Summary
O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da separação baseada em flotação para isolar, ativar e expandir células T humanas primárias.
Abstract
O processo de isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para estabelecer culturas ex vivo é crucial para pesquisa, testes clínicos e terapias baseadas em células. Neste estudo, um protocolo simples e novo para isolar, ativar e expandir células T de PBMCs ex vivo é apresentado. Este estudo utiliza a tecnologia funcionalizada de classificação celular ativada por flutuabilidade (BACS) para isolar e ativar células T. Resumidamente, o protocolo envolve a seleção positiva de células CD3+ de PBMCs derivados de leucopacos, seguida por uma co-estimulação de 48 horas com microbolhas de estreptavidina pré-conjugadas anti-CD28 (SAMBs) antes da transdução em placas de 24 poços. As microbolhas funcionalizadas oferecem uma oportunidade única de ativar células de forma flutuante, levando a fenótipos proliferativos que permitem a expansão com o mínimo de exaustão. Esta técnica oferece exaustão reduzida, pois as microbolhas co-estimulatórias permanecem flutuantes e retornam ao topo do meio de cultura, reduzindo assim a quantidade de tempo que as células em expansão estão em contato com os fatores co-estimulatórios. Os resultados indicam que as células T isoladas e cultivadas recebem estimulação suficiente para ativar e proliferar, mas não a um ponto que leva à superativação, o que leva à exaustão, como demonstrado pela presença de PD-1 excessiva.
Introduction
Mais de 500 ensaios clínicos de terapia celular T com receptor de antígeno quimérico (CAR)-T estão sendo conduzidos em todo o mundo, e quatro produtos de terapia celular CAR-T estão disponíveis no mercado1. No entanto, ainda existem inúmeras necessidades de pesquisa e fabricação de células CAR-T que devem ser abordadas para melhorar a eficácia, a escalabilidade e o sucesso a longo prazo dessas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. A pesquisa e fabricação clínica adotiva de células CAR-T começa com o isolamento de células T de uma amostra de sangue periférico e a subsequente estimulação, transdução e expansão das células isoladas. Parâmetros como recuperação de células T, pureza e sinais de ativação/exaustão requerem consideração cuidadosa ao escolher as técnicas de isolamento e estimulação celular para pesquisa e fabricação de células CAR-T 3,4,6. É importante ressaltar que a melhora na persistência terapêutica das terapias com células CAR-T, minimizando os impedimentos biológicos decorrentes dos atuais processos de fabricação, como a exaustão das células T, é necessária para aumentar a eficácia terapêutica 6,7.
Como alternativa aos métodos tradicionais de isolamento celular, como a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS), aqui é demonstrada a classificação de células ativadas por flutuabilidade (BACS) com microbolhas para isolamento de células T. A separação de microbolhas utiliza microesferas flutuantes e ocas (microbolhas) para ligar os alvos e flutuá-los na superfície de amostras de fluidos 8,9. Ao funcionalizar microbolhas com anticorpos (ou seja, anti-CD3), as populações de células T desejadas podem ser selecionadas positivamente a partir de amostras de sangue periférico. Posteriormente, o uso de uma população diferente de microbolhas funcionalizadas por anticorpos (ou seja, anti-CD28) para co-estimular e ativar células T positivamente selecionadas em suspensão é demonstrado neste trabalho. As microbolhas oferecem um fluxo de trabalho de isolamento e ativação simples e altamente ajustável que gera células T prontas para cultura de células suspensas e aplicações a jusante, como modificação genética e expansão. Criticamente, a ativação celular flutuante com microbolhas promove estimulação celular contida para evitar a exaustão excessiva das células T7.
Para este estudo, a citometria de fluxo foi a principal ferramenta utilizada para analisar o sucesso de isolamento, ativação e transdução das microbolhas funcionalizadas, bem como para fornecer informações detalhadas sobre as subpopulações específicas presentes durante as fases de crescimento e expansão pós-transdução. Além da citometria de fluxo, a microscopia de campo brilhante e fluorescência foi usada para confirmar a saúde celular, morfologia e sucesso da transdução. Com base nesses resultados, a tecnologia e o protocolo de microbolhas fornecem uma alternativa mais ajustável e mais suave aos métodos tradicionais de isolamento e ativação atualmente em uso atualmente; em particular, as células ativadas por microbolhas apresentam uma expressão notavelmente menor de marcadores de exaustão de células T do que a normalmente observada com ferramentas e kits padrão da indústria.
