Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontroll av partikelfraktion i mikroporösa glödgade partikelställningar för 3D-cellodling

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

Att minimera variationen i partikelfraktionen inom granulära byggnadsställningar underlättar reproducerbara experiment. Detta arbete beskriver metoder för att generera granulära byggnadsställningar med kontrollerade partikelfraktioner för in vitro-vävnadstekniska applikationer.

Abstract

Mikrogeler är byggstenarna i mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP), som fungerar som en plattform för både in vitro-cellodling och vävnadsreparation in vivo . I dessa granulära byggnadsställningar möjliggör den medfödda porositeten som genereras av tomrummet mellan mikrogeler cellinfiltration och migration. Att kontrollera tomrumsfraktionen och partikelfraktionen är avgörande för MAP-ställningens design, eftersom porositet är en bioaktiv ledtråd för celler. Sfäriska mikrogeler kan genereras på en mikrofluidisk anordning för kontrollerad storlek och form och därefter frystorkas med metoder som förhindrar sprickbildning av polymernätverket. Vid rehydrering leder de frystorkade mikrogelerna till kontrollerade partikelfraktioner i MAP-ställningar. Implementeringen av dessa metoder för mikrogellyofilisering har lett till reproducerbara studier som visar effekten av partikelfraktion på makromolekyldiffusion och cellspridning. Följande protokoll kommer att täcka tillverkning, frystorkning och rehydrering av mikrogeler för att kontrollera partikelfraktion i MAP-byggnadsställningar, samt glödgning av mikrogelerna genom bio-ortogonal tvärbindning för 3D-cellodling in vitro.

Introduction

Mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP) är en underklass av granulära material där mikrogelbyggstenarna (μgel) är sammankopplade för att bilda en bulk, porös byggnadsställning. Med den unika mikroarkitekturen hos dessa granulära byggnadsställningar stöder den medfödda porositeten som genereras av tomrummet mellan sammanlänkad sfärisk mikrogel accelererad cellinfiltration och migration1. Mikrogelbyggstenarna i MAP-ställningar kan tillverkas av både syntetiska och naturliga polymerer med kemiska modifieringar2. Metoderna som beskrivs här belyser specifikt användningen av mikrogeler som består av en hyaluronsyra (HA) ryggrad modifierad med funktionella norbornen (NB) handtag. NB-funktionshandtaget på HA-polymeren stöder klickkemiska reaktioner för att bilda mikrogeler och länka dem samman för att generera MAP-ställningar 3,4. Många scheman har använts för att länka mikrogelerna tillsammans (dvs. glödgning), såsom enzymatisk1, ljusbaserad 5,6 och additivfri klickkemi 3,7 reaktioner. Additivfri klickkemi beskrivs i detta arbete, med hjälp av tetrazin-norbornen invers elektronbehov Diels-Alder-konjugering för sammankoppling av HA-NB-mikrogelerna.

För att tillverka MAP-ställningar genererar användarna först mikrogelbyggstenarna med hjälp av omvända emulsioner antingen i batchsystem eller inom mikrofluidiska enheter, samt med elektrohydrodynamisk sprutning, litografi eller mekanisk fragmentering2. Produktionen av sfäriska HA-NB-mikrogeler har beskrivits väl och tidigare rapporterats med hjälp av både batchemulsion2 och mikrofluidiska droppgenereringstekniker 8,9,10,11. I detta arbete genererades sfäriska HA-NB-mikrogeler på en flödesfokuserande mikrofluidisk plattform för kontrollerad storlek och form, som tidigare beskrivits 8,9,10. Efter rening existerar mikrogelerna i en vattenhaltig suspension och måste koncentreras för att inducera ett fastnat tillstånd. När de har fastnat uppvisar mikrogeler skjuvförtunnande egenskaper, vilket gör att de kan fungera som injicerbara, rymdfyllande material1. En metod för att inducera ett fastnat tillstånd är att torka mikrogelerna via frystorkning eller frystorkning och sedan rehydrera den torkade produkten i en kontrollerad volym12. Alternativt kan överskottsbuffert avlägsnas från mikrogeluppslamningen via centrifugering över en sil eller med manuellt avlägsnande av bufferten från mikrogelpelleten antingen genom aspiration eller med hjälp av ett absorberande material. Att använda centrifugering för att torka mikrogelerna kan emellertid generera ett mycket varierande intervall av partikelfraktioner och tomrumsfraktioner vid tillverkning av granulära byggnadsställningar12. Tekniker för att frysofila mikrogeler har beskrivits med 70% IPA för polyetylenglykol (PEG) mikrogeler13, fluorerade oljor för gelatinmetakryloyl (GelMa) mikrogeler 14 och 70% etanol för HA-mikrogeler12. Detta protokoll belyser metoder för frystorkning av sfäriska HA-mikrogeler med användning av 70% etanol, ett standardlaboratoriereagens, för att behålla de ursprungliga mikrogelegenskaperna under torkningsprocessen. De frystorkade HA-mikrogelerna kan vägas och rehydreras med användardefinierade viktprocent för att kontrollera de slutliga partikelfraktionerna i MAP-ställningar12.

Det sista steget i MAP-ställningsbildning bygger på glödgning av mikrogelerna för att skapa en bulk, porös byggnadsställning1. Genom att använda inbyggda extracellulära matriskomponenter och använda bio-ortogonala glödgningsscheman fungerar MAP-ställningar som en biokompatibel plattform för både in vitro-cellodling och in vivo-vävnadsreparation3. Genom dessa tillvägagångssätt kan MAP-ställningar tillverkas av HA-NB-byggstenar med användardefinierade partikelfraktioner för deras anställning i vävnadstekniska applikationer12. Följande protokoll beskriver den mikrofluidiska produktionen av HA-NB-mikrogeler följt av frystorkning och rehydrering för kontroll av partikelfraktion i MAP-byggnadsställningar. Slutligen beskrivs steg för glödgning av mikrogelerna med hjälp av bio-ortogonal kemi för in vitro 3D-cellodlingsexperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverkning av mikrofluidiska enheter

