Summary
Dette papir beskriver en immunpanoreringsprotokol for voksne musedorsalrodsganglier. Ved at klæbe antistoffer til dyrkningsplader kan vi negativt vælge og fjerne ikke-neuronale celler. Vi viser, at kulturerne er beriget for neuroner ved hjælp af denne protokol, hvilket giver mulighed for en dybdegående undersøgelse af neuronale reaktioner på manipulation.
Abstract
Dorsalrodsganglier (DRG'er) er perifere strukturer ved siden af rygmarvens dorsale horn, som huser cellelegemerne i sensoriske neuroner såvel som forskellige andre celletyper. Offentliggjorte kulturprotokoller henviser ofte til hele dissocierede DRG-kulturer som neuronale på trods af tilstedeværelsen af fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og lymfocytter. Mens hele disse DRG-kulturer er tilstrækkelige til billeddannelsesapplikationer, hvor neuroner kan skelnes baseret på morfologi eller farvning, er protein- eller RNA-homogenater indsamlet fra disse kulturer ikke primært neuronal oprindelse. Her beskriver vi en immunpanoreringssekvens for dyrkede muse-DRG'er. Målet med denne metode er at berige DRG-kulturer for neuroner ved at fjerne andre celletyper. Immunopanning refererer til en metode til fjernelse af celletyper ved at klæbe antistoffer til cellekulturskåle. Ved hjælp af disse retter kan vi negativt vælge imod og reducere antallet af fibroblaster, immunceller og Schwann-celler i kultur. Denne metode giver os mulighed for at øge procentdelen af neuroner i kulturer.
Introduction
Dorsalrodsganglier (DRG'er) huser cellelegemerne i de sensoriske neuroner, som inderverer perifert væv. At studere disse neuroner giver os mulighed for at forstå det mekanistiske grundlag for smerte og sensoriske tilstande. DRG'er består imidlertid ikke af neuroner alene, men indeholder også fibroblaster, Schwann-celler, makrofager og andre immunceller1. På trods af tilstedeværelsen af disse forskellige celletyper omtales hele DRG-kulturer ofte i litteraturen som neuronal 2,3. Disse kulturer er stadig nyttige til neuronal undersøgelse ved billeddannelse eller flowcytometri, hvilket ville muliggøre neuronal identifikation ved farvning, cellestørrelse og / eller morfologi. For assays såsom polymerasekædereaktion (PCR) eller western blotting, hvor kulturer homogeniseres til RNA- eller proteinindsamling, kan tilstedeværelsen af ikke-neuronale celletyper imidlertid interferere med resultaterne. Derfor er der behov for at øge andelen af neuronale celler i DRG-kulturer.
Immunopanning er en teknik, der bruges til at rense en række celletyper, herunder kortikale neuroner, astrocytter, oligodendrocytprecursorceller og mikroglia. Med enkle ord involverer det at klæbe et antistof mod en celleoverflademarkør til en petriskål, beregnet til at binde visse celler (figur 1), og det kan bruges til at vælge enten for eller imod celletyper af interesse 4,5,6. Immunopanning rotte embryonale DRG'er til at vælge mod ikke-neuronale celler er tidligere blevet beskrevet af Zuchero7. Vi har dog ikke været i stand til at finde en immunpanoreringsprotokol, der er specifik for DRG'er til mus. I denne protokol bygger vi videre på Zuchero-protokollens grundlæggende lejere, men tilpassede i stedet immunpanoreringssekvensen for at berige DRG-kulturer med voksne mus (figur 2). Dette er et kraftfuldt værktøj til at studere etablerede sensoriske neuroner i kultur. Det er fordelagtigt, da det giver mulighed for brug af voksne mus fra genetiske, sygdoms- og skademodeller, så deres sensoriske neuroner kan studeres med større specificitet.
Denne protokol er fordelagtig for læsere, der ønsker at øge andelen af neuroner i DRG-kulturer med voksne mus. Imidlertid kan immunpanningstrinnene også udelades, og denne protokol kan også bruges til hele DRG-kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse fra University of Alberta Health Sciences Animal Care and Use Committee (protokol 0000274).
