Summary
Este artículo describe un protocolo de inmunopanopanización para los ganglios de la raíz dorsal del ratón adulto. Al adherir anticuerpos a las placas de cultivo, podemos seleccionar y eliminar negativamente las células no neuronales. Mostramos que los cultivos se enriquecen para las neuronas utilizando este protocolo, lo que permite un estudio en profundidad de las respuestas neuronales a la manipulación.
Abstract
Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son estructuras periféricas adyacentes al asta dorsal de la médula espinal, que albergan los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, así como varios otros tipos de células. Los protocolos de cultivo publicados a menudo se refieren a cultivos DRG disociados completos como neuronales, a pesar de la presencia de fibroblastos, células de Schwann, macrófagos y linfocitos. Si bien estos cultivos DRG completos son suficientes para aplicaciones de imágenes donde las neuronas se pueden discernir en función de la morfología o la tinción, los homogeneizados de proteínas o ARN recolectados de estos cultivos no son principalmente de origen neuronal. Aquí, describimos una secuencia de inmunopanopanización para DRG de ratón cultivados. El objetivo de este método es enriquecer los cultivos de DRG para las neuronas mediante la eliminación de otros tipos de células. El inmunopanning se refiere a un método para eliminar tipos de células mediante la adhesión de anticuerpos a placas de cultivo celular. Usando estos platos, podemos seleccionar negativamente y reducir el número de fibroblastos, células inmunes y células de Schwann en cultivo. Este método nos permite aumentar el porcentaje de neuronas en cultivos.
Introduction
Los ganglios de la raíz dorsal (GRD) albergan los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales que inervan los tejidos periféricos. El estudio de estas neuronas nos permite comprender los fundamentos mecanicistas del dolor y las condiciones sensoriales. Sin embargo, los DRG no están compuestos solo por neuronas, sino que también contienen fibroblastos, células de Schwann, macrófagos y otras células inmunes1. A pesar de la presencia de estos diversos tipos de células, los cultivos DRG completos a menudo se denominan neuronales 2,3. Estos cultivos siguen siendo útiles para la investigación neuronal mediante imágenes o citometría de flujo, lo que permitiría la identificación neuronal por tinción, tamaño celular y/o morfología. Sin embargo, para ensayos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el western blotting, donde los cultivos se homogeneizan para la recolección de ARN o proteínas, la presencia de tipos de células no neuronales puede interferir con los resultados. Por lo tanto, existe la necesidad de aumentar la proporción de células neuronales en los cultivos DRG.
El inmunopanning es una técnica utilizada para purificar una variedad de tipos de células, incluidas las neuronas corticales, los astrocitos, las células precursoras de oligodendrocitos y la microglía. En palabras simples, implica adherir un anticuerpo contra un marcador de superficie celular a una placa de Petri, destinado a unir ciertas células (Figura 1), y puede usarse para seleccionar a favor o en contra de los tipos celulares de interés 4,5,6. Zuchero7 ha descrito previamente DRG embrionarios de rata inmunopandeando para seleccionar contra células no neuronales. Sin embargo, no hemos podido encontrar un protocolo de inmunopanopanización específico para los DRG de ratón. En este protocolo, nos basamos en los inquilinos básicos del protocolo Zuchero, pero en su lugar adaptamos la secuencia de inmunopanopanización para enriquecer los cultivos DRG de ratones adultos (Figura 2). Esta es una herramienta poderosa para estudiar neuronas sensoriales establecidas en cultivo. Es ventajoso ya que permite el uso de ratones adultos a partir de modelos genéticos, de enfermedad y lesiones, de modo que sus neuronas sensoriales pueden estudiarse con mayor especificidad.
Este protocolo es ventajoso para los lectores que buscan aumentar la proporción de neuronas en cultivos DRG de ratones adultos. Sin embargo, los pasos de inmunopanización también se pueden omitir, y este protocolo también se puede usar para cultivos DRG completos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Ciencias de la Salud de la Universidad de Alberta (protocolo 0000274).
1. Preparación del reactivo
- Para el día 1, prepare los siguientes reactivos: agua de grado de cultivo celular; poli-D-lisina: preparar una cepa reconstituyendo toda la botella en 50 ml de agua de cultivo hasta una concentración madre de 100 μg/ml, almacenar a 4 °C y diluir la cepa 1:10 en agua de cultivo hasta una concentración final de 10 μg/ml; tris-HCl-preparar una cepa disolviendo clorhidrato de tris en polvo en agua de cultivo hasta una concentración madre de 500 mM (3,94 g en 50 ml), pH 9,5, esterilizar el filtro (0,22 μm), almacenar a 4 °C y diluir la cepa 1:10 en agua de cultivo hasta una concentración final de 50 mM; anticuerpos secundarios (cabra anti-rata, -conejo y -ratón).