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Protocol
1. Isolamento de células T com microbolhas usando seleção positiva
NOTA: Este protocolo detalha uma abordagem de seleção positiva CD3+ em pequena escala usando SAMBs.
- Incubar 3 x 108 PBMCs obtidos comercialmente em 2,5 mL de tampão de separação com anticorpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a uma concentração de 25 ng de anticorpo por 1 milhão de células (25 ng/M). Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e incube à temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Adicione microbolhas de estreptavidina (SAMBs) a uma proporção de 0,5 (quantidade de SAMB):1 (quantidade de célula) de acordo com a concentração de SAMB relatada pelo fabricante.
- Misture usando um rotador comercial de ponta a ponta (EOE) a 20 rpm por 10-15 min à temperatura ambiente. Centrífuga durante 5 min a 400 x g à temperatura ambiente.
- Após a centrifugação, as células selecionadas positivamente estarão no topo da suspensão com os SAMBs. As células restantes não selecionadas estarão na pelota de célula na parte inferior do tubo. Usando uma pipeta de vidro 9, insira a ponta abaixo da camada de células de bolha no fundo do tubo, aspirar a pastilha de célula e o sobrenadante com uma pipeta eletrônica e transferi-los para um novo tubo.
2. Co-estimulação (ativação) das células T positivamente selecionadas
- Ressuspeite a camada de células de bolhas remanescente no tubo original em 1 mL de meio de célula T completo (ou outro meio desejado).
- Conte as células no subnadante com microscopia de campo brilhante usando um contador de células automatizado e subtraia esse valor do número de células iniciais para determinar o número de células capturadas na camada de células de bolha.
- Antes desta etapa, misture o anticorpo anti-CD28 biotinilado com SAMBs comerciais por um período mínimo de 2 h para criar os SAMBs anti-CD28 conjugados. Entre em contato com o fabricante do SAMB para determinar a quantidade de anticorpos anti-CD28 necessária para a conjugação. Adicione os SAMBs conjugados anti-CD28 à suspensão de células de bolhas resultante da etapa 2.1 usando uma proporção de 1,5 (SAMBs anti-CD28):1 (células).
- Misture usando a rotação EOE por 15 min e, em seguida, ajuste o volume total para 2 milhões de células por mL com meio de célula T completo ou outro meio desejado de acordo com o número de células obtido na etapa 2.2.
3. Expansão das células coestimuladas em meio de cultura celular
- Distribuir 1 mL de células ativadas a partir da etapa 2.4 a uma concentração de 2 M/mL por poço em uma placa de 24 poços. Incubar em incubadora de CO2 a 5% umidificado a 37 °C.
- Após 24 h, adicionar 50 U/mL de IL-2 e 25 ng/M de anti-CD3 solúvel (OKT3) para incentivar ainda mais a expansão, conforme calculado usando o número inicial de células banhadas no dia 0. Colocar a placa celular de volta na incubadora de CO2 humidificada e deixar incubar durante a noite a 37 °C.
4. Opcional: Transdução de células T ativadas com lentivírus
NOTA: A abordagem aqui utilizada é adaptada de Prommersberger et al. 10.
- Descongele o lentivírus à temperatura ambiente e misture brevemente por pipetagem.
- Remova suavemente o nadante médio, 600 μL de cada poço, sem tocar nas células filhas que estão agora no fundo do poço ou na camada de bolhas que permaneceu na superfície da solução.
- Adicione 5 μg/mL de brometo de hexadimetrina por poço para melhorar a transdução viral. Adicione as partículas lentivirais a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 (partículas lentivirais por célula).
- Centrifugar a placa durante 45 minutos a 800 x g e 32 °C utilizando aceleração lenta e sem quebra para desaceleração. Incubar as células durante 4 h numa incubadora de CO2 humidificada a 37 °C.
- Após 4 h, adicionar 600 μL de meio de células T completo fresco e comercialmente disponível e 50 U/mL de IL-2 a cada poço e colocar a placa celular de volta na incubadora de CO2 umidificada a 37 °C para expansão de células T.
5. Expansão das células T (com ou sem transdução prévia)
- A cada 2 dias, remova metade do meio do nadante médio, substitua-o por um meio de células T fresco e completo e adicione IL-2 a uma concentração de 50 U/mL.