  1. Mjuk litografi
    OBS: Detta protokoll beskriver enhetstillverkning av en flödesfokuserande mikrofluidisk enhetsdesign från de Wilson et al.9. Detta protokoll kan dock användas med vilken enhetsdesign som helst på en SU-8-skiva. Skivan kan tejpas fast på en petriskål och måste sedan silaniseras för att förhindra att PDMS fästs på skivfunktionerna15.
    1. Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) elastomerbasen med härdningsmedlet (se materialförteckningen) i förhållandet 10:1. Förbered cirka 100 g för att täcka skivan med ~ 5 mm PDMS. Häll PDMS-blandningen på skivan och avgasa i en exsickator i cirka 30 minuter. När alla bubblor är borta, placera i en ugn vid 60 ° C i minst 2 timmar för att härda PDMS.
    2. Använd en kniv för att försiktigt spåra runt enhetens parameter utan att spricka skivan; Dra sedan försiktigt av PDMS från skivan. Använd en 1 mm biopsistans (se materialtabell) för att skapa inlopps- och utloppskanalerna.
      OBS: Var försiktig när du stansar mikrofluidikanordningen. Tårar eller revor runt inlopps- eller utloppskanalerna kan orsaka läckage under mikrogelproduktionen.
    3. Använd tejp för att ta bort damm från enheten på funktionssidan. Placera enheterna och rengör glasskivorna på en värmeplatta vid 135 °C i minst 15 minuter för att avlägsna fukt.
    4. I en dragskåp, använd en koronaplasmapistol (se Materialförteckning) högt på både glasskivorna och enheterna (funktionssidan exponerad) i cirka 30 s och bind dem sedan snabbt ihop. Tryck försiktigt för att säkerställa en bra tätning mellan enheten och glasskivan. Placera enheterna i en ugn på 60 °C över natten för att säkra bindningen.

2. Mikrofluidisk produktion av hyaluronsyra (HA) mikrogeler med norbornen (NB) funktionella handtag

  1. HA-NB syntes
    OBS: HA-norbornen (HA-NB) syntes anpassades från Darling et al.3 med användning av 79 kDa natrium HA med molära ekvivalenter av 1: 1.5: 2.5 av HA-repeteringsenheter till 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-yl)-4-metylmorfoliniumklorid (DMTMM) till 5-norbornen-2-metylamin (NMA).
    1. Väg reaktanterna. Lös upp HA vid 20 mg/ml i 200 mM MES-buffert (pH ~6) genom omrörning i en bägare eller kolv på en omrörningsplatta. När den är upplöst, tillsätt DMTMM till HA-lösningen och låt reagera i cirka 20 minuter vid rumstemperatur. Till exempel kan 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 μL NMA användas.
    2. Lägg till NMA droppvis i HA/DMTMM-lösningen. Tillsätt parafilm till öppningen av reaktionskärlet för att minimera avdunstningen och täck reaktionskärlet med folie. Fortsätt omrörningen medan reaktionen fortsätter i cirka 24 timmar.
    3. Efter 24 timmar, kyla 200 bevis etanol (cirka 10x reaktionsvolymen). Överför reaktionen droppvis till den kylda etanolen på en omrörningsplatta för att fälla ut HA-NB och fortsätt omrörningen vid 200-300 rpm i 20 minuter.
    4. Överför lösningen till 50 ml koniska rör och centrifugera sedan vid 5 000 x g i 10 minuter. Häll av överskottet av etanol för att bortskaffa som avfall. Vid denna tidpunkt bör HA-NB-produkten vara vita pellets i de koniska rören. Dra vakuum på HA-NB i en exsickator för att torka över natten.
    5. Rena HA-NB med 12-14 kDa molekylviktsavskuren cellulosadialysslang (se materialförteckning). Lös upp HA-NB i 2 M NaCl-lösning och överför till dialysslangen. Bind slangen och säkra med klämmor, om det behövs. Överför den fyllda dialysslangen till en hink med 5 L ultrarent vatten och dialysera HA-NB mot vatten över natten.
    6. Nästa dag, ta bort vattnet och ersätt med 1 M NaCl-lösning i 30 min. Ta bort NaCl-lösningen och dialysera sedan mot ultrarent vatten i 3 dagar och byt ut vattnet dagligen.
    7. Filtrera den dialyserade produkten med 0,2 μm vakuumdrivet filter och överför sedan den filtrerade produkten till 50 ml koniska rör.
    8. Tillsätt flytande kväve i en kryogen behållare och snabbfrys HA-NB-rören i 10 minuter. Ta sedan bort de koniska rören med pincett och ta snabbt bort locket och täck med en vävnad av laboratoriekvalitet (se materialförteckning). Säkra vävnaden med ett gummiband och överför till en frystorkningsbehållare eller kammare (se materialförteckning) och frystorka. Förvara den frystorkade produkten vid -20 °C.
      VARNING: Flytande kväve är ett farligt ämne. Använd lämplig personlig skyddsutrustning när du arbetar med flytande kväve.
    9. Kvantifiera norbornenmodifiering genom att lösa upp HA-NB vid 10 mg / ml iD2O och analysera via proton NMR (figur 1A) 16.
      1. För att bestämma mängden funktionalisering, kalibrera först D2O-lösningsmedelstoppen till 4,8 PPM. Integrera toppen för HA-metylprotonerna (δ2.05) och kalibrera integrationen till 3.0. Integrera sedan topparna för de hängande norbornengrupperna vid δ6,33 och δ6,02 (vinylprotoner, endo). Normalisera integrationen av dessa toppar till motsvarande antal protoner för att bestämma den genomsnittliga graden av modifiering3.
  2. Beredning av HA-NB mikrogelprekursor
    1. Bered 50 mM HEPES-buffert (pH 7,5) och sterilfiltrera bufferten med ett 0,2 μm vakuumdrivet filter. Bereda med hjälp av HEPES-bufferten respektive 50 mM lager av litiumfenyl(2,4,6,-trimetylbensoyl)fosfinat (LAP) fotoinitiator och tris(2-karboxyetyl)fosfin (TCEP) reduktionsmedel. Håll LAP-lösningen borta från ljus.
    2. Bered de andra mikrogelprekursorkomponenterna genom att bereda respektive 50 mM lager av di-tiollinker och RGD-peptid i sterilt destillerat vatten. Väg upp HA-NB och lös upp i HEPES-buffert för att bereda ett lager på 10 mg/ml.
      OBS: Olika di-tiollänkar kan användas för den interna tvärbindningen av mikrogelerna baserat på användarens preferenser. Både en nedbrytbar (dvs. MMP-klyvbar) och icke-nedbrytbar (ditiotreitol eller DTT) länkare har listats i materialförteckningen. RGD-peptiden ingår i mikrogelformuleringen för att främja celladhesion i MAP-ställningar, men denna komponent kan tas bort och ersättas med lika stor volym HEPES-buffert.
    3. Kombinera prekursorkomponenterna med slutkoncentrationer på 9,9 mM LAP, 0,9375 mM TCEP (4 tiol/TCEP), 2,8 mM ditiollänkare, 1 mM RGD-peptid och 3,5 wt% (w/v) HA-NB genom att tillsätta extra HEPES-buffert för att nå önskad slutlig volym. Blanda föregångaren väl med en positiv förskjutningspipett.
    4. Använd en P1000-pipett och dra långsamt upp hela blandningen. Sätt spetsen på änden av en 1 ml spruta och mata ut spetsen från pipetten. Dra sprutkolven för att ladda blandningen i sprutan och tillsätt sedan ett 0,2 μm filter på sprutans ände och filtrera i ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör. Centrifugera den filtrerade prekursorlösningen för att avlägsna bubblorna som produceras under filtreringen.
    5. Återigen, med hjälp av en P1000-pipett, dra långsamt upp den filtrerade föregångaren och var försiktig så att du inte skapar bubblor. Om det finns bubblor, tryck försiktigt på spetsen så att de lossnar och flyter till toppen.
    6. Placera spetsen på änden av en 1 ml spruta och mata ut spetsen från pipetten. Håll sprutan i rätt höjd och dra långsamt i sprutkolven tills hela prekursorlösningen finns i sprutan. Tillsätt en trubbig spetsnål i sprutan och tryck föregångaren genom nålspetsen. Vik sprutan i folie för att hålla dig borta från ljus.
  3. Framställning av mikrogel-klämlösning
    1. Förbered 5% v/v Span-80 i tung vit mineralolja och blanda väl. Torka för att ta bort bubblor. Förvara tensiden/oljeblandningen i rumstemperatur insvept i folie. Blanda väl och torka före varje användning.
    2. Använd en 5 ml spruta för att dra upp blandningen av olja/ytaktivt ämne (minimera bubblor) tills avståndet mellan kolven och greppet är ungefär lika med avståndet till prekursorsprutan. Tillsätt en trubbig nål i sprutan och tryck oljan genom nålspetsen.
  4. Inställning av mikrofluidisk enhet
    1. Tillsätt en trubbig nål i en 1 ml spruta och fyll med syntetisk hydrofob behandlingslösning (se materialtabell). Flöda försiktigt lösningen genom mikrofluidikanordningen tills den samlas vid varje inlopp/utlopp. Låt lösningen torka i enheten på bänkskivan i cirka 30 minuter och dra sedan vakuum på utloppet för att ta bort överflödig lösning. Säkra enheten med klämmor på ett bordsmikroskop.
    2. Vik in ett 15 ml koniskt rör med folie och lägg i ett rörställ för att fungera som mikrogeluppsamlingsbehållare. Använd ett ringstativ med en klämma för att placera UV-ljussonden i uppsamlingsrörets öppning. Använd en UV-detektor (se materialförteckning) för att mäta UV-intensiteten och flytta sonden tills 20 mW/cm2 uppnås. Stäng av UV-ljuset tills senare.
    3. Skär slangen i en längd som når från mikrofluidikanordningen till uppsamlingsbehållaren. I ena änden av slangen, skär en 45 ° vinkel. För försiktigt in den vinklade änden av slangen i utloppskanalen.
      OBS: Var försiktig när du sätter in slangen i mikrofluidikanordningen. Tårar eller revor runt inlopps- eller utloppskanalerna kan orsaka läckage under mikrogelproduktionen.
    4. Säkra både prekursor- och oljefassprutorna på en pump med dubbla sprutor (se materialförteckningen). Skär ytterligare två slangstycken i en längd som når från sprutspetsarna till mikrofluidikanordningen. I ena änden av varje rör, skär en 45 ° vinkel. Fäst försiktigt slangen (trubbig ände) på båda sprutspetsarna.
    5. Ändra inställningarna på pumpen för sprutan på 1 ml och inkludera den ungefärliga prekursorvolymen. Tryck långsamt pumpen framåt tills tillräckligt med tryck appliceras på sprutkolvarna för att trycka både oljan och föregångaren till slangens ändar och ta bort luft från systemet. Låt trycket utjämna 5-10 min innan du går vidare till steg 2.4.6.
    6. För försiktigt in den vinklade änden av slangen i mikrofluidikanordningens inloppskanaler med mikrogelprekursorlösningen i det främre inloppet och klämoljan i det bakre inloppet. Flytta pumpen framåt i små steg tills flödet börjar i enheten och sfäriska mikrogeler börjar bildas vid det flödesfokuserande området. Starta pumpen med ett flöde på 0,4 μl/min och låt enheten gå tills den stabiliseras. Justera vid behov flödeshastigheten ±0,1 μl/min i små steg för att stabilisera mikrogelproduktionen.
    7. När mikrogelproduktionen stabiliserats som visas i figur 1B, byt ut uppsamlingsröret mot ett nytt rör och slå på UV-ljuset. Kontrollera körningen regelbundet för att säkerställa att mikrogelproduktionen är stabil under körningen.