1. Fremstilling af reagens
- For dag 1 skal du forberede følgende reagenser: vand af cellekulturkvalitet; poly-D-lysin-Forbered en stamme ved at rekonstituere hele flasken i 50 ml vand af dyrkningskvalitet til en stamkoncentration på 100 μg/ml, opbevar ved 4 °C, og fortynd stammen 1:10 i vand af dyrkningskvalitet til en slutkoncentration på 10 μg/ml tris-HCl-Forbered en stamme ved at opløse pulveriseret trishydrochlorid i vand af dyrkningskvalitet til en stamkoncentration på 500 mM (3,94 g i 50 ml), pH 9,5, filtersterilisere (0,22 μm), opbevare ved 4 °C og fortynde stammen 1:10 i vand af dyrkningskvalitet til en slutkoncentration på 50 mM; sekundære antistoffer (ged anti-rotte, -kanin og -mus).
- For dag 2 skal du forberede følgende reagenser.
- Forbered cellekulturklasse Ca 2+, Mg2+-fri Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS; HBSS-/-) og cellekulturkvalitet D-phosphatbufret saltvand (PBS) med Ca 2+ og Mg2+. Der fremstilles en alikvote af lamininbestand, som opbevares ved -80 °C umiddelbart efter modtagelsen. stammen i steril HBSS-/- fortyndes til en slutkoncentration på 10 μg/ml for arbejdsmateriale.
- Forbered 4% bovin serumalbumin (BSA) lager ved at opløse 400 mg BSA i 7,5 ml D-PBS (pH 7,4), bring volumen til 10 ml, filtrer steriliser (0,22 μm), alikvote og opbevar ved -20 °C. Forbered 0,2% BSA ved at fortynde 750 μL 4% BSA i 14,25 ml D-PBS.
- Forbered 0,4% DNAse-bouillon ved at tilsætte 1 ml Earles afbalancerede saltopløsning (EBSS) pr. 12.500 enheder DNAse, filtrer steriliser (0,22 μm), alikvote og opbevar ved -20 °C. Forbered panoreringsbuffer (0,02 % BSA) ved at tilsætte 3 ml 0,2 % BSA og 100 μL 0,4 % DNAse i 27 ml D-PBS. Forbered primære antistoffer (CD45, PDGRFβ, O4).
BEMÆRK: Denne protokol bruger et O4-hybridom 8,9, men 10 μg af et kommercielt tilgængeligt O4-antistof ville også være passende. - Kombinationskollagenasestammen fremstilles ved at opløse en flaske kombinationskollagenase (50 mg) i 5 ml HBSS-/-, alikvote, og opbevares ved -20 °C. Forbered et arbejdsmateriale pr. to mus ved at tilsætte 500 μL opvarmet kombinationskollagenase og 50 μL opvarmet 0,4% DNase til 4,5 ml HBSS-/-.
- Forbered lav ovomucoid ved at tilsætte 3 g BSA til 150 ml D-PBS, tilsæt derefter 3 g trypsinhæmmer og bland for at opløse. Juster pH-værdien til 7,4, og bring lydstyrken op på 200 ml med D-PBS. Filtrer steriliser, tilbered 1 ml alikvoter og opbevar ved -20 °C. På dissektionsdagen kombineres 1 ml lavt ovomucoid i 9 ml D-PBS til arbejdsløsningen.
- Der fremstilles 15 % BSA ved opløsning af 7,5 g BSA i 50 ml HBSS-/- (anbringes på en ryster for at opløses helt), filtreresitføres sterilisator, og opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 50 ml neuronmedier ved tilsætning af 23,2 ml DMEM, 23,2 ml neurobasalt medium, 500 μL glutamax, 500 μL natriumpyruvat, 500 μL penicillin/streptomycin (alikvote umiddelbart efter ankomsten og opbevares ved -20 °C), 500 μL insulin (5 μg/ml endelig udg.), 500 μL SATO, 50 μL N-acetyl-L-cystein (NAC; 5 μg/ml endelig), og 1.000 μL B27+ (straks alikvote og opbevares ved -20 °C ved modtagelse).
- Forbered insulinstammen ved at opløse vand i dyrkningskvalitet til en koncentration på 0,5 mg/ml (50 mg i 100 ml), juster pH-værdien til 7,4, filtrer steriliser (0,22 μm), tilbered 500 μL alikvoter og opbevar ved -20 °C.
- Forbered SATO-stammen ved at kombinere 20 μL progesteron (2,5 mg i 100 μL ethanol), 800 μL natriumselenit (4 mg i 10 ml neurobasalmedier + 10 μL 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg transferrin, 128 mg putrescinedihydrochlorid og 80 ml neurobasal. Der filtreresiver (0,22 μm), fremstilles 500 μL alikvoter, og der opbevares ved -20 °C. Det er vigtigt at lave friske progesteron- og natriumselenitopløsninger.