- Para el día 2, prepare los siguientes reactivos.
- Preparar la solución salina balanceada de Hank de grado de cultivo celular Ca 2+, Mg2+ (HBSS; HBSS-/-), y solución salina tamponada con D-fosfato de grado de cultivo celular (PBS) con Ca 2+ y Mg2+. Preparar una alícuota de laminina y conservar a -80 °C inmediatamente después de recibirla; diluir el stock en HBSS-/- estéril hasta una concentración final de 10 μg/ml para el material de trabajo.
- Preparar un stock de albúmina sérica bovina (BSA) al 4% disolviendo 400 mg de BSA en 7,5 ml de D-PBS (pH 7,4), llevar el volumen a 10 ml, esterilizar el filtro (0,22 μm), alícuota y almacenar a -20 °C. Preparar BSA al 0,2% diluyendo 750 μL de BSA al 4% en 14,25 ml de D-PBS.
- Prepare un stock de ADN al 0,4% agregando 1 ml de solución salina balanceada de Earle (EBSS) por cada 12.500 unidades de DNAsa, esterilice el filtro (0,22 μm), alícuota y guárdelo a -20 °C. Prepare el tampón de barrido (0,02% BSA) agregando 3 ml de BSA al 0,2% y 100 μL de DNAsa al 0,4% en 27 ml de D-PBS. Preparar anticuerpos primarios (CD45, PDGRFβ, O4).
NOTA: Este protocolo utiliza un hibridoma O48,9, sin embargo, 10 μg de un anticuerpo O4 disponible comercialmente también sería apropiado. - Preparar el stock de cogelinasa combinada disolviendo un frasco de cogelinasa combinada (50 mg) en 5 ml de HBSS-/-, alícuota, y almacenar a -20 °C. Prepare un material de trabajo por cada dos ratones agregando 500 μL de colagenasa combinada calentada y 50 μL de DNasa calentada al 0,4% a 4,5 ml de HBSS-/-.
- Prepare un ovomucoide bajo agregando 3 g de BSA a 150 ml de D-PBS, luego agregue 3 g de inhibidor de tripsina y mezcle para disolver. Ajuste el pH a 7.4 y lleve el volumen hasta 200 ml con D-PBS. Filtrar esterilizar, preparar 1 ml de alícuotas y almacenar a -20 °C. El día de la disección, combine 1 ml de ovomucoide bajo en 9 ml de D-PBS para la solución de trabajo.
- Preparar BSA al 15% disolviendo 7,5 g de BSA en 50 ml de HBSS-/- (colóquelo en una agitadora para disolverlo completamente), esterilice el filtro y guárdelo a 4 °C.
- Preparar 50 ml de medios neuronales añadiendo 23,2 ml de DMEM, 23,2 ml de medio neurobasal, 500 μL de glutamax, 500 μL de piruvato de sodio, 500 μL de penicilina/estreptomicina (alícuota inmediatamente después de la llegada y conservar a -20 °C), 500 μL de insulina (5 μg/ml final), 500 μL de SATO, 50 μL de N-acetil-L-cisteína (NAC; 5 μg/ml final), y 1.000 μL de B27+ (alícuota inmediata y conservar a -20 °C al recibir).
- Preparar el stock de insulina disolviendo en agua de cultivo hasta una concentración de 0,5 mg/ml (50 mg en 100 ml), ajustar el pH a 7,4, esterilizar el filtro (0,22 μm), preparar 500 μL de alícuotas y almacenar a -20 °C.
- Preparar el stock de SATO combinando 20 μL de progesterona (2,5 mg en 100 μL de etanol), 800 μL de selenito de sodio (4 mg en 10 ml de medios neurobasales + 10 μL de NaOH 1 N), 800 mg de BSA, 800 mg de transferrina, 128 mg de diclorhidrato de putrescina y 80 ml de neurobasal. Esterilizar el filtro (0,22 μm), preparar alícuotas de 500 μL y conservar a -20 °C. Es esencial hacer soluciones frescas de progesterona y selenito de sodio.
