Summary
In dieser Arbeit wird ein Immunpanning-Protokoll für adulte dorsale Wurzelganglien der Maus beschrieben. Durch das Anhaften von Antikörpern an Kulturplatten können wir nicht-neuronale Zellen negativ selektieren und entfernen. Wir zeigen, dass die Kulturen mit diesem Protokoll für Neuronen angereichert werden, was eine eingehende Untersuchung der neuronalen Reaktionen auf Manipulation ermöglicht.
Abstract
Dorsale Wurzelganglien (DRGs) sind periphere Strukturen, die an das Hinterhorn des Rückenmarks angrenzen und die Zellkörper sensorischer Neuronen sowie verschiedene andere Zelltypen beherbergen. In veröffentlichten Kulturprotokollen werden ganze dissoziierte DRG-Kulturen oft als neuronal bezeichnet, obwohl Fibroblasten, Schwann-Zellen, Makrophagen und Lymphozyten vorhanden sind. Während diese ganzen DRG-Kulturen für bildgebende Anwendungen ausreichen, bei denen Neuronen anhand der Morphologie oder der Färbung unterschieden werden können, sind Protein- oder RNA-Homogenate, die aus diesen Kulturen gewonnen werden, nicht primär neuronalen Ursprungs. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Immunpanning-Sequenz für kultivierte Maus-DRGs. Ziel dieser Methode ist es, DRG-Kulturen für Neuronen anzureichern, indem andere Zelltypen entfernt werden. Immunopanning bezieht sich auf eine Methode zur Entfernung von Zelltypen durch Anhaften von Antikörpern an Zellkulturschalen. Mit diesen Schalen können wir negativ selektieren und die Anzahl der Fibroblasten, Immunzellen und Schwann-Zellen in Kultur reduzieren. Diese Methode ermöglicht es uns, den Anteil der Neuronen in Kulturen zu erhöhen.
Introduction
Dorsale Wurzelganglien (DRGs) beherbergen die Zellkörper der sensorischen Neuronen, die periphere Gewebe innervieren. Die Untersuchung dieser Neuronen ermöglicht es uns, die mechanistischen Grundlagen von Schmerz und sensorischen Bedingungen zu verstehen. DRGs bestehen jedoch nicht nur aus Neuronen, sondern enthalten auch Fibroblasten, Schwann-Zellen, Makrophagen und andere Immunzellen1. Trotz des Vorhandenseins dieser verschiedenen Zelltypen werden ganze DRG-Kulturen in der Literatur oft als neuronalbezeichnet 2,3. Diese Kulturen sind nach wie vor nützlich für neuronale Untersuchungen durch Bildgebung oder Durchflusszytometrie, die eine neuronale Identifizierung durch Färbung, Zellgröße und/oder Morphologie ermöglichen würden. Bei Assays wie der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder dem Western-Blotting, bei denen Kulturen für die RNA- oder Proteinsammlung homogenisiert werden, kann jedoch das Vorhandensein nicht-neuronaler Zelltypen die Ergebnisse beeinträchtigen. Daher besteht die Notwendigkeit, den Anteil neuronaler Zellen in DRG-Kulturen zu erhöhen.
Immunopanning ist eine Technik, die zur Reinigung einer Vielzahl von Zelltypen verwendet wird, darunter kortikale Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten-Vorläuferzellen und Mikroglia. In einfachen Worten handelt es sich um das Aufkleben eines Antikörpers gegen einen Zelloberflächenmarker an eine Petrischale, der bestimmte Zellen binden soll (Abbildung 1), und er kann verwendet werden, um entweder für oder gegen Zelltypen von Interesse zu selektieren 4,5,6. Das Immunpanning embryonaler DRGs von Ratten zur Selektion gegen nicht-neuronale Zellen wurde bereits von Zuchero7 beschrieben. Wir konnten jedoch kein spezifisches Immunpanning-Protokoll für Maus-DRGs finden. In diesem Protokoll bauen wir auf den Grundprinzipien des Zuchero-Protokolls auf, passen aber stattdessen die Immunpanning-Sequenz an, um DRG-Kulturen adulter Mäuse anzureichern (Abbildung 2). Dies ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um etablierte sensorische Neuronen in Kultur zu untersuchen. Dies ist vorteilhaft, da es die Verwendung von erwachsenen Mäusen aus Genetik-, Krankheits- und Verletzungsmodellen ermöglicht, so dass ihre sensorischen Neuronen mit größerer Spezifität untersucht werden können.
