved en feiltakelse. Oppsettet av hele plattformen er også basert på mekaniske strukturer, noe som setter en høyere etterspørsel etter operatøren sammenlignet med automatisert utstyr. Faktisk kan alle de nevnte problemene forbedres ved gjentatt trening av operasjonen.

Det kan sees at minimalt invasiv og standardisert modellering er gunstig for å gjøre resultatene mer ensartede, stabile og repeterbare, evaluere effekten av ulike behandlingsplaner nøyaktig og optimalisere forskningsplanen for traumatisk SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7