- Preparar 50 μL de cepa de N-acetil-L-cisteína (NAC) disolviendo en medio neurobasal hasta una concentración madre de 5 mg/ml (50 mg en 10 ml), esterilizar el filtro (0,22 μm), alícuota y almacenar a -20 °C.
- Para los días 4 y 5, prepare los siguientes reactivos.
- Preparar tampón fosfato (PB) 0,2 M disolviendo 21,8 g de fosfato de sodio dibásico (Na2HPO 4) y 8,34 g de fosfato de sodio monobásico dihidratado (NaH2PO4) en 1.000 mL de agua. Ajuste el pH a 7.4 y guárdelo a temperatura ambiente.
- Prepare paraformaldehído al 8% (PFA) de la siguiente manera: en una campana extractora, caliente 50 ml de agua a 55 °C, apague el fuego y agregue 8 g de gránulos de PFA, agitando constantemente. Agregue 1 N NaOH gota a gota hasta que la solución comience a aclararse, luego agregue 40 ml de 0.2 M PB y continúe revolviendo hasta que esté clara. Enfríe la solución a temperatura ambiente, ajuste el pH a 7.4 y lleve el volumen hasta 100 ml con 0.2 M PB. Filtrar y conservar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
- Prepare D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) agregando 0.2% de Triton X-100 en D-PBS de grado de cultivo (1 ml de Triton + 500 mL de D-PBS). Conservar a 4 °C. Prepare la solución de bloqueo, que es suero de burro normal (NDS) al 1% en PBSTX. Antes de tiempo, se puede preparar 1 ml de NDS + 9 ml de PBSTX y almacenarse a -20 °C en alícuotas de 10 ml.
- Preparar una solución de anticuerpos que sea 0.2% NDS/0.2% BSA en PBS TX: 200 μL de NDS + 200 mg BSA + 9.6 mL de PBSTX; puede prepararse con antelación y almacenarse a -20 °C en alícuotas de 10 ml.
2. Configuración del equipo
- Instalar el siguiente equipo: gabinete de bioseguridad de cultivo celular estéril, juego de micropipetas, pipetas serológicas y pistola de pipetas, placas de Petri de 10 cm, placas de cultivo celular deseadas para el recubrimiento (aquí, se utilizaron placas de fondo de vidrio negro de 24 pocillos para la obtención de imágenes), tubos cónicos de 15 ml y 50 ml, herramientas de disección (a saber: tijeras de resorte finas para laminectomía y recorte nervioso, pinzas finas, y una cuchilla de afeitar), baño maría ajustado a 37 °C, filtro celular de 70 μm, centrífuga (10 min a 300 x g) con adaptadores para tubos cónicos de 15 ml, azul de tripano y hemocitómetro, campana extractora y placa caliente de agitación magnética.
3. Método experimental
- Día 1: preparación de platos
- En un gabinete de bioseguridad, cubra la superficie de cultivo deseada con suficiente poli-D-lisina para cubrir el fondo del pozo. Conservar toda la noche a 4 °C. Aquí, se utilizaron placas con fondo de vidrio de 24 pocillos para la obtención de imágenes, y por lo tanto se utilizaron 300 μL de poli-D-lisina.
- En un gabinete de bioseguridad, prepare los platos de barrido: para el plato CD45, agregue 10 ml de solución de tris-HCl de trabajo y 30 μL de IgG antirata de cabra a una placa de Petri de 10 cm; para la placa PDGFRβ, añadir 10 ml de solución de tris-HCl de trabajo y 30 μL de IgG anticonejo de cabra a una placa de Petri de 10 cm; para la placa de hibridoma O4, añadir 10 ml de solución de tris-HCl de trabajo y 30 μL de IgG anti-ratón de cabra a una placa de Petri de 10 cm. Asegúrese de que la solución cubra toda el área del plato y déjela a 4 ° C durante la noche.
- Día 2: disección, trituración e inmunopanopanización
- Aspire la poli-D-lisina, lave las placas tres veces con agua de cultivo de tejidos, abra la tapa y deje que la superficie se seque completamente en un gabinete de bioseguridad. Aplicar suficiente laminina a las placas para recubrir el fondo de cada pocillo y colocar en una incubadora a 37 °C. Para las placas de 24 pocillos, 200 μL es suficiente.
- Termine de preparar los platos de paneo. Lave cada plato con D-PBS e incube con 10 μg de anticuerpo primario. Dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 2 h.