Dieses Protokoll ist vorteilhaft für Leser, die den Anteil der Neuronen in DRG-Kulturen adulter Mäuse erhöhen möchten. Die Schritte des Immunpannings können jedoch auch weggelassen werden, und dieses Protokoll kann auch für ganze DRG-Kulturen verwendet werden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des University of Alberta Health Sciences Animal Care and Use Committee (Protokoll 0000274) durchgeführt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie für Tag 1 die folgenden Reagenzien vor: Wasser in Zellkulturqualität; Poly-D-Lysin-Herstellung einer Brühe, indem die ganze Flasche in 50 ml Wasser in Kulturqualität auf eine Stammkonzentration von 100 μg/ml rekonstituiert, bei 4 °C gelagert und die Brühe 1:10 in Wasser in Kulturqualität bis zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml verdünnt wird; tris-HCl-Präparation eines Stammes durch Auflösen von pulverförmigem Trishydrochlorid in Kulturwasser auf eine Stammkonzentration von 500 mM (3,94 g in 50 ml), pH 9,5, Filtersterilisieren (0,22 μm), Lagern bei 4 °C und Verdünnen des Stoffes 1:10 in Wasser in Kulturqualität bis zu einer Endkonzentration von 50 mM; Sekundäre Antikörper (Ziegen-Anti-Ratte, -Kaninchen und -Maus).
- Bereiten Sie für Tag 2 die folgenden Reagenzien vor.
- Bereiten Sie Ca2+,Mg2+-freie Hank-Salzlösung (HBSS; HBSS-/-) und D-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in Zellkulturqualität mit Ca 2+ und Mg2+. Bereiten Sie ein Laminin-Vorratsaliquot vor und lagern Sie es sofort nach Erhalt bei -80 °C. Verdünnen Sie das Material in sterilem HBSS-/- auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml für Arbeitsmaterial.
- Bereiten Sie 4 % Kälberserumalbumin (BSA) vor, indem Sie 400 mg BSA in 7,5 ml D-PBS (pH 7,4) auflösen, das Volumen auf 10 ml bringen, filtrieren Sie es (0,22 μm), aliquotieren Sie es und lagern Sie es bei -20 °C. Bereiten Sie 0,2 % BSA vor, indem Sie 750 μl 4 % BSA in 14,25 ml D-PBS verdünnen.
- Bereiten Sie 0,4 % DNAse-Vorrat vor, indem Sie 1 ml Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) pro 12.500 Einheiten DNAse hinzufügen, filtrieren, sterilisieren (0,22 μm), aliquot und bei -20 °C lagern. Bereiten Sie Schwenkpuffer (0,02 % BSA) vor, indem Sie 3 ml 0,2 % BSA und 100 μl 0,4 % DNAse in 27 ml D-PBS hinzufügen. Präparation von Primärantikörpern (CD45, PDGRFβ, O4).
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein O4-Hybridom8,9, jedoch wären auch 10 μg eines kommerziell erhältlichen O4-Antikörpers angemessen. - Bereiten Sie die Kombinationskollagenase vor, indem Sie eine Flasche Kombinationskollagenase (50 mg) in 5 ml HBSS-/-, aliquot auflösen und bei -20 °C lagern. Bereiten Sie einen Arbeitsstock pro zwei Mäuse vor, indem Sie 500 μl erwärmte Kombinationskollagenase und 50 μl erwärmte 0,4%ige DNase zu 4,5 mL HBSS-/- hinzufügen.