- Der fremstilles 50 μL N-acetyl-L-cystein (NAC) ved opløsning i neurobasalt medium til en stamkoncentration på 5 mg/ml (50 mg i 10 ml), filtersteriliseres (0,22 μm), alikvote, og opbevares ved -20 °C.
- For dag 4 og 5 fremstilles følgende reagenser.
- Der fremstilles 0,2 M fosfatbuffer (PB) ved at opløse 21,8 g natriumphosphatdibasisk (Na2HPO4) og 8,34 g monobasisk natriumphosphatdihydrat (NaH2PO4) i 1.000ml vand. Juster pH-værdien til 7,4 og opbevar den ved stuetemperatur.
- Der fremstilles 8 % paraformaldehyd (PFA) på følgende måde: 50 ml vand opvarmes i en damphætte til 55 °C, der slukkes for varmen, og der tilsættes 8 g PFA-piller under konstant omrøring. Der tilsættes dråbevis 1 N NaOH, indtil opløsningen begynder at blive klar, derefter tilsættes 40 ml 0,2 M PB, og omrøringen fortsættes, indtil den er klar. Afkøl opløsningen til stuetemperatur, juster pH til 7,4, og bring lydstyrken op til 100 ml med 0,2 M PB. Filtrer og opbevar ved 4 °C i op til 2 uger.
- Forbered D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) ved at tilføje 0,2% Triton X-100 i dyrkningsklasse D-PBS (1 ml Triton + 500 ml D-PBS). Opbevares ved 4 °C. Forbered blokeringsopløsning, som er 1% normalt æselserum (NDS) i PBSTX. På forhånd kan 1 ml NDS + 9 ml PBSTX fremstilles og opbevares ved -20 °C i 10 ml alikvoter.
- Forbered antistofopløsning, som er 0,2% NDS / 0,2% BSA i PBS TX: 200 μL NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBSTX; kan tilberedes på forhånd og opbevares ved -20 °C i 10 ml alikvoter.
2. Opsætning af udstyr
- Opsæt følgende udstyr: steril cellekultur biosikkerhedsskab, mikropipettesæt, serologiske pipetter og pipettepistol, 10 cm petriskåle, ønskede cellekulturskåle til plettering (her blev 24-brønds sorte glasbundplader brugt til billeddannelse), 15 ml og 50 ml koniske rør, dissektionsværktøjer (nemlig: fin fjedersaks til laminektomi og nervetrimning, fine tang, og et barberblad), vandbad indstillet til 37 °C, 70 μm cellesi, centrifuge (10 min ved 300 x g) med adaptere til 15 ml koniske rør, trypanblåt og hæmocytometer, stinkhætte og magnetisk omrøringsvarmeplade.
3. Eksperimentel metode
- Dag 1: tilberedning af retter
- I et biosikkerhedsskab skal du belægge den ønskede kulturoverflade med nok poly-D-lysin til at dække bunden af brønden. Opbevares natten over ved 4 °C. Her blev der anvendt 24-brønds glasbundsplader til billeddannelse, og dermed blev der anvendt 300 μL poly-D-lysin.
- Forbered panoreringsskålene i et biosikkerhedsskab: til CD45-skålen tilsættes 10 ml arbejdstris-HCI-opløsning og 30 μL gedanti-rotte IgG til en 10 cm petriskål; til PDGFRβ-skålen tilsættes 10 ml arbejdstris-HCI-opløsning og 30 μL gedantikanin IgG til en 10 cm petriskål; til O4-hybridomskålen tilsættes 10 ml arbejdstris-HCl-opløsning og 30 μL gede-anti-mus IgG til en 10 cm petriskål. Sørg for, at opløsningen dækker hele opvaskeområdet og lad den stå ved 4 °C natten over.
- Dag 2: dissektion, trituration og immunpanorering
- Opsug poly-D-lysin, vask pladerne tre gange med vævskulturvand, vip låget åbent, og lad overfladen tørre helt i et biosikkerhedsskab. Påfør nok laminin på pladerne til at dække bunden af hvert hul, og læg det i en inkubator ved 37 °C. For pladerne med 24 brønde er 200 μL tilstrækkelig.
- Afslut forberedelsen af panoreringsskålene. Hver skål vaskes med D-PBS og inkuberes med 10 μg primært antistof. Lad det sidde ved stuetemperatur i mindst 2 timer.