- Para la antena CD45, añadir 5 ml de BSA al 0,2% y 20 μL de CD45 primario; para la placa PDGFRβ, añadir 5 ml de BSA al 0,2% y 15,4 μL de PDGFRβ; para la placa de O4, agregue 3 ml de BSA al 0,2%, 2 ml de hibridoma de O4 y 100 μL adicionales de BSA al 4% (para garantizar que la concentración final de BSA permanezca en 0,2%).
- Eutanasia de uno a cuatro ratones usando 0.1 ml / kg de pentobarbitol de sodio (por placa de inmunopanificación de 10 cm). Utilizamos ratones C57BL/6 a las 8-10 semanas de edad. Ambos sexos fueron utilizados y cultivados por separado el uno del otro. Perfundir al animal con 30 mL de solución salina fría al 0,9%.
- Fije las patas delanteras y traseras a una etapa de espuma de poliestireno y use una hoja de afeitar limpia para exponer la columna vertebral desde la parte posterior. Realice una laminectomía haciendo cortes aproximadamente a la mitad de profundidad a cada lado de la columna vertebral dorsal, eliminando la mitad dorsal de la columna, para exponer la médula espinal. Corte suavemente los nervios y retire la médula espinal, o empuje suavemente la médula hacia un lado, manteniendo la integridad del nervio.
- Use las raíces nerviosas espinales (ya sea cortadas o unidas a la médula espinal) para encontrar y eliminar todos los DRG de ambos lados de la columna vertebral. Recorte los restos nerviosos de cada GRD a medida que se eliminan (más restos nerviosos en el cultivo pueden conducir a una supervivencia deficiente del cultivo). Recoja los DRG en 15 ml de HBSS-/- en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo.
NOTA: Tenga en cuenta que el tejido se disecciona al aire libre, pero una vez que los DRG se agregan al tubo, deben tratarse como estériles y solo manipularse en un gabinete de bioseguridad. - Coloque las existencias congeladas de estemxima 1 y 0,4% de ADN en un baño de agua, aproximadamente 30 minutos antes del final de las disecciones (aproximadamente al iniciar el último ratón). Permita que se asienten en el fondo del tubo cónico, luego continúe el protocolo en un gabinete de bioseguridad.
- Aspire la mayor parte de los HBSS-/- de los DRG. Use una pipeta en lugar de succión para obtener <1 ml de líquido y deje ~ 100 μL de líquido para no correr el riesgo de perder tejido.
- Lavar tres veces con 1 ml de HBSS-/-. Agregue 5 ml de solución de estemxyme de trabajo al tejido. Cubrir la tapa con una película transparente y hacer flotar el tubo de lado en un baño maría a 37 °C durante 1 h.
- Después de la incubación en la enzima, agregue 1 ml de solución de inhibidor bajo en ovo al tubo. Triturar las células suavemente con una pipeta p1000 10-15 veces. Permita que los trozos de tejido se asienten.
- Transfiera los 2-3 ml superiores de solución (que contienen células disociadas) a una solución fresca de bajo ovomucoide. Repita hasta que el tejido esté completamente disociado y no queden trozos visibles.
- Centrifugar durante 10 min a 300 x g a temperatura ambiente. Vuelva a extraer el sobrenadante, usando una pipeta en lugar de succión durante el último 1 ml, dejando ~ 100 μL, y resuspenda el pellet celular en 1 ml de tampón de barrido.
- Pipetear suavemente para mezclar. Prehumedezca un filtro de células de 70 μm con 1 ml de tampón de movimiento sobre un tubo cónico de 50 ml. Filtre la solución celular a través del filtro celular.
- Lave el tubo con 1 ml de tampón de barrido, luego pase a través del filtro (3 ml de filtrado). Coloque la suspensión celular suavemente (1 ml a la vez) sobre 2 ml de un cojín BSA al 15% para eliminar los residuos de mielina. Un cojín de 2 ml es efectivo para dos ratones, y 3 ml es efectivo para cuatro ratones.
- Para la estratificación, coloque los 2 ml de BSA en el tubo, cierre y cubra suavemente los lados del tubo con BSA. Luego, coloque suavemente la suspensión celular de la parte superior, pipeteando contra el lado del tubo.
- Centrifugar a temperatura ambiente a 300 x g durante 10 min (aceleración y desaceleración lentas). Use una pipeta P1000 para eliminar el líquido transparente en la parte superior, la fase de mielina intermedia y la BSA, 1 ml a la vez (cambiando las puntas entre cada ml). Deje ~ 100 μL de BSA para no perturbar el pellet.