Figure 1
Figur 1: Mikrofluidisk produktion av hyaluronsyra (HA) mikrogeler med norbornen (NB) funktionella handtag. (A) Cirka 31% av HA-upprepningsenheterna modifierades framgångsrikt med NB, vilket bestämdes genom proton NMR-analys utförd i deuteriumoxid. 1 H NMR-förskjutningar av hängande norbornener vid δ6,33 och δ6,02 (vinylprotoner, endo) och δ6,26 och δ6,23 ppm (vinylprotoner, exo) jämfördes med HA-metylgruppen δ2,05 ppm för att bestämma funktionalisering. Omtryckt från Anderson et al.12 med tillstånd från Elsevier. (B) Schematisk för den flödesfokuserande mikrofluidiska anordning som används för att generera HA-NB μgels. (C) Maximala intensitetsprojektioner från konfokalmikroskopi användes för att visualisera fluorescerande märkta μgels (skalstång = 500 μm). (D) Frekvensfördelningar av mikrogeldiameter från oberoende körningar på mikrofluidikinställningen visar kontroll över mikrogelstorlek ~ 50 μm eller ~ 100 μm beroende på vilken enhet som används. (E) Mikrogeldiameter rapporteras som medelvärde och standardavvikelse för varje oberoende körning. Omtryckt från Wilson et al.9 med tillstånd från Wiley. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Renande och torkande mikrogeler