- Til CD45-skålen tilsættes 5 ml 0,2% BSA og 20 μL CD45 primær; til PDGFRβ-skålen tilsættes 5 ml 0,2% BSA og 15,4 μL PDGFRβ; til O4-skålen tilsættes 3 ml 0,2% BSA, 2 ml O4-hybridom og yderligere 100 μL 4% BSA (for at sikre, at den endelige BSA-koncentration forbliver på 0,2%).
- Afliv en til fire mus med 0,1 ml/kg natriumpentobarbitol (pr. 10 cm immunpanoreringsskål). Vi brugte C57BL/6-mus, da de var 8-10 uger gamle. Begge køn blev brugt og dyrket adskilt fra hinanden. Perfus dyret med 30 ml koldt 0,9% saltvand.
- Fastgør for- og bagpoterne til et styrofoam-trin, og brug et rent barberblad til at udsætte rygsøjlen bagfra. Udfør en laminektomi ved at lave snit cirka halvvejs dybt på hver side af rygsøjlen, fjerne den dorsale halvdel af søjlen for at udsætte rygmarven. Skær forsigtigt nerverne og fjern rygmarven, eller skub forsigtigt ledningen til siden og oprethold nerveintegriteten.
- Brug rygmarvsnerverødderne (enten afskåret eller fastgjort til rygmarven) til at finde og fjerne alle DRG'erne fra begge sider af rygsøjlen. Trim nerveresterne fra hver DRG, når den fjernes (mere nerveaffald i kulturen kan føre til dårlig kulturoverlevelse). DRG'erne samles i 15 ml HBSS-/- i et 15 ml konisk rør på is.
BEMÆRK: Bemærk, at vævet dissekeres i fri luft, men når DRG'erne er tilsat røret, skal de behandles som sterile og kun manipuleres i et biosikkerhedsskab. - Anbring frosne lagre af stemxyme 1 og 0,4% DNAse i et vandbad, ca. 30 min før dissektionernes afslutning (ca. når du starter den sidste mus). Lad dem slå sig ned i bunden af det koniske rør, og fortsæt derefter protokollen i et biosikkerhedsskab.
- Opsug det meste af HBSS-/- fra DRG'erne. Brug en pipette i stedet for at suge for at få <1 ml væske, og lad ~ 100 μL væske stå for ikke at risikere at miste væv.
- Vask tre gange med 1 ml HBSS-/-. Tilsæt 5 ml arbejdsstemxymeopløsning til vævet. Låget dækkes med en gennemsigtig film, og røret flyder på siden i et vandbad, der er indstillet til 37 °C, i 1 time.
- Efter inkubation i enzymet tilsættes 1 ml lavovo-hæmmeropløsning til røret. Triturer cellerne forsigtigt med en p1000 pipette 10-15 gange. Lad vævsstykkerne sætte sig.
- Overfør de øverste 2-3 ml opløsning (indeholdende dissocierede celler) til frisk lav ovomucoid opløsning. Gentag indtil vævet er helt dissocieret, og der ikke er synlige bidder tilbage.
- Centrifuger i 10 min ved 300 x g ved stuetemperatur. Sifonen af supernatanten igen ved hjælp af en pipette i stedet for sugning i de sidste 1 ml, så ~100 μL efterlades, og cellepelleten resuspenderes i 1 ml panoreringsbuffer.
- Pipette forsigtigt for at blande. Forvåd en 70 μm cellesi med 1 ml panoreringsbuffer over et 50 ml konisk rør. Filtrer celleopløsningen gennem cellesilen.
- Vask røret med 1 ml panoreringsbuffer, og passér derefter gennem silen (3 ml filtrat). Lag forsigtigt cellesuspensionen (1 ml ad gangen) oven på 2 ml af en 15% BSA-pude for at fjerne myelinaffald. En 2 ml pude er effektiv til to mus, og 3 ml er effektiv til fire mus.
- Til lagdeling placeres de 2 ml BSA i røret, lukkes og forsigtigt belægges siderne af røret med BSA. Derefter lægges forsigtigt cellesuspensionen af toppen ved pipettering mod siden af røret.
- Der centrifugeres ved stuetemperatur ved 300 x g i 10 minutter (langsom acceleration og deceleration). Brug en P1000-pipette til at fjerne den klare væske ovenpå, myelinfasen imellem og BSA, 1 ml ad gangen (skiftende spidser mellem hver ml). Forlad ~ 100 μL BSA for ikke at forstyrre pelleten.