- Añadir 5 ml de tampón de barrido e incubar el tubo en una incubadora de 37 °C, 10% de CO2 durante 30-45 min. Esto permite la recuperación de antígenos. Asegúrese de aflojar la tapa para permitir el intercambio de gases.
- Lave el plato CD45 tres veces con D-PBS. Vierta el enjuague final. Decantar la suspensión celular en el plato CD45.
- Incubar las células en el plato CD45 durante un total de 20 minutos a temperatura ambiente, girando suavemente en el punto de 10 minutos para permitir que las células tengan el mismo acceso al anticuerpo.
- Enjuague el plato PDGFRβ tres veces con D-PBS y vierta el enjuague final. Transfiera las células no unidas de la placa CD45 a la placa PDGFRβ.
- Agite suavemente el plato CD45 y sosténgalo en ángulo. Pipetear suavemente 1 ml de la suspensión celular sobre el plato para recoger las células no unidas. Decantarlo en la placa PDGFRβ y pipetear para transferir la suspensión celular restante a la placa PDGFRβ.
- Incubar la placa PDGFRβ durante un total de 20 minutos a temperatura ambiente, girando suavemente en el punto de 10 minutos para permitir que las células tengan el mismo acceso al anticuerpo.
- Enjuague el plato de O4 tres veces con D-PBS y vierta el enjuague final. Transfiera las celdas no unidas de la placa PDGFRβ a la placa de O4 utilizando el mismo método que en el paso 3.2.19. Incubar la placa de O4 durante un total de 20 minutos a temperatura ambiente, girando suavemente en el punto de 10 minutos para permitir que las células tengan el mismo acceso al anticuerpo.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 10 min a 300 x g. Resuspender las células en el volumen deseado y diluir 1:1 con azul de tripano para la viabilidad celular. Contar células medianas a grandes con un hemocitómetro (esto permitirá la mejor representación del número de neuronas en el cultivo).
- Retire la laminina y coloque las células en la densidad deseada. No permita que la placa se seque entre la eliminación de laminina y el recubrimiento, y agregue las celdas inmediatamente.
- Cultivar las células cuantificadas para el enriquecimiento neuronal (Figura 3) con 500 neuronas en 25 μL de medio de cultivo (descrito en 1.2.7) por pocillo en placas de 24 pocillos e incubar a 37 °C durante 30 min. Inundar los pozos hasta un volumen final de 500 μL.
- Día 4: fijación inmunocitoquímica (ICC), bloqueo y primaria
- Después de 48 h de crecimiento, agregue 500 μL / pocillo (o volumen equivalente al medio en el pozo) de PFA al 8% durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar las células. Si se desea un análisis de medios, se puede arreglar con 4% de PFA directamente. Sin embargo, no hemos probado esto.
- Lave las celdas con D-PBS tres veces. Tenga en cuenta que hemos mantenido estas células en cultivo sin cambio de medios durante un máximo de 72 h, pero la hipótesis es que podrían sobrevivir más tiempo, particularmente si el medio está medio cambiado.
- Retire el lavado final y agregue suficiente solución de bloqueo por pocillo para cubrir las celdas por completo. Bloquear durante 30 min a temperatura ambiente. Retire la solución bloqueante y agregue el anticuerpo primario en la solución de anticuerpos: β3-tubulina en una dilución 1:1,000. Sellar la placa con film transparente e incubar durante la noche a 4 °C.
NOTA: Se podría considerar la tinción con PDGFRβ para la ausencia de fibroblastos, CD45 para la ausencia de células inmunes, P0 o PMP22 para la ausencia de mielina, o fabp7 para la glía satélite.
- Día 5: ICC secundaria
- Lave las celdas con D-PBS tres veces. Retire el lavado final y agregue anticuerpos secundarios en solución de anticuerpos: anti-conejo 488 en una dilución 1:500 y DAPI en una dilución 1:2,000. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
- Lavar con D-PBS tres veces. Agregue suficiente D-PBS para cubrir el fondo del pozo y la imagen. La placa puede sellarse con película transparente, protegerse de la luz y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Las células fijas teñidas con DAPI y β3-tubulina se visualizaron con un sistema de detección confocal de alto contenido. Las imágenes se analizaron utilizando un software comercial adecuado para determinar el porcentaje de células DAPI positivas que comarcaron con β3-tubulina (Figura 3). Se determinó que los cultivos DRG completos tenían tinción de 42,36% ± 6,4% de β3-tubulina, y se determinó que los cultivos de DRG inmunopanizados tenían tinción de β3-tubulina al 71,44% ±7,43%. Esto revela un aumento significativo en el enriquecimiento neuronal con inmunopanopanización (p < 0,0001, prueba t no pareada).