- Bereiten Sie ein niedriges Ovomucoid zu, indem Sie 3 g BSA zu 150 ml D-PBS hinzufügen, dann 3 g Trypsin-Inhibitor hinzufügen und mischen, um sich aufzulösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bringen Sie das Volumen mit D-PBS auf 200 ml. Sterilisieren, 1-ml-Aliquots herstellen und bei -20 °C lagern. Kombinieren Sie am Tag der Dissektion 1 ml niedriges Ovomucoid mit 9 ml D-PBS für die Arbeitslösung.
- Bereiten Sie 15 % BSA zu, indem Sie 7,5 g BSA in 50 ml HBSS-/- auflösen (auf einen Shaker geben, um sich vollständig aufzulösen), filtrieren, sterilisieren und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 50 ml Neuronenmedium zu, indem Sie 23,2 ml DMEM, 23,2 ml neurobasales Medium, 500 μl Glutamax, 500 μl Natriumpyruvat, 500 μl Penicillin/Streptomycin (sofort nach Ankunft aliquot und bei -20 °C lagern), 500 μl Insulin (5 μg/ml endgültig), 500 μl SATO, 50 μl N-Acetyl-L-Cystein (NAC; 5 μg/ml endgültig) zubereiten. und 1.000 μl B27+ (sofort aliquot und nach Erhalt bei -20 °C lagern).
- Bereiten Sie den Insulinvorrat vor, indem Sie ihn in Kulturwasser auf eine Konzentration von 0,5 mg/ml (50 mg in 100 ml) auflösen, den pH-Wert auf 7,4 einstellen, den Filter sterilisieren (0,22 μm), 500 μl Aliquots vorbereiten und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie den SATO-Stamm vor, indem Sie 20 μl Progesteron (2,5 mg in 100 μl Ethanol), 800 μl Natriumselenit (4 mg in 10 ml neurobasaler Medien + 10 μl 1 N NaOH), 800 mg BSA, 800 mg Transferrin, 128 mg Putrescindihydrochlorid und 80 ml neurobasal kombinieren. Filtersterilisieren (0,22 μm), 500 μl Aliquots herstellen und bei -20 °C lagern. Es ist wichtig, frische Progesteron- und Natriumselenitlösungen herzustellen.
- Bereiten Sie 50 μl N-Acetyl-L-Cystein (NAC) vor, indem Sie es in neurobasalem Medium auf eine Stammkonzentration von 5 mg/ml (50 mg in 10 ml) auflösen, filtern, sterilisieren (0,22 μm), aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie für Tag 4 und 5 die folgenden Reagenzien vor.
- Bereiten Sie 0,2 M Phosphatpuffer (PB) vor, indem Sie 21,8 g zweibasisches Natriumphosphat (Na2HPO4) und 8,34 g einbasiges Natriumphosphatdihydrat (NaH2PO4) in 1.000 ml Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und lagern Sie ihn bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie 8 % Paraformaldehyd (PFA) wie folgt vor: In einem Abzug 50 ml Wasser auf 55 °C erwärmen, die Hitze ausschalten und unter ständigem Rühren 8 g PFA-Prills hinzufügen. Fügen Sie 1 N NaOH tropfenweise hinzu, bis die Lösung zu klären beginnt, fügen Sie dann 40 ml 0,2 M PB hinzu und rühren Sie weiter, bis sie klar sind. Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur ab, stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein und bringen Sie das Volumen mit 0,2 M PB auf 100 ml. Filtern und bei 4 °C bis zu 2 Wochen lagern.
- Bereiten Sie D-PBS + Triton X-100 (PBS TX) vor, indem Sie 0,2 % Triton X-100 in D-PBS in Kulturqualität (1 ml Triton + 500 ml D-PBS) hinzufügen. Bei 4 °C lagern. Bereiten Sie eine Blockierlösung vor, bei der es sich um 1% normales Eselsserum (NDS) in PBSTX handelt. Im Voraus können 1 ml NDS + 9 ml PBSTX hergestellt und bei -20 °C in 10-ml-Aliquoten gelagert werden.