- Conte as células T duas vezes por semana para avaliar a densidade celular. Quando a densidade celular exceder 2 x 10 6-2,5 x 106 células/mL, transfira as células para um vaso maior, diluindo-as para 5 x 105 células/mL.
6. Colheita das células T e citometria de fluxo
- Misture suavemente o conteúdo de cada poço pipetando para cima e para baixo. Remova todo o conteúdo do poço, incluindo as microbolhas, e transfira-as para um tubo de 1,5 mL.
- Lave cada poço com 400 μL de DPBS (−/−) sem cálcio e magnésio e transfira a solução para um tubo de 1,5 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 50 μL de tampão de separação.
- Manchar com um coquetel de anticorpos de ativação e exaustão/coloração e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. Prepare os coquetéis de coloração da seguinte forma: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; coquetel de exaustão: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Adicione 1 mL de tampão de separação e misture suavemente. Centrífuga a 400 x g durante 5 min à temperatura ambiente para lavar o excesso de anticorpos. Aspirar o sobrenadante completamente.
- Ressuspeite a pastilha celular em 1 mL de tampão de separação e transfira para um vaso apropriado (por exemplo, um tubo FACS, uma placa de 96 poços, etc.) para a análise de citometria de fluxo. O esquema de análise de citometria de fluxo recomendado está detalhado na Figura 1.
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Representative Results
As células T foram isoladas de PBMCs compradas e plaqueadas para ativação, conforme descrito no protocolo. As amostras de controle negativo (PBMCs comprados) não foram ativadas. Essas amostras de controle foram incluídas para demonstrar o efeito que o processo de ativação de microbolhas teve sobre as amostras experimentais em comparação com os controles de células T intocadas e não estimuladas, garantindo que os marcadores de ativação observados fossem o resultado dos fatores de ativação adicionados e não fossem inerentes às próprias células T. De acordo com o esboço experimental da Figura 2, as células foram semeadas a 2 x 106 células/mL em meio de células T e foram intocadas/não estimuladas ou coestimuladas com SAMBs anti-CD3 (clone OKT3) e anti-CD28 (clone 28.2). Após 48 h de estimulação em cultura, as células foram transduzidas com a partícula lentiviral codificadora para zsGreen. Aos 4 dias e 6 dias após a transdução, as células foram fotografadas, colhidas e coradas superficialmente usando AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (ou PE-CD69, dependendo se os painéis de exaustão ou ativação foram usados, respectivamente) e 7-AAD. O transgene zsGreen foi detectável no canal FITC. A abordagem de bloqueio da citometria de fluxo é detalhada na Figura 1. Aumentos no número viável de células T e células T transgênicas positivas foram observados entre a amostra controle e as células que receberam coestimulação de microbolhas (Figura 3). Populações de células efetoras aumentadas também foram observadas nas amostras de microbolhas (Figura 4). Células T expressando aumento dos marcadores de ativação e exaustão foram observadas entre as amostras celulares que receberam coestimulação de microbolhas (Figura 5 e Figura 6). A expansão celular foi observada entre os momentos do dia 4 e do dia 6 das amostras coestimuladas, indicando que as células estavam ativas, proliferativas e transmitindo o transgene à medida que se expandiam.