Figura 1: Conceptos básicos de inmunopanización. Un anticuerpo secundario se adhiere a una placa de cultivo durante la noche, y luego se introducen anticuerpos primarios. Esto permite que las células de interés se unan a la placa mediante un antígeno de superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inmunopanización de la neurona DRG de ratón adulto por selección negativa. Los DRG se cosechan, se disocian y se cuelan en una solución de una sola célula. Los restos de mielina se eliminan por centrifugación a través de un cojín BSA. Luego, la suspensión celular se pasa a través de tres placas inmunopanorámicas (CD45, PDGFRβ y O4) para lograr un cultivo enriquecido para las neuronas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Enriquecimiento neuronal del cultivo DRG por inmunopanización. Los cultivos fijos se tiñeron con β3-tubulina para las neuronas y DAPI para todos los núcleos. (A) Imagen representativa de un cultivo completo (no inmunopanizado). (B) Imagen representativa de un cultivo inmunopanizado. (C) Cuantificación de células β3-tubulina positivas como porcentaje del total de células DAPI-positivas. Las barras indican la media ± la media de error estándar (SEM). = p < 0,0001, prueba t no pareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo de inmunopanización aumenta la proporción de células neuronales en cultivos primarios de DRG. Para obtener los mejores resultados, las disecciones deben hacerse de manera oportuna, y los DRG deben recortarse del exceso de nervios. El paso de disociación debe ser monitoreado cuidadosamente, y no debe exceder 1 h, para evitar que las células sufran un estrés innecesario. Con respecto a la inmunopanorámica específicamente, cada placa debe girarse suavemente en el punto medio para permitir que las células tengan acceso a los anticuerpos recubiertos. Las placas también deben observarse bajo un microscopio de cultivo después de que se recolecte la suspensión de células neuronales para garantizar que las células no neuronales se hayan unido.
Una limitación en el uso de ratones adultos es la naturaleza establecida de los DRG. La incapacidad de eliminar todos los tipos de células no neuronales deja aproximadamente el 30% del cultivo como no neuronal (Figura 3). Si bien podemos disociar y reducir la población de células inmunes, fibroblastos y células de Schwann de los cultivos, la glía satélite puede ser extremadamente difícil de disociar de las neuronas. También planteamos la hipótesis de que estas neuronas podrían tener una supervivencia deficiente sin el apoyo metabólico proporcionado por la glía satélite10. Si bien nuestro intento de teñir estas células usando GFAP falló debido a la mala especificidad de los anticuerpos, una dirección futura puede ser teñir estas células usando fabp7. Intentamos eliminar las células no neuronales CD9 positivas, como la glía satélite, al solucionar problemas de este protocolo. Sin embargo, en la placa CD9, se encontró que muchas neuronas estaban unidas a la placa. Nuestra hipótesis es que las neuronas de ratón pueden tener alguna expresión de CD9. De hecho, la literatura de vesículas extracelulares de células similares a neuronas de ratón emplea CD9 como marcador11. Si se pudiera encontrar un anticuerpo de barrido más adecuado para reducir la proporción de glía satélite, se podría considerar la suplementación adicional con factores de crecimiento como NGF, BDNF o NT3 para contrarrestar la pérdida de estas células de soporte.
Este protocolo de inmunopanificación puede mejorar la precisión de las lecturas neuronales de muestras homogéneas de cultivo de DRG al aumentar la proporción de células neuronales en cultivo. También proporciona una vía para cultivar neuronas DRG de ratón adulto, lo que permite una investigación en profundidad de los fenotipos neuronales en modelos de ratones genéticos, de enfermedad y de lesiones.
El inmunopanning también es una herramienta altamente personalizable. Por ejemplo, el marcador de superficie celular isolectina-B4 podría emplearse para seleccionar específicamente nociceptores de ratón no peptidérgicos. El inmunopanning también se puede usar para enriquecer otros cultivos primarios, incluidas las neuronas corticales, la microglía, los astrocitos y las células precursoras de oligodendrocitos. Es una herramienta poderosa que puede ampliar las aplicaciones de los cultivos celulares primarios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de proyecto de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (FRN-162434) y una subvención de descubrimiento de la Sociedad de EM de Canadá (EGID-3761). Los autores desean agradecer al Dr. Sun y al Cross Cancer Institute por la capacitación y el uso del sistema ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