  1. Rening av mikrogeler
    1. Förbered mikrogeltvättbufferten (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl 2) samt2% (w/v) Pluronic F-127 ytaktiv lösning i tvättbuffert. Sterilisera lösningarna med ett 0,2 μm vakuumdrivet filter.
    2. Centrifugera mikrogeluppsamlingsröret (5 000 x g) i 5 minuter. I en steril huva, aspirera försiktigt supernatantoljefasen. Kombinera μgels 1: 1 med 2% Pluronic F-127 ytaktiv lösning och virvel för att blanda väl. Centrifugera (5 000 x g) i 5 minuter och aspirera den supernatanta tvättlösningen.
    3. Tillsätt tvättbuffert vid 4x mikrogelvolym och virvel för att blanda väl. Centrifugera (5 000 x g) blandningen i 5 min och aspirera tvättlösningen. Slutför 4-8 tvättar med tvättbufferten tills ytaktivt ämne tas bort från systemet (dvs inga bubblor kvarstår).
  2. Fluorescerande märkning av HA-NB mikrogeler
    OBS:Den interna syntesen av ett fluorescerande märkt tetrazin bygger på två baskatalyserade tiol-Michael-additionsreaktioner i serier som har beskrivits väl och tidigare rapporterats3. För detta arbete konjugerades Alexa Fluor-488 med tetrazin för märkning av norbornenmodifierade μgeler. Den frystorkade produkten (Alexa Flour 488-Tet) löstes i dimetylformamid vid 1 mg/ml och förvarades vid -20 °C.
    1. För att fluorescerande märka μgelerna, förbered först en arbetslösning av Alexa Fluor 488-Tet genom att späda 1 mg / ml lager 1:14 i steril 1x PBS. I en steril huva, kombinera μgelerna med arbetslösningen (2:1 volymmässigt).
    2. Använd en förskjutningspipett och blanda väl. Inkubera blandningen i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
    3. Centrifugera (5 000 x g) och aspirera färgningslösningen. Tvätta μgels två gånger med 1x PBS (1: 1 volym) för att ta bort oreagerad Alexa Fluor 488-Tet.
      OBS: Vid denna tidpunkt kan de fluorescerande märkta μgelerna avbildas på ett konfokalmikroskop för att kvantifiera mikrogelstorleken (figur 1C-E)9. Metoder för att mäta mikrogelstorlek har beskrivits grundligt av Roosa et al.17.
  3. Torkning av HA-NB mikrogeler
    1. Överför renade μgels (figur 2A) till ett kryosäkert skruvlockrör med en pipett med positiv förskjutning. Tillsätt 70% etanol till de renade μgelerna 50% (v / v) och blanda väl med en förskjutningspipett. Centrifugera i 5 min vid 5 000 x g.
      VARNING: Etanol är ett mycket brandfarligt ämne.
      OBS: Det kryosäkra skruvlocksröret kan vägas innan μgels tillsätts och sedan vägas igen efter frystorkning för att bestämma massan av μgels. Detta rekommenderas för att minimera fel vid användning av kvantiteter mindre än 1 mg. Se till att vågen är internt justerad eller kalibrerad före användning.
    2. Aspirera supernatantvätskan och ersätt med 70% etanol (50% v / v) (figur 2B). Blanda väl med en förskjutningspipett. Inkubera över natten vid 4 °C.
      OBS: Microgels kan förvaras i 70% etanol vid 4 ° C före frystorkning för långvarig lagring, om det behövs. Frystorkade mikrogeler visas i figur 2C. Andra lyofiliseringsmedier kan användas i detta steg om kryogelbildning önskas (figur 2D).
    3. Centrifugera kort för att säkerställa att μgelerna är längst ner på skruvlocksröret. Tillsätt flytande kväve i en kryogen behållare och tillsätt sedan röret med μgels för att frysa snabbt.
    4. Efter 5-10 min, ta bort röret av μgels med pincett. Ta snabbt bort locket och täck med en vävnad av laboratoriekvalitet. Säkra vävnaden med ett gummiband och överför till en frystorkningsbehållare eller kammare.
    5. Ladda provet på lyofilisatorn enligt tillverkarens instruktioner. Frystorkas vid 0,066 Torr och -63 °C. Förvara de frystorkade μgelerna (lyo-μgels) tätt förseglade vid rumstemperatur.
      OBS: Lyofilisering är klar när all vätska avlägsnas från röret och en torkad produkt kvarstår. Organiska lösningsmedel kan minska livslängden hos gummiarmaturerna på vanliga lyofiliseringssystem.

Figure 2
Figur 2: Torkning av HA-NB-mikrogeler. (A) Maximal intensitetsprojektion av μgels i vattenlösning (skalstreck = 100 μm). (B) Renade μgeler kan inkuberas 1:1 i volym i det valda frystorkningsmediet och frystorkas. (C) Maximal intensitetsprojektion av torkade lyo-μgels (skalstreck = 100 μm). (D) Mikrogeler återsuspenderas efter frystorkning. EtOH (70%) rekommenderas för att behålla de ursprungliga egenskaperna hos μgelerna under hela frystorkningsprocessen; emellertid kan andra medier såsom isopropylalkohol (IPA), vatten och acetonitril (MeCN) användas omväxlande för att underlätta kryogelbildning (skalstång = 100 eller 50 μm som noterat). (E) Mätning av HA-NB mikrogeldiameter före (grå) och efter frystorkning (grön) i 70% EtOH visas som frekvensfördelningar för tre mikrogelpopulationer. Omtryckt från Anderson et al.12 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. KARTA ställningstillverkning