- Herstellung einer Antikörperlösung, die 0,2 % NDS/0,2 % BSA in PBS TX enthält: 200 μl NDS + 200 mg BSA + 9,6 ml PBSTX; können im Voraus zubereitet und bei -20 °C in 10-ml-Aliquoten gelagert werden.
2. Einrichten der Ausrüstung
- Richten Sie die folgende Ausrüstung ein: sterile Biosicherheitswerkbank für Zellkulturen, Mikropipettenset, serologische Pipetten und Pipettenpistole, 10-cm-Petrischale, gewünschte Zellkulturschalen für die Beschichtung (hier wurden 24-Well-Platten mit schwarzem Glasboden für die Bildgebung verwendet), konische 15-ml- und 50-ml-Röhrchen, Dissektionswerkzeuge (nämlich: feine Federschere für Laminektomie und Nerventrimmen, feine Pinzetten, und eine Rasierklinge), Wasserbad auf 37 °C, 70 μm Zellsieb, Zentrifuge (10 min bei 300 x g) mit Adaptern für 15 mL konische Röhrchen, Trypanblau- und Hämozytometer, Abzug und magnetische Rührkochplatte.
3. Experimentelle Methode
- Tag 1: Zubereitung der Speisen
- Beschichten Sie die gewünschte Kulturoberfläche in einer Biosicherheitswerkbank mit so viel Poly-D-Lysin, dass der Boden der Vertiefung bedeckt ist. Über Nacht bei 4 °C lagern. Hier wurden 24-Well-Glasbodenplatten für die Bildgebung verwendet, und somit wurden 300 μL Poly-D-Lysin verwendet.
- Bereiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank die Schwenkschalen vor: Für die CD45-Schale 10 ml Tris-HCl-Arbeitslösung und 30 μl Ziegen-Anti-Ratten-IgG in eine 10-cm-Petrischale geben; für die PDGFRβ-Schale 10 ml Tris-HCl-Arbeitslösung und 30 μl Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG in eine 10-cm-Petrischale geben; Für die O4-Hybridomschale werden 10 ml Tris-HCl-Arbeitslösung und 30 μl Ziegen-Anti-Maus-IgG in eine 10-cm-Petrischale gegeben. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Schüsselfläche bedeckt, und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C stehen.
- Tag 2: Präparation, Verreibung und Immunpanning
- Saugen Sie das Poly-D-Lysin an, waschen Sie die Platten dreimal mit Gewebekulturwasser, kippen Sie den Deckel auf und lassen Sie die Oberfläche in einer Biosicherheitswerkbank vollständig trocknen. Tragen Sie so viel Laminin auf die Platten auf, dass der Boden jeder Vertiefung bedeckt ist, und stellen Sie sie bei 37 °C in einen Inkubator. Für die 24-Well-Platten sind 200 μL ausreichend.
- Beenden Sie die Zubereitung der Pfannengerichte. Waschen Sie jede Schale mit D-PBS und inkubieren Sie sie mit 10 μg Primärantikörper. Mindestens 2 h bei Raumtemperatur ruhen lassen.
- Für die CD45-Schale fügen Sie 5 ml 0,2 % BSA und 20 μl CD45 primär hinzu; für die PDGFRβ-Schale 5 ml 0,2 % BSA und 15,4 μl PDGFRβ hinzufügen; Für die O4-Schale fügen Sie 3 ml 0,2 % BSA, 2 ml O4-Hybridom und weitere 100 μl 4 % BSA hinzu (um sicherzustellen, dass die endgültige BSA-Konzentration bei 0,2 % bleibt).
- Euthanasieren Sie ein bis vier Mäuse mit 0,1 ml/kg Natrium-Pentobarbitol (pro 10-cm-Immunopanning-Schale). Wir haben C57BL/6 Mäuse im Alter von 8-10 Wochen verwendet. Beide Geschlechter wurden getrennt voneinander verwendet und kultiviert. Perfundieren Sie das Tier mit 30 ml kalter 0,9%iger Kochsalzlösung.