Figura 1: Exemplo de esquema de bloqueio intocado/amostra de controle negativo. A partir dos singletos, as células da população foram fechadas em seguida usando SSC-A/FSC-A. As células CD3+ totais foram retiradas, seguidas de um gating CD3+ viável usando 7-AAD para determinar a viabilidade da população. Todas as populações e cálculos subsequentes foram determinados a partir da população viável 7-AAD(−)/CD3+(+), como mostrado usando as setas indicando as portas da subpopulação. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral da linha do tempo experimental. Os dias do protocolo são mencionados acima, e os dias correspondentes pós-transdução (D0-D6) são usados nas figuras abaixo. As células foram plaqueadas imediatamente após a seleção e ativação. Os poços controle foram gerados por meio de um protocolo de seleção negativa de microbolhas. As células T de controle não receberam agentes de co-estimulação e não foram submetidas a transdução, embora tenham recebido IL-2 para garantir que as células fossem mantidas saudáveis o suficiente para manter uma viabilidade razoável durante todo o experimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação de células viáveis e transduzidas com sucesso pós-transdução . (A) Células CD3+ viáveis 4 dias e 6 dias após a transdução. A viabilidade foi determinada por meio de análise de citometria de fluxo, na qual a população foi quantificada por gating em células 7-AAD(−)/CD3+(+). (B) O número de células transduzidas com sucesso com rLV.EF1.zsGreen foi determinado através de citometria de fluxo, na qual a população viável de 7-AAD(−)/CD3+(+) foi ainda mais transformada em células zsGreen(+). Todas as condições foram realizadas em triplicado (n = 3). Os dados representam a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Células T CD4+ e CD8+ viáveis. As subpopulações de células T CD4+ e CD8+ foram quantificadas por meio de gating na população CD3+ viável (CD3+ [+]/7-AAD[−]) e medindo-se a expressão de (A) CD4+ e (B) CD8+. Todas as condições foram realizadas em triplicado (n = 3). Os dados representam a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Células T ativadas viáveis. A população CD3+ viável também foi analisada para marcadores de ativação específicos, conforme denotado nas figuras acima. (A) CD69 é um marcador precoce de ativação; (B) CD25 é um marcador de ativação do meio para o final. As porcentagens acima das barras de erro representam a porcentagem de células CD3+ viáveis que expressam o respectivo marcador. Todas as condições foram realizadas em triplicado (n = 3). Os dados representam a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Células T exaustas. A população CD3+ viável também foi analisada quanto aos marcadores de exaustão (PD-1). (A) O número total de células 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+) no dia 4 e no dia 6 pós-transdução. (B) A porcentagem de células PD-1+. No dia 4 e no dia 6, a população de amostra ativada/transduzida tinha ~25% de células CD3+/PD-1+ viáveis, enquanto a população de amostra controle tinha ~2% de células CD3+/PD-1+ viáveis. Digno de nota, o material inicial/isolado apresentou <~15% de células CD3+/PD-1+ viáveis (dados pós-isolamento/pré-cultura não mostrados). Todas as condições foram realizadas em triplicado (n = 3). Os dados representam a média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito permite o isolamento de células T de amostras de PBMC e a ativação de células T suspensas em meios de cultura com microbolhas. Este método baseia-se em microbolhas funcionalizadas cuja flutuabilidade inerente oferece uma oportunidade única de introduzir sinais co-estimulatórios nas células e ativá-los enquanto estão suspensos em um meio de cultura, reduzindo assim a exposição das células em expansão à estimulação prolongada; essa superestimulação pode resultar no aumento da expressão dos marcadores de exaustão das células T e na redução da eficácia terapêutica11. As células T estimuladas que estão flutuando ligadas a microbolhas funcionalizadas produzem células filhas intocadas que caem para o fundo da placa de cultura celular para expansão, permitindo um período de crescimento longe dos fatores de estimulação flutuantes. Tem sido detalhado na literatura como a exposição prolongada de células T isoladas a fatores de estimulação - como protocolos baseados em esferas magnéticas12 - pode impactar negativamente a expansão e a eficácia terapêutica 6,7,11.
Como este protocolo relatado depende da seleção positiva de células CD3 + , é fundamental remover o subnadante abaixo da camada de células de bolha com cuidado, mas completamente, durante a fase de isolamento deste protocolo. Isso garante que apenas a população de células T selecionada positivamente seja ainda mais estimulada e chapeada. Este também é um passo importante para determinar o número de células selecionadas da amostra PBMC inicial, o que é necessário para cálculos precisos de co-estimulação e chapeamento.
Essas atividades de desenvolvimento de protocolo de microbolhas para ativação e expansão de células T alavancaram uma ampla gama de marcadores durante a análise de citometria de fluxo, permitindo a caracterização completa da população de células T isoladas e estimuladas para avaliar parâmetros críticos de células T, incluindo ativação, exaustão e expansão clonal. Quando comparado com as tecnologias de isolamento e estimulação de células T comumente usadas, como protocolos baseados em contas magnéticas, este protocolo de microbolhas visa minimizar a superestimulação das células sem sacrificar a expansão e as habilidades de função efetora correspondentes das células T isoladas. Aplicações futuras desta técnica de microbolhas incluirão vários protocolos para seleção positiva de células T, co-estimulação e culturas subsequentes de células de microbolhas para atender a uma variedade de necessidades de fluxo de trabalho para comunidades de pesquisa e fabricação de terapia celular.
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Disclosures
Todos os autores, no momento da submissão, são funcionários da Akadeum Life Sciences, que fabrica e vende produtos de separação de microbolhas.
Acknowledgments
Nenhum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
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