- Der tilsættes 5 ml panoreringsbuffer og inkuberes røret i en 37 °C, 10 % CO2 inkubator i 30-45 min. Dette giver mulighed for antigenhentning. Sørg for at løsne hætten for at tillade gasudveksling.
- CD45-fadet vaskes tre gange med D-PBS. Hæld den sidste skylning af. Dekanter cellesuspensionen i CD45-skålen.
- Inkuber cellerne på CD45-skålen i alt 20 minutter ved stuetemperatur, hvirvl forsigtigt ved 10 min-punktet for at give cellerne lige adgang til antistoffet.
- Skyl PDGFRβ-fadet tre gange med D-PBS og hæld den sidste skylning af. Overfør de ubundne celler fra CD45-skålen til PDGFRβ-skålen.
- Ryst forsigtigt CD45-skålen og støt den. Afpipetter forsigtigt 1 ml af cellesuspensionen over skålen for at opsamle ubundne celler. Det dekanteres i PDGFRβ-skålen og pipetteres for at overføre den resterende cellesuspension til PDGFRβ-pladen.
- Der inkuberes PDGFRβ-pladen i alt 20 minutter ved stuetemperatur, og hvirvles forsigtigt rundt ved 10 min-punktet for at give cellerne lige adgang til antistoffet.
- Skyl O4-fadet tre gange med D-PBS og hæld den sidste skylning af. De ubundne celler overføres fra skålen PDGFRβ til O4-skålen efter samme metode som i trin 3.2.19. Inkuber O4-pladen i alt 20 minutter ved stuetemperatur, hvirvl forsigtigt ved 10 min-punktet for at give cellerne lige adgang til antistoffet.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør og centrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Resuspender cellerne i det ønskede volumen, og fortynd 1: 1 med trypanblå for cellelevedygtighed. Tæl mellemstore til store celler med et hæmocytometer (dette giver mulighed for den bedste repræsentation af antallet af neuroner i kulturen).
- Fjern laminin og plade cellerne ved den ønskede densitet. Lad ikke pladen tørre mellem lamininfjernelse og plettering, og tilsæt cellerne straks.
- De kvantificerede celler dyrkes til neuronal berigelse (figur 3) med 500 neuroner i 25 μL dyrkningsmedium (beskrevet i 1.2.7) pr. brønd i plader med 24 brønde og inkuberes ved 37 °C i 30 minutter. Brøndene oversvømmes til et slutvolumen på 500 μL.
- Dag 4: immuncytokemi (ICC) fiksering, blokering og primær
- Efter 48 timers vækst tilsættes 500 μL/hul (eller volumen svarende til mediet i brønden) 8 % PFA i 15 minutter ved stuetemperatur for at fiksere cellerne. Hvis medieanalyse ønskes, kan man rette med 4% PFA direkte. Vi har dog ikke testet dette.
- Vask cellerne med D-PBS tre gange. Bemærk, at vi har holdt disse celler i kultur uden medieændring i maksimalt 72 timer, men antager, at de kunne overleve længere, især hvis mediet er halvt udskiftet.
- Fjern den endelige vask, og tilsæt nok blokeringsopløsning pr. Brønd til at dække cellerne helt. Bloker i 30 minutter ved stuetemperatur. Den blokerende opløsning fjernes, og der tilsættes primært antistof i antistofopløsningen: β3-tubulin ved en fortynding på 1:1.000. Pladen forsegles med gennemsigtig film og inkuberes natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Man kan overveje farvning med PDGFRβ for fravær af fibroblaster, CD45 for fravær af immunceller, P0 eller PMP22 for fravær af myelin eller fabp7 for satellitglia.
- Dag 5: ICC sekundær
- Vask cellerne med D-PBS tre gange. Fjern den endelige vask og tilsæt sekundære antistoffer i antistofopløsning: antikanin 488 ved en 1:500 fortynding og DAPI ved en 1:2.000 fortynding. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
- Vask med D-PBS tre gange. Tilføj nok D-PBS til at dække bunden af brønden og billedet. Pladen kan forsegles med gennemsigtig film, beskyttes mod lys og opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De faste celler farvet med DAPI og β3-tubulin blev derefter afbildet med et konfokal screeningssystem med højt indhold. Billeder blev analyseret ved hjælp af passende kommerciel software for at bestemme procentdelen af DAPI-positive celler, der co-mærkede med β3-tubulin (figur 3). Hele DRG-kulturer blev bestemt til at have 42,36% ± 6,4% β3-tubulinfarvning, og immunpanerede DRG-kulturer blev bestemt til at have 71,44% ±7,43% β3-tubulinfarvning. Dette afslører en signifikant stigning i neuronal berigelse med immunpanning (p < 0,0001, uparret t-test).