- Stecken Sie die Vorder- und Hinterpfoten an eine Styroporstufe und legen Sie die Wirbelsäule mit einer sauberen Rasierklinge von hinten frei. Führen Sie eine Laminektomie durch, indem Sie auf beiden Seiten der dorsalen Wirbelsäule etwa halbtiefe Schnitte machen und die dorsale Hälfte der Wirbelsäule entfernen, um das Rückenmark freizulegen. Durchtrennen Sie entweder vorsichtig die Nerven und entfernen Sie das Rückenmark oder schieben Sie das Rückenmark vorsichtig zur Seite, um die Nervenintegrität zu erhalten.
- Verwenden Sie die Spinalnervenwurzeln (entweder durchtrennt oder am Rückenmark befestigt), um alle DRGs auf beiden Seiten der Wirbelsäule zu finden und zu entfernen. Schneiden Sie die Nerventrümmer von jedem DRG ab, während es entfernt wird (mehr Nerventrümmer in der Kultur können zu einem schlechten Überleben der Kultur führen). Sammeln Sie die DRGs in 15 ml HBSS-/- in einem konischen 15-ml-Röhrchen auf Eis.
Anmerkungen: Beachten Sie, dass das Gewebe im Freien präpariert wird, aber sobald die DRGs in das Röhrchen gegeben werden, sollten sie als steril behandelt und nur in einer Biosicherheitswerkbank manipuliert werden. - Gefrorene Vorräte von Stempxym 1 und 0,4 % DNAse in ein Wasserbad geben, etwa 30 Minuten vor dem Ende der Dissektion (ungefähr beim Start der letzten Maus). Lassen Sie sie am Boden des konischen Röhrchens absetzen und setzen Sie dann das Protokoll in einer Biosicherheitswerkbank fort.
- Saugen Sie den größten Teil des HBSS-/- aus den DRGs ab. Verwenden Sie eine Pipette anstelle eines Saugers, um <1 ml Flüssigkeit zu erhalten, und lassen Sie ~100 μl flüssig, um nicht zu riskieren, Gewebe zu verlieren.
- Dreimal mit 1 ml HBSS-/- waschen. Fügen Sie dem Gewebe 5 ml der funktionierenden Stempxymlösung hinzu. Decken Sie den Deckel mit einer transparenten Folie ab und lassen Sie den Schlauch auf der Seite in einem auf 37 °C eingestellten Wasserbad für 1 h schwimmen.
- Nach der Inkubation im Enzym geben Sie 1 ml Low-ovo-Inhibitor-Lösung in das Röhrchen. Verreiben Sie die Zellen vorsichtig mit einer p1000-Pipette 10-15 Mal. Lassen Sie die Gewebestücke absetzen.
- Übertragen Sie die oberen 2-3 ml der Lösung (mit dissoziierten Zellen) in eine frische, niedrig ovomukoide Lösung. Wiederholen Sie den Vorgang, bis das Gewebe vollständig dissoziiert ist und keine sichtbaren Stücke mehr übrig sind.
- 10 min bei 300 x g Raumtemperatur zentrifugieren. Saugen Sie den Überstand für die letzten 1 ml mit einer Pipette anstelle eines Saugers wieder ab, so dass ~100 μl übrig bleiben, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Schwenkpuffer.
- Zum Mischen vorsichtig pipettieren. Befeuchten Sie ein 70-μm-Zellsieb mit 1 ml Schwenkpuffer über einem konischen 50-ml-Röhrchen. Filtern Sie die Zelllösung durch das Zellsieb.
- Waschen Sie das Röhrchen mit 1 ml Schwenkpuffer und passieren Sie es dann durch das Sieb (3 ml Filtrat). Schichten Sie die Zellsuspension vorsichtig (jeweils 1 ml) auf 2 ml eines 15%igen BSA-Polsters, um Myelinablagerungen zu entfernen. Ein 2-ml-Polster ist für zwei Mäuse und 3 ml für vier Mäuse wirksam.