  1. Tetrazin linker syntes
    OBS: Tetrazinlänkar kan användas för att sammanlänka μgels med fria norbornengrupper (figur 3A). HA-tetrazin (HA-Tet) syntesproceduren anpassades från Zhang et al.18 med användning av 79 kDa natrium-HA med molära ekvivalenter av 1: 1: 0,25 av HA-repeteringsenheter till DMTMM till tetrazin-amin (Figur 3B) 12.
    1. Väg reaktanterna. Lös upp HA vid 20 mg/ml i 200 mM MES-buffert (pH ~6) genom omrörning i en bägare eller kolv på en omrörningsplatta. När den är upplöst, tillsätt DMTMM till HA-lösningen och låt reagera i cirka 20 minuter vid rumstemperatur. Till exempel kan 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg tetrazin-amin användas.
    2. Lös tetrazin-aminet vid 15 mg/ml i 200 mM MES-buffert och tillsätt droppvis till HA/DMTMM-lösningen. Se figur 3C för HA-Tet-reaktionsinställningen.
    3. Tillsätt parafilm till öppningen av reaktionskärlet för att minimera avdunstningen och täck reaktionskärlet med folie. Fortsätt omrörningen medan reaktionen fortsätter i cirka 24 timmar.
    4. Efter 24 timmar, kyla 200 bevis etanol (cirka 10x reaktionsvolymen). Överför reaktionen droppvis till den kylda etanolen på en omrörningsplatta för att fälla ut HA-Tet (figur 3D) och fortsätt omrörningen i 20 minuter.
    5. Överför lösningen till 50 ml koniska rör och centrifugera sedan vid 5 000 x g i 10 minuter. Häll av överskottet av etanol för att bortskaffa som avfall. Dra vakuum på HA-Tet i en exsickator för att torka över natten. Ett exempel på den torkade produkten i detta steg i protokollet finns i figur 3E.
    6. Rena HA-Tet med dialys. Lös upp HA-Tet i 2 M NaCl-lösning och överför till cellulosadialysslang med en 12-14 kDa molekylviktsavgränsning. Överför den fyllda dialysslangen till en hink med 5 L ultrarent vatten och dialysera HA-Tet mot vatten över natten.
    7. Nästa dag, ta bort vattnet och ersätt med 1 M NaCl-lösning i 30 min. Ta bort NaCl-lösningen och dialysera sedan mot ultrarent vatten i 3 dagar och byt ut vattnet dagligen.
    8. Filtrera den dialyserade produkten med 0,2 μm vakuumdrivet filter och överför sedan den filtrerade HA-Tet-produkten till 50 ml koniska rör.
    9. Flash-frys de koniska rören i flytande kväve i 10 minuter och ta sedan bort de koniska rören med pincett. Ta snabbt bort locket och täck med en vävnad av laboratoriekvalitet. Säkra vävnaden med ett gummiband och överför till en frystorkningsbehållare eller kammare och frystorka. Förvara den frystorkade produkten (figur 3F) vid -20 °C.
    10. Kvantifiera tetrazinmodifiering genom att lösa upp HA-Tet vid 10 mg / ml iD2Ooch analysera via proton NMR (figur 3G)16.
      1. För att bestämma mängden funktionalisering, kalibrera först D2O-lösningsmedelstoppen till 4,8 PPM. Integrera toppen för HA-metylprotonerna (δ2.05) och kalibrera integrationen till 3.0. Integrera sedan topparna för hängande tetrazingrupper vid δ8,5 (2H) och δ7,7 (2H) (aromatiska protoner). Normalisera integrationen av dessa toppar till motsvarande antal protoner för att bestämma den genomsnittliga graden av modifiering12.
  2. Sammankoppling av lyo-μgels för att bilda MAP-ställningar för karakterisering
    1. Förbered MAP-ställningskomponenterna (dvs. μgels, HA-Tet, rehydreringsvolym). Väg lyo-μgels (figur 4A) och rekonstituera i 84% av den slutliga MAP-volymen på 1x PBS. Låt mikrogelerna svälla i cirka 20 minuter (figur 4B,C). Wt% MAP som används för rehydrering kan väljas baserat på användarens preferens för slutlig partikelfraktion (se figur 4D, E).
    2. Lös upp HA-Tet i 1x PBS vid vald koncentration (se OBS nedan).
      OBS: Ändring av både förpackningsfraktionen (via wt% MAP) och koncentrationen av HA-Tet kommer att förändra bulkställningens mekaniska egenskaper. Till exempel genererar en 3,4 vikt% MAP-ställning tvärbunden med 0,02 mg / ml HA-Tet (glödgningsförhållande på 2,6 mol Tet: mol HA-NB) MAP-ställningar med cirka 700 Pa-skjuvlagringsmodul12.
    3. Använd en förskjutningspipett för att kombinera HA-Tet och lyo-μgels och blanda väl. Vid denna tidpunkt kan blandningen överföras via förskjutningspipett på glasskivor, brunnsplattor eller en behållare som användaren väljer. Låt μgels glödgas vid 37 °C i 25 minuter och använd sedan en spatel för att överföra MAP-ställningarna till brunnsplattor fyllda med 1x PBS. Förvara MAP-ställningar i 1x PBS tills de är redo för karakterisering.
  3. Beräkning av MAP-ställningens partikelfraktion
    1. För förbättrad bildkvalitet, överför MAP-ställningen till en glasöverdragsglas med en spatel. Bildkarta ställningar på ett konfokalmikroskop med lasern för FITC-excitation och emission. Bildkarta ställningar på ett 20x mål och få en Z-stack som passerar 250-300 μm i Z-riktning med en stegstorlek på 2,5 μm. Anteckna μm/pixelkalibreringen av bilden.
    2. Importera Z-stack-bilden till analysprogramvaran (se Materialförteckning). Välj knappen Lägg till nya ytor . Markera rutan för att segmentera endast en region av intresse och välj sedan den blå pilknappen Nästa: Intresseområde.
    3. Definiera en region av intresse och håll reda på X-, Y- och Z-dimensionerna för volymen som analyseras. Välj den blå pilknappen Nästa: Källkanal.
      OBS: X- och Y-dimensioner är i enheter av pixlar medan Z-dimensionen är antalet steg. En rekommenderad Z-höjd för intresseområdet bör innehålla minst två μgel.
    4. Använd listrutan Källkanal för att välja FITC-kanal. Markera rutan bredvid Släta och mata in en ytdetalj på 2,50 μm. Under Tröskelvärde väljer du Absolut intensitet och sedan den blå pilknappen Nästa: Tröskelvärde.
    5. Använd det föreslagna tröskelvärdet för FITC-kanalen. Rotera 3D-projektionen för att bedöma renderingskvaliteten och justera efter behov. Välj Nästa: Klassificera ytor.
      OBS: Tillbaka-knappen kan användas för att redigera tidigare steg i processen, till exempel Z-dimension, efter behov.
    6. Kontrollera om Antal Voxels är 10,0 och välj sedan den gröna dubbelpilknappen Slutför: Utför alla skapande steg och avsluta guiden.
      Volymåtergivningsparametrar kan lagras för batchanalys så att samma inställningar tillämpas för att analysera alla byggnadsställningar.
    7. Om du vill exportera data väljer du fliken Statistik och sedan fliken Detaljerad . Använd den andra listrutan för att välja variabeln Volym. Välj diskettknappen Exportera statistik på fliken Visa till fil och spara som en kalkylbladsfil (.xls) när du uppmanas till det.
    8. Öppna filen och använd SUM-funktionen på kolumn A-volym för att bestämma den totala volymen (μm3) för μgels i intresseområdet.
    9. Konvertera dimensionerna för det intressanta området som analyserades från pixlar till μm. Använd μm/pixel-kalibreringen av bilden från steg 4.3.1 för att konvertera X- och Y-dimensionerna. Multiplicera Z-dimensionen (antal steg) med stegstorleken för bilden för att konvertera Z-dimensionen till μm. Beräkna volymen för intresseområdet (μm3) genom att multiplicera X-, Y- och Z-dimensionerna.
    10. För att bestämma ställningens partikelfraktion, dela den totala volymen av μgelerna i intresseområdet (finns i steg 4.3.8) med volymen i intresseområdet (finns i steg 4.3.9).