Figur 1: Grundlæggende om immunpanorering. Et sekundært antistof klæbes til en kulturskål natten over, og primære antistoffer introduceres derefter. Dette gør det muligt at fastgøre cellerne af interesse til pladen med et overfladeantigen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: DRG-neuronimmunpanorering af DRG-neuron med voksne mus ved negativ selektion. DRG'er høstes, adskilles og anstrenges i en enkelt celleopløsning. Myelinrester fjernes ved centrifugering gennem en BSA-pude. Cellesuspensionen føres derefter over tre immunpandende skåle (CD45, PDGFRβ og O4) for at opnå en kultur, der er beriget til neuroner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: DRG-kulturens neuronale berigelse ved immunpanorering. Faste kulturer blev farvet med β3-tubulin for neuroner og DAPI for alle kerner. (A) Repræsentativt billede af en hel (ikke-immunpandet) kultur. B) Repræsentativt billede af en immunpanderet kultur. C) Kvantificering af β3-tubulinpositive celler i procent af de samlede DAPI-positive celler. Søjler angiver middelværdi ± standardfejlgennemsnit (SEM). = p < 0,0001, uparret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne immunpanningsprotokol øger andelen af neuronale celler i DRG-primære kulturer. For de bedste resultater skal dissektioner udføres rettidigt, og DRG'er skal trimmes af overskydende nerver. Dissociationstrinnet skal overvåges nøje og bør ikke overstige 1 time for at forhindre cellerne i unødvendig stress. Med hensyn til immunpanorering specifikt skal hver plade forsigtigt hvirvles halvvejs for at give cellerne adgang til de overtrukne antistoffer. Pladerne skal også ses under et dyrkningsmikroskop, efter at neuroncellesuspensionen er opsamlet for at sikre, at ikke-neuronale celler er bundet.
En begrænsning i brugen af voksne mus er DRG'ernes etablerede karakter. En manglende evne til at fjerne alle ikke-neuronale celletyper efterlader ca. 30% af kulturen som ikke-neuronal (figur 3). Mens vi kan adskille og reducere populationen af immunceller, fibroblaster og Schwann-celler fra kulturerne, kan satellitglia være yderst vanskeligt at adskille fra neuroner. Vi antager også, at disse neuroner kunne have dårlig overlevelse uden den metaboliske støtte fra satellit glia10. Mens vores forsøg på at plette for disse celler ved hjælp af GFAP mislykkedes på grund af dårlig antistofspecificitet, kan en fremtidig retning være at plette for disse celler ved hjælp af fabp7. Vi forsøgte at fjerne CD9-positive ikke-neuronale celler såsom satellitglia under fejlfinding af denne protokol. I CD9-pladen blev det imidlertid konstateret, at mange neuroner var fastgjort til pladen. Vi antager, at museneuroner kan have noget CD9-udtryk. Faktisk anvender ekstracellulær vesikellitteratur fra museneuronlignende celler CD9 som markør11. Hvis der kunne findes et mere egnet panoreringsantistof til at reducere andelen af satellitglia, kunne man overveje yderligere tilskud med vækstfaktorer som NGF, BDNF eller NT3 for at modvirke tabet af disse støtteceller.
Denne immunpanoreringsprotokol kan forbedre nøjagtigheden af neuronale aflæsninger fra homogene DRG-kulturprøver ved at øge andelen af neuronale celler i kultur. Det giver også en mulighed for at dyrke DRG-neuroner med voksne mus, hvilket giver mulighed for en dybdegående undersøgelse af neuronale fænotyper i genetiske, sygdoms- og skademusemodeller.
Immunopanning er også et meget tilpasseligt værktøj. For eksempel kan celleoverflademarkøren isolectin-B4 anvendes til specifikt at vælge ikke-peptiderge musenociceptorer. Immunopanning kan også bruges til at berige andre primære kulturer, herunder kortikale neuroner, mikroglia, astrocytter og oligodendrocytprecursorceller. Det er et kraftfuldt værktøj, der kan udvide anvendelserne af primære cellekulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et projekttilskud fra Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) og et Discovery Grant fra MS Society of Canada (EGID-3761). Forfatterne vil gerne takke Dr. Sun og Cross Cancer Institute for træning og brug af ImageXpress-systemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