- Zum Schichten geben Sie die 2 ml BSA in das Röhrchen, verschließen Sie es und beschichten Sie die Seiten des Röhrchens vorsichtig mit BSA. Schichten Sie dann vorsichtig die Zellsuspension von oben, indem Sie gegen die Seite des Röhrchens pipettieren.
- Bei Raumtemperatur bei 300 x g für 10 min zentrifugieren (langsames Beschleunigen und Abbremsen). Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um die klare Flüssigkeit auf der Oberseite, die Myelinphase dazwischen, und die BSA jeweils 1 ml zu entfernen (wechseln Sie die Spitzen zwischen den einzelnen ml). Lassen Sie ~100 μl BSA stehen, um das Pellet nicht zu stören.
- Fügen Sie 5 ml Schwenkpuffer hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen in einem 37 °C, 10% CO2 -Inkubator für 30-45 min. Dies ermöglicht die Rückgewinnung von Antigenen. Achten Sie darauf, die Kappe zu lösen, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
- Waschen Sie die CD45-Schale dreimal mit D-PBS. Gießen Sie die letzte Spülung ab. Die Zellsuspension in die CD45-Schale umfüllen.
- Inkubieren Sie die Zellen auf der CD45-Schale insgesamt 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie vorsichtig bei 10 Minuten, um den Zellen einen gleichmäßigen Zugang zum Antikörper zu ermöglichen.
- Spülen Sie die PDGFRβ-Schale dreimal mit D-PBS aus und gießen Sie die letzte Spülung ab. Übertragen Sie die ungebundenen Zellen aus der CD45-Schale in die PDGFRβ-Schale.
- Schütteln Sie die CD45-Schale vorsichtig und stützen Sie sie schräg ab. Pipettieren Sie vorsichtig 1 ml der Zellsuspension über die Schale, um ungebundene Zellen zu sammeln. Dekantieren Sie es in die PDGFRβ-Schale und pipettieren Sie, um die verbleibende Zellsuspension auf die PDGFRβ-Platte zu übertragen.
- Inkubieren Sie die PDGFRβ-Platte insgesamt 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie vorsichtig bei 10 Minuten, um den Zellen einen gleichmäßigen Zugang zum Antikörper zu ermöglichen.
- Spülen Sie die O4-Schale dreimal mit D-PBS aus und gießen Sie die letzte Spülung ab. Die ungebundenen Zellen werden mit der gleichen Methode wie in Schritt 3.2.19 von der PDGFRβ-Schale in die O4-Schale übertragen. Inkubieren Sie die O4-Platte insgesamt 20 Minuten lang bei Raumtemperatur und schwenken Sie sie vorsichtig bei 10 Minuten, um den Zellen einen gleichmäßigen Zugang zum Antikörper zu ermöglichen.
- Die Zellsuspension wird in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt und 10 min bei 300 x g zentrifugiert. Resuspendieren Sie die Zellen im gewünschten Volumen und verdünnen Sie sie 1:1 mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Zählen Sie mittelgroße bis große Zellen mit einem Hämozytometer (dies ermöglicht die beste Darstellung der Anzahl der Neuronen in der Kultur).
- Entfernen Sie das Laminin und beschichten Sie die Zellen mit der gewünschten Dichte. Lassen Sie die Platte zwischen dem Entfernen des Laminins und dem Ausplattieren nicht trocknen und fügen Sie die Zellen sofort hinzu.
- Die quantifizierten Zellen zur neuronalen Anreicherung (Abbildung 3) werden mit 500 Neuronen in 25 μl Nährmedium (beschrieben in 1.2.7) pro Well in 24-Well-Platten kultiviert und bei 37 °C für 30 min inkubiert. Fluten Sie die Brunnen auf ein Endvolumen von 500 μL.