Figure 3
Figur 3: Syntes av tetrazinlänkare för tillverkning av mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP). (A) Schematisk bild av HA-NB μgels som är sammankopplade med en tetrazinlänkare för att bilda MAP-ställningar. (B) Reaktionsschema för HA-Tet-syntes. (C) HA-Tet-reaktionen ställdes in och fick reagera över natten följt av (D) utfällning av HA-Tet i etanol. (E) När HA-Tet har renats och torkats rehydrerades och frystorkades för att ge (F) en torkad, ljusrosa produkt. (G) Proton NMR-analys visar framgångsrik modifiering av 11% av HA-upprepningsenheter. Omtryckt från Anderson et al.12 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Rehydrering av frystorkade mikrogeler för tillverkning av MAP-ställningar. (A) Maximal intensitetsprojektion av torkade lyo-μgels (skalstreck = 100 μm). (B) Efter frystorkning visar det sig att rehydrering av lyo-μgels tar cirka 20 minuter (skalstreck = 100 μm). (C) Lyo-μgels kan rehydreras med varierande viktprocent MAP för att producera fastnat μgels (skalstreck = 100 μm). (D) Att öka wt% MAP vid rehydrering av lyo-μgels förändrar partikelfraktionen i MAP-ställningar, vilket visas av enstaka Z-skivor av MAP-ställningar och volymprojektioner (skalstreck = 100 μm). (E) Med hjälp av dessa användardefinierade wt% MAP-ställningar kan unika partikelfraktioner uppnås (NL = icke-frystorkade μgeler). En enkelriktad ANOVA med Tukey HSD utfördes på proverna (n = 3), med signifikans rapporterad vid p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***) och p < 0,001 (****). Omtryckt från Anderson et al.12 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5.3D cellodling i kartställningar

  1. Förbered cellodlingsenheter
    1. Om du vill skapa en anpassad cellodlingsenhet för dessa experiment (bild 5A-C) använder du en 3D-skrivare för att skriva ut en negativ form med CAD-filen som finns i kompletterande kodningsfil 1.
      OBS: Cellodlingsanordningens mått är följande: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm med 2,6 mm total brunnshöjd. Diametern på de inre brunnarna och yttre brunnarna är 4 mm respektive 6 mm.
    2. Blanda polydimetylsiloxan (PDMS) elastomerbas med härdningsmedlet i förhållandet 10:1 i viktprocent. Häll PDMS-blandningen i en stor petriskål av plast och avgasa i en exsickator i cirka 30 minuter eller tills alla bubblor har försvunnit.
    3. När alla bubblor har försvunnit, placera försiktigt den 3D-tryckta formen i PDMS för att minimera bildandet av nya bubblor. Ställ in i ugnen vid 60 °C i minst 2 timmar för att härda PDMS.
    4. Använd en kniv eller rakblad för att försiktigt spåra runt odlingsanordningens parameter och ta sedan försiktigt bort formen. Använd en 4 mm biopsistans för att ta bort PDMS från botten av brunnarna. Skär enheterna så att de passar på en glaskåpa.
      OBS: Cellodlingsanordningar kan också bindas till glasskivor, men glasöverdrag förbättrar provavbildning.
    5. Använd tejp för att ta bort damm från undersidan av odlingsanordningarna. Placera de rena glasöverdragen och odlingsanordningarna (nedifrån och upp) på en värmeplatta vid 135 °C i minst 15 minuter för att avlägsna fukt.
    6. I en dragskåp, använd en koronaplasmapistol högt på både glaskåpan och undersidan av enheten i 30 s och bind sedan snabbt ihop de behandlade ytorna. Tryck försiktigt för att säkerställa en bra tätning mellan odlingsanordningen och glaskåpan.
    7. Upprepa steg 5.1.6 för alla enheter och placera sedan i en ugn på 60 °C över natten för att säkra bindningen. Autoklavera enheterna för att sterilisera före användning in vitro.
  2. Cellodling i MAP-ställningar
    1. Förbered MAP-ställningskomponenterna (dvs. μgels, HA-Tet, medievolym) baserat på önskad partikelfraktion (se figur 4D-E). Väg lyo-μgelerna i en steril huva och rekonstituera i 84 % av den slutliga MAP-volymen av cellmedier baserat på den valda wt% MAP. Låt μgelerna svälla i ca 20 min.
      OBS: Dessa metoder kräver att användaren väger lyo-microgel-produkten för rehydrering. För små massor (1 mg eller mindre) föreslås att man först väger kryoröret innan man tillsätter och frystorkar μgels och sedan väger om röret efter lyofilisering för att bestämma produktens massa för att minimera fel.
    2. Lös upp HA-Tet i cellmedia i 16% av den slutliga MAP-volymen.
      OBS: Följande steg för att förbereda celler för sådd i MAP-byggnadsställningar kan ändras beroende på vilken celltyp som används. I detta protokoll odlades D1-musmesenkymala celler i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 1% penicillin-streptomycin (pen-strep) och 10% fetalt bovint serum (FBS) (se materialtabell). Standardprotokoll för vidhäftande cellodling bör följas för dessa celler, med kulturerna bibehållna vid 37 °C och 5 %CO2 i vävnadsodlingsbehandlade odlingskärl.
    3. När D1-musmesenkymala celler har nått 70% -80% sammanflöde, aspirera mediet och tvätta cellerna med 1x PBS. Lyft cellerna genom att tillsätta tillräckligt med volym av 1% trypsin-EDTA för att täcka till ytan av vävnadsodlingskärlet. Inkubera vid 37 ° C i 1-3 minuter och släck sedan trypsiniseringen genom att tillsätta DMEM-media kompletterat med 1% pennstrep och 10% FBS vid 2x volymen trypsin-EDTA.
    4. Centrifugera cellsuspensionen vid 100 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna. Aspirera supernatantmediet och återsuspendera cellerna i 1 ml DMEM-media kompletterat med 1% pennstrep och 10% FBS.
    5. Se till att cellsuspensionen är väl blandad och överför sedan 20 μL till ett nytt mikrocentrifugrör. Tillsätt 20 μL trypanblå lösning och blanda väl. Använd 20 μL av denna blandning för att räkna cellerna med antingen en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare med cellräkningskammarglas.
    6. Överför antalet celler som behövs för sådd av 10 000 celler/μL MAP till ett nytt mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 100 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera cellerna. Aspirera försiktigt supernatantmediet från cellpelleten utan att aspirera cellerna.
    7. Tillsätt μgels och tvärbindare till cellpelleten med en förskjutningspipett. Blanda väl med en förskjutningspipett och frö sedan 10 μL av blandningen per brunn. Vid plätering, pipettera i en cirkulär rörelse för att jämnt fördela blandningen i brunnen.
    8. Låt μgelerna glödgas vid 37 °C i cellinkubatorn i 25 minuter innan du tillsätter cellmedia för att fylla brunnarna (~50 μL media per brunn). Håll 3D-kulturerna vid 37 °C och byt media efter behov. För att undvika att suga ställningen vid byte av media, stabilisera pipettspetsen längs åsen på den övre brunnen.
      OBS: När du tillsätter eller tar bort vätska från odlingsbrunnarna, vila pipettspetsens ände på avsatsen ovanför MAP-ställningen för att minimera risken för att störa eller aspirera ställningen från brunnen.
    9. Vid önskade tidpunkter, fixa prover genom att ta bort mediet och tillsätt 50 μL 4% paraformaldehyd per brunn i 30 minuter vid rumstemperatur. Tvätta proverna 3x med 50 μL 1x PBS eller önskad buffert. Vid denna punkt i protokollet kan standardmetoder för immunofluorescens eller fluorescensfärgning följas med användning av 50 μL per arbetsvolym.
      OBS: Dessa metoder för fixering och cellfärgning beskriver specifikt användningen av fluorescerande fläckar; Immunfärgning med primära och/eller sekundära antikroppskonjugationer kan dock utföras i dessa byggnadsställningar samt följa tillverkarens instruktioner med 50 μL som arbetsvolym per brunn.
    10. Avbilda celler i MAP-ställningar på ett konfokalmikroskop med ett 20x-mål och få en Z-stack som passerar 200-250 μm i Z-riktningen med en stegstorlek på 2,5 μm. Ett exempel på fluorescensfärgning med DAPI (kärnfläck utspädd 1: 1000 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) och falloidin-647 (F-aktinfläck utspädd 1:40 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) visas i figur 5E, F med fasta D1-celler odlade i MAP-byggnadsställningar i 3 dagar.
      OBS: Plasmabehandling av glasytor resulterar i ökad hydrofilicitet, vilket har visat sig förbättra celladhesionen. Celler kommer sannolikt att observeras sprida sig längs botten av cellodlingsbrunnarna men bör inte inkluderas i cellantal eller cellvolymkvantifiering för att bedöma cellrespons i MAP-byggnadsställningar.