- Tag 4: Immunzytochemie (ICC) Fixierung, Blockierung und primäre
- Nach 48 Stunden Wachstum fügen Sie 500 μl/Well (oder ein Volumen, das dem Medium in der Well entspricht) 8 % PFA für 15 min bei Raumtemperatur hinzu, um die Zellen zu fixieren. Wenn eine Medienanalyse gewünscht ist, kann man direkt mit 4% PFA fixieren. Wir haben dies jedoch nicht getestet.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit D-PBS. Beachten Sie, dass wir diese Zellen ohne Medienwechsel für maximal 72 Stunden in Kultur gehalten haben, aber wir vermuten, dass sie länger überleben könnten, insbesondere wenn das Medium halb ausgetauscht wird.
- Entfernen Sie die letzte Wäsche und fügen Sie so viel Blockierlösung pro Vertiefung hinzu, dass die Zellen vollständig bedeckt sind. 30 Minuten bei Raumtemperatur blockieren. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie den primären Antikörper in die Antikörperlösung: β3-Tubulin in einer Verdünnung von 1:1.000. Die Platte mit Klarsichtfolie versiegeln und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
ANMERKUNG: Man könnte eine Färbung mit PDGFRβ für das Fehlen von Fibroblasten, CD45 für das Fehlen von Immunzellen, P0 oder PMP22 für das Fehlen von Myelin oder Fabp7 für Satellitenglia in Betracht ziehen.
- Tag 5: ICC-Sekundarstufe
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit D-PBS. Entfernen Sie die letzte Wäsche und geben Sie sekundäre Antikörper in die Antikörperlösung: Anti-Kaninchen 488 bei einer Verdünnung von 1:500 und DAPI bei einer Verdünnung von 1:2.000. 30 min bei Raumtemperatur und lichtgeschützt inkubieren.
- Dreimal mit D-PBS waschen. Fügen Sie genug D-PBS hinzu, um den Boden der Vertiefung abzudecken, und bilden Sie ab. Die Platte kann mit transparenter Folie versiegelt, vor Licht geschützt und bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
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Representative Results
Die fixierten Zellen, die mit DAPI und β3-Tubulin gefärbt wurden, wurden dann mit einem konfokalen High-Content-Screening-System abgebildet. Die Bilder wurden mit geeigneter kommerzieller Software analysiert, um den Prozentsatz der DAPI-positiven Zellen zu bestimmen, die mit β3-Tubulin co-markiert waren (Abbildung 3). Es wurde festgestellt, dass ganze DRG-Kulturen eine Färbung von 42,36 % ± 6,4 % β3-Tubulin aufwiesen, und bei immunpanierten DRG-Kulturen wurde eine Färbung von 71,44 % ±7,43 % β3-Tubulin festgestellt. Dies zeigt eine signifikante Zunahme der neuronalen Anreicherung durch Immunpanning (p < 0,0001, ungepaarter t-Test).
Abbildung 1: Grundlagen des Immunopannings. Über Nacht wird ein Sekundärantikörper auf eine Kulturschale geklebt und anschließend werden Primärantikörper eingebracht. Dadurch können die interessierenden Zellen durch ein Oberflächenantigen an die Platte gebunden werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Adulte Maus-DRG-Neuronen-Immunpanning durch negative Selektion. DRGs werden geerntet, dissoziiert und zu einer Einzelzelllösung abgeseiht. Myelin-Trümmer werden durch Zentrifugation durch ein BSA-Kissen entfernt. Die Zellsuspension wird dann durch drei Immunopanning-Schalen (CD45, PDGFRβ und O4) geleitet, um eine Kultur zu erhalten, die für Neuronen angereichert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Neuronale Anreicherung von DRG-Kulturen durch Immunpanning. Fixierte Kulturen wurden mit β3-Tubulin für Neurone und DAPI für alle Zellkerne gefärbt. (A) Repräsentatives Bild einer ganzen (nicht immunpannischen) Kultur. (B) Repräsentatives Bild einer immungepannten Kultur. (C) Quantifizierung des Prozentsatzes der β3-Tubulin-positiven Zellen an der Gesamtzahl der DAPI-positiven Zellen. Die Balken geben den Mittelwert ± den Standardfehlermittelwert (SEM) an. = p < 0,0001, ungepaarter t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Dieses Immunpanning-Protokoll erhöht den Anteil neuronaler Zellen in DRG-Primärkulturen. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollten Dissektionen rechtzeitig durchgeführt und DRGs von überschüssigen Nerven befreit werden. Der Dissoziationsschritt sollte sorgfältig überwacht werden und 1 Stunde nicht überschreiten, um die Zellen vor unnötigem Stress zu schützen. Speziell im Hinblick auf das Immunopanning sollte jede Platte auf halbem Weg vorsichtig geschwenkt werden, damit die Zellen Zugang zu den beschichteten Antikörpern haben. Die Platten sollten auch nach der Entnahme der neuronalen Zellsuspension unter einem Kulturmikroskop betrachtet werden, um sicherzustellen, dass sich nicht-neuronale Zellen gebunden haben.