Figure 5
Figur 5: Cellodling i MAP-ställningar. (A) Formen för att skapa cellodlingsbrunnar kan 3D-skrivas ut och gjutas med PDMS. Hela formen är 95 mm i diameter, de stora brunnarna är 6 mm i diameter och de små inre brunnarna är 4 mm i diameter. (B) När de har gjutits med PDMS är cellodlingsanordningarna plasmabundna till täckglas för förbättrad mikroskopikapacitet. (C) Tvärsnittet av en cellodlingsbrunn visar behållaren för cellmedia (~ 50 μL) och en mindre reservoar för sådd av MAP-ställning med celler (~ 10 μL). (D) Processen för sådd av celler i MAP-ställningar är först beroende av rehydrering av lyo-μgels vid användarens önskade wt%, följt av blandning med celler och tvärbindaren för att sammanlänka μgelerna. (E) Celler kan kapslas in i MAP-ställningar (gröna) med varierad vikt % MAP. Representativa bilder är från dag 5 av D1-cellodling i MAP-ställningar (skalstreck = 100 μm). (F) Enstaka Z-skivor visar skillnader i celltillväxt i byggnadsställningar som består av olika wt% MAP (skalstreck = 50 μm). Omtryckt från Anderson et al.12 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Syftet med detta protokoll är att demonstrera beredningen av mikroporösa glödgade partikelställningar (MAP) med ett bio-ortogonalt tvärbindningsschema samt kontrollerade partikelfraktioner för 3D-cellodling. Först modifierades HA med norbornenhängande grupper för att användas i både mikrogelbildning och sammankoppling för att bilda MAP-ställningar. Med hjälp av dessa metoder modifierades cirka 31 % av HA-repetitionsenheterna framgångsrikt med ett norbornenfunktionellt handtag (figur 1A). Mikrofluidiska anordningar med ett flödesfokuseringsområde (figur 1B) visade sig producera HA-NB μgels med antingen ~ 50 μm eller ~ 100 μm i diameter (figur 1C, D). De μgels som användes under resten av detta arbete hade en medeldiameter på 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) (Figur 1E).

För att kontrollera partikelfraktionen torkades μgeler via frystorkning (figur 2A-C) för att producera en produkt som kunde vägas av användaren och rehydreras för att uppnå svullna μgeler. Mediet för frystorkning av μgelerna optimerades för att förhindra kryogelbildning (dvs inre defekter) genom att använda 70% etanol, men det har också visats att kryoglar uppnåddes med hjälp av andra medier för lyofilisering om kryoglar önskas av användaren (Figur 2D). En omfattande studie av olika lyofiliseringsmedier för mikrogel cryogelbildning finns i arbetet av Anderson et al.12. Med hjälp av konfokalmikroskopi kvantifierades HA-NB-mikrogeldiametern både före och efter frystorkning med 70% etanol (figur 2E), vilket indikerade ingen signifikant förändring i mikrogelstorlek med denna torkningsprocess.

För att underlätta bio-ortogonal sammankoppling av HA-NB μgels syntetiserades en linjär HA-Tet-tvärbindare (figur 3). Proton NMR-spektroskopi visade framgångsrik modifiering av 11% av HA-upprepningsenheter med en tetrazinhänggrupp med hjälp av stegen som beskrivs i detta arbete (figur 3G), och reaktionsutbytet var 95%. Med hjälp av HA-Tet-länkaren rehydrerades den torkade lyo-mikrogelprodukten (figur 4A) med specificerade volymer för att uppnå olika wt% (w/v) formuleringar av μgeler (figur 4B,C) i MAP-ställningar som sträcker sig från 10 μL (4 mm diameter) till 50 μL (8 mm diameter) i storlek för cellodlingsexperiment respektive materialkarakterisering. Dessa användardefinierade viktprocent av μgels i MAP-ställningar motsvarade unika partikelfraktioner i ställningarna (figur 4D,E).

Detta protokoll detaljerade också processen för sådd av celler i MAP-ställningar för 3D-odling (figur 5D) med hjälp av bio-ortogonala glödgningsscheman. Lyo-μgelerna rehydrerades vid önskad viktprocent i cellmediet och blandades sedan med cellpelleten och HA-Tet för att sammanlänka μgelerna. Denna blandning pläterades sedan i cellodlingsanordningar (figur 5A-C) för att ge celler inkapslade i tomrummet mellan μgels i MAP-byggnadsställningar. Celler i 3D-odling i MAP-ställningar fixerades dag 5, färgades och avbildades på ett konfokalmikroskop som visas i figur 5E. Ett exempel på cellerna i tomrummet i MAP-ställningarna för olika wt% formuleringar visas i figur 5F.