Eine Einschränkung bei der Verwendung erwachsener Mäuse ist die etablierte Natur der DRGs. Wenn es nicht möglich ist, alle nicht-neuronalen Zelltypen zu entfernen, bleiben etwa 30 % der Kultur als nicht-neuronal zurück (Abbildung 3). Während wir die Population von Immunzellen, Fibroblasten und Schwann-Zellen aus den Kulturen dissoziieren und reduzieren können, kann es äußerst schwierig sein, Satellitenglia von Neuronen zu trennen. Wir stellen auch die Hypothese auf, dass diese Neuronen ohne die metabolische Unterstützung durch die Satellitenglia10 ein schlechtes Überleben haben könnten. Während unser Versuch, diese Zellen mit GFAP zu färben, aufgrund der schlechten Antikörperspezifität gescheitert ist, könnte eine zukünftige Richtung darin bestehen, diese Zellen mit fabp7 zu färben. Wir haben versucht, CD9-positive nicht-neuronale Zellen wie Satellitenglia zu entfernen, als wir dieses Protokoll fehlerfrei behandelten. In der CD9-Platte wurde jedoch festgestellt, dass viele Neuronen an der Platte befestigt waren. Wir vermuten, dass die Neuronen von Mäusen eine gewisse CD9-Expression aufweisen könnten. Tatsächlich verwendet die Literatur über extrazelluläre Vesikel aus neuronenähnlichen Zellen der Maus CD9 als Marker11. Wenn ein geeigneterer Panning-Antikörper gefunden werden könnte, um den Anteil der Satellitenglia zu reduzieren, könnte man eine zusätzliche Supplementierung mit Wachstumsfaktoren wie NGF, BDNF oder NT3 in Betracht ziehen, um dem Verlust dieser Stützzellen entgegenzuwirken.
Dieses Immunpanning-Protokoll kann die Genauigkeit neuronaler Auslesungen aus homogenen DRG-Kulturproben verbessern, indem der Anteil neuronaler Zellen in der Kultur erhöht wird. Es bietet auch eine Möglichkeit, DRG-Neuronen adulter Mäuse zu kultivieren, was eine eingehende Untersuchung neuronaler Phänotypen in genetischen, Krankheits- und Verletzungsmodellen ermöglicht.
Immunopanning ist auch ein hochgradig anpassbares Werkzeug. Zum Beispiel könnte der Zelloberflächenmarker Isolectin-B4 verwendet werden, um gezielt für nicht-peptiderge Mausnozizeptoren zu selektieren. Immunopanning kann auch zur Anreicherung anderer Primärkulturen verwendet werden, darunter kortikale Neuronen, Mikroglia, Astrozyten und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Es ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Anwendungen von primären Zellkulturen erweitern kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Projektzuschuss der Canadian Institutes of Health Research (FRN-162434) und einen Discovery Grant der MS Society of Canada (EGID-3761) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Dr. Sun und dem Cross Cancer Institute für die Schulung und Nutzung des ImageXpress-Systems.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
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- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
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