Kompletterande kodningsfil 1: CAD-fil som används för att 3D-skriva ut formen för cellodlingsenheter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofluidisk produktion av HA-NB-mikrogeler har visat sig generera mikrogeler med ett smalare storleksintervall än emulsionsbatchproduktion 3,9. Mikrogelerna som beskrivs i detta protokoll formulerades med användning av en MMP-klyvbar tvärbindare (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) för att stödja materialnedbrytning. HA-NB-mikrogeler kan emellertid också tvärbindas med hjälp av en alternativ di-tiollänkare såsom ditiotreitol (DTT), som inte är nedbrytbar. På liknande sätt kan andra fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959 2-hydroxi-4-(2-hydroxietoxi)-2-metylpropiofenon, användas i HA-NB-föregångaren istället för LAP för att underlätta tiol-en tvärbindning10. Dessa mikrogeler bestod av 3,5 vikt% HA baserat på ett tidigare arbete som visade att viskositeten hos en 3,5 vikt% prekursorlösning var mottaglig för klämning i droppar på en mikrofluidisk plattform6. Andra har beskrivit HA-NB-mikrogeltillverkning på flödesfokuserande mikrofluidiska anordningar med användning av formuleringar med lägre viktprocent (3 wt% HA-NB) samt 8,10,11. Även om denna metod är fördelaktig för att producera mikrogelpopulationer med låg polydispersitet, är den mer tids- och arbetsintensiv än batchemulsionstekniker som också kan användas för HA-NB-mikrogelproduktion3.

Mikrogellyofiliseringsprocessen är beroende av frysning av tvärbundna polymernätverk. Defekter kan uppstå under frysning när kristallstrukturer i lyofiliseringsmediet bildas och fungerar som porogener, och de resulterande kryoglarna uppvisar förbättrad porositet och olika mekaniska egenskaper jämfört med det ursprungliga materialet19,20. Hittills har det beskrivits metoder för frystorkande mikrogeler som förhindrar kryogelbildning för polyetylenglykol (PEG)13, GelMa 14 och HA-formuleringar12 med olika medier för lyofilisering. För detta protokoll kan användaren byta 70% etanol med ett annat lyofiliseringsmedium som de väljer om kryogels önskas. Medan kryogels kan vara fördelaktiga för vissa applikationer, lyftes 70% etanol fram i detta protokoll som lyofiliseringsmediet eftersom det är ett vanligt laboratoriereagens, det innehåller fördelen med sterilisering i processen med MAP-tillverkning, och det gör att HA-mikrogelerna kan behålla sin ursprungliga storlek, form och styvhet samtidigt som de minimerar inre defekter när de har rehydrerats12 . Förutom dessa bedömningar av mikrogelegenskaper kan miljösvepelektronmikroskopi (SEM) implementeras som ett potentiellt verktyg för att bedöma mikrogelmorfologi före och efter frystorkning.

De metoder som beskrivs i detta arbete för torkning av HA-NB-mikrogeler introducerades för att kringgå variationen i partikelfraktionen och producera konsekventa MAP-ställningar med användardefinierade wt% -formuleringar. Studien av kontrollerad partikelfraktion vid olika viktprocent rehydrering var begränsad till studier av sfäriska mikrogeler. Andra mikrogelformer, såsom stavar8,21 eller oregelbundna former10,22, har inte undersökts för att bedöma förhållandet mellan wt% MAP och partikelfraktion. Partikelfraktion har utvärderats i MAP-ställningar med hjälp av konsekventa proportioner av rehydrerade lyo-mikrogeler (84%) och HA-Tet-tvärbindare (16%) baserat på en tidigare studie2; Dessa fraktioner kan dock ändras efter användarens gottfinnande så länge HA-Tet-volymen är tillräcklig för att lösa upp HA-Tet vid önskat tvärbindningsförhållande. Norbornen-tetrazinklickkemireaktionen har varit effektiv vid glödgning av mikrogeler för att bilda MAP-ställningar med hjälp av bifunktionella23, flerarm3, liksom den linjära12 tetrazinlänkaren som beskrivs i dessa metoder. Om så önskas kan det molära förhållandet mellan Tet: HA-NB varieras för att uppnå olika styvheter hos MAP-ställningarnai bulk 12. Dessa tekniker för rehydrerade lyo-mikrogeler har ännu inte utvärderats för andra glödgningskemier förutom tetrazin-norbornen.

3D-cellodling i MAP-ställningar har beskrivits tidigare med många celltyper, såsom endotelceller8, fibroblaster 1,3,4,24, neurala stamceller9 och mesenkymala stamceller 25,26. Återstående etanol observerades via proton NMR efter att HA-NB-mikrogeler frystorkades i 70% etanol; Det bekräftades dock också att spårmängderna etanol inte påverkade cellviabiliteten12. Odling i MAP-byggnadsställningar bestående av lyo-mikrogeler har hittills endast visats med mesenkymala stamceller från mus12; Detta protokoll för sådd av celler i MAP-ställningar med lyo-mikrogeler kan dock bytas ut mot andra celltyper och deras motsvarande cellmedier. För D1-cellodling har F-aktinintensiteten och den totala cellvolymen visat sig minska när wt% MAP ökar12. Det har också visats att en ökning av wt% MAP motsvarar en ökning av bulkställningens styvhet (inte lokal mikrogelstyvhet) eftersom tomrummet mellan mikrogeler blir mindre, vilket leder till mindre cellproliferation i MAP-ställningar med hög vikt12.

Detta arbete beskrev metoder för att producera HA-NB-mikrogeler på en mikrofluidisk plattform följt av frystorkning av mikrogelerna för att antingen behålla de ursprungliga mikrogelegenskaperna eller producera kryogel. Detta protokoll skisserade syntesen av en tetrazinlänkare som används för att länka lyo-mikrogelerna när de har rehydrerats med användardefinierade viktprocent för att skapa MAP-ställningar med kontrollerade partikelfraktioner. Slutligen detaljerade detta arbete stegen för odling av celler inom dessa MAP-ställningar med användardefinierade mikroarkitekturer. Att skapa granulära byggnadsställningar med konsekventa partikelfraktioner förbättrar reproducerbarheten av experimentella resultat för MAP-användare, som sträcker sig bortom cellsvar till masstransport och mekaniska egenskaper också12. MAP-ställningar som genereras med hjälp av dessa tekniker kan användas framåt för in vivo-applikationer . Användningen av en frystorkad produkt för granulär ställningstillverkning är fördelaktig för att förbättra materialets hållbarhet och kommer också att vara fördelaktigt för framtida översättning av MAP-ställningar till en klinisk miljö.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ARA och TS har lämnat in ett provisoriskt patent på denna teknik.

Acknowledgments

Författarna vill tacka National Institutes of Health, National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) och National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Detta arbete utfördes delvis vid Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), en medlem av North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), som stöds av National Science Foundation (prisnummer ECCS-2025064) som en del av National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Författarna vill tacka labbets tidigare post-doc Dr. Lucas Schirmer samt Ethan Nicklow för deras hjälp med att generera den 3D-tryckta enheten för cellodlingsexperiment.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

Tags

Bioengineering utgåva 188
Kontroll av partikelfraktion i mikroporösa glödgade partikelställningar för 3D-cellodling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter